Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Microrespiration analizi ve mikrodiseksiyon kullanarak soruşturma Teliospore çimlenme

doi: 10.3791/57628 Published: May 13, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Kurum mantarlar çok yıkıcı tarım hastalıkları neden. Yanıt olarak çevre ipuçları çimlenme uyuyan teliospores olarak dağılmış. Çimlenme sırasında moleküler değişiklikleri öğrenmek için iki yöntem anahat: metabolik aktivasyon algılamak için solunum artış ölçme ve moleküler olayları farklı morfolojik aşamalarında teliospores izole ederek değiştirme değerlendirilmesi.

Abstract

Kurum mantarlar birkaç yıkıcı tarımsal hastalıkların etiyolojik ajanlar. Onlar teliospores, kalın duvarlı dağılma ajanlar üretim tarafından karakterizedir. Teliospores yıllardır atıl kalabilir. Uyuşukluk düşük metabolik oranları ile karakterize, makromoleküllerin biyosentezi durdu ve solunum düzeyde büyük ölçüde azalır. Gerekli çevre sinyalleri aldıktan sonra yeni mermi enfeksiyon başlatabilir haploit hücreleri üretmek için teliospores çimlenme. Teliospore çimlenme makromoleküllerin biyosentezi, artan solunum ve dramatik morfolojik değişiklikler yeniden başlamasını ile karakterizedir. Tam olarak çimlenme erken evrelerinde hücresel solunum değişiklikleri ölçmek için basit bir protokol Clark tipli respirometer istihdam geliştirdik. Çimlenme sonraki aşamalarını belirli morfolojik değişiklikler tarafından ayırt edilir ama çimlenme uyumsuzdur. Biz teliospores ayrı çimlenme aşamalarında toplamamızı sağlayan bir mikrodiseksiyon teknik geliştirilmiştir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kurum mantarlar (Ustilaginales) önemli tahıl bitkileri, Mısır, arpa ve buğday da dahil olmak üzere, milyarlarca dolar kırpma kayıplara yol açan bitkiler enfekte 1,600 türler oluşur her yıl1. Bu mantarlar hücre duvarları koyu pigmentli ve dağıtım aracıları olan teliospores, üretim ile karakterizedir. Teliospores ana bitkiler arasında yayılma stresleri sırasında genetik materyal korumak için çalışır ve yıl2için atıl bir durumda devam edebilir. Bu nedenle, teliospores hastalığı yaymak bir unsuru vardır.

Teliospore Biyoloji çalışma amacıyla modeli kurum mantar hastalığı 'ortak kurum Mısır' nedensel ajan olan Ustilago maydis (U. maydis), bizim laboratuvar yararlanmaktadır. U. maydis olgun teliospores büyüme tutuklama, azaltılmış hücre metabolizması ve hücresel solunum3düşük düzeyleri tarafından karakterizedir. Uygun çevre koşulları içinde (örn., özel şeker varlığı), U. maydis teliospores çimlenme ve tam yeni mermi enfeksiyon başlatabilir mayoz, üreten basidiospores. Çimlenme artan solunum, dönüş için metabolik aktivite ve çimlenme4gözlemlenebilir morfolojik aşamalarla ilerleme ile karakterizedir.

Çimlenme ilk aşamada artan solunum ve metabolik fonksiyon içerir, ancak, değişimin morfolojik bir belirti yok. U. maydis solunum değişikliği özgün ölçümleri üzerinden 50 yıl önce oksijen tüketimi manometrically Warburg şişesi aparatı5ile ölçüm yapılmıştır. Çimlenme Clark tipli microrespirometer kullanarak bir saat boyunca oksijen tüketimi ölçerek hassas solunum teliospore çimlenme sırasında değişimler okuyan yeni ve basit bir yöntem geliştirdik. Daha önce vahşi-türü arasında solunum hızı değişiklikleri incelemek için bu yöntem kullanılan U. maydis haploit hücreleri ve arızalı mitokondri6, mutantlarla ve protokol teliospore solunum sırasında değişiklikleri çalışmaya adapte olması çimlenme. Bu biz teliospores erken moleküler olayları araştırmak için çimlenme başlanmasından sonra uygun zamanda hedef böylece doğru solunum değişikliği zamanlama tanımlamak için bir yol sağlar. Çimlenme ilerlemesini mikroskobik bir kez promycelia teliospore ortaya çıkıyor ama yeterli teliospores yalıtım soruşturma için belirli bir aşamada zaman uyumsuz doğa inhibe izlenebilir. Biz o vitro fertilizasyon için fiziksel olarak farklı morfolojik çimlenme aşamalarında teliospores toplamak için kullanılan benzer bir mikrodiseksiyon teknik geliştirilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. mısır koçanı enfeksiyon

  1. Zea mays (cv. altın ufak tefek) büyümek kadar koçanı kurulur ve ipek (yaklaşık 60 gün) başlamıştır.
  2. Kültür uyumlu haploit U. maydis daha önce standart protokolleri kullanarak suşları açıklanan7.
  3. Yukarıda açıklanan7olarak standart protokolleri kullanarak mısır koçanı bulaştırmak.

