Summary
L’objectif du protocole présenté ici est d’étudier la réponse de transcriptomique des isolés endosphère Bacillus mycoides aux exsudats racinaires de pommes de terre. Cette méthode facilite l’identification des gènes bactériens importants impliqués dans les interactions plantes-microorganismes et est en principe applicable aux autres endophytes et plantes, avec des ajustements mineurs.
Abstract
Bactéries associées aux plantes jouent un rôle important dans la promotion de la croissance et la prévention des maladies chez les plantes. L’application des rhizobactéries promotrices de la croissance de plantes (PGPR) biofertilisants ou biocontrol agents est devenu une alternative efficace à l’usage des engrais classiques et peut augmenter la productivité des cultures à faible coût. Interactions plantes-microorganismes dépendent des signaux sécrétée à la plante hôte et une réaction sur le connaissement par leurs bactéries associées. Cependant, les mécanismes moléculaires des bactéries bénéfiques comment répondent à leurs associés végétale signaux ne sont pas totalement comprises. Évaluation de la réponse de transcriptomique des bactéries aux exsudats racinaires est une approche puissante pour déterminer l’expression de gène bactérien et règlement conditions rhizosphérique. Une telle connaissance est nécessaire pour comprendre les mécanismes sous-jacents impliqués dans les interactions plantes-microorganismes. Cet article décrit un protocole détaillé pour étudier la réponse de transcriptomique de b. mycoides CE18, une souche isolée chez l’endosphère de pommes de terre, d’exsudats racinaires de pommes de terre. Avec l’aide des récentes technologies de séquençage haut débit, ce protocole peut être effectué en plusieurs semaines et les ensembles de données massives de produits. Tout d’abord, nous collectons les exsudats des racines dans des conditions stériles, après quoi ils sont ajoutés à des cultures de b. mycoides . L’ARN de ces cultures est isolé en utilisant une méthode phénol/chloroforme combinée avec une trousse commerciale et soumises à un contrôle de qualité par un instrument automatisé de l’électrophorèse. Après le séquençage, analyse des données est effectuée avec le pipeline de T-REx sur le web et un groupe de gènes différentiellement exprimés est identifié. Cette méthode est un outil utile pour faciliter les nouvelles découvertes sur les gènes bactériens impliqués dans les interactions plantes-microorganismes.
Introduction
Les plantes peuvent exsudat jusqu'à 20 % du carbone fixé lors de la photosynthèse par racines dans la rhizosphère1, c'est-à-dire, la zone étroite du sol près des racines. En raison de la plus grande disponibilité des éléments nutritifs, la rhizosphère est un habitat adéquat pour les divers micro-organismes, y compris les bactéries favorisant la croissance des plantes. Les exsudats des racines contiennent une variété de composés inorganiques comme les ions, acides inorganiques, d’oxygène et d’eau. Cependant, la majorité des exsudats racinaires est formée par les matières organiques, qui peuvent être divisés en des composés de faible poids moléculaire et masse moléculaire élevée de composés. Les composés de faible poids moléculaire sont des acides aminés, acides organiques, sucres, composés phénoliques, acides gras et un tableau de métabolites secondaires. Les composés de poids moléculaire élevé sont constitués de mucilage et protéines,2,3. Micro-organismes de la rhizosphère peuvent utiliser certains de ces composés comme source d’énergie pour la croissance et le développement. Les exsudats des racines jouent un rôle important dans le façonnement de la communauté des rhizobactéries puisque les composés de produits végétaux dans les exsudats peuvent influencer le comportement de bactéries associées à la rhizosphère par affecter l’expression de gènes spécifiques.
Comprendre la réaction bactérienne d’exsudats racinaires est une étape clé de décryptage des mécanismes d’interaction plante-microbe. Car la réponse bactérienne aux interactions plantes-microorganismes est le produit de l’expression différentielle des gènes, elle puisse être étudiée par l’analyse du transcriptome. En utilisant cette méthode, des études antérieures identifié plusieurs gènes importants impliqués dans les interactions plantes-microorganismes. Pseudomonas aeruginosa, gènes impliqués dans le métabolisme, le chimiotactisme et type de sécrétion II étaient divulgués pour répondre à la racine de betterave à sucre exsudats4. Fan et al. 5 a étudié la transcriptomique profilage de b. amyloliquefaciens FZB42 en réponse à des exsudats racinaires de maïs. Leurs résultats montrent que les gènes fortement induites par les exsudats racinaires, plusieurs groupes sont occupent de voies métaboliques liés à l’utilisation des éléments nutritifs, chimiotactisme, motilité et non ribosomale synthèse de peptides antimicrobiens et polyketides.
