Summary
فطريات التفحم يسبب الكثير من الأمراض الزراعية المدمرة. أنها مشتتة تيليوسبوريس الخاملة التي تنبت في استجابة لمنبهات بيئية. أننا مخطط طريقتين لتقصي التغيرات الجزيئية أثناء الإنبات: قياس زيادة التنفس للكشف عن التنشيط الأيضي وتقييم الأحداث الجزيئية المتغيرة عن طريق عزل تيليوسبوريس في المراحل المورفولوجية المميزة.
Abstract
فطريات التفحم هي العوامل المسببة للعديد من الأمراض الزراعية المدمرة. أنها تتميز بإنتاج تيليوسبوريس، وعوامل التشتت السميكة. تيليوسبوريس يمكن أن تظل نائمة لعقود. تتميز بانخفاض معدلات التمثيل الغذائي السكون ومؤقتا الحيوي الجزيئات وتقلص إلى حد كبير مستويات التنفس. عند تلقي إشارات البيئية المطلوبة، تنبت تيليوسبوريس لإنتاج خلايا فرداني، الذي يمكن بدء جولات جديدة من العدوى. تيليوسبوري إنبات يتسم باستئناف الحيوي الجزيئات وزيادة التنفس والتغييرات الشكلية المثيرة. من أجل دقة قياس التغيرات في التنفس الخلوي خلال المراحل الأولى من الإنبات، قمنا بتطوير بروتوكول بسيط توظيف ريسبيروميتير كلارك من نوع. وتتميز المراحل اللاحقة للإنبات بالتغييرات الشكلية المحددة، ولكن الإنبات غير متزامنة. قمنا بتطوير تقنية ميكروديسيكشن التي تمكننا من جمع تيليوسبوريس في مراحل إنبات متميزة.
Introduction
تتكون فطريات التفحم (سواديات) 1,600 أكثر الأنواع التي تصيب الحشائش بما في ذلك محاصيل الحبوب الهامة من الذرة والشعير والقمح، مما تسبب ببلايين الدولارات في خسائر في المحاصيل سنوياً1. تتميز هذه الفطريات بإنتاج تيليوسبوريس، الذي يكون مظلم مصطبغة جدران الخلية، وهي عوامل التشتت. تيليوسبوريس تعمل على حماية المواد الجينية أثناء ضغوط تفريق بين النباتات المضيفة، ويمكن أن تستمر في حالة سبات عميق لسنوات2. على هذا النحو، تيليوسبوريس عنصر أساسي في انتشار المرض.
من أجل دراسة البيولوجيا تيليوسبوري، يستخدم مختبرنا فطر التفحم نموذج مايديس Ustilago (U. مايديس)، الذي هو عامل المسببة للمرض 'المشتركة التفحم للذرة'. الناضجة مايديس U. تيليوسبوريس تتميز بالقبض على النمو وانخفاض الأيض الخلوية، والمستويات المنخفضة للتنفس الخلوي3. في الظروف البيئية الملائمة (مثلاً.، وجود السكريات محددة)، تيليوسبوريس مايديس U. تنبت واستكمال الانقسام الاختزالي، تنتج باسيديوسبوريس التي يمكن بدء جولات جديدة من العدوى. الإنبات يتميز بزيادة التنفس والنشاط العودة للتمثيل الغذائي والتقدم من خلال المراحل المورفولوجية يمكن ملاحظتها لإنبات4.
وتشمل المرحلة الأولى من الإنبات زيادة التنفس ووظيفة التمثيل الغذائي، ومع ذلك، لا توجد أية مؤشرات المورفولوجية للتغيير. وأجريت القياسات الأصلية لتغيير الجهاز التنفسي في الولايات المتحدة مايديس قبل 50 عاماً، قياس استهلاك الأوكسجين مانوميتريكالي مع جهاز5قارورة واربورغ. وقد وضعنا طريقة بسيطة وجديدة لدراسة التغييرات الدقيقة في التنفس أثناء الإنبات تيليوسبوري بقياس استهلاك الأوكسجين خلال دورة وقت للإنبات باستخدام ميكروريسبيروميتير كلارك من نوع. استخدمنا هذا الأسلوب سابقا لدراسة التغيرات في معدل التنفس بين البرية من نوع مايديس U. فرداني الخلايا وطفرات مع6من الميتوكوندريا المعيبة، وتكيفت البروتوكول هنا لدراسة التغيرات في التنفس تيليوسبوري أثناء الإنبات. وهذا يوفر وسيلة لتحديد دقة توقيت التغيير التنفس حيث أنه يمكن أن نستهدف تيليوسبوريس بعد بدء الإنبات للتحقيق في الأحداث الجزيئية المبكر في الوقت المناسب. يمكن أن تتبع التقدم لإنبات مجهريا بمجرد بروميسيليا يخرج من تيليوسبوري، ولكن الطبيعة غير متزامن تحول دون عزل ما يكفي تيليوسبوريس في مرحلة معينة للتحقيق. قمنا بتطوير تقنية ميكروديسيكشن مماثلة لتلك المستخدمة للاخصاب في الأنابيب لجمع تيليوسبوريس جسديا في مراحل متميزة المورفولوجية للإنبات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-الذرة الكوز العدوى
- تنمو ميس زيا (عام البنطم الذهبي) حتى يتم تشكيل الكيزان وبدأت الحرير (حوالي 60 يوما).
