Summary
Sote sopp forårsaker mange ødeleggende landbruket sykdommer. De er spredt som sovende teliospores som spirer svar på miljømessige signaler. Vi skissere to metoder for å undersøke molekylær endringer under spiring: måle åndedrett økning for å oppdage metabolske aktivisering og vurdere endre molekylære hendelser ved å isolere teliospores på forskjellige morfologiske stadier.
Abstract
Sote sopp er paranoid agenter for flere ødeleggende landbruket sykdommer. De er preget av produksjon av teliospores, som er tykke vegger spredning agenter. Teliospores kan forbli sovende i flere tiår. Dormancy er preget av lav metabolsk priser og stanset macromolecular biosyntesen sterkt reduserte nivåer av åndedrett. Ved mottak av nødvendige Miljøsignaler, spire teliospores for å produsere haploid celler, som kan starte nye runder av infeksjon. Teliospore spiring er preget av gjenopptakelse av macromolecular biosyntesen, økt åndedrett og dramatiske morfologiske endringer. For å presist måle endringer i cellular respirasjon i den tidlige fasen av spirende, har vi utviklet en enkel protokoll ansette en Clark-type respirometer. Av spiring kjennetegnes av bestemte morfologiske endringer, men spiring er asynkron. Vi utviklet en microdissection teknikk som gjør det muliggjør for oss å samle inn teliospores på forskjellige spiring stadier.
Introduction
Den sote sopp (Ustilaginales) består av over 1600 arter som infisere gress inkludert viktig frokostblanding avlinger av korn, bygg og hvete, forårsaker milliarder av dollar i avling tap årlig1. Disse sopp er preget av produksjon av teliospores, som har mørkt pigmentert cellevegger og er spredning agenter. Teliospores for å skjerme genetisk materiale under hverdagens stress spredning mellom verten planter, og kan vedvare i en sovende tilstand for år2. Slik er teliospores en avgjørende del av sykdom spread.
For å studere teliospore biologi, utnytter vårt laboratorium modell sote soppen Ustilago maydis (U. maydis), som er den kausale agenten for sykdommen 'vanlige sote korn'. Eldre U. maydis teliospores kjennetegnes av vekst arrestasjon, redusert cellenes stoffskifte og lave nivåer av cellular respirasjon3. I gunstige miljømessige forhold (f.eks., tilstedeværelse av bestemte sukker), U. maydis teliospores spirer og fullføre meiose, produksjon av basidiospores som kan starte nye runder av infeksjon. Spiring er preget av økt åndedrett, tilbake til metabolske aktiviteten og progresjon gjennom observerbare morfologiske stadier av spiring4.
Den innledende fasen av spiring inkluderer økt åndedrett og metabolsk funksjon, men det finnes ingen morfologiske indikasjoner for endring. Opprinnelige målinger av luftveiene endringen i U. maydis ble utført over 50 år siden, måle oksygenforbruk manometrically med en Warburg kolbe apparater5. Vi har utviklet en ny, enkel metode for å studere nøyaktig endringer i åndedrett under teliospore spiring ved å måle oksygenforbruk en gang løpet av spiring bruker en Clark-type microrespirometer. Vi har tidligere anvendt denne metoden for å studere endringer i respirasjonsfrekvens mellom vill-type U. maydis haploid celler og mutanter med defekt mitokondrier6, og har tilpasset protokollen her for å studere endringer i teliospore åndedrett under spiring. Dette gir et middel til å nøyaktig identifisere tidspunktet for åndedrett endre slik at vi kan målrette teliospores på riktig tidspunkt etter initiering av spiring undersøke tidlig molekylære hendelser. Utviklingen av spiring kan følges mikroskopisk når promycelia kommer fra teliospore, men den asynkrone måten hemmet isolering av nok teliospores på et gitt tidspunkt for undersøkelse. Vi utviklet en microdissection teknikk som ligner på de som brukes for i vitro fertilisering fysisk samle teliospores på forskjellige morfologiske stadier av spiring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. korn Cob infeksjon
- Vokse Zea mays (cv. Golden Bantam) til cobs er dannet og har begynt å silke (ca 60 dager).