L’exactitude de ces études repose sur la collecte des exsudats racinaires. Plusieurs méthodes ont décrit la collection d’exsudats racinaires à différentes fins, ils exigent des instruments sophistiqués ou ne sont pas exécutées dans des conditions bien contrôlées6,7,8. Par ailleurs, les micro-organismes inhibant la rhizosphère peuvent influencer racine exsudat composition en affectant la perméabilité de la membrane de cellules végétales et endommager les tissus de la racine, notamment dans le cas de consortiums de micro-organismes9. Lors d’enquêtes sur la réponse microbienne d’exsudats racinaires, il est important d’utiliser des conditions bien définies afin d’éviter l’altération des composés par d’autres microorganismes10. En outre, RNA de haute qualité est obligatoire pour RNA-seq basé des études du transcriptome. Toutefois, lorsqu’il s’agit des souches non modèle-bactérienne, les protocoles standard ou les kits commerciaux ont généralement un faible rendement en raison de facteurs inconnus ou propriétés de croissance spécial.
Le protocole décrit ici a été vérifié à l’aide de b. mycoides, qui est une bactérie Gram positive sporulé du phylum des Firmicute. Il est omniprésent dans la rhizosphère des diverses espèces végétales. Plusieurs propriétés promotion de la croissance végétale ont été signalées pour cette espèce, y compris l’induction de résistance systématique (ISR) dans la betterave à sucre11, inhibition du pathogène fonte Pythium pour concombre12, ainsi que d’azote fixation dans la rhizosphère tournesol13. Cependant, les mécanismes moléculaires de ses interactions avec une plante hôte ne sont pas bien étudiés.
L’objectif des expériences présentées ici est d’étudier la réponse de transcriptomique des isolés endosphère b. mycoides aux exsudats racinaires de pommes de terre. En bref, le protocole se compose des étapes suivantes : tout d’abord, recueillir des exsudats racinaires de pommes de terre dans des conditions stériles. Ensuite, extrayez qualité RNA de cellules bactériennes, traités avec les exsudats racinaires. La dernière étape est l’analyse des données avec les webmail T-REx pipeline14. Ce protocole a été utilisé pour identifier les gènes de b. mycoides qui montrent un changement dans les niveaux d’expression au contact des exsudats racinaires et donc pourraient jouer un rôle important dans les interactions plantes-microorganismes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. germination des pommes de terre en Conditions stérilisées
- Rincer la surface de la pomme de terre à l’eau stérile. Baigner la pomme de terre dans l’éthanol à 70 %, puis à l’hypochlorite de sodium 3 %, de 5 min chacun. Rincer à nouveau à l’eau stérile pour éliminer tout reste d’hypochlorite de sodium.
- Préparer le matériel nécessaire pour la germination et la croissance des tubercules de pomme de terre ; stériliser les pots en plastique, paniers de greffe, vermiculite et arrosez-les à l’autoclave à 121 ° C pendant 20 min.
Remarque : Assurez-vous que tous les matériaux utilisés sont stérilisables en autoclave. Dans le cas contraire, utiliser d’autres méthodes de stérilisation. - Mettre la pomme de terre stérilisées en surface dans le panier de la greffe et placez-la dans un pot stérilisé contenant de la vermiculite humide.
- Garder le pot dans une chambre climatique à 24 ° C pendant trois semaines. Réglez-le sur les cycles de 16 h de lumière (120 µmol m-2s-1) et 8 h d’obscurité. Pour éviter des contaminations microbiennes, utilisez une boîte de fibre de verre pour couvrir la casserole.
2. collecte des exsudats racinaires de pommes de terre
- Lorsque les pousses pousses, transfert le panier avec les pommes de terre entières dans un bécher stérile plein avec 150 mL d’eau désionisée autoclavé, avec la pomme de terre tubercules placés juste au-dessus de la surface de l’eau et les racines immergées dans l’eau (voir Figure 1). Maintenir le semis dans la chambre climatique et utiliser les mêmes paramètres que précédemment [24 ° C ; cycles de 16 h de lumière (120 µmol m-2s-1), 8 h d’obscurité].