- الثقافة متوافقة فرداني مايديس U. سلالات تستخدم بروتوكولات قياسية كما سبق وصف7.
- إصابة الكيزان الذرة باستخدام البروتوكولات القياسية كما هو موضح سابقا7.
2-تيليوسبوري الحصاد
- معدات اﻷوتوكﻻف (مداخل [بشنر] وقوارير [بشنر] والخلاطات، 250 مل زجاجات أجهزة الطرد المركزي، وملاعق مسطحة والمياه) باستخدام معيار جافة دورة مع على الأقل 30 دقيقة التعقيم في 121 درجة مئوية (دورة السائلة القياسية للمياه).
- إزالة الكيزان المصابة من النباتات (حوالي 28 – 35 يوما بعد الإصابة) باستخدام الشفرة والكيزان على صينية المشمولة في مقاعد البدلاء حامي.
- إزالة الأورام من الكيزان مع شفرة حلاقة وجمع في كوب.
- ملء كوب خلاط مختبر 250 مل مع الأورام حتى حوالي 1/3 كامل وإضافة يعقم dH2س حتى كأس خلاط هو حوالي 3/4 الكامل. تعطيل الأورام بالنبض الخلاط منخفضة، حتى تجانس.
- قم بتوصيل مضخة فراغ إلى فخ مياه ثم إلى قارورة [بشنر] ل 1.
- إدراج كبيرة [بشنر] القمع قارورة وخط أسفل القمع [بشنر] مع أربع طبقات من القماش القطني.
- قم بتشغيل مضخة فراغ.
- صب جزء من الأورام المتجانس من خلال القماش القطني وكشط مع ملعقة.
- صب بعض dH2س القماش القطني من أجل طرد تيليوسبوريس من خلال.
- كرر حتى dH2س القادمة من خلال القماش القطني واضح.
- انتزاع من القماش القطني يحتوي على مادة الورم المتجانس في عامل التصفية لضمان استرداد الحد الأقصى تيليوسبوري.
- عندما يتم الحصول على قارورة [بشنر] 1 لتر قريبة من كامل وإفراغه في قارورة Erlenmeyer كبيرة ووضعه جانبا.
- وضع قطعة من القماش القطني جديدة في عامل التصفية وكرر الخطوتين (2.7 – 2.12) إلى كل من الأورام تعطلت وتصفيتها.
- صب تيليوسبوريس الذي تم تصفيته في زجاجات يعقم 250 مل الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق، وصب المادة طافية.
- كرر الخطوة 2، 14 حتى هي القريبون كل من تيليوسبوريس التي تمت تصفيتها باستخدام الطرد المركزي.
- تعليق الكريات في كمية صغيرة من الماء ونقلها إلى أنابيب الطرد المركزي 50 مل.
- الطرد المركزي هذه الأنابيب في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق، وصب المادة طافية.
- تعليق بيليه في حوالي 50 مل من dH2س والطرد المركزي هذه الأنابيب في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق، وصب المادة طافية. بلطف كشط قبالة الطبقة العليا رمادي مع البسط والتخلص منه. كرر حتى لم يعد هناك طبقة رمادية في الأعلى.
- جفاف العينات بين عشية وضحاها في مجفف فراغ.
- تخزين تيليوسبوريس المجفف في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
-
إذا رغبت في ذلك، تعامل تيليوسبوريس مع كبريتات النحاس8 قبل الحث على الإنبات. إذا لم تعالج، ثم القيام بتحليل مجهرية من تيليوسبوريس للتأكد من العينة تمثل تيليوسبوريس نقية وخالية من البكتيريا أو الملوثات الأخرى.
- وزنها إلى حوالي 50 مغ تيليوسبوريس في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.
- إضافة حوالي 1.0 مل من 0.75 في المائة خصصت4 إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي الأنبوبة التي تحتوي على تيليوسبوريس. "الماصة؛" صعودا وهبوطاً لتعليق تيليوسبوريس في حل4 CuSO متبوعاً بالتحريض العينة ح 3.
- الطرد المركزي العينة في 2,500 س ز لمدة 5 دقائق وإزالة المادة طافية. ريسوسبيند بيليه تيليوسبوري بالماء المعقم وكرر الطرد المركزي، وإزالة المادة طافية.
- كرر الخطوة 2.21.3 مرتين أخريين.
3-تيليوسبوري الجدوى واختبار الإنبات
- تزن حوالي 10 ملغ تيليوسبوريس مايديس U. في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل لتقييم جدواها وتوقيت الإنبات.
- وفي السلامة الأحيائية مجلس الوزراء، تعد البطاطا الدكستروز مرق (PDB، 24 غرام/لتر) وتستكمل مع ستربتوميسين سلفات (160 ميكروغرام/مل).
- تعليق تيليوسبوريس في 500 ميليلتر من PDB. بلطف "الماصة؛" لخلط وكسر جميع كتل من تيليوسبوريس.
- نقل تعليق تيليوسبوري إلى 250 مل يعقم قارورة Erlenmeyer التي تحتوي على 10 مل من PDB.
- احتضان قارورة عند 28 درجة مئوية تهز 90 لفة في الدقيقة ح 12 – 16.
- في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء، إزالة عينة ميليلتر 20 من تيليوسبوريس التي يسببها للإنبات وإعداد شريحة مجهر.
-
استخدام مجهر، بصريا تقييم مراحل الإنبات الموجودة ووجود التلوث البكتيري.