- Kultur kompatibel haploid U. maydis stammer ved hjelp av standardprotokoller som tidligere beskrevet7.
- Infisere korn cobs ved hjelp av standardprotokoller som beskrevet tidligere7.
2. teliospore høste
- Autoclave utstyr (Büchner trakter, Büchner flasker, blandemaskiner, 250 mL sentrifuge flasker, flat spatler og vann) bruker et standard tørr syklus med minst 30 min sterilisering 121 ° c (standard flytende syklus for vann).
- Fjerne infiserte cobs fra planter (ca 28 – 35 dager innlegget infeksjon) bruker en barberhøvel og angi cobs på et brett i benk protector.
- Fjerne svulster fra cobs med et barberblad og samle i et beaker.
- Fylle en 250 mL laboratorium blender kopp med svulster til ca 1/3 full og legge autoklaveres dH2O til blender koppen er ca 3/4 full. Forstyrre svulster ved pulserende blender ved lave, før homogenisert.
- Koble vakuumpumpe til en vannlås og deretter til en 1 L Büchner kolbe.
- Sett inn store Büchner trakt i flasken og line bunnen av Büchner trakten med fire lag cheesecloth.
- Aktivere vakuumpumpe.
- Hell en del av de homogenisert svulster gjennom cheesecloth og skrape med en slikkepott.
- Hell noen dH2O i cheesecloth for å tømme teliospores gjennom.
- Gjenta til dH2O kommer gjennom cheesecloth er klart.
- Vri ut cheesecloth inneholder homogenisert svulst materialet inn i filterene å sikre maksimal teliospore utvinning.
- Når 1 L Büchner kolbe blir nær full, tømme den i en stor Erlenmeyer kolbe og sett det til side.
- Et nytt stykke av cheesecloth inn filteret og Gjenta trinnene (2.7-2.12) til alle svulster har blitt forstyrret og filtrert.
- Hell de filtrerte teliospores i autoklaveres 250 mL sentrifuge flasker og sentrifuge 1000 x g for 5 min og Dekanter nedbryting.
- Gjenta trinn 2.14 til alle de filtrerte teliospores er pelleted med sentrifugering.
- Avbryte pellets en liten mengde vann og overføring til 50 mL sentrifuge rør.
- Sentrifuge rør 1000 x g i 5 min og Dekanter nedbryting.
- Avbryte pellet ca 50 mL av dH2O sentrifuge rør 1000 x g i 5 min og Dekanter nedbryting. Forsiktig skrape av øverste lag med en spatula og kast. Gjenta til det er ikke lenger et lag på toppen.
- Tørr prøvene overnatting i et vakuum desiccator.
- Lagre tørket teliospores på 4 ° C før bruk.
-
Eventuelt kan du behandle teliospores med kobber sulfat8 før inducing spire. Hvis ikke behandles, deretter utføre grundig mikroskopisk analyse av teliospores å bekrefte prøven representerer ren teliospores og er blottet for bakteriell eller andre forurensing.
- Veie ut ca 50 mg teliospores i en 1,5 mL microcentrifuge tube.
- Tilsett ca 1,0 mL av 0,75% CuSO4 til 1,5 mL microcentrifuge røret som inneholder teliospores. Pipetter opp og ned for å avbryte teliospores CuSO4 løsningen etterfulgt av agitating utvalget for 3t.
- Sentrifuge prøven 2500 x g i 5 min og fjerne nedbryting. Resuspend teliospore pellets med sterilt vann, gjenta sentrifugering og fjerne nedbryting.
- Gjenta trinn 2.21.3 to ganger.
3. teliospore levedyktighet og spiring Test
- Veie ca 10 mg av U. maydis teliospores i en 1,5 mL microcentrifuge tube å vurdere sin levedyktighet og tidspunktet for spiring.
- I en biosafety skap, Forbered potet druesukker kjøttkraft (PDB, 24 finans) med streptomycin sulfate (160 µg/mL).
- Avbryte teliospores 500 µL av PDB. Pipetter forsiktig å blande og bryte opp alle klumper av teliospores.