2. teliospore hasat

  1. Otoklav ekipman (Büchner huniler, Büchner şişeler, karıştırıcılar, 250 ml'lik santrifüj şişe, düz spatula ve su) bir standart kuru kullanarak döngüsü ile en az 30 dk sterilizasyon 121 ° c (Standart sıvı döngüsü su için).
  2. Bir jilet kullanarak enfekte koçanı bitkilerden (yaklaşık 28-35 gün sonrası enfeksiyon) kaldırın ve tezgah koruyucu kaplı bir tepsi üzerinde koçanı ayarlayın.
  3. Bir tıraş bıçağı ile koçanı tümörler kaldırmak ve bir ölçek içinde toplamak.
  4. 250 mL laboratuvar blender Kupası tümörleri ile yaklaşık 1/3 tam kadar doldurun ve blender yaklaşık 3/4, bu kadar autoclaved dH2O ekleyin tam. Tümörler homojenize oluncaya kadar düşük, blender darbe tarafından bozabilir.
  5. Vakum Pompası Su tuzak ve sonra bir 1 L Büchner şişesi bağlayın.
  6. Büyük Büchner huni şişeye yerleştirin ve Büchner huni dört kat tülbent ile alt çizgi.
  7. Vakum pompası açmak.
  8. Tülbent ve kazıma yoluyla homojenize tümörleri bir kısmını bir spatula ile dökün.
  9. Bazı dH2O teliospores aracılığıyla floş için tülbent dökün.
  10. DH2tekrar tülbent ile geliyor O açıktır.
  11. Homojenize tümör materyal içeren en fazla teliospore kurtarma sağlamak için filtre içine tülbent dışarı sıkmak.
  12. 1 L Büchner şişeye yakın alırken tam, büyük bir Erlenmeyer şişesi boşaltın ve bir kenara koyun.
  13. Filtre içine tülbent yeni bir parça koy ve tüm tümörler bozulduğu ve filtre (2.7-2.12) tamamlayana dek.
  14. Filtre uygulanmış teliospores autoclaved 250 ml'lik santrifüj şişe ve 5 min için 1000 x g, santrifüj içine dökün ve süpernatant dikkatle boşaltmak.
  15. Tüm filtre uygulanmış teliospores tarafından Santrifüjü pelleted kadar 2,14 tekrarlayın.
  16. Granül küçük bir miktar su ve 50 mL santrifüj tüpleri transfer askıya.
  17. 1000 x g 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi ve süpernatant dikkatle boşaltmak.
  18. Pelet askıya dH2O yaklaşık 50 mL, 1000 x g 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi ve süpernatant dikkatle boşaltmak. Yavaşça gri üst tabaka bir spatula ve bunu atmayın ile kazı. Üstte gri bir tabaka artık kadar yineleyin.
  19. Kuru örnekleri bir vakum desiccator geceleme.
  20. 4 ° C'de kurutulmuş teliospores kullanmak kadar saklamak.
  21. İstenirse, teliospores Bakır sülfat8 ile çimlenme için inducing önce tedavi. Tedavi değil, örnek saf teliospores temsil eder ve bakteriyel veya diğer contaminations yoksun olduğunu onaylamak için teliospores ayrıntılı mikroskobik analizi gerçekleştirin.
    1. Yaklaşık 50 mg teliospores 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde dışarı tartın.
    2. Yaklaşık 1.0 mL % 0.75 CuSO4 teliospores içeren 1.5 mL microcentrifuge tüp ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı teliospores 3 h için örnek Tantanacı tarafından takip CuSO4 çözümde askıya almak için.
    3. 2500 x g 5 min için de örnek santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın. Teliospore Pelet steril su ile resuspend, aralıklarla tekrarlayın ve süpernatant kaldırın.
    4. 2.21.3 iki kez daha tekrarlayın.