- حساب عدد تيليوسبوريس في المراحل الأولى من خلال الخامس استخدام هيموسيتوميتير وتحديد النسبة المئوية التي قد نامي.
- إلا إذا كان في المرحلة الأولى تيليوسبوريس موجودة، والاستمرار في احتضان قارورة لمدة 24 ساعة قبل تقييم الإنبات تيليوسبوري. تستمر الحضانة لمدة أقصاها 48 ساعة قبل اعتبار العينة غير قابل للحياة.
- في حالة وجود التلوث البكتيري، تكملة PDB مع كبريتات كاناميسين (50 ميكروغرام/مل) فضلا عن ستربتوميسين سلفات (160 ميكروغرام/مل) وثم كرر الخطوات من 3.1 إلى 3.7. في حالة استمرار التلوث البكتيري، تعامل تيليوسبوريس مع كبريتات النحاس وكرر الخطوات من 3.1 إلى 3.7.
4-تنظيم دورات تعريفية للإنبات لمراقبة التنفس
- وزن كمية متساوية (على سبيل المثال-، 50 مغ) من تيليوسبوريس لكل تجربة التنفس.
- في مجلس الوزراء السلامة الأحيائية، إضافة تيليوسبوريس إلى دائرة تنفس يعقم.
- وتستكمل تعبئة الدائرة مع PDB (24 غرام/لتر) مع ستربتوميسين سلفات (160 ميكروغرام/مل) وسلفات كاناميسين (50 ميكروغرام/مل).
- "الماصة؛" صعودا وهبوطاً لإنشاء تعليق تيليوسبوري.
- ضع غطاء الدائرة في قاعة لإنشاء ختم الهواء ضيقة.
5-الحصول على قياسات معدل (OCR) استهلاك الأكسجين
- مكان الدائرة في الرف الدائرة داخل حمام مائي (يسخن إلى 28 درجة مئوية).
- مكان المسبار2 س داخل فتح الدائرة.
- رصد نقاط البيانات التي تظهر في الوقت الحقيقي في برنامج "سينسورتريس" معدل، واسمحوا المسبار استقرار (~ 3 دقيقة بعد أن يتم وضع التحقيق في الدائرة).
- انقر فوق "إجراء" لقياس مستويات2 س بشكل مستمر ح 6 مع القياسات سجلت فترات s 2.
- وقف القياس، وكرر الخطوات 4، 1 – 5.4 لكل عينة تحليلها.
- تصدير البيانات إلى Microsoft Excel بالنقر فوق "الملف | تصدير | حفظ ك.xls ".
6-بيانات التحليل
-
حساب التعرف الضوئي على الحروف
- في ملف Excel المصدر تحت علامة التبويب "Within_Rates"، سجل "معدل" لكل قياس الدائرة (نمول/h).
- لكل عينة تجريبية، طرح "معدل" دائرة فارغة من "معدل" قاعة العينة التجريبية للحصول على قيمة التعرف الضوئي على الحروف المصوبة، وتأخذ القيمة المطلقة لهذا العدد.
- حساب OCR مجموع كل مغ تيليوسبوريس بقسمة قيمة التعرف الضوئي على الحروف مطلقة تصحيحها الخلوي الشامل المستخدمة.
- معدل تكرار القيم "التعرف الضوئي على الحروف كل مغ تيليوسبوريس" لكل سلالة.
- تحليل البيانات باستخدام الأسلوب الإحصائي المناسب (على سبيل المثال.، الطالب t-الاختبار، وتحليل التباين) باستخدام Microsoft Excel من البرامج الإحصائية الأخرى.
- بيانات raw الرسم البياني، وحساب النسبة المئوية للأكسجين المتبقي لكل نقطة مرة كنت ترغب في إنشاء رسم بياني. تقسيم القراءة الأولى بحد ذاته ضرب 100 (الأكسجين 100% المتبقية)، ثم تقسيم كل قراءة اللاحقة بالقراءة الأولى وضرب 100 للحصول على النسبة المئوية للأكسجين المتبقي في الدائرة.
7-تنظيم دورات تعريفية لإنبات تيليوسبوري لعزل تيليوسبوريس في مراحل متميزة للإنبات
- إعداد PDB (24 غرام/لتر) تستكمل مع ستربتوميسين سلفات (160 ميكروغرام/مل) في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء.
- ضع حوالي 10 ملغ تيليوسبوريس مايديس U. في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.
- تعليق تيليوسبوريس في 500 ميليلتر من PDB. بلطف ماصة مزيج حتى هناك لا كتل من تيليوسبوريس في الأجل المتوسط.
- نقل تعليق تيليوسبوري قارورة Erlenmeyer يعقم 250 مل تتضمن PDB تستكمل مع ستربتوميسين سلفات.
- احتضان قارورة بين عشية وضحاها في 28 درجة مئوية تهز 90 لفة في الدقيقة.
8-إعداد طبق بيتري وميكرومانيبولاتور
-
تحضير طبق بتري (57 سم2) بصفوف بيبيتينج من قطرات لإعداد ميكروكابيلاري، وجمع العينات.
- "الماصة؛" 5 ميليلتر (x 4) dH2س قطرات عبر الجزء العلوي من طبق بيتري.
- "الماصة؛" 2 ميليلتر (x3) من الجيش الملكي النيبالي الاستقرار الحل على طبق بيتري التي ستستخدم لجمع العينات.