- Depuis le deuxième jour, recueillir l’eau contenant les exsudats et remplir le bécher avec de l’eau désionisée stérile. Effectuer l’échantillonnage chaque jour jusqu’au septième jour après le transfert de la plantule.
- Stocker chaque échantillon séparément à 4 ° C. Pour chaque échantillon, répandre 100 µL sur un Luria-Bertani (LB, 1 % de tryptone, extrait de levure 0,5 %, 0,5 % NaCl) Gélose pour vérifier les contaminations microbiennes. Jeter les échantillons contaminés.
- Combinez les échantillons collectés d’un semis et les concentrer par lyophilisation eux à-40 ° C pour un volume final de 150 mL.
3. croissance des bactéries
- Ensemencer une souche de b. mycoides provenant d’un stock de glycérol de-80 ° C sur une gélose LB et incuber la plaque à 30 ° C durant la nuit.
- Ensemencer un milieu liquide LB avec une seule colonie de la plaque et développer la culture dans un incubateur à agitation à 200 tr/min pendant la nuit à 30 ° C.
4. le traitement et l’échantillonnage des bactéries
- Pour comparer la courbe de croissance de la bactérie traités avec les exsudats racinaires à un témoin négatif, préparer une série de fioles contenant 50 mL de milieu liquide LB. Ajouter 0,5 mL de la culture bactérienne pendant la nuit à tous les flacons et ajouter soit 0 %, 5 %, 10 % ou 15 % (v/v) racine exsudat ou eau désionisée stérile au milieu, respectivement.
- Utiliser une culture avec de l’eau désionisée au lieu d’exsudats racinaires comme un contrôle. Mesurer la densité optique à 600 nm (OD600) toutes les 1 h par la suite. Générer une courbe de croissance en traçant les valeurs de600 OD par rapport au temps.
Remarque : On a vu que 10 % des exsudats racine n’a pas affecté la croissance de b. mycoides (voir Figure 2) ; ce rapport a été utilisé pour des expériences de RNA-seq. - Diluer une culture de b. mycoides nuitée avec 90 mL de préchauffé milieu LB à l’initiale de OD600 de ~ 0,05 dans un flacon de 300 mL. Ajouter 10 mL d’exsudats racinaires à la culture et il incuber à 30 ° C pendant 1 h.
- Utiliser un traitement de l’eau désionisée stérile 10 mL sous forme de contrôle. Prélever des cellules de la culture par centrifugation à 9 000 x g pendant 2 min à 4 ° C. Éliminer le liquide surnageant et immédiatement geler le culot dans l’azote liquide, puis conserver à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.
5. les ARN
Remarque : Avant de commencer l’isolement, préparer le workbench, grilles et pipettes en les nettoyant avec une solution de décontamination de RNase (voir Table des matières). Porter des gants en tout temps et s’assurer que tous les tubes, des conseils et des solutions sont sans RNase. Gardez toujours les échantillons sur la glace lorsque cela est possible.
- Ajouter 0,1 % (v/v) de diéthyl pyrocarbonate (DEPC) à eau ultrapure (100 µL de DEPC par 100 mL de solution), mélanger bien et gardez-le à température ambiante pendant la nuit. Autoclave le mélange pour inactiver le CPDE après traitement au jour le jour. Cette eau ultrapure traitée DEPC permet de préparer le tampon TE [10 mM Tris-HCl (pH = 8) ; 1 mM EDTA] et une solution de SDS (p/v) de 10 %.
- Décongeler les granules cellulaires sur la glace et suspendre chacun à 400 µL de tampon TE (DEPC). Transférer les suspensions dans les tubes de 2 mL bouchon à vis.
- Mélangez 300 µL d’alcool isoamylique-chloroforme (24:1 v/v) et 300 µL de phénol (acide phénol, RNA grade), puis laissez le mélange reposer pendant 5 min. Prendre 500 µL de la phase organique supérieure à ajouter aux cellules remises en suspension. Puis ajouter 50 µL de SDS de 10 % et 0,5 g de perles de verre (0,5 µm) dans le tube.
- Bien fermer le couvercle et placer le tube dans un homogénéisateur de moulin à billes (voir Table des matières). Effectuer une homogénéisation de pulse 3 × 45 s avec un intervalle de 1 min sur glace.
