Summary
クロボ菌類は、壊滅的な農業の多くの病気を引き起こします。彼らは環境のキューに応答で発芽休眠の寄主として分散しています。発芽過程における分子の変化を調査する 2 つの方法の概要を説明: 呼吸増加代謝活性化を検出するための測定と形態学的段階に寄主を分離することによって変化する分子イベントを評価します。
Abstract
クロボ菌類は、いくつかの壊滅的な農業病気の病因のエージェントです。彼らは肉厚分散エージェントである寄主の生産によって特徴付けられます。寄主は、何十年も休眠することができます。休眠は、低代謝率によって特徴付けられる、高分子生合成を一時停止し、呼吸のレベルを大幅に削減します。必要な環境シグナルを受け取ったら、寄主は感染症の新ラウンドを開始することができます半数体の細胞を生産する発芽します。冬の発芽は、高分子合成、高められた呼吸および劇的な形態学的変化の再開によって特徴付けられます。発芽の初期段階中に細胞呼吸の変化を正確に測定、するためにクラーク型呼吸度計を用いた単純なプロトコルを開発しました。発芽の後の段階は特定の形態学的変化によって区別されますが、発芽は非同期です。我々 は異なる発芽段階で寄主を収集するために私たちができる顕微解剖技術を開発しました。
Introduction
黒穂病菌 (Ustilaginales) から成っている牧草、トウモロコシ、大麦、小麦の重要な穀物を含む作物の損失のドルの十億を引き起こす感染以上 1,600 種年間1。これらの菌は、寄主細胞壁を発色が暗く、散布剤の生産によって特徴付けられます。寄主はホスト植物の間分散のストレスの中に遺伝物質を保護するために機能し、2年間休止状態で保持できます。そのため、寄主は病気の広がりの重要なコンポーネントです。
冬の生物学を研究するためには、当研究室は、モデル黒穂病菌経路(米国アルテリシジン) 'トウモロコシの共通黒穂病' 病気の原因物質であるを利用しています。成熟した米国アルテリシジン寄主は増殖停止、減らされた細胞の代謝と細胞呼吸3の低レベルによって特徴付けられます。有利な環境条件 (e.g。、特定の糖の存在)、米国アルテリシジン寄主が発芽し、減数分裂、生産担子胞子による感染症の新ラウンドを開始することができますこれを完了。発芽は、高められた呼吸、代謝に戻り活動、発芽4の観察可能な形態学的段階を経て進行が特徴です。
発芽の初期段階に高められた呼吸と代謝機能が含まれています、ただし、変更の形態学的兆候がないです。米国アルテリシジンの呼吸の変化の元の測定は Warburg フラスコ装置5マノメーターで高い酸素消費を測定 50 年以上前に行われました。クラーク型 microrespirometer を使用して発芽の時間経過とともに酸素消費量を測定することによって冬発芽時における呼吸の正確な変化を研究する新しい、シンプルな方法を行った。野生型の呼吸速度の変化を研究するこのメソッドが以前米菌細胞の倍加と不良ミトコンドリア6、変異体中に冬の呼吸速度の変化を勉強するここのプロトコルを適応していると発芽。これは早い分子でき事を調査するため発芽開始後の適切な時期に寄主を対象することができますようにする呼吸の変更のタイミングを正確に識別できる手段を提供します。一度、冬から、promycelia が出てくるが、非同期の性質は調査の特定の段階で十分な寄主の分離を抑制、発芽の進行は顕微鏡的続くことができます。我々 は、物理的に発芽の形態学的段階で寄主を収集する体外受精に使用するものと同様レーザーマイクロダイ セクション技術を開発しました。
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Protocol
1. トウモロコシ穂軸感染
- トウモロコシ(品種黄金のバンタム) の成長まで、穂軸が形成され、シルク (約 60 日) を開始しています。
- 互換性のある半数米アルテリシジンの文化系統の前述の標準プロトコルを使用して説明7。
- 前述7として標準プロトコルを使ってトウモロコシの穂軸に感染します。
2. 冬の収穫
- オートクレーブ装置 (ファンネルを Büchner、フラスコを Büchner、ミキサー、遠心瓶 250 mL、フラットのへら、水) 121 ° C (標準的な水の液体のサイクル) で少なくとも 30 分滅菌のサイクル乾燥標準を使用して。