- "الماصة؛" 5 ميليلتر (x 30) قطرات من الإنبات تيليوسبوريس على طبق بيتري.
- إضافة 15 مل الزيوت المعدنية إلى طبق بيتري. ضمان شمول جميع قطرات النفط قبل المتابعة.
- إعداد ميكروكابيلاري مع قطرها داخلي 15 ميكرون وشفة 1 مم وطول 55 ملم وزاوية نصيحة 20° قبل وضعها في حامل ميكروكابيلاري وغمر في الزيت المعدني حيث سيسمح عمل شعري الزيوت المعدنية للدخول ميكروكابيلاري. الإفراج عن الضغط في ميكروكابيلاري قبل إعادته إلى قطره الماء. نضح لإعداد ميكروكابيلاري بالماء.
9-عزل تيليوسبوريس الخاصة بمرحلة الإنبات
- استخدام عناصر التحكم ميكرومانيبولاتور، نقل ميكروكابيلاري استعداد لواحدة من قطرات الإنبات. اختراق الحبرية وانخفاض في ميكروكابيلاري وإحضار فم ميكروكابيلاري حتى تيليوسبوري جيرميناتينج في مرحلة إنبات فائدة.
- نضح ببطء للقبض على تيليوسبوري جيرميناتينج. وقف يسفط حالما دخلت تيليوسبوري ميكروكابيلاري. كرر حتى هناك ما يقرب من خمسة تيليوسبوريس في ميكروكابيلاري.
- رفع ميكروكابيلاري مع ميكرومانيبولاتور واحضاره إلى الحبرية جمع من الجيش الملكي النيبالي تثبيت الحل. اختراق الحبرية وتيليوسبوريس بحقن الحبرية.
- كرر الخطوات من 8.1 إلى 8.3 حتى ألقي القبض على تيليوسبوريس 1,000 تقريبا.
10-استرداد مجموعة الحبرية
- "الماصة؛" حتى الحبرية جمع وتحويلها إلى غطاء أنبوب ميكروسينتريفوجي 2.0 مل رناسي/الدناز-مجاناً. بعناية إزالة الزيوت المعدنية مع ماصة دون إزعاج الحبرية جمع.
- استخدم في تيليوسبوريس للتطبيقات المصب مثل عزل الحمض النووي الريبي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام الأسلوب القائم على ميكروريسبيروميتير من نوع كلارك لقياس التغيرات في التنفس أثناء السكون تيليوسبوري وإنبات، أكدنا أن يحمل تيليوسبوريس نائمة على مستوى منخفض من التنفس (~ 1,075 µmol/ح/mg) مقارنة الإنبات تيليوسبوريس (~ 2,614 µmol/ح/ملغ؛ الشكل 1A). وهذا يمثل تغييرا ~2.4-fold في المعدل المتوسط للتنفس بين نائمة تيليوسبوريس وتيليوسبوريس التي دفعت للإنبات. وبالإضافة إلى ذلك، قمنا بتحديد أن تيليوسبوريس التي دفعت على الإنبات بتأخير ~ 45 دقيقة في امتصاص الأكسجين (الشكل 1B). يدل على ذلك التأخير ~ 30 دقيقة في امتصاص الأكسجين (الشكل 1B) بالإضافة إلى التأخير ~ 15 دقيقة بين تنظيم دورات تعريفية للإنبات وبداية قياسات الأكسجين. وهذا يحدد نقطة وقت لبدء تقييم التغيرات الجزيئية في تيليوسبوريس جيرميناتينج التي لا تتغير بشكل واضح.
ويمكن ملاحظة التغييرات اللاحقة أثناء الإنبات مجهريا. وحددت خمس مراحل للإنبات. المرحلة الأولى من الإنبات ويمثل تيليوسبوريس التي دفعت للإنبات ولكن لا تزال لا يمكن تمييزها عن تيليوسبوريس نائمة. المرحلة الثانية تيليوسبوريس قد بروميسيليوم بطول أقل من أو يساوي قطر تيليوسبوري الناشئة. وقد تيليوسبوريس المرحلة الثالثة بروميسيليا التي أكبر من قطر تيليوسبوري. المرحلة الرابعة لإنبات مهدها الأولى من باسيديوسبوريس من بروميسيليا، وهي "المرحلة الخامسة" basidiospores فرداني الناتجة عن تلك الفجوة التي مهدها (الشكل 2). باستخدام تقنية ميكروديسيكشن التي قمنا بتطوير، أننا قد عزلت بنجاح 500 إلى 1,000 الإنبات تيليوسبوريس للتطبيقات المصب مثل عزل الحمض النووي الريبي ل RT-PCR أو الحمض النووي الريبي-Seq (الجدول 1). ويبين الشكل 3 العامة Petri dish على ميكروديسيكشن والخطوات اللازمة لاستخدام ميكرومانيبولاتور ميكروديسيكشن.