3. teliospore canlılığı ve çimlenme Test

  1. U. maydis teliospores canlılığı değerlendirmek için 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde yaklaşık 10 mg ve çimlenme zamanlaması tartın.
  2. Bir biyogüvenlik kabini, streptomisin sülfat (160 µg/mL) ile desteklenmiş patates dekstroz suyu (PDB, 24 g/L) hazırlayın.
  3. Teliospores PDB 500 µL içinde askıya alma. Yavaşça karıştırın ve teliospores tüm kümeleri kadar kırmak için pipet.
  4. Teliospore süspansiyon bir autoclaved 250 mL Erlenmeyer PDB 10 mL içeren flask aktarın.
  5. 12-16 h için 90 rpm'de sallayarak 28 ° C'de şişeye kuluçkaya.
  6. Bir biyogüvenlik kabini, çimlenme ve mikroskop slayt hazırlamak için indüklenen teliospores 20 µL örneğini kaldırın.
  7. Bir mikroskop kullanarak, görsel olarak mevcut çimlenme aşamaları ve bakteriyel kontaminasyon varlığı değerlendirmek.
    1. Teliospores saymak sahneler bir hemasitometre kullanarak V ile ve germinated yüzde belirlemek.
    2. Eğer sadece evre ı teliospores mevcut, teliospore çimlenme değerlendirilmesi önce 24 saat olmak üzere toplam şişeye kuluçkaya devam. Örnek uygun olmayan deeming önce kuluçka en fazla 48 h devam.
    3. Bakteriyel kirlenme varsa, sefaloridin sülfat (50 µg/mL) ile PDB streptomisin sülfat (160 µg/mL) yanı sıra ek ve adımları 3.1 3,7 için yineleyin. Bakteriyel kontaminasyon ederse, teliospores Bakır sülfat ile tedavi ve 3.1 3,7 olan adımları yineleyin.

4. solunum izleme çimlenme indüksiyon

  1. Eşit miktarda tartmak (örn., 50 mg), her solunum deney için teliospores.
  2. Bir biyogüvenlik kabini, teliospores bir autoclaved solunum odasına ekleyin.
  3. Dolgu PDB (24 g/L) ile odası streptomisin sülfat (160 µg/mL) ve sefaloridin sülfat (50 µg/mL) ile desteklenmiştir.
  4. Yukarı ve aşağı bir teliospore süspansiyon oluşturmak için pipet.
  5. Odası kapak hava sıkı mühür oluşturmak için odasına koyun.

5. oksijen tüketim hızı (OCR) ölçümleri elde etme

  1. Odası (28 ° C'ye ısıtılmış) bir su banyosu içinde odası raf yerleştirin.
  2. O2 soruşturma açılması odasının içinde bir yer.
  3. Gerçek zamanlı "SensorTrace oranı" programı olarak görünen veri noktaları izlemek ve (~ 3 sonda odasında yerleştirildikten sonra min) stabilize etmek sonda izin.
  4. "2 s aralıklarla kaydedilen ölçümleri ile 6 h için sürekli olarak O2 düzeylerini ölçmek için ölçü birimi"'ı tıklatın.
  5. Ölçüm durdurmak ve adımları 4.1-5,4 analiz edilecek her örnek için yineleyin.
  6. Tıklatarak verileri Microsoft Excel'e ver "dosya | İhracat | «««Kaydet".xls.

6. veri analizi

  1. OCR hesaplamak
    1. "Within_Rates" sekmesi altında verilen Excel dosyasında "Oranı" her odası ölçüm (nmol/h) için kayıt.
    2. Deneysel her örnek için "Düzeltilmiş bir OCR değer elde etmek için oranı" deneysel örnek odası boş odasından "oranı" çıkarmak ve bu sayının mutlak değerini alır.
    3. Teliospores mg başına toplam OCR kitle kullanılan cep tarafından düzeltilen mutlak OCR değer bölerek hesaplayın.
    4. Ortalama her zorlanma "OCR teliospores mg başına" değerlerini çoğaltmak.
  2. Uygun istatistiksel yöntem kullanarak verileri analiz (e.g., öğrenci t-testi, Varyans analizi) Microsoft Excel diğer istatistiksel yazılım kullanarak.
  3. Ham veri grafiği, grafik istediğiniz her zaman-nokta için kalan oksijen yüzdesi hesaplamak için. İlk okuma kendisi tarafından bölmek ve (% 100 oksijen kalan) 100 ile çarpmak, sonra sonraki her okuma tarafından ilk okuma bölmek ve oksijen odasında kalan yüzde elde etmek için 100 ile çarpmak.

7. indüksiyon Teliospores çimlenme farklı aşamalarında yalıtmak için Teliospore çimlenme

  1. Streptomisin sülfat (160 µg/mL) bir biyogüvenlik kabini ile takıma PDB (24 g/L) hazırlayın.
  2. Yaklaşık 10 mg U. maydis teliospores 1.5 mL microcentrifuge tüp içine yerleştirin.
  3. Teliospores PDB 500 µL içinde askıya alma. Yavaşça pipet teliospores orta hiçbir kümeleri kadar karıştırın.
  4. Teliospore süspansiyon streptomisin sülfat ile desteklenmiş PDB içeren bir autoclaved 250 mL Erlenmeyer flask aktarın.
  5. Gecede 28 ° C'de 90 rpm'de sallayarak şişeye kuluçkaya.