- Overføre teliospore suspensjon til en autoklaveres 250 mL Erlenmeyer kolbe som inneholder 10 mL av PDB.
- Inkuber kolbe på 28 ° C rister på 90 rpm for 12-16 h.
- Fjerne et 20 µL eksempel teliospores overtalt til å spire og forberede en microscope skyve et biosikkerhet kabinett.
-
Bruker et mikroskop, vurdere visuelt stadier av spiring som finnes og tilstedeværelsen av bakteriell forurensning.
- Antall teliospores på etapper jeg gjennom V bruker en hemocytometer og bestemme prosent som har spirer.
- Hvis bare stadium I teliospores finnes, fortsette å ruge kolbe totalt 24 timer før vurdere teliospore spiring. Fortsette inkubasjonstiden for maksimalt 48 timer før deeming prøven ikke-levedyktige.
- Hvis bakteriell forurensning, supplere PDB med kanamycin sulfate (50 µg/mL) og streptomycin sulfate (160 µg/mL) og gjentar trinn 3.1 til 3.7. Hvis bakteriell forurensning vedvarer, behandle teliospores med kobber sulfat og gjenta 3.1 til 3.7.
4. induksjon av spiring for åndedrett overvåking
- Veier like mye (f.eks., 50 mg) av teliospores for hver åndedrett eksperimentet.
- Legg teliospores til en autoklaveres åndedrett kammer i et biosikkerhet kabinett.
- Fyll til kammeret PDB (24 g/L) supplert med streptomycin sulfate (160 µg/mL) og kanamycin sulfate (50 µg/mL).
- Pipetter opp og ned for å opprette en teliospore suspensjon.
- Plass lokket kammer i kammeret opprette lufttett forsegling.
5. få oksygen forbruk Rate (OCR) målinger
- Plass kammeret i kammeret rack i et vannbad (forvarmet til 28 ° C).
- Sted O2 sonden innsiden av åpningen av kammeret.
- Overvåke datapunktene vises i sanntid på programmet "SensorTrace Rate", og la sonden stabilisere (~ 3 minutter etter sonden er plassert i kammeret).
- Klikk "Tiltak" for å måle O2 nivåer kontinuerlig for 6 h med mål registrert med 2 s mellomrom.
- Stopp målingen, og Gjenta trinnene 4.1-5.4 for hver prøve som skal analyseres.
- Eksportere data til Microsoft Excel ved å klikke "fil | Eksportere | Lagre som XLS".
6. dataanalyse
-
Beregne OCR
- I den eksporterte Excel-filen under kategorien "Within_Rates", kan du registrere "Rate" for hver kammer måling (nmol/h).
- For hver eksperimentelle prøve, trekker "Rate" av Tom chamber fra "Rate" av eksperimentelle prøve chamber å få en korrigert OCR-verdi, og ta den absolutte verdien av sparingen.
- Beregne den totale OCR per mg av teliospores ved korrigert absolutt OCR verdi med mobilnettet masse brukes.
- Gjennomsnittlig replikere "OCR per mg teliospores" verdier for hver stamme.
- Analysere dataene med statistiske metoden (f.eks., student t-test, variansanalyse) bruker Microsoft Excel til andre statistisk programvare.
- Graf rådata, beregning av oksygen gjenværende for hvert tidspunkt du vil lage. Dele første lesning av seg selv og multiplisere med 100 (100% oksygen gjenværende), deretter dele hver påfølgende lesing av første lesning, og multipliseres med 100 for å få prosent av oksygen igjen i kammeret.
7. induksjon av Teliospore spiring isolere Teliospores på forskjellige stadier av spiring
- Forberede PDB (24 g/L) med streptomycin sulfate (160 µg/mL) i en biosafety kabinett.
- Plass ca 10 mg av U. maydis teliospores i en 1,5 mL microcentrifuge tube.
- Avbryte teliospores 500 µL av PDB. Pipetter forsiktig for å blande inntil det er ingen klumper av teliospores i medium.
- Overføre teliospore suspensjon til en autoklaveres 250 mL Erlenmeyer kolbe som inneholder PDB supplert med streptomycin sulfat.