رقم 1: الوقت بالطبع من استهلاك الأكسجين أثناء الإنبات تيليوسبوري. تيليوسبوريس نائمة كانت المستحث للإنبات، وسجلت مستويات الأوكسجين باستمرار ح 6 استخدام ميكروريسبيروميتير كلارك من نوع. تيليوسبوريس نائمة غير العمدي واستخدمت كعنصر تحكم، وجرى تطبيع جميع القياسات لنموذج فارغ. (أ) تمثيل البيانات كمتوسط التعرف الضوئي على الحروف. (ب) رسم البيانات الخام للحصول على منحنيات التنفس، تسمح بالكشف عن التغييرات في التعرف الضوئي على الحروف وأثناء الوقت. تيليوسبوريس التي دفعت للإنبات تستهلك الأوكسجين بمعدل متوسط الأضعاف أسرع من تيليوسبوريس نائمة غير العمدي (ف < 0.01؛ الطالب t-اختبار). خنزير: تحريض بعد الإنبات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: مراحل الإنبات تيليوسبوري. مراحل موضحة الأول إلى الخامس لإنبات تيليوسبوري (A–ه). شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: ميكروديسيكشن لعزل المراحل المورفولوجية المميزة للإنبات تيليوسبوريس. ويوضح العام إعداد Petri dish ميكروديسيكشن والخطوات اللازمة لعزل تيليوسبوري في المرحلة الثالثة إنبات. (أ) إعداد الرسم التوضيحي لطبق بيتري مع صفوف من قطرات تحتوي على أما الماء المعقم، حل استقرار الجيش الملكي النيبالي، أو الإنبات تيليوسبوريس. وبعد الإنبات التعريفي، تيليوسبوريس كانت معزولة في مراحل معينة من الإنبات باستخدام ميكروديسيكشن. (ب) الحبرية الإنبات تحتوي على فعل على الإنبات تيليوسبوريس في مراحل الأول إلى الثالث. (ج) طرح استعداد ميكروكابيلاري إلى تيليوسبوري "المرحلة الثالثة" للمجموعة عن طريق الاستنشاق. (د) "المرحلة الثالثة" تيليوسبوري في ميكروكابيلاري زجاج إزالتها من الحبرية الإنبات وانتقلت إلى معالجة تجميعية جمع. (ه) ميكروكابيلاري تم إدراجه في حل الاستقرار الرنا تحتوي على جمع الحبرية وتم حقن تيليوسبوري "المرحلة الثالثة" في الحبرية. (و) مجموعة من تيليوسبوريس "المرحلة الثالثة" في حل استقرار الجيش الملكي النيبالي. شريط المقياس = 20 ميكرومتر (أ-د، و) و 50 ميكرون (ه). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| مرحلة الإنبات | عدد تيليوسبوريس الإنبات معزولة |
| في المرحلة الأولى | 1,000 |
| المرحلة الثانية | 500 |
| المرحلة الثالثة | 650 |
الجدول 1: عدد تيليوسبوريس الإنبات معزولة بنجاح لكل مرحلة من مراحل الإنبات في تجربة عزلة قياسية. الجدول يوضح متوسط عدد تيليوسبوريس التي تم عزلها باستخدام ميكروديسيكشن للمراحل الأول إلى الثالث قبل جمع طلبات المتلقين للمعلومات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مسببات الأمراض النباتية بيوتروفيك باسيديوميسيتي تسبب مليارات الدولارات في خسائر في المحاصيل سنوياً. الغالبية العظمى من هذه الجراثيم تنتج تيليوسبوريس التي جزء لا يتجزأ من تشتت الفطرية والتكاثر الجنسي. اكتساب المعرفة التنمية وإنبات تيليوسبوريس أمر بالغ الأهمية لفهم انتشار الأمراض المدمرة الناجمة عن هذه الفطريات. من أجل التعرف على التغيرات الجزيئية في نقاط المراقبة الرئيسية وضعنا طريقة لتحديد توقيت التحولات الفسيولوجية وآخر لعزل تيليوسبوريس في مراحل متميزة للإنبات. سيتو et al. (غير منشورة) أشار إلى خمس مراحل الإنبات تيليوسبوري بالفحص المجهري الخفيفة (الشكل 2). من أجل التحقيق في تفعيل الفسيولوجية خلال المرحلة الأولى وتقييم معدل التنفس أثناء الإنبات، استخدمنا ميكروريسبيروميتير كلارك من نوع بدقة لقياس التغيرات في استهلاك الأوكسجين. لدينا نموذج بيانات تشير إلى أن لدينا أسلوب دقيق واستنساخه بدرجة عالية. وتؤكد النتائج التي توصلنا إليها أن الإنبات مايديس U. تيليوسبوريس المعرض زيادة كبيرة في التنفس الخلوي تيليوسبوريس نائمة غير العمدي بالمقارنة. لقد حددنا للمرة الأولى، أن يحمل تيليوسبوريس مايديس الولايات المتحدة التي دفعت للإنبات تأخير ~ 45 دقيقة في امتصاص الأكسجين. وهذا يوحي بأن تيليوسبوريس مايديس U. قد تحتاج إلى بعض الوقت لمعالجة الإشارات الإنبات (مثلاً.، وجود السكريات) قبل الرد، أن امتصاص الأكسجين زيادة ليست من بين الاستجابات العاجلة جداً لإنبات إشارات أو أن لم يكن لدينا المقايسة حساسة بما يكفي للكشف عن تغيير طفيف في امتصاص الأكسجين الأولية.