- かみそりを使用して植物 (約 28-35 日ポスト感染) から感染したコブを削除し、ベンチ プロテクターで覆われているトレイに穂軸を設定します。
- かみそりの刃で穂軸から腫瘍を削除し、ビーカーに収集します。
- 腫の約 1/3 フルまで 250 mL 研究所ブレンダー カップを埋めるし、ブレンダー カップが約 3/4 までオートクレーブ dH2O を追加検討します。腫瘍が均質になるまで低速、ミキサーをパルスで中断されます。
- 水トラップを放置して 1 L 吸引ビンは、真空ポンプを接続します。
- フラスコを Büchner の大きい漏斗を挿入し、寒冷紗の 4 つの層を Büchner じょうごの底を並べ。
- 真空ポンプをオンにします。
- ヘラで寒冷紗とこすりを通じて均質化腫瘍の部分を注ぐ。
- 寄主をフラッシュするために、寒冷紗にいくつか dH2O を注ぐ。
- DH2まで繰り返し、寒冷紗を通って来る O は、明らかです。
- 最大冬復旧できるようにフィルターに均質化腫瘍物質を含む寒冷紗を絞る。
- 1 L 吸引ビンが近くなっている場合完全な大きなエルレンマイヤー フラスコに空、脇に置いておきます。
- 寒冷紗の新しい作品を入れて、フィルターと腫瘍のすべてが破壊されているし、フィルターまで (2.7-2.12) の手順を繰り返します。
- フィルター処理された寄主を注ぎオートクレーブ 250 ml 遠心分離機、1,000 x g で 5 分間遠心し、上清をデカントします。
- 遠心分離によってペレットすべてフィルター処理された寄主のされるまで、手順 2.14.
- 少量の水と 50 mL 遠沈管への転送でペレットを中断します。
- 5 分、1,000 x g でチューブを遠心し、上清をデカントします。
- DH2O の約 50 mL にペレットを中断、5 分、1,000 x g でチューブを遠心し、上清をデカントします。優しくへらと処分灰色のトップ層をこすり。上はグレーのレイヤーがされなくなるまでを繰り返します。
- 乾燥試料は真空デシケータで一夜します。
- 使用するまで 4 ° C で乾燥した寄主を格納します。
-
必要な場合は、発芽に誘導する前に硫酸銅8寄主を扱います。扱われていない場合は、細菌や他の汚染を欠いている、純粋な寄主を表すサンプルを確認する寄主の徹底的な顕微解析を実行します。
- 50 mg を約 1.5 mL 遠心チューブに寄主を重量を量る。
- 寄主を含む 1.5 mL 遠心チューブに 0.75% CuSO4の約 1.0 mL を追加します。ピペットの上下の攪拌 3 h のサンプルに続いて CuSO4ソリューション、寄主を中断します。
- 5 分間 2,500 x g でサンプルを遠心し、上清を除去します。滅菌水で冬のペレットを再懸濁します、遠心分離を繰り返し、上澄みを除去します。
- 2.21.3 のステップを 2 回繰り返します。
3. 冬の生存率及び発芽試験
- 彼らの生存率を評価するために 1.5 mL 遠心チューブに米国アルテリシジン寄主の約 10 mg と発芽のタイミングを重量を量る。
- バイオ セーフティ キャビネット、ストレプトマイシン硫酸塩 (160 μ g/mL) を添加したジャガイモ デキスト ロース スープ (PDB、24 g/L) を準備します。
- PDB の 500 μ L で、寄主を中断します。優しくのピペットをミックスし、寄主のすべての塊を破る。
- 冬のペンションをオートクレーブ 250 mL PDB の 10 ml 三角フラスコに転送します。
- 28 ° c 12-16 h 90 rpm で振盪フラスコを孵化させなさい。
- バイオ セーフティ キャビネット、発芽し、顕微鏡スライドを準備する誘導寄主の 20 μ L のサンプルを削除します。
-
顕微鏡を使用して、存在している発芽の段階と細菌汚染の有無を視覚的に評価します。
- 寄主の数を数える V 診断の使用を行うし、発芽率を決定します。
- 場合にのみステージ I 寄主が存在、冬発芽を評価する前に 24 時間の合計はフラスコをインキュベートし続けます。非実行可能なサンプルを認める前に最大 48 時間の培養を続けます。
- 細菌汚染が存在する場合ストレプトマイシン硫酸塩 (160 μ g/mL)、硫酸カナマイシン (50 μ g/mL) PDB を補完し、手順 3.1 から 3.7。細菌汚染が解決しない場合、硫酸銅と寄主を扱う、手順 3.1 から 3.7.