- Inkuber kolbe overnatting på 28 ° C rister på 90 rpm.
8. forberedelse av Petriskål og Micromanipulator
-
Forberede en Petriskål (57 cm2) av pipettering rader med dråper microcapillary forberedelser og prøvetaking.
- Pipetter 5 µL (x 4) dH2O dråper øverst i Petriskål.
- Pipetter 2 µL (x3) RNA stabilisering løsning på Petriskål brukes til prøvetaking.
- Pipetter 5 µL (x 30) dråper Anskuelser teliospores på Petriskål.
- Legge til 15 mL av mineralolje Petriskål. Kontroller at alle dråper er dekket av olje før du fortsetter.
- Klargjør en microcapillary med 15 µm indre diameter, 1 mm flens, 55 mm lengde og en 20° tips vinkel ved å plassere den i microcapillary holderen og submerging det i mineralolje der kapillær handling vil tillate mineralolje inn i microcapillary. Slipp trykket i microcapillary før bringe den til vann droplet. Sug opp for å forberede microcapillary med vann.
9. isolasjon av scenen-spesifikke spirende Teliospores
- Bruke kontrollene av micromanipulator, flytte de forberedt microcapillary til en av spiring dråper. Trenge slippverktøyet, lavere i microcapillary og få munningen av microcapillary til en germinating teliospore på scenen i spiring rundt.
- Sakte Sug opp for å fange den germinating teliospore. Stopp aspirating når teliospore har kommet inn i microcapillary. Gjenta til det er ca fem teliospores i microcapillary.
- Øke microcapillary med micromanipulator og bringe den til samlingen slippverktøyet RNA stabilisering løsning. Trenge slippverktøyet og injisere teliospores i slippverktøyet.
- Gjenta trinn 8.1 til 8.3 til ca 1000 teliospores er tatt.
10. utvinning av samlingen slippverktøy
- Pipetter opp samling slippverktøyet og overføre den til lokket på en RNase/DNase-fri 2.0 mL microcentrifuge tube. Fjern forsiktig mineralolje med en pipette uten å forstyrre samling slippverktøyet.
- Bruk teliospores for nedstrøms programmer som RNA isolasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med Clark-type microrespirometer-baserte metoden å måle endringer i åndedrett teliospore dormancy og spiring bekreftet vi at sovende teliospores ha et lavt nivå av åndedrett (~ 1,075 µmol/h/mg) sammenlignet med spirende teliospores (~ 2,614 µmol/h/mg; Figur 1A). Dette representerer en ~2.4-fold endring i Gjennomsnittskurs ånding mellom sovende teliospores og teliospores som har blitt overtalt til å spire. I tillegg har vi identifisert som teliospores som har blitt overtalt til å spire har en ~ 45 min forsinkelse i oksygenopptak (figur 1B). Dette angis med ~ 30 min forsinkelsen i oksygenopptak (figur 1B) i tillegg til ~ 15 min forsinkelsen mellom induksjon av spiring og starten av oksygen målinger. Dette identifiserer et tidspunkt for å starte vurderer molekylær endringer i de germinating teliospores som ikke er synlig endring.
Senere endringer under spiring kan observeres mikroskopisk. Fem stadier av spiring var bestemt. Scenen I spiring representerer teliospores som har blitt overtalt til å spire, men fortsatt ikke kan skilles fra sovende teliospores. Fase II teliospores har en voksende promycelium med en lengde som er mindre enn eller lik diameteren på teliospore. Fase III teliospores har promycelia som er større enn teliospore diameter. Stage IV av spirende er første spirende av basidiospores fra promycelia, og fase V er de resulterende haploid basidiospores som deler av spirende (figur 2). Bruke microdissection teknikken som vi har utviklet, har vi lykkes isolert 500 til 1000 spirende teliospores for nedstrøms programmer som RNA isolasjon for RT PCR eller RNA-Seq (tabell 1). Figur 3 viser generelle satt Petri dish for microdissection og trinnene for microdissection ved hjelp av en micromanipulator.