8. Petri kabına ve Micromanipulator hazırlanması

  1. Petri kabına (57 cm2) damlacıkları pipetting satırlara göre microcapillary hazırlık ve örnek koleksiyon için hazırlayın.
    1. 5 (x 4) µL dH2O damlacıkları Petri kabına üst boyunca pipet.
    2. 2 µL (x3) RNA sabitleme çözüm üzerinde örnek koleksiyon için kullanılmak üzere Petri kabına pipet.
    3. Petri kabına teliospores takımıdır, 5 (x 30) µL damlacıkları pipet.
  2. Mineral yağı 15 mL petri kabına ekleyin. Bütün damlacıklar petrol devam etmeden önce kapalı olduğunu emin olun.
  3. Bir microcapillary 15 µm iç çapı, 1 mm flanş, 55 mm Uzunluk ve 20 ° uç açısı içinde microcapillary sahibinin yerleştirerek ve mineral yağ nerede kılcal eylem madeni yağ microcapillary girmek izin verir batış hazırlayın. Yayın microcapillary basınç su damlacığı getirmeden önce. Su ile microcapillary hazırlamak için Aspire edin.

9. aşama özel takımıdır Teliospores yalıtım

  1. Micromanipulator denetimleri kullanarak, hazırlanan microcapillary çimlenme damlacıkları birine taşıyın. Damlacık nüfuz eder, microcapillary alt ve microcapillary bir germinating teliospore kadar ağız çimlenme ilgi aşamasında.
  2. Yavaş yavaş germinating teliospore yakalamak için Aspire edin. Teliospore microcapillary girdiğinde alıyorum durdurmak. Microcapillary içinde yaklaşık beş teliospores kadar yineleyin.
  3. Micromanipulator ile microcapillary raise ve RNA sabitleme çözüm koleksiyonu damlacık getirmek. Damlacık nüfuz ve damlacık teliospores enjekte.
  4. Yaklaşık 1000 teliospores yakalanan 8.1-8.3 tamamlayana dek.

10. toplama damlacık kurtarılması

  1. Koleksiyon damlacık kadar pipet ve bir RNase/Dnaz-Alerjik 2.0 mL microcentrifuge tüp kapağı için transfer. Dikkatli bir şekilde bir pipet ile madeni yağ toplama damlacık bozmadan çıkarın.
  2. Teliospores RNA izolasyon gibi aşağı akım uygulamaları için kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Solunum teliospore uyuşukluk ve çimlenme sırasında değişiklikleri ölçme Clark tipli microrespirometer tabanlı yöntem kullanarak, biz uyuyan teliospores takımıdır için karşılaştırıldığında solunum (~ 1,075 µmol/h/mg) düşük düzeyde sergi doğruladı teliospores (~ 2,614 µmol/h/mg; Şekil 1A). Bu ortalama oranı solunum uyuyan teliospores ve çimlenme için indüklenen teliospores arasında bir ~2.4-fold değişiklik gösterir. Buna ek olarak, biz çimlenme için indüklenen teliospores oksijen alımı (şekil 1B) ~ 45 dk gecikme var belirledik. Bu oksijen alımı (şekil 1B) ~ 30 dakika gecikme ile oksijen ölçümleri başlangıcı arasında çimlenme indüksiyon ~ 15 dk. gecikme ek olarak belirtilir. Bu gözle görülür değişemeyen germinating teliospores moleküler değişikliklerin değerlendirilmesi başlamak için bir zaman noktası tanımlar.

Çimlenme sırasında sonraki değişiklikler olarak görülebilir. Çimlenme beş aşamalarında belirlenmiştir. Evre ı çimlenme ama uyuyan teliospores ayırt edilemez kalır için indüklenen çimlenme temsil teliospores. Aşama II teliospores bir promycelium teliospore çapı eşit veya daha az bir süre ile ortaya çıkan var. Aşama III teliospores teliospore çapı daha büyük promycelia var. Evre IV çimlenme basidiospores promycelia gelen ilk tomurcuklanma ve sahne V tomurcuklanma tarafından bölmek elde edilen haploit basidiospores (Şekil 2). Geliştirdiğimiz mikrodiseksiyon yöntemi kullanarak başarıyla 500-1000 takımıdır teliospores RT-PCR veya RNA-Seq (Tablo 1) için RNA izolasyonu gibi aşağı akım uygulamalar için izole ettim. Şekil 3 genel set mikrodiseksiyon için Petri dish ve adımlar mikrodiseksiyon bir micromanipulator kullanarak için ortaya çıktı.