4. 呼吸を監視するため発芽の誘導
- 同量の重量を量る (e.g。、50 mg) 各呼吸実験の寄主の。
- バイオ セーフティ キャビネット、寄主をオートクレーブ呼吸室に追加します。
- ストレプトマイシン硫酸塩 (160 μ g/mL) とカナマイシン硫酸塩 (50 μ g/mL) 塗りつぶし PDB (24 g/L) とチャンバーが補われます。
- 上下のピペット冬の懸濁液を作成します。
- 気密のシールを作成する商工会議所の商工会議所のふたを配置します。
5. 酸素消費率 (OCR) 測定値を得る
- 商工会議所ラック (28 ° C に予熱) 水浴中でチャンバーを配置します。
- オープニングの中商工会議所の O2プローブを配置します。
- 「SensorTrace レート」プログラム上でリアルタイムに表示されるデータ ポイントを監視し、、プローブが (~ 3 分商工会議所にプローブを配置後) を安定化します。
- 2 秒間隔で記録した測定値と 6 時間の継続的に O2レベルを測定する「測定」をクリックします。
- 測定を停止し、各サンプルを分析するための手順 4.1-5.4 を繰り返します。
- クリックして、データを Microsoft Excel にエクスポート"ファイル |エクスポート |.Xls として保存"。
6. データの分析
-
OCR を計算します。
- エクスポートされた Excel ファイル"Within_Rates"タブの下でそれぞれの商工会議所の測定 (nmol/h)「率」を記録します。
- 各実験のサンプルでは、空白のチャンバー修正された OCR 値を取得するに実験試料室の「率」からの「率」を減算し、この数値の絶対値を取る。
- 質量使用携帯修正絶対 OCR 値で除算して寄主の mg 当たり合計 OCR を計算します。
- 平均は、各系統の"寄主の mg 当たり OCR"値をレプリケートします。
- 適切な統計的手法を用いたデータ分析 (e.g。、スチューデントのt-テスト、分散分析) 他の統計ソフトウェアの Microsoft Excel を使用して。
- 生データをグラフ化、グラフ化したい場合は、各時点の残存酸素の割合を計算します。単独で最初の読書を分割 (100% 酸素残存) 100 倍、各後続の読み取りの最初の読書、除算し、100 倍チャンバ内酸素の割合を取得します。
7. 冬発芽発芽の段階で寄主を分離するための誘導
- バイオ セーフティ キャビネットのストレプトマイシン硫酸塩 (160 μ g/mL) を添加した PDB (24 g/L) を準備します。
- 1.5 mL 遠心チューブに米国アルテリシジン寄主の約 10 mg を配置します。
- PDB の 500 μ L で、寄主を中断します。優しくピペット培地で寄主の塊がなくなるまで混ぜます。
- 冬サスペンションを含む PDB ストレプトマイシン硫酸塩を添加したオートクレーブ 250 mL 三角フラスコに転送します。
- 一晩で 28 ° C 90 rpm で振動フラスコを孵化させなさい。
8. シャーレおよびマイクロマニピュレーターの準備
-
マイクロキャピ ラリーの準備、およびサンプル コレクションの液滴行数のピペッティングしてシャーレ (57 cm2) を準備します。
- ペトリ皿の上部に 5 μ L (x 4) dH2O 液滴をピペットします。
- 2 μ L (x3) サンプル コレクションに使用するシャーレに RNA 安定化溶液をピペットします。
- ペトリ皿に寄主を発芽 5 (30) x μ L 水滴をピペットします。
- 鉱物油の 15 mL をシャーレに追加します。すべての液滴が進む前に油で覆われていることを確認します。
- マイクロキャピ ラリー ホルダーにそれを置き、鉱物油に水没して毛細管は、マイクロキャピ ラリーを入力する鉱物油になります 15 μ m の内径、1 mm フランジ、55 ミリメートルの長さ、20 ° の先端角とマイクロキャピ ラリーを準備します。水液滴に持ち込む前に、マイクロキャピ ラリー内の圧力のリリースです。吸引水でマイクロキャピ ラリーを準備します。
9. ステージ固有の発芽の寄主の分離
- 発芽粒のいずれかに準備マイクロキャピ ラリーを移動マニピュレーターのコントロールを使用する。液滴を浸透、マイクロキャピ ラリーを下げ、関心の発芽の段階で発芽冬までマイクロキャピ ラリーの口をもたらします。