- Centrifuger les échantillons pendant 10 min à 11 000 x g (4 ° C) et transférer la phase supérieure dans un nouveau tube.
- Ajouter 500 µL de chloroforme-isoamylique alcool (24:1) à la phase supérieure de l’étape 5.5 et centrifuger le mélange pendant 5 min à 11 000 x g (4 ° C).
Remarque : Les étapes suivantes ont été modifiés depuis les instructions du fabricant d’un isolement basées sur le filtre commercial verre fibre nécessaire (voir la Table des matières). - Transférer 500 µL de la phase supérieure dans un nouveau tube, ajouter 2 volumes (1 mL) d’un tampon de lyse/liaison et mélangez-le en pipettant également de haut en bas.
- Combiner les tubes filtre et collection (à partir du kit d’isolement d’ARN) et déposer le mélange de l’étape 5,7 au tube filtre. Centrifuger les tubes pendant 15 s à 8 000 x g et jeter le cheminement.
- Préparer le 1,5 mL tubes de microcentrifuge avec 100 µL de tampon de DNase, 10 µL de la DNase I et 5 µL d’un inhibiteur de RNase (voir Table des matières). Ajouter le mélange de la solution préparée sur le filtre du tube filtre et il incuber pendant 20-30 min à 15-25 ° C.
- Effectuez les étapes de lavage selon les instructions du fabricant. Utilisez 50 µL d’un tampon d’élution pour Éluer la RNA.
- Enregistrez l’ARN éluée à-80 ° C, puis mettre un film plastique paraffine autour d’elle. Dans le même temps, transférer quelques microlitres de l’échantillon dans un tube de microtubes de 1,5 mL pour effectuer un contrôle de qualité.
6. séquençage et contrôle qualité de l’ARN
- Vérifier l’ARN avec un spectrophotomètre microvolume.
NOTE : Taux d’absorption à 260/280 sera au-dessus de 1,8 et ratios à 260/230 doivent être supérieur au moins 1,8, préférence au-dessus de 2.0. - Exécuter l’ARN purifié dans un instrument d’électrophorèse automatisée à l’aide de l’analyse de RNA recommander kit (voir Table des matières) ; le nombre d’intégrité RNA (RIN) doit être au moins supérieur à 7 à aller de l’avant.
- Utiliser un montant total de 3 µg d’ARN par exemple pour générer des bibliothèques avec une préparation de bibliothèque de RNA-Seq nécessaire (voir la Table des matières) suite aux recommandations du fabricant.
NOTE : Les préparatifs de la bibliothèque ont été séquencés sur une plate-forme de séquençage haut-débit et jumelé-fin lectures ont été générés.
7. analyse en utilisant le T-REx de Pipeline sur le Web
- Effectuer un filtrage de qualité grâce au FASTX-Toolkit version 0.0.13 (scores de qualité de programme REDSP de > 20). Taillez les lectures brutes de RNA-Seq de séquences adaptateur via l’outil Trimmomatic.
Remarque : Toutes les analyses en aval étaient fondés sur des données propres de haute qualité. - Télécharger la base de données du génome de b. mycoides ATCC 6462 NCBI (adhésion NCBI no : CP009692.1) et l’utiliser comme un génome de référence pour la cartographie les lectures propres à l’aide de Bowtie2/2.2.3.
- Utilisation HTSeq v0.6.1 pour compter le nombre de lectures mappé à chaque gène et les lectures par kilobases de transcription par million lectures mappés (RPKM) de chaque gène basée sur la longueur du gène et lectures comte mappée à ce gène.
- Pour l’analyse des données par le pipeline de T-REx, utiliser la table RPKM comme entrée, ainsi que trois fichiers descriptifs : (i) un fichier de facteurs pour décrire l’expérience en facteurs, (ii) un fichier de contrastes pour définir quels facteurs seront comparées pour l’expression différentielle des gènes et (iii) un fichier de classe pour décrire des groupes de gènes d’intérêt.