Figure 1
Şekil 1: zamanlı Kurs teliospore çimlenme sırasında oksijen tüketiminin. Uyuyan teliospores çimlenme ikna ve oksijen seviyesi sürekli olarak 6 h Clark tipli microrespirometer kullanarak kaydedildi. Un indüklenen uyuyan teliospores bir denetim olarak kullanılan ve tüm ölçümler için boş bir örnek normalleştirilmiş. ((A)) ortalama OCR temsil edilen veri. (B) solunum eğrileri, değişikliklerin tespiti OCR içinde saat boyunca izin elde etmek ham veri çizilen. Çimlenme için indüklenen teliospores tüketmek ortalama bir oranda oksijen 2.4-fold un indüklenen uyuyan teliospores daha hızlı (p < 0,01; Öğrenci t-test). Domuz: çimlenme sonrası indüksiyon. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: teliospore çimlenme aşamaları. Ben teliospore çimlenme V ile resimli aşamaları (A-E). Ölçek çubuğu 20 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: teliospores takımıdır farklı morfolojik aşamaları yalıtmak için mikrodiseksiyon. Genel Kurulum mikrodiseksiyon için bir Petri dish ve teliospore evre III. çimlenme izole için adımlar resimli. (A) bir petri çizimi ya da steril su, RNA sabitleme çözüm içeren veya teliospores takımıdır damlacıkları satırlarla ayarlayın. Çimlenme indüksiyon teliospores çimlenme mikrodiseksiyon kullanarak belirli aşamalarında izole edildi. (B) içeren bir çimlenme damlacık teliospores aşamada çimlenme için indüklenen ben ile III. (C) bir hazır microcapillary için bir aşama III teliospore aspirasyon yoluyla koleksiyonu için büyütüldüm. (D) Stage III teliospore cam microcapillary içinde çimlenme damlacık kaldırılır ve bir koleksiyon damlacık taşındı. (E) microcapillary koleksiyonu damlacık içeren RNA sabitleme çözüm eklenmiş ve sahne III teliospore damlacık enjekte ettiler. (F) sahne III teliospores RNA sabitleme çözümde topluluğu. Ölçek çubuğu 20 µm (A-D, F) ve 50 µm (E) =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Çimlenme sahne İzole takımıdır teliospores sayısı
Evre ı 1000
Evre II 500
Aşama III 650

Tablo 1: sayısı için bir standart yalıtım deneyi her çimlenme aşamasında başarılı bir şekilde izole takımıdır teliospores. Tablo mikrodiseksiyon istimal sahne için izole edilmiş teliospores ortalama numaralarını gösterir ben III koleksiyonu aşağı akım uygulamaları için önce aracılığıyla.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Basidiomycete biotrophic bitki patojenleri milyarlarca dolar her yıl ürün kayıplara neden. Bu patojenler büyük çoğunluğu mantar dağılma ve Eşeyli üreme için ayrılmaz teliospores üretmek. Bilgi geliştirme ve teliospores çimlenme kazanıyor bu mantarlar tarafından neden yıkıcı hastalıkların yayılması anlamak için önemlidir. Anahtar kontrol noktalarında moleküler değişiklikleri tanımlamak için fizyolojik vardiya ve teliospores çimlenme farklı aşamalarında yalıtmak için başka bir zamanlama tanımlamak için bir yöntem geliştirdi. Seto vd. (yayımlanmamış) ünlü beş aşamalarında teliospore çimlenme tarafından ışık mikroskobu (Şekil 2). Fizyolojik etkinleştirme sırasında araştırmak için evre ı ve çimlenme sırasında solunum oranı değerlendirmek için biz Clark tipli microrespirometer tam olarak oksijen tüketimi değişiklikleri ölçmek için kullanılır. Bizim örnek veriler bizim yöntem hassas ve son derece tekrarlanabilir gösteriyor. Cihazla ilgili izlenimlerimizi U. maydis takımıdır teliospores hücresel solunum için un indüklenen uyuyan teliospores göre ciddi bir artış gösteren onaylayın. İlk kez, biz çimlenme için indüklenen U. maydis teliospores oksijen alımını ~ 45 dk gecikmeden sergi belirledik. Bu U. maydis teliospores çimlenme sinyalleri işlemek için biraz zaman gerekebilir göstermektedir (örn., şeker varlığı) yanıt vermeden önce bu artan oksijen alımını arasında çimlenme sinyalleri için çok acil yanıt değil veya bizim tahlil minimal değişiklik ilk oksijen alımını algılamak için hassas değildi.