- ゆっくりと発芽の冬をキャプチャする吸引します。一度、冬を迎えて、マイクロキャピ ラリーを吸引を停止します。繰り返して、マイクロキャピ ラリーを約 5 寄主があります。
- マニピュレーターにマイクロキャピ ラリーを上げるし、RNA 安定化ソリューションのコレクション液滴にそれをもたらします。液滴を浸透し、寄主の液滴を注入します。
- 約 1,000 の寄主がキャプチャされるまで 8.1 に 8.3 の手順を繰り返します。
10 コレクション液滴の回収
- コレクション液滴をピペットし、RNase 空き DNase の 2.0 mL 遠心チューブの蓋に転送。コレクション液滴を乱すことがなく、ピペットと鉱物油を慎重に取り外します。
- RNA の隔離など下流用、寄主を使用します。
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Representative Results
休眠寄主が呼吸 (1,075 ~ µmol/h/mg) 発芽と比較しての低レベルを示すことを確認した冬の休眠および発芽における呼吸速度の変化を測定するクラーク型 microrespirometer ベース メソッドを使用して、寄主 (2,614 ~ µmol/h/mg;図 1 a)。これは、休眠寄主と発芽を誘導されて寄主の呼吸率は平均で ~2.4-fold 変更を表します。さらに、発芽に誘導されている寄主酸素摂取量 (図 1 b) の ~ 45 分遅れがあることを同定しました。これは発芽の誘導と酸素測定の開始と 〜 15 分遅れに加えて酸素摂取量 (図 1 b) ~ 30 分遅れで示されます。これは、目に見えて変化がない発芽寄主の分子変更の評価を開始する時点を指定します。
発芽中にそれ以降の変更は顕微鏡で観察することができます。発芽の 5 つのステージが決定しました。発芽が休眠寄主から区別がつかないまま誘導されて発芽表します寄主のステージします。ステージ II 寄主新興が未満か、冬の直径に等しい長さと promycelium があります。ステージ III 寄主がある冬の直径より大きい promycelia。発芽の段階 IV は、promycelia から担子胞子の初期の出芽とステージ V が新進で除算結果半数性担子胞子 (図 2)。私たちが開発したレーザーマイクロダイ セクション法を使用して、1,000 に 500 RT-PCR または RNA シーケンス (表 1) のための RNA の隔離など下流用発芽寄主を正常に分離しています。図 3は、レーザーマイクロダイ セクションの Petri dish ・ マイクロダイ セクション マニュピュレーターを使用しての手順一般的なセットを示します。
図 1: 冬発芽時の酸素消費量の経時変化します。休眠寄主が発芽に誘導された、酸素レベルはクラーク型 microrespirometer を使用して 6 時間継続的に記録されました。非誘導の休眠寄主はコントロールとして使用され、すべての測定値は、空白のサンプルを正規化されました。(A)データは、平均 OCR として表されます。(B)呼吸曲線、時間のコースの中に OCR の変更の検出を許可を取得するに Raw データがプロットされます。発芽に誘導されている寄主消費平均速度で酸素 2.4-fold 非誘導の休眠寄主より速く (p < 0.01;学生のt-テスト)。豚: 発芽の後の誘導。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 冬の発芽の段階。冬発芽の V を通して私が図示されているステージ(A-E)。スケール バー = 20 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 寄主を発芽の形態学的段階を隔離するレーザーマイクロダイ セクション。レーザーマイクロダイ セクションの Petri dish と発芽の III 期冬を隔離するための手順の全般的な設定を示しています。(A)ペトリ皿のイラストは、水滴か滅菌水、RNA の安定化ソリューションを含むまたは寄主を発芽の行を設定します。発芽誘導次寄主はマイクロダイ セクションを使用して発芽の特定の段階で分離されました。(B) 、発芽の液滴を含む段階で寄主を発芽する誘起 III を私。(C)準備マイクロキャピ ラリーは吸引によるコレクションのステージ III 冬に育てられました。(D)ガラス マイクロキャピ ラリーで、ステージ III 冬に発芽液滴から削除、コレクション液滴移動します。(E) 、マイクロキャピ ラリー コレクション液滴含む RNA 安定化溶液に挿入された、ステージ III 冬は、液滴に注入されました。(F) RNA 安定化ソリューションでステージ III 寄主のコレクションです。スケール バー = 20 μ m (A ~ D, F) と (E) 50 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 発芽期 | 分離された発芽の寄主の数 |