Remarque : Les fichiers descriptifs sont au format in.txt. On trouvera des exemples sur la page Web de T-REx (http://genome2d.molgenrug.nl/). Une instruction détaillée pour l’analyse de données à l’aide de T-REx se trouvent dans une publication précédente de Jong et al. 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Associées aux plantes micro-organismes peuvent influencer positivement la croissance des plantes et la santé. Cependant, les mécanismes d’interactions complexes entre les plantes et leurs symbiotes microbiens ne sont pas entièrement compris. Exsudats racinaires jouent un rôle important dans la régulation de l’activité des rhizobactéries et le comportement, et on suppose généralement que la colonisation microbienne des racines initie avec l’attraction des microbes d’exsudats racinaires. Le but de ce travail était d’étudier la réponse de transcriptomique des rhizobactéries b. mycoides d’exsudats racinaires de pommes de terre. Pour accomplir cela, les tubercules de pommes de terre étaient en surface stérilisé et germent dans la vermiculite autoclavée. Puis les exsudats racinaires ont été recueillis comme illustré à la Figure 1. Afin d’écarter la possibilité des exsudats racinaires qui affectent la croissance bactérienne, jusqu'à 15 % des exsudats racine ont été ajoutés à la culture de b. mycoides , et aucun changement dans la croissance a été détectée pendant le temps de mesure (Figure 2). Ainsi, les changements d’expression de gène observés dans cette étude n’étaient pas probablement causés par les effets liés à la croissance.
Après le prélèvement, les exsudats racinaires ont été ajoutés à la culture de b. mycoides dans une proportion de 10 % (v/v) et l’ARN total bactérienne a été isolé comme décrit précédemment. L’ARN a été ensuite soumis à un contrôle de qualité par un instrument d’électrophorèse automatisés dont les résultats sont présentés à la Figure 3. Figure 3 a et 3 b représentent l’ARN isolé de b. mycoides , traités avec les exsudats des racines, et la Figure 3 et 3D l’ARN isolé appartenant au groupe témoin. Tous les échantillons a marqué d’une valeur RIN supérieur à 9 avec deux bandes claires correspondant aux sous-unités RNA 16 s et 23 s, ce qui démontre que RNA de haute qualité a été obtenue par le présent protocole.
Après la préparation de la bibliothèque, lectures de paire-fin ont été obtenus avec une plate-forme de séquençage haut-débit. Les lectures brutes de RNA-Seq ont été retirés les séquences de l’adaptateur et correspondance avec la séquence du génome de référence. Des données obtenues, la table RPKM a été générée. L’analyse du transcriptome a été réalisée avec le pipeline de T-REx. L’intrigue d’intensité ratio de tous les gènes différentiellement exprimés est illustré à la Figure 4. Par rapport à un contrôle, l’ajout d’exsudats racinaires de pommes de terre induit 715 gènes s’exprimer différemment. Parmi les jeunes, 408 gènes étaient surexprimés et 307 gènes ont été réprimés,15. La variation relative de certains des gènes avec une expression altérée est répertoriée dans le tableau 1.
Figure 1 : schéma du processus de la collection d’exsudats racinaires de pommes de terre. Les matériaux utilisés sont stérilisés à l’autoclave et la germination est exécutée dans une chambre climatique. Laver le tubercule de pomme de terre avec de l’eau stérilisée et bain il en 2-3 % NaOCl pour 5 min. bain dans de l’éthanol 75 % pendant un autre 5 min Place la pomme de terre dans un panier autoclavé et le mettre dans un pot contenant de la vermiculite humide. Cultiver la pomme de terre dans une chambre climatique pour 3-4 semaines et ensuite transférer le panier avec le plant de pomme de terre dans un becher. Recueillir les exsudats racinaires de tous les jours, puis remplir le bécher avec de l’eau stérilisée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : La courbe de croissance de b. mycoides avec différentes concentrations d’exsudats racinaires de pommes de terre. La souche CE18 a été cultivée dans un milieu LB liquide additionné d’exsudats racinaires de pommes de terre ou stérile H2O. OD600 a été mesuré toutes les 1 h et tracées en fonction du temps. Tous les groupes ne montrent une tendance de croissance similaire, ce qui indique que jusqu'à 15 % de l’addition d’exsudats de racine a aucun effet significatif sur la croissance de b. mycoides . S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : contrôle de qualité du RNA par l’appareil d’électrophorèse automatisée. A et B représentent l’ARN isolé de la b. mycoides traités avec les exsudats racinaires et C et D représentent l’ARN isolé appartenant au groupe témoin. Tous les échantillons d’ARN montrent deux bandes claires correspondant à 23 s et ARNr 16 s et une bande d’ARNr 5 s faible. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : intrigue intensité Ratio pour visualiser l’expression différentielle des gènes d’échantillons de RNA-seq de b. mycoides en réponse aux exsudats racinaires de pommes de terre. La figure est générée automatiquement par le T-REx. L’axe x représentant le niveau d’expression de gène, et l’axe y représentant le changement de pli log2-transformées. Les gènes en amont et réprimés ont des valeurs de ratio log2 positives et négatives. Les points noirs dans la zone rayée marquent les gènes qui ne sont pas significativement plus - ou sous-exprimés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Balise de gène | Strand | Changement de pli | Annotation |
| BG05_RS09165 | + | 3.3 | protéine d’efflux multirésistance |
| BG05_RS20930 | + | 25.3 | protéine membranaire |
| BG05_RS10935 | + | 23.3 | stade de protéine de sporulation III AD |
| BG05_RS08990 | - | 11,8 | protéine de sporulation |
| BG05_RS16405 | + | 3.9 | IPSC famille régulateur transcriptionnel |
| BG05_RS24905 | - | 3 | alpha de sous-unité tryptophane synthase |
| BG05_RS24920 | - | 2.3 | indole-3-glycérol-phosphate synthase |
| BG05_RS22255 | - | 27 | acétolactate synthase |
| BG05_RS22250 | - | 6.5 | reductoisomerase du cétol-acide |
| BG05_RS22265 | - | 26.4 | acides aminés à chaîne ramifiée aminotransférase |
| BG05_RS18715 | - | 2.8 | pullulanase |
| BG05_RS18040 | + | -9,1 | protéines YpeB de la germination |
| BG05_RS16930 | + | -4,2 | sucre ABC transporteur ATP-GRB2 |
| BG05_RS27345 | + | -2,9 | Transporteur MFS |
| BG05_RS19555 | - | -3,3 | Sous-unité de transporteur PTS cellobiose IIB |
| BG05_RS24345 | - | -2,7 | importateur de putrescine |
| BG05_RS22525 | - | -12,4 | cardiolipine synthase |
| BG05_RS15225 | - | -3,3 | protéine membranaire |
| BG05_RS18475 | + | -5,7 | protéine membranaire |
| BG05_RS19095 | + | -2,1 | protéine de germination |
Tableau 1 : Liste des gènes exprimés différemment d’un groupe d’imprégnées d’exsudats de racines par rapport à un contrôle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Interactions plantes-microorganismes ont été hypothétiquement être déterminé par un équilibre finement réglé entre les bactéries et les plantes. Ces interactions sont très complexes et difficiles à étudier dans un système naturel, qui comprend diverses espèces microbiennes, potentiellement servir de consortiums. Cet article décrit un protocole simplifié pour étudier la réponse bactérienne d’exsudats racinaires dans des conditions bien contrôlées. Le profil de transcriptome de rhizobactéries, lors de l’exposition d’exsudats racinaires, fournit des informations détaillées sur l’adaptation bactérienne à la niche de la rhizosphère. Ce protocole de collecte des exsudats racine ne nécessite pas de procédures compliquées et équipements spécialisés. Cependant, toutes les procédures doivent être effectués dans des conditions rigoureusement stériles et un contrôle de stérilité doit être inclus. Nous vous recommandons plusieurs tubercules de pomme de terre en parallèle de plus en plus et en jetant les plus contaminés. Modifications sont possibles au présent protocole, si d’autres espèces de plantes sont à l’étude. Il est important d’utiliser une méthode appropriée pour stériliser les graines/tubercules car elles peuvent varier dans la tolérance pour les désinfectants appliqués.
Une fois que les exsudats racinaires sont obtenus, RNA de qualité doit être isolé des cellules bactériennes. Divers réactifs et protocoles standard qui sont principalement basées sur la méthode de TRIzol ou de phénol/chloroforme sont chronophages16. Les kits commerciaux sont principalement conçus pour les organismes modèles, mais sont moins applicables à d’autres. Ce protocole d’isolement ARN qui combine la méthode phénol/chloroforme et un kit d’isolation d’ARN permet de surmonter les inconvénients de ces méthodes. Par ailleurs, une étape de perle-battant est incluse pour homogénéiser les cellules de b. mycoides qui regroupent généralement dans la culture planctonique. Contamination possible de l’ADN est enlevée par une incubation supplémentaire à la DNase avant d’élution. Le nombre élevé de RIN implique l’isolement du RNA intact. Par conséquent, ce protocole est particulièrement efficace et gagner du temps pour des souches de bactéries environnementales.