Kurum teliospores solunum oranları inceleyerek çalışmalar3 oksijen ölçmek için Warburg şişesi cihazları üzerinde dayanıyordu önceki manometrically5düzeyleri. Kısaca, bu yöntem Manometre kolundan sıvı düzeyi değişiklikleri doğrudan gözlem yoluyla kapalı bir şişe içinde basınç değişiklikleri tespit ederek oksijen tüketimi ve CO2 üretim ölçer. Deneyler kurmak zor olabilir ve ölçümler imprecise olabilir. Cihazı ölçüm dönemi boyunca katıldı olmalıdır ve kapsamlı hesaplamalar OCR tahmin etmek için gereklidir. Bizim protokol yapar teknolojik gelişmeler kullanın, gereksinimi ortadan kaldırarak kullanıcının cihazı tarafından Deneme süresince kalır yanında göz ölçümleri almak ve geniş matematiksel formüller kullanın. Ancak, erken bu araçların en fazla 20 dk sürekli ölçümler izin, diğerleri erken Clark tipli respirometers ölçü OCR Neurospora crassa9 ve Botryodpilodia theobromae10 sporlar için kullandık. Bu sınırlama ~ 45 dk gecikme tanımlaması içinde biz daha yeni modeli respirometer ile gözlenen oksijen alımını izin vermezdi. Okuma odası, hangi doğrudan herhangi bir hesaplama veya veri manipülasyon grafiği çizilecek kalan oksijen konsantrasyonu olduğu gibi bizim iletişim kuralı veri yorumu daha basit, yaptı. Buna ek olarak, sürekli ölçümler almak mümkündür (her 2 s) kullanılabilir oksijen tamamen tükenmiş kadar belirsiz bir süre için. Bu solunum uzun bir süre içinde küçük değişiklikler tanımlanmasına izin verir. Bu nedenle, biz önceki teknikleri geliştirilmiş ve mantar sporları oksijen tüketimi ölçmek için basit, hassas ve tekrarlanabilir bir yöntem geliştirdi. Bilgimizi, bu solunum teliospores kurum mantar takımıdır karşı uyuyan, eğitim için modern bir Clark tipli respirometer kullanmak için ilk çalışmadır.

Rağmen kolaylık ve basitlik bu protokol, optimizasyon gereklidir ve biyolojik gerçekler analiz sınırlı. İlk, uygun örnek boyutları makul otomatik olarak karakterlerini tanır elde etmek için tanımlanması gerekir. Çok fazla örnek erken oksijen düzeyleri çökmesini için yol açabilir ve çok az örnek yetersizlik oksijen tüketimi anlamlı değişiklikler gözlemlemek için neden olabilir. İkinci olarak, (~ 3 dk) doğru ilk veri sağlamak için stabilize etmek prob süre vermek zorunludur. Son olarak, çimlenme orta antibakteriyel ajanlarla tamamlamak önemlidir (örn., streptomisin sülfat) bakteriyel kontaminasyon OCR okuma değiştirmemesi sağlamak için. Biz karşı biyolojik sınırlamaları ölçüm, (~ 1 görsel morfolojik değişiklikler gözlemci tarafından belirlenen %) saat boyunca düşük çimlenme oranı vardı. Spore canlılığı belirleme spore sayısına oranla dönüştürmek bu oranı belirleme sağlayacak ve teliospores daha yüksek oranda çimlenme ile izole daha yüksek otomatik olarak karakterlerini tanır için yol açacak. U. maydis teliospores11 zaman uyumsuz çimlenme için muhasebesi gerekir ve oksijen tüketimi daha önce çimlenme algılamak için bir yetersizlik için katkıda bulunmuştur bir gerçekliktir.

Doğruluk ve teliospore Solunum ölçüm değişiklikleri kesinliğini artırmak için bu yöntemin gelecekte uyarlamalar OCR tek bir hücre temelinde ölçme içerir. Embriyolardan teknikleri, hangi o zaman çimlenme için bağlı olmak ve solunum hızları izlenebilir bir tek teliospore yalıtmak için kullanılabilir. Bu çözünürlük, uyuşukluk-çimlenme vardiya başına teliospore yerine teliospores mg başına sırasında OCR ile ilgili bilgi sağlayan artırabilirsiniz. Buna ek olarak, bu zaman uyumsuz çimlenme karıştırıcı sorunu çözer.