| I 期します。 | 1,000 |
| II 期 | 500 |
| ステージ III | 650 |
表 1: 標準の隔離実験で発芽段階ごとに正常に分離された発芽の寄主の数。表は段階のレーザーマイクロダイ セクションを使用して分離されている寄主の平均数を示していますダウン ストリーム アプリケーションのコレクションの前に III を私。
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Discussion
担子菌赤植物病原菌は、毎年作物の損失の数十億ドルを引き起こします。これらの病原体の大半は、真菌の散布と有性生殖に不可欠な寄主を生成します。寄主の発芽と開発の知識を得ることは、これらの菌によって引き起こされる破壊的な病気の広がりを理解する重要です。主な制御点で分子の変更を識別するために我々 は、生理学的変化と発芽の段階で寄主を分離する別のタイミングを識別する手法を考案した.瀬戸ら光顕 (図 2) で冬発芽の (未発表) 指摘した 5 つのステージ。中に生理活性化を調査するために I 期、発芽過程における呼吸速度を評価するために我々 は酸素消費量の変化を正確に測定するクラーク型 microrespirometer を使用します。サンプル データは、手法が正確かつ再現性の高いことを示します。我々 の調査結果は、発芽米アルテリシジン寄主展示に比べて非誘導の休眠寄主細胞呼吸において大幅な増加を確認します。初めて、発芽を誘導されて米国アルテリシジン寄主が酸素摂取量 ~ 45 分遅れを示すことを同定しました。これは米国アルテリシジン寄主が発芽信号を処理するいくつかの時間を必要がありますを示唆 (e.g、糖の存在)、応答する前に発芽信号に非常に即時の応答の中ではその増加の酸素摂取量または。我々 の分析は初期の酸素摂取量の最小限の変更を検出する十分な敏感でした。
黒穂病寄主の呼吸を調べる研究3酸素を測定するウォーバーグ フラスコ装置に頼った前レベル5の主。簡単に、このメソッドは圧力計アームの流体のレベル変化の直接観察により密閉されたフラスコ内の圧力の変化を検出することにより酸素消費量と CO2の生産量を測定します。実験は、セットアップが難しいことができ、測定が正確にすることができます。装置は、測定期間中出席されなければならないし、OCR を推定するために必要な大規模な計算。我々 のプロトコルでは、技術の進歩を使用して、装置による実験の期間のままにユーザーの目で、測定を取る要件を排除し、広範な数式を使用します。アカパンカビ9およびBotryodpilodia theobromae10胞子の OCR を測定する初期のクラーク型 respirometers を使用している他、これら初期の楽器が最大 20 分の連続測定を許可するただし、します。この制限がない酸素摂取量新しいモデル工場の見学 〜 45 分遅れの識別を許可しています。我々 のプロトコルをしたデータ解釈単純、読み出しは残りの計算やデータ操作をすることがなく直接グラフにできるチャンバー内酸素濃度。さらに、それは継続的な測定を取ることが可能 (すべて 2 s) 無期限利用可能な酸素が枯渇するまでの時間。これは時間の長い期間にわたって呼吸で小さな変更の識別を許可します。したがって、以前の手法に改良して真菌胞子の酸素消費量を測定する簡単な正確で再現可能な手法を開発しました。私たちの知る限り、これは黒穂病菌の寄主の発芽と休眠中の呼吸を研究する現代のクラーク型呼吸を使用する最初の研究です。