Figur 1: tid selvfølgelig oksygenopptak ved teliospore spiring. Sovende teliospores ble overtalt til å spire, og oksygennivået ble registrert kontinuerlig 6 h med en Clark-type microrespirometer. Un indusert sovende teliospores ble brukt som en kontroll, og alle mål var normalisert et tomt utvalg. (A) Data representert som gjennomsnittlig OCR. (B) rådata plottet å få åndedrett kurver, tillater påvisning av endringer i OCR løpet tid. Teliospores som har blitt overtalt til å spire forbruker oksygen gjennomsnittlig 2.4-fold raskere enn un indusert sovende teliospores (p < 0.01; Student t-test). GRIS: etter induksjon av spiring. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: stadier av teliospore spiring. Stadier I til V av teliospore spiring er illustrert (A-E). Skala bar = 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Microdissection å isolere distinkte morfologiske stadier av spirende teliospores. Generelt satt opp av en Petri dish for microdissection og fremgangsmåten for å isolere teliospore i stadium III av spirende illustrert. (A) illustrasjon av en Petriskål satt opp med rader av dråpestørrelse inneholder enten sterilt vann, RNA stabilisering løsning, eller spirende teliospores. Etter spiring induksjon ble teliospores isolert i bestemte faser av spiring bruker microdissection. (B) en spiring droplet inneholder overtalt til å spire teliospores i stadier I til III. (C) en forberedt microcapillary vokste opp til en Trinn III teliospore for samlingen gjennom aspirasjon. (D) The Stage III teliospore i et glass microcapillary er fjernet fra spiring slippverktøyet og flyttet til en samling dråpe. (E) på microcapillary ble satt inn i samling droplet inneholder RNA stabilisering løsningen og Trinn III teliospore ble sprøytet inn slippverktøyet. (F) en samling av trinn III teliospores i RNA stabilisering løsningen. Skala bar = 20 µm (A-D, F) og 50 µm (E). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Spiring scenen | Antall spirende teliospores isolert |
| Medeier | 1000 |
| Fase II | 500 |
| Fase III | 650 |
Tabell 1: antall spirende teliospores ble isolert for hver spiring scenen i et standard isolasjon eksperiment. Tabellen viser gjennomsnittlig antall teliospores som er isolert med microdissection for stadier I til III før samling for nedstrøms programmer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Basidiomycete biotrophic plante patogener føre milliarder av dollar i avling tap årlig. De aller fleste av disse patogener produsere teliospores som er integrert i fungal spredning og seksuell reproduksjon. Få kunnskap om utvikling og spiring av teliospores er avgjørende for å forstå spredning av ødeleggende sykdommer forårsaket av disse sopp. For å identifisere molekylær endringer på sentrale kontrollpunktene har vi utviklet en metode for å identifisere tidspunktet for fysiologiske endringer, og en annen for å isolere teliospores på forskjellige stadier av spiring. Seto et al. (upublisert) bemerket fem stadier av teliospore spiring av * lys (figur 2). For å undersøke fysiologiske aktivisering under trinn I og for å vurdere pustefrekvens under spiring, vi brukte en Clark-type microrespirometer å presist måle endringer i oksygenforbruk. Våre eksempeldata indikerer at vår metode er presis og svært reproduserbare. Våre funn bekrefter at spirende U. maydis teliospores ha en drastisk økning i cellular respirasjon sammenlignet un indusert sovende teliospores. For første gang, har vi funnet at U. maydis teliospores som har blitt overtalt til å spire ha en ~ 45 min forsinkelse i oksygenopptak. Dette tyder på at U. maydis teliospores kan kreve litt tid å behandle spiring signaler (f.eks., tilstedeværelse av sukker) før du svarer, som økte oksygenopptak er ikke blant svært umiddelbart svar spiring signaler eller at våre analysen ikke var sensitive nok til å oppdage minimal endringen i første oksygenopptak.