Çimlenme sonraki aşamalarını için teliospores çimlenme ortak aşamalarında yalıtmak için bir Embriyolardan yöntem geliştirdik. Bu nispeten zaman uyumlu teliospore nüfus analizi için oluşturulmasını sağladı. Tek mikroorganizmalar izole için çeşitli yöntemler tarif var ve12yıl üzerine geliştirilmiştir. Bu yöntemler tek mikroorganizmalar, orta micromanipulators kullanan kodlamayla ve mekanik yöntemleri için transfer sporlar elde etmek için microcapillaries kullanımını yarı mekanik yöntemlerle elde etmek için spor süspansiyonlar seyreltme içerir . Teliospores çimlenme aynı aşamada elde etmek için kullanılan önceki yöntemleri kanatlı santrifüj elutriation ve takımıdır teliospores belirli gözenek boyutu olan bir naylon membran aracılığıyla filtreleme içerir. Teliospores takımıdır için zenginleştirmek için bize izin verdi bu yöntemleri kullanarak, ancak, örneklerimizi hâlâ teliospores çimlenme13çeşitli aşamalarında kontrol altında. Embriyolardan tek mikroorganizmaların için mevcut teknoloji ile daha yüksek büyütme ve aletleri kapiller iğne, aspirasyon ve transfer mikroorganizmaların hassas denetim için giriş geliştirdi. Önceki Embriyolardan teknikleri tek hücre kültürü için veya tek hücre PCR uygulamaları14kullanmak için izole üzerinde odaklanmıştır. Micromanipulators tek mantar sporları yalıtmak için kullanımı daha önce kurulmuş değil. Tek mantar sporları izole bir önceki yöntem iyi forseps veya katı orta sporlar15takımıdır içeren küçük parçaları toplamak için iğne kullanımı dahil. Embriyolardan micromanipulators kullanımı ile ascospores kümeleri kültür agar orta segregasyonun genetik analiz16için ayrılmış aşağıdaki sporulation nerede olabilir Maya çalışmalarda yaygın olarak kullanılır. Biz bakteri hücreleri14 Embriyolardan tekniği birleştiren bir yöntem ve takımıdır teliospores izole vitro fertilizasyon yöntemler geliştirdik. Biz ortak çimlenme sahne teliospores yüzlerce bu tekniği ile elde edilebilir göstermiştir. Bu örnekler RT-qPCR gibi teknikleri kullanarak akış yönündeki ifade çalışmaları için kullanılabilir veya RNA-devamı içinde çimlenme eşitlenir teliospores nüfusu alma belirli değişiklikleri analiz sırasında ortaya çıkan ve gen ifadesinde izin verir erken, orta ve daha sonraki aşamalarında teliospore çimlenme.

Sahne teliospores takımıdır belirli mikrodiseksiyon deneyim küme kadar gerekli olabilir ve çimlenme farklı aşamalarında kabul ederek, ancak, bu deneyim hızlı bir şekilde uygulama yoluyla elde edilebilir. Başarılı mikrodiseksiyon RNA izolasyon tarafından takip için takip edilmesi gereken birkaç adım vardır. İlk olarak, çimlenme orta antibiyotik ile takviye gerekir (örn., streptomisin sülfat) büyüme çimlenme başlatıldığında bakteriyel kirlenme yanı sıra teliospores takımıdır toplama sırasında bastırmak için. İkinci olarak, stabilize ve RNA izolasyon için korumak için bir istikrar çözüm kullanmak önemlidir. RNA sabitleme çözüm ek teliospores toplanırken sonraki çimlenme Sahne Alanı'na ilerliyor toplanan teliospores da engeller. Üçüncü olarak, bir kez başarılı RNA ayıklama sağlamak için toplama damlacık kurtarıldı madeni yağ kaldırmak önemlidir. Son olarak, biz izole teliospores uzun bir süre için RNA sabitleme çözümde depolanmışsa, RNA kalite kaybı fark ettim; Bu nedenle, bu RNA hemen çimlenme sahne belirli teliospores topluluğu izole önerilir. A sınırlama-in belgili tanımlık yöntem sahne olduğunu ben toplanan teliospores uyuyan, ölü ve bu üç aşamalı morfolojik ayırt edilemez olduğu gibi teliospores çimlenme için indüklenen içerebilir. Ayrıca, sahne III teliospores toplarken, mayoz teliospores karışımı ben veya mayoz II elde edilebilir. Örnek canlılığı belirlemek için gerçekten uyuyan ve ölü teliospores arasında ayrım yardım etmenin bir yolu olabilir. Mantar spore canlılığı canlı/ölü hücre canlılığı deneyleri kullanarak değerlendirmek için bir yöntem uygun teliospores hangi-ebil var olmak daha bilgilendirici çimlenme oranları belirlenen17yüzdesi değerlendirmek mümkün olabilir. Buna ek olarak, DAPI ile boyama çekirdek sahne III ve sahne IV geçiş sırasında daha fazla Aşama III, morfolojik teliospores karakterize için ortaya çıkan mayoz olayların görselleştirmek için örneğin, kullanılabilir. Bu teliospores koleksiyonu yalnızca bir çimlenme aşamasında bizim mikrodiseksiyon yöntemini kullanırken yardım edeceğini.

Sonuç olarak, Ustilago maydis teliospores uyuşukluk-çimlenme vardiyası sırasında gerçekleşen hücresel solunum değişiklikleri ölçmek basit, hassas ve tekrarlanabilir bir yöntem geliştirdik. Buna ek olarak, belirli aşamaları RNA-devamı gibi aşağı akım uygulamaları için kullanılabilecek teliospores takımıdır toplamak için bir yöntem geliştirdik Bizim yöntemleri çeşitli hücre tipleri ve türler için adapte edilebilir. Biz ilerleme-e doğru bizim teknikleri solunum değişiklikleri tek bir spor yanı sıra daha fazla çimlenme daha sonraki aşamalarında meydana gelen olayları tanımlama düzey algılama kolaylaştırmak olacaktır tahmin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının veya diğer çatışmaları ifşa etmek var.