المستويات السابقة الدراسات دراسة معدلات التنفس تيليوسبوريس التفحم3 تعتمد على جهاز قارورة واربورغ لقياس الأوكسجين مانوميتريكالي5. باختصار، هذا الأسلوب تدابير CO2 إنتاج واستهلاك الأوكسجين عن طريق الكشف عن التغييرات في الضغط في قارورة مغلقة من خلال المراقبة المباشرة للتغييرات على مستوى السائل في الذراع لكنها. هذه التجارب يمكن أن تكون صعبة لإعداد، ويمكن أن تكون القياسات غير دقيقة. يجب أن يحضر الجهاز طوال فترة القياس، وواسعة النطاق من العمليات الحسابية المطلوبة لتقدير التعرف الضوئي على الحروف. لدينا بروتوكول يجعل استخدام التقدم التكنولوجي، وإلغاء الشرط للمستخدم أن يبقى الجهاز خلال مدة التجربة، أخذ قياسات بالعين، واستخدام الصيغ الرياضية الواسعة. آخرين استخدمت المبكر كلارك من نوع ريسبيروميتيرس إلى تدبير التعرف الضوئي على الحروف crassa نيوروسبورا9 و10 ثيوبروماي بوتريودبيلودياجراثيم، بيد أن هذه الصكوك المبكر يسمح قياسات مستمرة لمدة أقصاها 20 دقيقة. هذا القيد لم يسمح تحديد التأخير ~ 45 دقيقة في امتصاص الأكسجين لاحظنا مع ريسبيروميتير النموذج الأحدث. لدينا بروتوكول جعلت تفسير البيانات أسهل، كما قراءات هو تركيز الأكسجين المتبقي في الدائرة، التي يمكن رسوم بيانية مباشرة دون أي تلاعب في الحسابات أو البيانات. وباﻹضافة إلى ذلك، فمن الممكن لأخذ قياسات مستمرة (كل 2 ثانية) لمدة زمنية غير محددة من الوقت حتى تماما هو استنزاف الأوكسجين المتاحة. وهذا يسمح الكشف عن التغيرات الصغيرة في التنفس لفترة طويلة من الزمن. لذلك، لدينا تحسين التقنيات السابقة ووضعت طريقة بسيطة ودقيقة، واستنساخه لقياس استهلاك الأوكسجين من الجراثيم الفطرية. على حد علمنا، هذا هو أول دراسة لاستخدام ريسبيروميتير من نوع كلارك حديثة لدراسة التنفس من سبات مقابل الإنبات تيليوسبوريس فطريات التفحم.
وعلى الرغم من السهولة والبساطة في هذا البروتوكول، الأمثل المطلوب وهناك الحقائق البيولوجية التي تقتصر التحليل. يجب تحديد حجم العينة الأولى، ومناسبة لتحقيق Ocr معقولة. عينة أكثر من اللازم يمكن أن يؤدي إلى تحطمها قبل الأوان من مستويات الأوكسجين، وعينه صغيرة جداً يمكن أن يؤدي عدم القدرة على مراقبة تغييرات ذات مغزى في استهلاك الأوكسجين. ثانيا، من الضروري إتاحة الوقت مسبار لاستقرار (~ 3 دقيقة) لتوفير البيانات الأولية الدقيقة. وأخيراً، من المهم أن تكمل المتوسطة الإنبات مع وكلاء المضادة للبكتيريا (على سبيل المثال-، ستربتوميسين سلفات) ضمانا للتلوث البكتيري لا يغير من القراءات التعرف الضوئي على الحروف. وكانت القيود البيولوجية التي واجهناها بمعدل إنبات منخفضة القياس، (~ 1%) كما هو محدد بمراقبة التغييرات الشكلية البصرية على مدى الزمن. تحديد صلاحية بوغ سيسمح هذا التصميم المعدل ليتم تحويلها إلى معدل كل رقم بوغ وعزل تيليوسبوريس مع معدلات أعلى للإنبات سيؤدي إلى ارتفاع Ocr. الإنبات غير متزامنة من مايديس U. تيليوسبوريس11 حقيقة واقعة يجب أن تحسب وقد ساهمت في عدم قدرة على الكشف عن استهلاك الأكسجين في وقت سابق في الإنبات.
ويمكن أن تشمل التعديلات المقبلة لهذا الأسلوب من أجل تحسين دقة والدقة لقياس التغيرات في التنفس تيليوسبوري، قياس التعرف الضوئي على الحروف على أساس خلية واحدة. ويمكن استخدام تقنيات ميكرومانيبوليشن لعزل تيليوسبوري واحد، يمكن رصد الذي يمكن أن يستحث على الإنبات، ومعدل التنفس. يمكن تحسين هذا القرار بتوفير المعلومات المتعلقة بالتعرف الضوئي على الحروف أثناء التحول السكون-إنبات كل تيليوسبوري وليس كل مغ من تيليوسبوريس. وبالإضافة إلى ذلك، هذا أن حل مسألة التباس الإنبات غير متزامن.