にもかかわらず、使いやすさ、シンプルさこのプロトコルの最適化が必要と分析を限られた生物学的現実があります。最初、適切なサンプル サイズは、合理的な ocr 処理を達成するために識別する必要があります。酸素レベルの早期クラッシュにつながることができますあまりにも多くのサンプルとあまりサンプルは酸素消費量で意味のある変化を観察することができないことになります。第二に、正確な初期データを提供する (〜 3 分) を安定させるためにプローブの時間を確保することが不可欠です。最後に、抗菌剤と発芽を補完することが重要だ (e.g。、ストレプトマイシン硫酸塩) 細菌汚染 OCR の測定値は変更されませんを確認するために。我々 が直面して生物学的限界だった低発芽率 (~ 1%) 視覚的な形態学的変化を観察することにより、測定の時間コース。胞子の生存率を決定する胞子数あたりに変換するには、このレート決定できるようになるし、高い ocr 処理につながる発芽率の高い寄主を分離します。米国アルテリシジン寄主11の非同期の発芽は考慮する必要がありますし、発芽前の酸素消費量を検出することができないことに貢献するかもしれない現実です。
精度と冬の呼吸の変化を測定の精度を改善するためにこのメソッドの将来の適応は単一セル ベースの OCR を測定を含めることができます。マイクロマニピュレーション技術は分離するしが誘導され、発芽とその呼吸速度を監視できる、単一の冬にされる可能性があります。これは寄主の mg 当たりではなく、冬の休眠発芽シフト中に OCR に関する情報を提供する、解像度が向上します。さらに、これは非同期の発芽の交絡の問題を解決するでしょう。
発芽の後の段階、発芽の一般的な段階で寄主を分離するマイクロマニピュレーション法を開発しました。これは比較的同期冬集団分析のための作成を許可します。1 つの微生物を分離するためのさまざまな方法が記載されているし、年12時に改善されています。これらのメソッドは、単一微生物、マニピュレーターを使用して培養、および機械的方法のための媒体に転送される胞子を取得する microcapillaries を使って半機械的方法を取得する胞子懸濁液の希釈.対向流遠心浄化および特定の細孔径を持つナイロン膜を通じて発芽寄主をフィルタ リング、発芽の同じ段階で寄主を取得するために使用私たち以前のメソッドが含まれます。寄主を発芽を豊かにすることができたこれらのメソッドを使用して、しかし、我々 のサンプルまだ含まれて寄主発芽13のさまざまな段階で。単一微生物のマイクロマニピュレーション用の現在の技術は、高い倍率とキャピラリーの針、誤嚥、そして微生物の伝達を細かく制御機器の導入により改善されました。マイクロマニピュレーションの前の技術は、単一細胞培養または単一セル PCR アプリケーション14用を孤立させることに焦点を当てています。単一の真菌胞子を分離するためのマニピュレーターの使用は既に確立されていません。以前単一の真菌胞子分離法には、微細鉗子や発芽胞子15を含む固体媒体の小片をピックアップする針の使用が関与しています。マイクロマニピュレーションのマイクロマニピュレーターを使いとは、子のう胞子のクラスターが減数分裂遺伝子解析16寒天培地の培養分離次胞子形成をすることができます酵母の研究で広く使用されます。細菌細胞14マイクロマニピュレーション技術を組み合わせたメソッドと発芽寄主を隔離するため体外受精方法を開発しました。我々 はこの手法で共通の発芽段階寄主の数百人を得られることを示しています。RT qPCR などの技術を使用してダウン ストリーム式研究のこれらのサンプルを使用できるまたは RNA シーケンス発芽を同期する寄主の人口を取得中に発生した遺伝子発現の特定の変化の解析を許可早く、冬発芽の中間およびそれ以降の段階。
特定寄主を発芽の段階の可能性がありますをセットでの経験を必要とし、発芽のさまざまな段階を認識し、しかし、この経験によって得られるすぐに実践。後 RNA の隔離に成功したレーザーマイクロダイ セクションに従う必要があるいくつかの手順があります。まず、発芽は抗生物質で補われなければならない (e.g。、ストレプトマイシン硫酸塩) 寄主を発芽のコレクションの中にだけでなく、細菌汚染発芽が開始されるのを抑制します。第二に、安定化し、分離の RNA を保護する安定化ソリューションを使用することが重要です。RNA 安定化ソリューションはまた、追加寄主を収集しながら発芽の次の段階に進んでから収集した寄主を防ぎます。第三に、コレクション液滴が成功した RNA の抽出を確実にリカバリ後に鉱物油を削除することが重要です。最後に、我々 は時間の長時間にわたって分離寄主 RNA 安定化溶液に保存する場合 RNA の品質のいくつかの損失を気づいています。したがって、RNA は発芽ステージ特定寄主のコレクションはすぐに次の分離をお勧めします。