Forrige studier undersøke åndedrett priser på sote teliospores3 er avhengig av en Warburg kolbe apparater å måle oksygen nivåer manometrically5. Kort, denne metoden måler oksygenforbruk og CO2 produksjon av oppdager endringer i trykket i et lukket kolbe gjennom direkte observasjon av væske endringer i manometer armen. Eksperimenter kan være vanskelig å sette opp, og mål kan være upresis. Apparatet må være gikk gjennom måling og omfattende beregninger må beregne OCR. Våre protokollen gjør bruk av teknologiske fremskritt, eliminerer behovet for brukeren være ved apparatet for varigheten av forsøket, ta målinger av øyet, og bruke omfattende matematiske formler. Andre har brukt tidlig Clark-type respirometers å måle OCR Neurospora crassa9 og Botryodpilodia theobromae10 sporene, men disse tidlige instrumenter tillatt kontinuerlig målinger for maksimalt 20 min. Denne begrensningen ville ikke tillatt identifikasjon av ~ 45 min forsinkelsen i oksygenopptak vi observert med den nyere modell respirometer. Våre protokollen har gjort data tolkning enklere, som readout er konsentrasjonen av oksygen igjen i kammeret, som kan kartlegges direkte uten noen beregninger eller data manipulasjon. I tillegg er det mulig å ta kontinuerlig målinger (hver 2 s) for en ubestemt tid til tilgjengelig oksygen er helt oppbrukt. Dette tillater identifikasjon av små endringer i åndedrett over lang tid. Vi har derfor forbedres tidligere teknikker og utviklet en enkel, presis og reproduserbar metode for å måle oksygenforbruk av sopp sporer. Vi vet er dette den første studien å bruke en moderne Clark-type respirometer for å studere åndedrett av sovende versus spirende teliospores av sote sopp.
Til tross for den letthet og enkelhet av denne protokollen, optimalisering er nødvendig og det er biologisk realiteter som begrenset analysen. Først, riktig utvalgene må identifiseres for å oppnå rimelig utfører OCR. For mye utvalg kan føre tidlig krasj av oksygen, og for lite utvalg kan føre til manglende evne til å observere meningsfulle forandringer i oksygenforbruk. Det andre er det viktig at sonden tiden å stabilisere (~ 3 minutter) for å gi nøyaktig startdata. Endelig er det viktig å supplere spiring medium med antibakterielle midler (f.eks., streptomycin sulfate) for å sikre bakteriell forurensning ikke endrer OCR målinger. Biologiske begrensninger vi møtte var en lav spiring rate over tid selvfølgelig måling (~ 1%) som bestemmes ved å observere visuelle morfologiske endringer. Bestemme spore levedyktighet ville tillate denne rate vilje til å bli konvertert til en per spore nummer og isolere teliospores med høyere priser på spiring ville føre til høyere utfører OCR. Den asynkrone spiring U. maydis teliospores11 er en virkelighet som må regnskapsføres og kan ha bidratt til en manglende evne til å oppdage oksygenforbruk tidligere i spiring.
For å forbedre nøyaktighet og presisjon på måling av endringer i teliospore åndedrett, kan fremtidige tilpasninger til denne metoden være måle OCR på en enkelt celle-basis. Micromanipulation teknikker kan brukes til å isolere en enkelt teliospore, som deretter kan bli overtalt til å spire, og dens pustefrekvens kan overvåkes. Dette kan forbedre oppløsning, gir informasjon om OCR under dormancy-spiring skiftet per teliospore, og ikke per mg av teliospores. I tillegg vil dette løse forvirrende problemet med asynkron spiring.