Après le séquençage RNA, analyse des données est effectuée avec le T-REx, un pipeline de l’analyse statistique basée sur le web pour RNA-seq gene expression données14. Ce pipeline est facile à utiliser, surtout pour les biologistes sans une connaissance étendue de bio-informatique. Le fichier d’entrée est que les RNA expression niveau données brutes, telles que RPKM, fragments par kilobases par million lectures mappés (FPKM), comptes par million lectures mappés (CPM), ou autres unités d’expression de gène. Ces fichiers de valeur d’expression de gène peuvent être générés par les outils disponibles, y compris SAMtools17, BEDtools18et19de la NGS-Trex. Pour exécuter l’analyse de RNA-seq, trois autres fichiers d’entrée sont nécessaires. Ces fichiers sont utilisés pour définir les facteurs qui décrivent les expériences et les répétitions, les comparaisons entre les diverses conditions expérimentales et les groupes de gènes d’intérêt. Lorsque les fichiers d’entrée sont téléchargés, le processus d’analyse prendra seulement quelques minutes.
Plusieurs gènes différentiellement exprimés de b. mycoides CE18, lorsque les traités avec les exsudats racinaires, sont énumérés au tableau 1. Parmi eux, l’expression de plusieurs gènes codant des protéines de la membrane est altérée. Gènes liés à la sporulation ou processus de germination sont exprimés de façon différentielle. L’expression des gènes impliqués dans la sporulation change aussi chez b. subtilis lorsque cultivées conjointement avec des semis de riz, parce que les exsudats racinaires fournissent l’énergie nécessaire à la croissance dynamique de bactériens cellules18. L’expression du régulateur transcriptionnel IPSC, qui est liée à la multirésistance aux médicaments et la dégradation des composés aromatiques dans les bactéries du sol, est augmentée. La souche de suppression IPSC des rhizobactéries Klebsiella pneumoniae a diminué la solubilisation du phosphate minéral, par rapport à la souche sauvage19. Plusieurs gènes liés à la synthèse et le métabolisme des acides aminés sont stimulés, tandis que les gènes impliqués dans le transport des sucres, y compris un transporteur PTS de cellobiose sont réprimés. Cela donne à penser que la souche CE18 peut avoir une préférence métabolique des acides aminés sur les sucres dans la rhizosphère. La fonction des gènes altérés peut être davantage étudiés in situ en faisant le masquage ou la surexpression des mutants. En résumé, le protocole décrit ici permet une identification rapide d’un grand nombre de gènes bactériens potentiellement importants impliqués dans les interactions plantes-microorganismes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Nous remercions Jakob Viel pour ses précieux commentaires et suggestions. Nous remercions également Anne de Jong pour son aide dans l’analyse bio-informatique. Yanglei Yi et Li Zhibo sont pris en charge par le Conseil de bourse Chine (CSC). Nous remercions NWO-TTW Perspectief Programma Back2Roots (TKI-AF-15510) pour leur soutien financier à l’OPK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium hypochlorite | Sigma | CAS: 7681-52-9 | 10-15% active chlorine |
| Luria-Bertani (LB) broth | |||
| incubater | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Genesys 20 | |
| liquid nitrogen | |||
| glass beads | Sigma | G8893 | 0.5 µm |
| 2.0 ml tube with screw cap | RNase free | ||
| 1.5 ml and 2.0 ml eppendorf tube | RNase free | ||
| Bead mill homogenizer | BioSpec | 607 | Mini_beadbeater |
| centrifuge | Eppendorf | 5430 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | sigma | CAS: 1609-47-8 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | sigma | CAS: 151-21-3 | 10% solution prepared with DEPC treated MQ water |
| TE buffer | 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8 | ||
| phenol | Sigma | RNA grade | |
| chloroform-isoamyl alcohol | prepare 24:1 of chloroform:isoamyl alcohol, store at room temperature | ||
| High pure RNA isolation kit | Roche | 11828665001 | |
| RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | RNase-Zap |
| Automated electrophoresis instrument | Agilent | 2100 | Bioanalyzer |
| Microvolume spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop ND-1000 | |
| RNA quality analysis kit | Agilent | RNA 6000 Nano kit | |
| RNase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | RiboLock | |
| Directional RNA library Prep kit | NEB | Ultra | For Illumina |
References
- Haichar, F. eZ., et al. Plant host habitat and root exudates shape soil bacterial community structure. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 2 (12), 1221-1230 (2008).