メソッドの制限ステージは、私収集寄主は休眠、死んだ、およびこれらの 3 段階が形態学的に区別可能な寄主を発芽する誘導を含めることができます。さらに、ステージ III 寄主を収集する際減数分裂で寄主の混合物か減数分裂 II を取得でした。本当に休止状態と死んで寄主の間の区別を支援する 1 つの方法は、サンプルの生存を確認することです。ライブ/デッド細胞実行可能性の試金を使用して真菌胞子の生存率を評価するための方法より有益な発芽率が決定17をあることができる実行可能な寄主の割合を評価することがあります。さらに、核染色 DAPI、たとえば、される可能性がありますさらにステージ III で形態学的寄主を特徴付けるためにステージ III、IV 期への移行中に発生している減数分裂のイベントを可視化します。弊社レーザーマイクロダイ セクション法を用いたときの発芽の 1 ステージのみの寄主のコレクションが助けるだろう.
結論として、経路寄主の休眠発芽シフトの間に発生する細胞呼吸の変化を測定する簡単な正確かつ再現可能な方法を開発しました。さらに、RNA シーケンスなどのダウン ストリーム アプリケーションに使用できる寄主を発芽の特定の段階を集めるための方法を開発しました。私たちの方法は、様々 な細胞タイプと種に対応することができます。当社の技術の改善はレベルだけでなく、さらに発芽の後の段階で発生するイベントを定義する単一の胞子の呼吸性変化の検出が容易にことを期待しています。
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Disclosures
著者を開示するない競合する金銭的な利益やその他の利害の関係があります。
Acknowledgments
彼の microrespirometer の使用のための博士ポール霜とニコール ワーグナーとアレックス ベルのテクニカル サポートに感謝したいと思います。この作品資金が供給された B.J.S. するレベルの補助金
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptomycin Sulfate | BioShop | STP101 | |
| Kanamycin Sulfate | BioShop | KAN201 | |
| Potato Dextrose Broth | BD Difco | 254920 | |
| 1 L Waring Laboratory blender | Waring | 7011S | |
| Cheesecloth | VWR | 470150-438 | |
| Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock | ThermoFisher Scientific | 5310-0250 | |
| Unisense MicroRespiration system | |||
| MicroRespiration Sensor (O2) | Unisense | OX10 | |
| MicroOptode Meter Amplifier | Unisense | N/A | |
| MR-Ch Small | Unisense | MR-Ch | |
| SensorTrace Rate Software | Unisense | N/A | |
| MicroRespiration Rack | Unisense | MR2-Rack | |
| MicroRespiration Stirrer | Unisense | MR2-Co | |
| Microdissection system | |||
| Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope | Zeiss | ||
| Coarse Manipulator | Narishige | MMN-1 | |
| Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-202ND | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| TransferTip (ES) | Eppendorf | 5175107004 |
References
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