For senere stadier av spirende utviklet vi en micromanipulation metode for å isolere teliospores på vanlige stadier av spiring. Dette tillot etableringen av relativt synkron teliospore bestander for analyse. Ulike metoder for å isolere enkelt mikroorganismer har blitt beskrevet og forbedret på over år12. Disse metodene omfatter fortynning av spore suspensjoner å få enkelt mikroorganismer, halvt mekanisk metoder med bruk av microcapillaries å få spores som overføres til middels for dyrking og mekanisk metoder som bruker micromanipulators . Tidligere metoder som vi pleide å få teliospores på samme scene av spirende inkluderer motstrøm sentrifugal elutriation og filtrering spirende teliospores gjennom en nylon membran med en bestemt porestørrelse. Benytter disse metoder tillatt oss for å berike for spirende teliospores, men inneholdt våre prøver fortsatt teliospores i ulike stadier av spiring13. Dagens teknologi for micromanipulation av enkelt mikroorganismer har forbedret med innføringen av høyere forstørrelse og instrumenter for bedre kontroll av kapillær nåler, aspirasjon og overføring av mikroorganismer. Forrige micromanipulation teknikker har fokusert på isolere enkeltceller for dyrking eller for bruk i én celle PCR programmer14. Bruk av micromanipulators å isolere enkelt fungal sporer har ikke tidligere opprettet. En tidligere metode for å isolere enkelt fungal sporer involvert bruken av fine tang eller pinner velge små biter av solid medium som inneholder spirende sporer15. Micromanipulation med bruk av micromanipulators er mye brukt i gjær studier der klynger av ascospores kan være atskilt følgende sporulation i kultur på agar medium meiotic genetisk analyse16. Vi har utviklet en metode som kombinerer micromanipulation teknikken for bakterieceller14 og i vitro fertilisering metoder for å isolere spirende teliospores. Vi har vist at hundrevis av vanlige spiring scenen teliospores kan oppnås med denne teknikken. Disse prøvene kan brukes til nedstrøms uttrykk studier med teknikker som RT-qPCR eller RNA-seq. skaffe en befolkning på teliospores der spiring synkroniseres tillater analyse av bestemte endringer i genuttrykk som oppstår under tidlig, midten og senere stadier av teliospore spiring.
Microdissection av scenen bestemt spirende teliospores kan kreve erfaring i sett opp og erkjenner de ulike fasene av spirende, men denne erfaringen kan oppnås raskt gjennom praksis. Det er flere trinn som må følges for vellykket microdissection etterfulgt av RNA isolasjon. Først spiring medium må suppleres med antibiotika (f.eks., streptomycin sulfate) å undertrykke veksten av bakteriell forurensning når spiring startes og samling av spirende teliospores. Det andre, er det viktig å bruke en stabilisering løsning å stabilisere og beskytte RNA isolering. RNA stabilisering løsningen hindrer også samlet teliospores går videre til neste spiring scenen mens samle ytterligere teliospores. For det tredje er det viktig å fjerne mineralolje når samling slippverktøyet er gjenopprettet for å sikre vellykket RNA utvinning. Til slutt, vi har merket tap av RNA kvalitet hvis isolert teliospores lagres i RNA stabilisering løsning for lengre tid; Det anbefales derfor at RNA er isolert umiddelbart etter samling av spiring scenen bestemte teliospores. En begrensning av metoden er at scenen jeg teliospores samlet kan inneholde sovende, død og overtalt til å spire teliospores som disse tre stadier er morphologically utvisket. I tillegg når Trinn III teliospores, en blanding av teliospores i meiose jeg eller meiose II kan hentes. En måte å hjelpe skille mellom virkelig sovende og død teliospores kan være å bestemme levedyktigheten til prøven. En metode for å vurdere fungal spore levedyktighet ved hjelp av live/dead celle levedyktighet analyser kunne vurdere andelen levedyktig teliospores som mer informative spiring priser kan være bestemt17. I tillegg kan kjernen farging med DAPI, for eksempel brukes å visualisere hendelsene i meiose som oppstår under Trinn III og overgangen til Stage IV for å ytterligere karakteriserer teliospores morphologically på Trinn III. Dette vil hjelpe i samlingen teliospores i bare ett trinn i spiring ved vår microdissection metoden.