مراحل لاحقة من الإنبات، قمنا بتطوير أسلوب ميكرومانيبوليشن لعزل تيليوسبوريس في مراحل مشتركة للإنبات. وهذا أتاح للسكان تيليوسبوري متزامن نسبيا لتحليل. وقد وصف أساليب مختلفة لعزل الكائنات الدقيقة وحيدة وتحسنت على مر السنين12. وتشمل هذه الأساليب تخفيف المعلقات بوغ للحصول على واحد الكائنات المجهرية، أساليب شبه الميكانيكية باستخدام ميكروكابيلاريس للحصول على الجراثيم التي يتم نقلها إلى المتوسطة لأساليب تثقيف، والميكانيكية التي تستخدم ميكرومانيبولاتورس . وتشمل الأساليب السابقة التي استخدمت للحصول على تيليوسبوريس في نفس المرحلة من الإنبات الوترييشن الطرد المركزي كونتيرفلوو وتصفية تيليوسبوريس الإنبات عن طريق غشاء نايلون مع حجم مسام محددة. استخدام هذه الأساليب سمح لنا لإثراء للإنبات تيليوسبوريس، ومع ذلك، لدينا عينات لا يزال يتضمن تيليوسبوريس في مختلف مراحل إنبات13. وتحسنت التكنولوجيا الحالية ميكرومانيبوليشن من الكائنات المجهرية وحيدة مع الأخذ بأعلى التكبير وأجهزة لمراقبة غرامة الإبر الشعرية والتطلع، ونقل الكائنات المجهرية. تقنيات ميكرومانيبوليشن السابقة ركزت على عزل الخلايا المفردة لاستزراع أو للاستخدام في تطبيقات PCR خلية مفردة14. استخدام ميكرومانيبولاتورس لعزل جراثيم فطرية واحدة لم يثبت سابقا. أسلوب سابقة لعزل الجراثيم الفطرية واحد ينطوي على استخدام الملقط غرامة أو الإبر لالتقاط القطع الصغيرة من المتوسطة الصلبة التي تحتوي على جراثيم الإنبات15. ميكرومانيبوليشن باستخدام ميكرومانيبولاتورس يستخدم على نطاق واسع في الدراسات الخميرة التي يمكن فيها مجموعات من ascospores تبوغ التالية المنفصلين عن ذويهم في الثقافة في المتوسط أجار للتحليل الجيني هو16. وقد وضعنا أسلوب الذي يجمع بين تقنية ميكرومانيبوليشن للخلايا البكتيرية14 وأساليب الإخصاب في المختبر لعزل تيليوسبوريس الإنبات. وقد أظهرنا أن مئات تيليوسبوريس مرحلة الإنبات مشتركة يمكن الحصول عليها بهذا الأسلوب. يمكن استخدام هذه العينات لدراسات التعبير المتلقين للمعلومات باستخدام تقنيات مثل الرايت قبكر أو الحمض النووي الريبي-يليها الحصول على عدد أن تيليوسبوريس التي تتم مزامنة إنبات يسمح تحليل التغيرات المحددة في التعبير الجيني الذي يحدث أثناء وقت مبكر، مراحل الإنبات تيليوسبوري منتصف والإصدارات الأحدث.
ميكروديسيكشن لمرحلة محددة من الإنبات تيليوسبوريس قد تتطلب خبرة في مجموعة أعلى والاعتراف بمختلف مراحل الإنبات، غير أن هذه التجربة يمكن الحصول عليها بسرعة من خلال الممارسة. وهناك العديد من الخطوات التي يجب اتباعها لنجاح ميكروديسيكشن متبوعاً بعزل الحمض النووي الريبي. أولاً، يجب أن تستكمل متوسطة الإنبات بالمضادات الحيوية (مثلاً.، ستربتوميسين سلفات) لقمع نمو التلوث البكتيري عند بدء الإنبات وكذلك أثناء جمع الإنبات تيليوسبوريس. ثانيا، من المهم أن استخدام حل استقرار لتحقيق الاستقرار وحماية الحمض النووي الريبي للعزلة. كما يمنع الحل استقرار الجيش الملكي النيبالي تيليوسبوريس التي تم جمعها من يتقدم إلى مرحلة الإنبات القادم حين جمع تيليوسبوريس إضافية. وثالثاً، من المهم لإزالة الزيوت المعدنية مرة واحدة وقد تم انتشال الحبرية جمع لضمان نجاح استخراج الحمض النووي الريبي. وأخيراً، أننا لاحظنا فقدان بعض من جودة الجيش الملكي النيبالي إذا تم تخزين تيليوسبوريس معزولة في الجيش الملكي النيبالي تثبيت الحل لفترة ممتدة من الوقت؛ لذلك، من المستحسن أن الجيش الملكي النيبالي عزلة فورا عقب مجموعة من مرحلة الإنبات تيليوسبوريس محددة. تحديد الأسلوب هو أن المرحلة التي أنا يمكن أن تحتوي على تيليوسبوريس التي تم جمعها نائمة وميتة، والمحرض على الإنبات تيليوسبوريس كهذه المراحل الثلاث لا يمكن تمييزها شكلياً. وبالإضافة إلى ذلك، عند جمع تيليوسبوريس "المرحلة الثالثة"، هي مزيج تيليوسبوريس في الانقسام الاختزالي الأول أو الانقسام الاختزالي الثاني يمكن الحصول على. يمكن أن تكون إحدى الطرق للمساعدة في التمييز بين تيليوسبوريس نائمة والميت حقاً لتحديد صلاحية العينة. قد تكون طريقة لتقييم جدوى بوغ الفطرية باستخدام فحوصات سلامة خلية يعيش الميت قادراً على تقييم النسبة المئوية لصالحه تيليوسبوريس التي يمكن أن تكون أكثر إفادة إنبات معدلات العزم17. وباﻹضافة إلى ذلك، نواة تلطيخ مع DAPI، على سبيل المثال، يمكن أن تصور أحداث الانقسام التي تحدث أثناء "المرحلة الثالثة" والانتقال إلى "المرحلة الرابعة" من أجل مواصلة تميز تيليوسبوريس شكلياً في "المرحلة الثالثة". وهذا سيساعد في جمع تيليوسبوريس في مرحلة واحدة فقط من الإنبات عند استخدام الأسلوب ميكروديسيكشن لدينا.