- Badri, D. V., Vivanco, J. M. Regulation and function of root exudates. Plant, Cell & Environment. 32 (6), 666-681 (2009).
- Rohrbacher, F., St-Arnaud, M. Root exudation: the ecological driver of hydrocarbon rhizoremediation. Agronomy Journal. 6 (1), 19 (2016).
- Mark, G. L., et al. Transcriptome profiling of bacterial responses to root exudates identifies genes involved in microbe-plant interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17454-17459 (2005).
- Fan, B., et al. Transcriptomic profiling of Bacillus amyloliquefaciens FZB42 in response to maize root exudates. BMC Microbiology. 12 (1), 116 (2012).
- Yoshitomi, K. J., Shann, J. R. Corn (Zea mays L.) root exudates and their impact on 14C-pyrene mineralization. Soil Biology and Biochemistry. 33 (12), 1769-1776 (2001).
- Lambert, M. R. Clover root exudate produces male-biased sex ratios and accelerates male metamorphic timing in wood frogs. Royal Society Open Science. 2 (12), (2015).
- Tuason, M. M. S., Arocena, J. M. Root organic acid exudates and properties of rhizosphere soils of white spruce (Picea glauca) and subalpine fir (Abies lasiocarpa). Canadian Journal of Soil Science. 89 (3), 287-300 (2009).
- Grayston, S. J., Vaughan, D., Jones, D. Rhizosphere carbon flow in trees, in comparison with annual plants: the importance of root exudation and its impact on microbial activity and nutrient availability. Applied Soil Ecology. 5 (1), 29-56 (1997).
- Rovira, A. D. Plant root exudates. Botanical Review. 35 (1), 35-57 (1969).
- Bargabus, R. L., Zidack, N. K., Sherwood, J. E., Jacobsen, B. J. Characterisation of systemic resistance in sugar beet elicited by a non-pathogenic, phyllosphere-colonizing Bacillus mycoides, biological control agent. Physiological and Molecular Plant Pathology. 61 (5), 289-298 (2002).
- Peng, Y. -H., et al. Inhibition of cucumber Pythium damping-off pathogen with zoosporicidal biosurfactants produced by Bacillus mycoides. Journal of Plant Diseases and Protection. 124 (5), 481-491 (2017).
- Ambrosini, A., et al. Diazotrophic bacilli isolated from the sunflower rhizosphere and the potential of Bacillus mycoides B38V as biofertiliser. Annals of Applied Biology. 168 (1), 93-110 (2016).
- de Jong, A., van der Meulen, S., Kuipers, O. P., Kok, J. T-REx: transcriptome analysis webserver for RNA-seq expression data. BMC Genomics. 16 (1), 663 (2015).
- Yi, Y., de Jong, A., Frenzel, E., Kuipers, O. P. Comparative transcriptomics of Bacillus mycoides strains in response to potato-root exudates reveals different genetic adaptation of endophytic and soil isolates. Frontiers in Microbiology. 8, 1487 (2017).
- Nwokeoji, A. O., Kilby, P. M., Portwood, D. E., Dickman, M. J. RNASwift: a rapid, versatile RNA extraction method free from phenol and chloroform. Analytical Biochemistry. 512, 36-46 (2016).
- Ramirez-Gonzalez, R. H., Bonnal, R., Caccamo, M., MacLean, D. Bio-samtools: Ruby bindings for SAMtools, a library for accessing BAM files containing high-throughput sequence alignments. Source Code for Biology and Medicine. 7 (1), 6 (2012).
- Quinlan, A. R. BEDTools: the Swiss-army tool for genome feature analysis. Current Protocols in Bioinformatics. , (2014).
- Boria, I., Boatti, L., Pesole, G., Mignone, F. NGS-trex: next generation sequencing transcriptome profile explorer. BMC Bioinformatics. 14 (7), S10 (2013).