I konklusjonen, har vi utviklet en enkel, presis og reproduserbar metode for å måle endringene i cellular respirasjon som oppstår under dormancy-spiring skifte av Ustilago maydis teliospores. I tillegg har vi utviklet en metode for å samle inn bestemte stadier av spirende teliospores som kan brukes for nedstrøms programmer, for eksempel RNA-seq. Våre metoder kan tilpasses til ulike celletyper og arter. Vi forventer at forbedringer av våre teknikker vil lette oppdagelsen av respiratoriske endringer på en enkelt spore nivå samt ytterligere definere hendelsene som oppstår i senere stadier av spiring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Dr. Paul Frost for bruk av hans microrespirometer, og Nicole Wagner og Alex Bell for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble finansiert av en NSERC grant å B.J.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptomycin Sulfate | BioShop | STP101 | |
| Kanamycin Sulfate | BioShop | KAN201 | |
| Potato Dextrose Broth | BD Difco | 254920 | |
| 1 L Waring Laboratory blender | Waring | 7011S | |
| Cheesecloth | VWR | 470150-438 | |
| Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock | ThermoFisher Scientific | 5310-0250 | |
| Unisense MicroRespiration system | |||
| MicroRespiration Sensor (O2) | Unisense | OX10 | |
| MicroOptode Meter Amplifier | Unisense | N/A | |
| MR-Ch Small | Unisense | MR-Ch | |
| SensorTrace Rate Software | Unisense | N/A | |
| MicroRespiration Rack | Unisense | MR2-Rack | |
| MicroRespiration Stirrer | Unisense | MR2-Co | |
| Microdissection system | |||
| Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope | Zeiss | ||
| Coarse Manipulator | Narishige | MMN-1 | |
| Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-202ND | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| TransferTip (ES) | Eppendorf | 5175107004 |
References
- Saville, B. J., Donaldson, M. E., Doyle, C. E. Meiosis - Molecular Mechanisms and Cytogenetic Diversity. Swan, A. , InTech. 411-460 (2012).
- Christensen, J. J. Monograph Number 2. , The American Phytopathological Society. Worcester, MA. (1963).
- Caltrider, P. D., Gottlieb, D. Respiratory activity and enzymes for glucose catabolism in fungal spores. Phytopathology. 53, 1021-1030 (1963).
- Allen, P. J. Metabolic aspects of spore germination in fungi. Ann. Rev. Phytopathol. 3, 313-342 (1965).
- Warburg, O. Metabolism of tumours. Biochemische Zeitschrift. 142, 317-333 (1923).
- Ostrowski, L. A., Saville, B. J. Natural antisense transcripts are linked to the modulation of mitochondrial function and teliospore dormancy in Ustilago maydis. Mol Microbiol. 103 (5), 745-763 (2017).
- Morrison, E. N., Donaldson, M. E., Saville, B. J. Identification and analysis of genes expressed in the Ustilago maydis dikaryon: uncovering a novel class of pathogenesis genes. Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 34 (3), 417-435 (2012).
- Doyle, C. E., Cheung, H. Y. K., Spence, K. L., Saville, B. J. Unh1, an Ustilago maydis Ndt80-like protein, controls completion of tumor maturation, teliospore development, and meiosis. Fungal Genetics and Biology. 94, 54-68 (2016).
- Stade, S., Brambl, R. Mitochondrial biogenesis during fungal spore germination: respiration and cytochrome c oxidase in Neurospora crassa. J Bacteriol. 147 (3), 757-767 (1981).
- Brambl, R. Characteristics of developing mitochondrial genetic and respiratory functions in germinating fungal spores. Biochim Biophys Acta. 396 (2), 175-186 (1975).
- Sacadura, N. T., Saville, B. J. Gene expression and EST analyses of Ustilago maydis germinating teliospores. Fungal Genet Biol. 40 (1), 47-64 (2003).
- Hilderbrand, E. M. Techniques for the isolation of single microorganisms. Botanical Review. 4 (12), 38 (1938).
- Seto, A. M. Analysis of gene transcripts during Ustilago maydis teliospore dormancy and germination. , Trent University. M.Sc. thesis (2013).
- Fröhlich, J., König, H. Soil Biology - Intestinal Microorganisms of Termites and Other Invertebrates. König, H., Varma, A. , Springer. 425-437 (2006).
- Choi, Y., Hyde, K., Ho, W. Single spore isolation of fungi. Fungal Diversity. 3, 11 (1999).
- Sherman, F. Getting started with yeast. Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Pt B. 350, 3-41 (2002).
- Chen, Y., Seguin-Swartz, G. A rapid method for assessing the viability of fungal spores. Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 24 (2), 230-232 (2002).