وفي الختام، قمنا بتطوير طريقة بسيطة ودقيقة واستنساخه لقياس التغيرات التي تحدث أثناء تحول السكون-إنبات مايديس Ustilago تيليوسبوريس في التنفس الخلوي. وبالإضافة إلى ذلك، قمنا بتطوير طريقة لجمع المراحل المحددة للإنبات تيليوسبوريس التي يمكن أن تستخدم للتطبيقات المتلقين للمعلومات، مثل الحمض النووي الريبي-ما يليها أساليب عملنا ويمكن تكييفها لاستيعاب مختلف أنواع الخلايا والأنواع. ونحن نتوقع أن إدخال تحسينات على تقنيات لدينا سوف تيسير الكشف عن تغيرات الجهاز التنفسي على بوغ وحيدة المستوى، فضلا عن مواصلة تحديد الأحداث التي تحدث في مراحل لاحقة من الإنبات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا يوجد تضارب المصالح المالية أو تضارب المصالح الأخرى بالكشف عن.
Acknowledgments
ونود أن نشكر الدكتور بول فروست للاستخدام في بلده ميكروريسبيروميتير، ونيكول فاغنر وأليكس بيل للمساعدة التقنية. تم تمويل هذا العمل من خلال منحة مقدمة إلى B.J.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptomycin Sulfate | BioShop | STP101 | |
| Kanamycin Sulfate | BioShop | KAN201 | |
| Potato Dextrose Broth | BD Difco | 254920 | |
| 1 L Waring Laboratory blender | Waring | 7011S | |
| Cheesecloth | VWR | 470150-438 | |
| Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock | ThermoFisher Scientific | 5310-0250 | |
| Unisense MicroRespiration system | |||
| MicroRespiration Sensor (O2) | Unisense | OX10 | |
| MicroOptode Meter Amplifier | Unisense | N/A | |
| MR-Ch Small | Unisense | MR-Ch | |
| SensorTrace Rate Software | Unisense | N/A | |
| MicroRespiration Rack | Unisense | MR2-Rack | |
| MicroRespiration Stirrer | Unisense | MR2-Co | |
| Microdissection system | |||
| Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope | Zeiss | ||
| Coarse Manipulator | Narishige | MMN-1 | |
| Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-202ND | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| TransferTip (ES) | Eppendorf | 5175107004 |
References
- Saville, B. J., Donaldson, M. E., Doyle, C. E. Meiosis - Molecular Mechanisms and Cytogenetic Diversity. Swan, A. , InTech. 411-460 (2012).
- Christensen, J. J. Monograph Number 2. , The American Phytopathological Society. Worcester, MA. (1963).
- Caltrider, P. D., Gottlieb, D. Respiratory activity and enzymes for glucose catabolism in fungal spores. Phytopathology. 53, 1021-1030 (1963).
- Allen, P. J. Metabolic aspects of spore germination in fungi. Ann. Rev. Phytopathol. 3, 313-342 (1965).
- Warburg, O. Metabolism of tumours. Biochemische Zeitschrift. 142, 317-333 (1923).
- Ostrowski, L. A., Saville, B. J. Natural antisense transcripts are linked to the modulation of mitochondrial function and teliospore dormancy in Ustilago maydis. Mol Microbiol. 103 (5), 745-763 (2017).
- Morrison, E. N., Donaldson, M. E., Saville, B. J. Identification and analysis of genes expressed in the Ustilago maydis dikaryon: uncovering a novel class of pathogenesis genes. Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 34 (3), 417-435 (2012).
- Doyle, C. E., Cheung, H. Y. K., Spence, K. L., Saville, B. J. Unh1, an Ustilago maydis Ndt80-like protein, controls completion of tumor maturation, teliospore development, and meiosis. Fungal Genetics and Biology. 94, 54-68 (2016).
- Stade, S., Brambl, R. Mitochondrial biogenesis during fungal spore germination: respiration and cytochrome c oxidase in Neurospora crassa. J Bacteriol. 147 (3), 757-767 (1981).
- Brambl, R. Characteristics of developing mitochondrial genetic and respiratory functions in germinating fungal spores. Biochim Biophys Acta. 396 (2), 175-186 (1975).
- Sacadura, N. T., Saville, B. J. Gene expression and EST analyses of Ustilago maydis germinating teliospores. Fungal Genet Biol. 40 (1), 47-64 (2003).
- Hilderbrand, E. M. Techniques for the isolation of single microorganisms. Botanical Review. 4 (12), 38 (1938).
- Seto, A. M. Analysis of gene transcripts during Ustilago maydis teliospore dormancy and germination. , Trent University. M.Sc. thesis (2013).
- Fröhlich, J., König, H. Soil Biology - Intestinal Microorganisms of Termites and Other Invertebrates. König, H., Varma, A. , Springer. 425-437 (2006).
- Choi, Y., Hyde, K., Ho, W. Single spore isolation of fungi. Fungal Diversity. 3, 11 (1999).
- Sherman, F. Getting started with yeast. Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Pt B. 350, 3-41 (2002).
- Chen, Y., Seguin-Swartz, G. A rapid method for assessing the viability of fungal spores. Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 24 (2), 230-232 (2002).