Acknowledgments

Dr Paul Frost onun microrespirometer kullanımı için ve Nicole Wagner ve Alex Bell teknik destek için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser finanse edildi B.J.S. için bir NSERC hibe

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Streptomycin Sulfate BioShop STP101
Kanamycin Sulfate BioShop KAN201
Potato Dextrose Broth BD Difco 254920
1 L Waring Laboratory blender Waring 7011S
Cheesecloth VWR 470150-438
Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock ThermoFisher Scientific 5310-0250
Unisense MicroRespiration system
MicroRespiration Sensor (O2) Unisense OX10
MicroOptode Meter Amplifier Unisense N/A
MR-Ch Small Unisense MR-Ch
SensorTrace Rate Software Unisense N/A
MicroRespiration Rack Unisense MR2-Rack
MicroRespiration Stirrer Unisense MR2-Co
Microdissection system
Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope Zeiss
Coarse Manipulator Narishige MMN-1
Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator Narishige MMO-202ND
Pneumatic Microinjector Narishige IM-11-2
TransferTip (ES) Eppendorf 5175107004

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saville, B. J., Donaldson, M. E., Doyle, C. E. Meiosis - Molecular Mechanisms and Cytogenetic Diversity. Swan, A. InTech. 411-460 (2012).
  2. Christensen, J. J. Monograph Number 2. The American Phytopathological Society. Worcester, MA. (1963).
  3. Caltrider, P. D., Gottlieb, D. Respiratory activity and enzymes for glucose catabolism in fungal spores. Phytopathology. 53, 1021-1030 (1963).
  4. Allen, P. J. Metabolic aspects of spore germination in fungi. Ann. Rev. Phytopathol. 3, 313-342 (1965).
  5. Warburg, O. Metabolism of tumours. Biochemische Zeitschrift. 142, 317-333 (1923).
  6. Ostrowski, L. A., Saville, B. J. Natural antisense transcripts are linked to the modulation of mitochondrial function and teliospore dormancy in Ustilago maydis. Mol Microbiol. 103, (5), 745-763 (2017).
  7. Morrison, E. N., Donaldson, M. E., Saville, B. J. Identification and analysis of genes expressed in the Ustilago maydis dikaryon: uncovering a novel class of pathogenesis genes. Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 34, (3), 417-435 (2012).
  8. Doyle, C. E., Cheung, H. Y. K., Spence, K. L., Saville, B. J. Unh1, an Ustilago maydis Ndt80-like protein, controls completion of tumor maturation, teliospore development, and meiosis. Fungal Genetics and Biology. 94, 54-68 (2016).
  9. Stade, S., Brambl, R. Mitochondrial biogenesis during fungal spore germination: respiration and cytochrome c oxidase in Neurospora crassa. J Bacteriol. 147, (3), 757-767 (1981).
  10. Brambl, R. Characteristics of developing mitochondrial genetic and respiratory functions in germinating fungal spores. Biochim Biophys Acta. 396, (2), 175-186 (1975).
  11. Sacadura, N. T., Saville, B. J. Gene expression and EST analyses of Ustilago maydis germinating teliospores. Fungal Genet Biol. 40, (1), 47-64 (2003).
  12. Hilderbrand, E. M. Techniques for the isolation of single microorganisms. Botanical Review. 4, (12), 38 (1938).
  13. Seto, A. M. Analysis of gene transcripts during Ustilago maydis teliospore dormancy and germination. Trent University. M.Sc. thesis (2013).
  14. Fröhlich, J., König, H. Soil Biology - Intestinal Microorganisms of Termites and Other Invertebrates. König, H., Varma, A. Springer. 425-437 (2006).
  15. Choi, Y., Hyde, K., Ho, W. Single spore isolation of fungi. Fungal Diversity. 3, 11 (1999).
  16. Sherman, F. Getting started with yeast. Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Pt B. 350, 3-41 (2002).
  17. Chen, Y., Seguin-Swartz, G. A rapid method for assessing the viability of fungal spores. Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 24, (2), 230-232 (2002).
Microrespiration analizi ve mikrodiseksiyon kullanarak soruşturma Teliospore çimlenme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ostrowski, L. A., Seto, A. M., Saville, B. Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection. J. Vis. Exp. (135), e57628, doi:10.3791/57628 (2018).More

Ostrowski, L. A., Seto, A. M., Saville, B. Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection. J. Vis. Exp. (135), e57628, doi:10.3791/57628 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter