Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Micromanipulation teknikker giver mulighed for analyse af morfogenetiske Dynamics og omsætning af Cytoskeletal regulatorer

Published: May 12, 2018 doi: 10.3791/57643
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Division of Molecular Cell Biology, Zoological Institute, Technische Universität Braunschweig, 2Department of Cell Biology, Helmholtz Centre for Infection Research

Summary

Vi beskriver hvordan mikro- og photomanipulation teknikker såsom FRAP og photoactivation aktiverer bestemmelse af motilitet parametre og spatiotemporelle dynamikken i proteiner inden for overflytning celler. Eksperimentelle udlæsninger omfatter subcellulært dynamics og omsætning af motilitet tilsynsmyndigheder eller de underliggende actin cytoskeleton.

Abstract

Undersøge den spatiotemporelle dynamics af proteiner kan afsløre deres funktionelle betydning i forskellige sammenhænge. I denne artikel er det diskuterede hvordan fluorescerende opsving efter photobleaching (FRAP) og photoactivation teknikker kan bruges til at studere proteiner subcellulært steder spatiotemporelle dynamik. Vi viser også, hvordan disse teknikker giver enkel bestemmelse af forskellige parametre knyttet til aktin cytoskeletal forordning og celle motilitet. Derudover er mikroinjektion af celler desuden beskrevet som en alternativ behandling (potentielt forud for eller supplerer de førnævnte photomanipulation teknikker) udløser øjeblikkelige virkninger af omplantede proteiner på celle morfologi og funktion. Micromanipulation såsom protein injektion eller lokale anvendelse af plasma membran-gennemtrængelige narkotika eller cytoskeletal hæmmere kan tjene som kraftfuldt værktøj til at registrere umiddelbare konsekvenser af en given behandling på celle adfærd på en enkelt celle og subcellulært niveau. Dette eksemplificeres her ved umiddelbar induktion af lamellipodial celle kant fremspring ved injektion af rekombinant protein, Rac1, som etablerede et kvart århundrede siden. Derudover giver vi en protokol til bestemmelse af omsætningen af forbedrede grøn fluorescerende proteiner (EGFP)-VASP, en actin glødetrådens polymerase fremtrædende akkumulere på lamellipodial tips B16-F1 celler, beskæftiger FRAP og herunder tilknyttede data analyse og kurve montering. Vi præsenterer også retningslinjer for beregning af satserne for lamellipodial actin netværk polymerisering, som eksemplificeret af celler, der udtrykker EGFP-tagged β-actin. Endelig er instruktioner givet for at undersøge priser af actin monomer mobilitet i cellen cytoplasma, efterfulgt af actin indarbejdelse på websteder af hurtige glødetrådens forsamling, som tips af fremspringende lamellipodia, ved hjælp af photoactivation tilgange. Ingen af disse protokoller er begrænset til komponenter og regulatorer af actin cytoskeleton, men kan nemt udvides til at udforske i analog mode spatiotemporelle dynamik og funktion af proteiner i forskellige forskellige subcellulært strukturer eller funktionelle sammenhænge.

Introduction

Overvågning spatiotemporelle dynamikken i proteiner og andre molekyler i levende celler er blevet et vigtigt værktøj i mange områder af celle- og molekylærbiologi. Avanceret Fluorescens mikroskopi-teknikker herunder fluorescens resonans energioverførsel (FRET) og FRET-fluorescens levetid imaging (FRET-FLIM), eller FRAP, fluorescens tab i photobleaching (FLIP) og photoactivation samt mange andre tillader for den tidsmæssige og rumlige sporing af protein-protein interaktioner, konformationelle ændringer, samt bestemmelse af kinetik af diffusion og lokalisering af forskellige proteiner i cellen1,2. FRAP og photoactivation teknikker, navnlig er alment gældende for behandlingen af regulatorer af actin cytoskelettet og celle migration. Disse teknikker kan anvendes alene eller i kombination med yderligere micromanipulation teknikker såsom mikroinjektion3og inddrage udtryk af fluorescently mærket proteiner. De tillade vurdering af kinetik af protein association til aktin-rige strukturer involveret i celle migration, såsom filopodia eller lamellipodia, af proteiner i fokale sammenvoksninger4, omsætning eller forgrenet actin netværk5. De gør det også muligt bestemmelse af lamellipodial actin polymerisering priser, vurdering af spredningen af monomere actin i cytosol, sats af subcellulært actin monomer translokation til polymeriserende actin filamenter i fremspringende lamellipodia6, og andre parametre.

FRAP er en metode til at visualisere og kvantificering af proteiner i en levende celle, oprindelig udviklet i 1970 ' erne af Axelrod7mobilitet. En region af interesse (ROI) i en celle, befolket med fluorescently mærket proteiner, er forbigående udsat for en laser af høj intensitet, tilstrækkeligt til at forårsage blegning af fluorophore molekyler findes i denne region i en given kort periode. De ublegede, fluorescently mærket proteiner beliggende uden for ROI under blegning, vil diffuse og infiltrere den bleget region alt efter deres spatiotemporelle dynamics, forårsager forskydning af photobleached molekyler over tid. Af fluorescens dækningsgraden i bleget regioner er afhængige af forskellige faktorer, herunder størrelse og satsen for udbredelse af en given molekyle, og naturligvis dets omsætning sats inden for den formodede forbundet bleget struktur. Således opløselige proteiner vil mægle inddrivelse af fluorescens i bleget ROI hurtigt gennem diffusion, mens proteiner tæt forbundet med strukturer, som focal sammenvoksninger, vil have længere omsætning gange, som deres fluorescens recovery vil afhænger af både på udbredelsen af de opløselige brøkdel af den struktur-associerede fraktion protein og dissociation-foreningen kinetik. Fluorescens recovery er normalt erhvervet og kvantificeret indtil den første præ blegemiddel intensiteten af fluorescens nået. Dette forekommer dog ikke hvis en del af den oprindelige fluorescens intensitet tilhører den såkaldte immobile fraktion, som ikke skal genopfyldes ved diffusion eller er efterfyldning på meget langsomme satser i forhold til fleste af molekyler bestående af mobilen brøk. Bestem satsen af protein omsætning genereres FRAP kurver, der repræsenterer omfanget af fluorescens opsving over tid. Fra disse opsving kurver, kan halv-gennemsnitstider protein opsving beregnes. Ved at oprette kurven passer i den gennemsnitlige FRAP data, og dermed matematiske analyser, er det også muligt at udlede, hvorvidt den gennemsnitlige omsætning sats i den mobile brøk er sammensat af en homogen population af molekyler, eller om det er sammensat af to eller flere delpopulationer af molekyler drejning over til differentierede priser. Ud over estimering protein omsætning satser af kvantitative tilgange, kan tracking genopretning af photobleached områder i lamellipodia også tillade for nøjagtig kvantificering af lamellipodial motilitet parametre såsom retrograd flow, fremspring, og aktin polymerisering priser. FRAP udgør et alsidigt værktøj til at blive anvendt til at vurdere forskellige parametre inden for strukturer af levende celler.

Photoactivation er en metode til at spore diffusion og mobilitet af proteiner eller molekyler med oprindelse fra en udpeget cellular placering. Teknikken beskæftiger, for eksempel, en variant af grøn fluorescerende vildtypeprotein (NGL), oprindeligt udviklet af Patterson og Lippincott-Schwartz8, der er muteret på en måde, der tillader dens fluorescens øges stærkt ved udsættelse for ultraviolet (UV) lys (ca. 400 nm; her, 405 nm). Som beskrevet af Patterson mfl., wild-type normal god landbrugspraksis lysopfangende eksisterer som en blandet population af neutrale phenoler og anioniske phenolates, der producerer et større absorbans højdepunkt på ca 397 nm og en lille en på 475 nm, henholdsvis. Ved bestråling af proteinet med UV-lys gennemgår befolkningen photoconversion, skiftende retning af anioniske form. Når ophidset af 488 nm, photoconverted/photoactivated protein udstiller en 3-fold stigning i fluorescens, utilstrækkelig i praksis for at skelne mellem aktiveret og ikke-aktiveret normal god landbrugspraksis på grund af høj iboende baggrund fluorescens. Dog er der sket et fald i baggrunden intensitet ved at indføre en enkelt aminosyre mutation i normal god landbrugspraksis sekvens (histidin substitution på position 203). Den resulterende T203H mutant, også kendt som photoactivatable-normal god landbrugspraksis (PA-NGL) er karakteriseret ved en betydelig reduktion i absorbansen af den mindre peak, som ved bestråling med UV-lys er steget næsten 100 når efterfølgende ophidset af 488 nm lys. Overekspression af PA-normal god landbrugspraksis-tagged proteiner er derfor en udbredte tilgang, som giver mulighed for bestemmelse af diffusion og motilitet af molekyler i celler. Vi har tidligere anvendt PA-normal god landbrugspraksis-tagged actin Bestem satsen for spredning af actin monomerer fra cytosole regioner, giver ikke kun udforskning af deres mobilitet inden for cytosol, men også deres iblanding i den fremspringende lamellipodial actin netværk6. Nyere litteratur beskriver også roman, foto-cabriolet proteiner, som i princippet kan bruges på en tilsvarende måde, men husly den potentielle fordel for at være synlige allerede før foto-konvertering. For denne gruppe af fluorescerende proteiner eksempler Dendra2 og mEos29,10,11,12.

I denne artikel vil forklare vi metode af microinjecting celler med proteiner. Vi forklare yderligere, hvordan denne teknik kan kombineres med FRAP, af photobleaching proteiner involveret i actin cytoskeleton forordning og motilitet, og hvordan FRAP kurver og halv-time inddrivelse af mobile fraktioner kan udledes. Derudover giver vi et eksempel på hvordan FRAP teknik kan bruges til at bestemme actin polymerisering satser af lamellipodial netværk. Vi leverer også vejledning og tips om hvordan man udfører photoactivation eksperimenter, som kan bruges til at bestemme cytosole mobilitet af monomere actin og priser af actin indarbejdelse i lamellipodia. Disse teknikker er naturligvis ikke kun begrænset til sporing af actin cytoskeleton komponenter, men potentielt kræves moderat tilpasning eller optimering, kan i vid udstrækning anvendes til andre celletyper eller at undersøge forskellige proteiner, strukturer, og parametre.

Protocol

1. Coverslip vask og sterilisation

  1. Fordyb 15 mm (diameter) dække briller (no.1) i en 500 mL målekolbe indeholdende en blanding af 40 mL 37% HCl og 60 mL 100% EtOH (ikke mere end 100 coverslips pr. 100 mL vask løsning).
    Bemærk: Selvom frisk købt, coverslips stringent rengøres før såning celler på deres overflader. Dette er fordi de kan indeholder tynde film af fedt, som makroskopisk usynlig, men effektivt kan interferere med vedhæftning og passende spredning af levende celler. Der henviser til, at disse film kan fjernes effektivt med opløsninger indeholdende syre eller base (Se Fischer et al. 13), bruger vi rutinemæssigt syre/alkohol blandingen beskrevet ovenfor.
  2. Kolben rystes der indeholder dækning glas i 30 min. på en rotation shaker. Vælg en hastighed, der giver mulighed for dækning briller at blive hvirvlet frit, men sen nok til at undgå hyppige bryde. Filtratet løsning for at fjerne glasskår stykker hvis genbrug.
  3. Overføre dække briller til en kolbe indeholdende mindst 200 mL sterilt vand og Ruger på en rotation shaker, mens gentagne gange erstatte vandet indtil den sure lugt er forsvundet. Flere vasker over flere timer anbefales til fuldstændig fjernelse af HCL-EtOH spor.
  4. Tørre individuelle dække briller på et ark filtrerpapir.
  5. Sted dække briller i bunden af en 10 cm (diameter) petriskål dækket med filtrerpapir og varme tørre-sterilisere. Undgå autoklavering, da dette vil medføre dække briller til at holde sammen.

2. behandling af celler, Transfektion og såning på Coverslips

  1. Vokse B16-F1 mus melanom celler standard celle kultur betingelser i DMEM (4,5 g/L glucose) der indeholder 10% føtalt kalveserum, 2 mM glutamin og 1% penicillin-streptomycin ved 37 ° C, 7% CO2.
  2. Vokse NIH3T3 fibroblastceller for microinjections standard celle kultur betingelser (vævskultur inkubator ved 37 ° C, 7% CO2) i DMEM (4,5 g/L glucose) der indeholder 10% føtal bovint serum, 1 mM natrium pyruvat, 1 x MEM ikke-essentielle aminosyrer , 2 mM glutamin, og 1% penicillin-streptomycin.
  3. For transfections, vokse B16-F1 celler til 100% sammenløbet i en 10 cm parabol og passage i forholdet 1:5 til en 3 cm (diameter) plastik skål.
  4. Den samme dag, efter B16-F1 celler fik lov til at holde sig i mindst 6 timer, transfect med 500 ng/fad af photoactivatable PA-normal god landbrugspraksis-actin eller EGFP-tagged β-actin plasmid DNA. For Co transfections af PA-normal god landbrugspraksis-actin med mCherry-kodning vektorer, bland alt 1 µg af plasmid DNA pr. 3 cm parabol.
  5. Transfect B16-F1 celler med Transfektion reagens (Tabel af materialer). For en 3 cm skål, bland 200 µL af 150 mM NaCl indeholdende 500 ng af DNA konstruere med 200 µL af 150 mM NaCl indeholder 1 µL af Transfektion reagens (dvs DNA (µg): reagens (µL) forholdet 1:2 blev brugt).
  6. Inkuber Transfektion blandingen i 20 min. ved stuetemperatur (RT) og afpipetteres Dråbevist på 3 cm parabol med cellerne. Forsigtigt swirl skål til at blande og inkuberes natten over ved 37 ° C, 7% CO2.
  7. Forberede laminin coatingbuffer indeholdende 50 mM Tris, pH 7,4 og 150 mM NaCl.
  8. For B16-F1 celler, pels 15 mm dække briller ved at sprede 150 µL af laminin (25 µg/mL i laminin coatingbuffer) og Inkuber i 1 time på RT. For NIH3T3 cellerne, pels dække briller med fibronektin løsning (25 µg/mL i fosfatbufferet saltopløsning (PBS)) og Inkuber i 1 time på RT.
  9. Vaske laminin - eller fibronektin-rugede dække briller med PBS, så Aspirér PBS og der tilsættes 2 mL af transfekteret celler.
  10. Seed transfected B16-F1 cellerne (i 1:30 forholdet fra en sammenflydende parabol), dagen efter Transfektion på laminin-belagt coverslips. Seed NIH3T3 fibroblaster (i 1:20-forholdet fra en sammenflydende parabol) på fibronektin-belagt coverslips.
  11. Tillad celler spredes på laminin - eller fibronektin-belagt dække briller natten over i en vævskultur inkubator ved 37 ° C før mikroskopi. Alternativt, mikroskopi eksperimenter kan blive indledt på den samme dag, at celler er tilladt at sprede for mindst 2-3 h.

3. montering af mikroskopi Imaging kammer

  1. Brug en varme ledende RC-26 aluminium imaging kammer for Mikroskopi (figur 1en). Smøre siliconefedt omkring konturen af plastik sealer åbningen ved hjælp af en sprøjte (figur 1b).
  2. Placere cover glas med celler side op på kammeret (figur 1c).
  3. Placer den plastik sealer på toppen af dækslet glas til at gøre en sikker tætning mellem coverslip og kammer. Lave plastik sealer (diagonalt for at undgå coverslip brud) ved at skrue de glidende klemmer på kammer at undgå medium utæt (fig. 1d).
  4. Pipette 37 ° C forvarmet mikroskopi medium i det centrale område. For medium reduceret i autofluorescence og dermed optimeret til mikroskopi, bruge den samme opskrift som næringssubstrat beskrevet ovenfor, men med F12-SKINKE i stedet for DMEM, som desuden indeholder 20 mM HEPES for dyrkning af celler i mangel af CO2 (figur 1e).
  5. Indsæt varme detektor udpegede plads i salen og sammenkæde elektroder af salen med en TC-324B automatisk temperatur controller opretholde en konstant temperatur på 37 ° C (figur 1f).
  6. Anbring en lille dråbe immersionsolie på målet og placere salen ovenpå.
  7. Inkuber kammer med celler i mindst 10-30 min at tillade dem at tilbagesøge temperaturfald under montering og tilpasse til mikroskopi medium.
  8. Før mikroskopi er indledt, erstatte næringssubstratet i den centrale reservoir af salen (ca 800 µL) at undgå upassende koncentration af mellemstore komponenter og serum på grund af medium fordampning. Langvarig mikroskopi sessioner med åbne kamre kræver rutine skiftende i den fordampende medium.

4. mikroinjektion Procedure

  1. Frakke i coverslips, forberede cellerne, og samle imaging kammeret som beskrevet ovenfor.
  2. Tø en alikvot af oprenset protein skal injiceres (typisk 10 µL eller mindre) og fortynd det med passende mikroinjektion buffer.
    Bemærk: Buffer sammensætning kan variere alt efter protein og celle type, men sørge for at bruge en pH-værdi mellem 6.95 og 8.00 og undgå at bruge PBS, som de fleste celle kan ikke lide at blive injiceret med PBS.
  3. Rac1 mikroinjektion, forberede buffer indeholdende 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT. Mg2 + ioner er afgørende for små GTPase stabilitet.
    Bemærk: Protein koncentrationer normalt variere mellem 0,1-1 mg/mL (maksimalt 2 mg/mL), afhængigt af proteinet, eksperiment, og celle type.
  4. Hvis det er relevant, skal du tilføje fluorescerende farvestof, som inert dextran (0,5 µg/mL, 70 kDa) til protein løsning, som kan bekræfte tilstedeværelsen af nålen flow før injektioner og tillader dokumentation af vellykket injektioner efter forsøget.
    Bemærk: Eksperimentet her er ikke sigter efter dynamikken i injiceres Rac1, der ville kun være mulig ved direkte fluorescens mærkning af protein. Kobling af proteiner med fluorescerende farvestoffer eller fusion til en fluorescerende proteiner er mulige, men undgås her som det havne risiko for at forstyrre funktionen signalering, navnlig af små proteiner som Rho-familie GTPase Rac1 (20 kDa).
  5. Der centrifugeres protein løsning på 10.000 x g i mindst 30 min. for at fjerne protein aggregater, der kan føre til nål tilstopning hvis tilstede i mikroinjektion kapillær.
  6. Indlæse en mikroinjektion nål (mikroinjektion kapillær) med 1 µL af injektion blanding fra bagsiden ved hjælp af en fleksibel pipette tip/microloader spids.
  7. Hvis luftbobler i nål-spids, forsigtigt trykke nålen base for at fjerne dem. Gå hurtigt til at undgå udtørring af nålen tip, som kan forårsage nål tilstopning.
  8. Nøje justere nålen holder på micromanipulation enhed. Hvis bruger en inverteret mikroskop for fase kontrast imaging, før nålen lastning, sørge for der er nok plads til at flytte nålen op og ned uden at hindre mikroskop kondensatoren.
  9. Ved skrue microcapillary nål holderen til, lægge pres (20 – 50 hPa baggrund pres) til nålen ved hjælp af en mikroinjektion pres enhed inden translocating nål-spids til cellekulturmedium.
    Bemærk: Aktivering presset når nålen er i mediet vil resultere i mediet bliver suget ved kapillær kraft, og således forbyder indsprøjtning af løsningen af interesse.
  10. Placer nålen i synsfeltet (lettes ved hjælp af lav forstørrelse mål). Et 40 X tør mål for mikroinjektion eksperimenter blev brugt her.
  11. Placer nålen tip makroskopisk i en lodret position i forhold til midten af formålet objektivet (dette vil fremskynde at finde nål-spidsen). Brug mikroskop med fasekontrast optik til at flytte nålen spidsen i det vandrette plan i forhold til synsfeltet på en optisk flyet godt-over cellelag.
    Bemærk: Nålen i første omgang vises som en skygge i synsfeltet og fokus flyet kan derefter justeres til at visualisere aflæsse. Når spidsen af nålen er fundet, gradvist lavere optisk flyet efterfulgt af nålen tip til en god beliggenhed tæt på cellelag.
  12. Tjekke nålen flow ved at skifte til en fluorescerende kanal, når du bruger fluorescerende dextran, og tune strømmen ved hjælp af pres enhed for at opnå en konstant "baggrund" flow.
    Bemærk: I denne artikel vil vi beskrive manuel indsprøjtning, hvilket er medieret af bryde gennem plasma-membran via rørende cellen overfladen og blid bevægelse af kanylen tip under konstant nål flow. Dette må ikke forveksles med automatiske indsprøjtning enheder under injektion begivenheder, som er mere passende for injektion af højere celle tal efterfulgt af en senere celle population ledsages af programmerede nål sænke og nål pres stigning analyse. Metoden beskrevet her er optimeret til enkelt celle analyse af time-lapse mikroskopi før, under og efter mikroinjektion.
  13. Find en celle af interesse og gradvist sænke nålen over cellen.
  14. Når du er klar til microinject, sænke nålen gradvist mod celle perinuclear regionen ved hjælp af den fine pinion af micromanipulator joystick, samtidig med at cellerne i fokus.
  15. For mikroinjektion, blidt røre plasma membran af cellen, som kan være nok til at trænge ind i cellen, eller støtte forbigående membran ruptur af en meget blid tap på opsætningen af mikroskop.
    Bemærk: En hvid prik på nål-spids vil angive tidspunktet for kontakt med plasma membran; efter membran brud, vil nålen tip reseal, ledsaget af en blid flow af injektion løsning ind i cellen.
  16. Stop indsprøjtningssystem processen, så snart strømmen ind i cellen er synlige (ideelt inden for 0,3 s) ved at flytte op nål tip til mediet. Når du bruger fluorescerende dextran, kan vellykket injektioner dokumenteres straks ved fluorescens.
  17. Hvis det ønskes, indlede time-lapse billede erhvervelse før eller efter mikroinjektion.
    Bemærk: Lokale anvendelse af narkotika eller hæmmere kan udføres på alle skridt her, bortset fra den mikroinjektion begivenhed i sig selv. For lokale applikationer, formidling af de aktive molekyle kan kontrolleres af flow pres og dokumenteret af fluorescens, og nål-spids kan være placeret i den ønskede højde. Se eksempler på lokal applikation eksperimenter, fx små og Rottner14 eller Kaverina et al. 15
  18. Efter mikroinjektion, vente, indtil effekten af proteinet opstår. For forskellige proteiner og afhængigt af det forventede resultat kan inkuberingstider variere. For den lille GTPase Rac1, svar af lamellipodium dannelse kan være påbegyndt indenfor 1 min eller mindre, men tager ca 10-15 min i gennemsnit til fuldt ud at udvikle (figur 1g, h).
  19. Dommer celler efter mikroinjektion levedygtighed.
    Bemærk: Upassende eller skadeligt injektioner kan forårsage celleskader, som er ofte ledsaget af uspecifik celle-kant retraktion eller plasma membran brud.
    1. Undgå at stikke gennem både top og bund plasma membran, der kan opstå for injektioner i fladt cellulære regioner.
      Bemærk: Injektionsvolumener bør holdes på et minimum (ideelt < 5% af det cellulære) og bliver normalt i femtoliter området. Kræves injektionsvolumener kan også styres af ændringer i koncentration, men Bemærk, at for proteiner, koncentrationer > 2 mg/mL kan blive upraktisk på grund af hyppige nål tilstopning. Men dette også afhænger af kvalitet og opførsel af oprenset protein; f.eks.indsprøjtning af fluorescently kombineret actin kompliceres af koncentration-afhængige og uundgåelige polymerisering i nål-spids, og så den udføres sjældent i dag (Se små et al. 16).
  20. Før, under eller efter effekten af mikroinjektion FRAP eller photoactivation kan udføres på den samme celle (Se afsnit 5 og 6).

5. FRAP Procedure

  1. Transfect celletype af interesse (B16-F1 celler her) med plasmid DNA kodning en fluorescently mærkede protein af interesse (her, en EGFP-mærket version af β-actin blev brugt). Frø celler på laminin-coated coverslips (trin 2.10).
  2. Samle den billeddiagnostiske afdeling (afsnit 3).
  3. Brug følgende indstillinger for lamellipodial region photobleaching: 65 mW laser power (variabel efter eksperimentel opsætning og laser kilde); 10 pixel laser lysbundtets diameter; 1 ms blegemiddel dwell tid/pixel; 500 ms normal god landbrugspraksis eksponeringstid; 1.500 ms tidsinterval. Eksperimentelle resultater i dette papir blev udført med en 100 X 1.4NA apokromatiske mål.
  4. Udføre laser kalibrering for at sikre nøjagtigheden i regionen photobleached dimensioner. Før kalibrering, flytte synsfeltet til et område, der mangler enhver celler/fluorescens signal og observere billedet på skærmen.
  5. Vælg den objektive forstørrelse ved at klikke på knappen respektive forstørrelse og reducere laser power (3-5 mW) i den "Panel | Intensitet"menu. For at starte manuel kalibrering på Visiview software (v2.1.4), Vælg den "Konfigurer | FRAP"menuen og klik på den" Calibrate | Justere manuel"menu. Sikre, at laseren kan skelnes som en skarp dot. Hvis ikke, enten koncentrere eller justere laser hardware.
  6. Udfør kalibrering af manuelt ledende laser til forudbestemte software X-Y koordinaterne. Dette instruerer softwaren hvordan du målrettet mod laser til en bruger-defineret region for den aktuelle forstørrelse.
  7. Før udløser laser, skifte til kanalen, normal god landbrugspraksis og indlede billede/tid bortfalder erhvervelse.
  8. Manuelt tegne region for at være photobleached på normal god landbrugspraksis kanal, mens du ser på skærmen.
  9. Indlede photobleaching af en manuel udløser af 405 nm laser, mindst 3 – 4 rammer efter indledningen af image erhvervelse. Erhverve rammer inden photobleaching er nødvendig for normalisering af billedet i senere dataanalyse.

6. Photoactivation Procedure

Bemærk: Software, opsætning af mikroskop og indstillinger, bortset fra laser power, er magen til dem for FRAP. I photoactivation, en vigtig forskel i forhold til FRAP, er der en 405-laser power betydeligt lavere end der ansat for photobleaching skal bruges til at aktivere PA-normal god landbrugspraksis uden samtidig photobleaching det.

  1. Co transfect celletype af interesse (B16-F1 celler her, se trin 2,5) med plasmid DNA kodning PA-normal god landbrugspraksis-actin og anden fluorescently mærket protein (f.eks. mCherry eller mCherry-Lifeact).
    Bemærk: I de fleste tilfælde, mCherry-positive celler vil også være positiv for PA-normal god landbrugspraksis-actin vektor, sidstnævnte normalt ikke ses i normal god landbrugspraksis kanalen før photoactivation. Øge chancen for, at mCherry-positive celler er også positiv for PA-normal god landbrugspraksis, bruge forholdet 1:2 Transfektion af mCherry:PA-normal god landbrugspraksis-actin. Efter denne protokol, mere end 90% af de celler, der udtrykker mCherry vises vellykket aktivering af PA-normal god landbrugspraksis-actin.
  2. Frø B16-F1 celler på laminin-coated coverslips (trin 2.10).
  3. Samle den billeddiagnostiske afdeling (afsnit 3).
  4. Før du indleder photoactivation eksperimenter, hvis det er nødvendigt, udføre laser kalibrering for det valgte mål (trin 5.4-5.6).
  5. Angiv normal god landbrugspraksis/488 nm billede erhvervelse til 500 ms eksponering og 1.500 ms tidsinterval (afhængigt af den eksperimentelle design).
  6. Justere softwareindstillingerne for for at erhverve enten dual-channel- eller triple-kanal time-lapse film ved mærkning pladsen "Bølgelængde serie" og vælge det ønskede antal kanaler i den "erhverve | Bølgelængde"menu. Det anbefales, at tid bortfalder film er erhvervet med fasekontrast og normal god landbrugspraksis kanaler.
    1. Eventuelt også medtage mCherry kanalen; dog kan udsætte celler med for meget lys fremkalde solskader. Dette kunne undgås med ilt skyllevæsker såsom Oxyrase17, selv om effektiv behandling kræver celle kammer forsegling.
  7. Find de transfected celler på mCherry kanal.
  8. Før udløser laser, indlede billede/tid bortfalder erhvervelse og manuelt tegne region for at være photoactivated på fase kontrast kanal, mens du ser på skærmen.
  9. Indlede photoactivation af en manuel udløser af 405 nm laser (intensitet ligger mellem 5-15 mW fra den "Panel | Intensitet"menu), mindst 3 – 4 rammer efter billede erhvervelse indledning.

7. dataanalyse og præsentation af FRAP resultater

Bemærk: Metoden præsenteret bruges til at undersøge omsætning af en protein akkumulere på lokaliteter af dynamiske actin forsamling, i dette tilfælde VASP, som knytter til vedhæftning websteder og tips af fremspringende lamellipodia. Vi analyserer dets omsætning på lamellipodium spids, men de samme principper for analyse kan anvendes til at undersøge omsætning af VASP eller nogen andre protein og andre subcellulært rum.

  1. Åbn time-lapse film stammer fra Visiview på Metamorph software. I denne artikel, blev Metamorph v7.8.10 brugt.
  2. Udlede intensitetsværdierne for photobleached regioner ved manuelt skitserer respektive regioner på Metamorph. Tegne en figur på spidsen af den lamellipodium, der dækker hele eller en del af photobleached området, og manuelt justere dets position på efterfølgende rammer hvis nødvendigt (dvs., Hvis kanten fremspringende), for at spore ændringer i lamellipodial intensiteter af den pågældende komponent under tip forskydning.
  3. Korrektion af baggrund og photobleaching erhvervelse, analysere regioner i og uden for cellen. Se figur 2en for repræsentative regioner af målte intensitet.
  4. Mens en ROI er valgt, uddrag dens intensitetsværdier på Metamorph ved hjælp af menuen "foranstaltning | Regionen målinger". Sikre indstillinger "Forløbet tid" og "Gennemsnitlige intensitet" er valgt i menuen "Konfigurer". Klik på "Åbn log" og vælge "Dynamic Data Exchange". Klik på "OK" for at åbne et Excel-regneark og klikke på knappen "Åbn log" igen for at indsætte Metamorph værdierne i Excel.
    Bemærk: Disse værdier bruges til at generere fluorescens opsving kurver.
  5. For at generere fluorescens opsving kurver på lamellipodium spidsen af photobleached regioner (normaliseret til regionen intensitet før photobleaching), gælde følgende ligning:
    Equation 1   Ligning 1
    hvor: FRAPTn er photobleached region intensitet for hver ramme af interesse efter photobleaching; UdTn er en region intensitet taget uden for cellen (baggrunden) for hver ramme af interesse efter photobleaching; InsTn er to gennemsnit inde i regionen intensiteter for hver ramme af interesse efter photobleaching (bruges til at normalisere for erhvervelse photobleaching over tid); FRAPT-1 er photobleached region intensiteten før photobleaching; T-1 er en region intensitet taget uden for cellen (baggrunden) før photobleaching; og InsT-1 er to gennemsnit inde i regionen intensiteter for hver ramme af interesse før photobleaching.
  6. For hver gang ramme af interesse, skal du bruge ligningen 1 for at opnå et fluorescens opsving kurve indeholdende alle tidsrammer skal undersøges. Hvor lang tid er strengt afhængig af protein under undersøgelsen. Når ukendt, udføre indledende forsøg for at erhverve omsætningshastighed af protein.
  7. Til beregning af halvlegen af recovery, indsætte værdier af fluorescens opsving kurve med den tilsvarende tid (i sekunder) i en Sigma plot (v.12), og udføre en kurve, der passer med den "dynamiske Fit Guide | Eksponentiel stigning til maksimum"værktøj. Vælg mono-eksponentiel (single, 3 parametre) eller bi-eksponentiel (dobbelt, 4 parametre) funktioner, afhængigt af den bedste kurve passer.
  8. Brug følgende formel til mono-eksponentiel funktion:
    Equation 2   Ligning 2
  9. Brug følgende formel til bi-eksponentiel funktion:
    Equation 3   Ligning 3
  10. Indsætte parametre "b" og "d" stammer fra Sigma Plot (ligning 2 eller ligning 3) ind i Excel til at beregne halvleg af recovery. Gælde følgende ligninger:
    Equation 4   Ligning 4
    eller
    Equation 5   Ligning 5
  11. Når mono-eksponentialfunktionen resulterer i en præcis curve fit, gælde kun ligning 4.
  12. Når mono-eksponentiel funktion ikke resulterer i en god curve fit, anvende den bi-eksponentiel formel ved at løse både ligning 4 og ligning 5. Overveje de resulterende to halv-gange af recovery som repræsenterer to forskellige protein fraktioner: et hurtigt og et langsomt udveksle fraktion, henholdsvis.

8. fastsættelsen af den Lamellipodial Actin polymerisering af FRAP

  1. At bestemme lamellipodial actin polymerisering sats, transfect B16-F1 celler med EGFP-tagged β-actin, og photobleach lamellipodial-regionen (trin 5.9) ved hjælp af 1,5 s tidsinterval og 500 ms normal god landbrugspraksis eksponering.
  2. Åbn time-lapse film erhvervet fra Visiview i Metamorph, og kalibrere pixel/µm forholdet efter mål bruges af den "foranstaltning | Kalibrere afstande"værktøj.
  3. Spille den time-lapse film og stoppe det på rammen, når lamellipodial fluorescens opsving, som løber baglæns mod lamel som en linje, har nået lamel og ingen yderligere bagud flow kan spores.
  4. Måle afstanden i µm mellem spidsen af lamellipodium og bagsiden af gendannede fluorescens. Denne afstand svarer til summen af retrograd flow og fremspring afstande.
  5. Alternativt, for at adskille fremspring fra retrograd flow, markere lamellipodial spidsen med en linje én ramme før photobleaching. Brug linje som et reference punkt i efterfølgende rammer til at henvise til den oprindelige position af lamellipodium tip på tidspunktet for photobleaching; Referencepunktet kan bruges til at måle fremspring afstand og retrograd flow.
  6. Bemærk den tid (i sekunder), der kræves for fluorescens opsving efter photobleaching at forekomme. Tiden kan beregnes manuelt fra billedhastigheden eller visualiseret ved Metamorph gennem den "foranstaltning | Regionen målinger"værktøj.
  7. Udlede actin polymerisering hastighed ved hjælp af følgende ligning (med nogle ligning parametre baseret på Metamorph målinger fra trin 8,4 og 8,6):
    Equation 6   Ligning 6
    hvor actin polymerisering sats er i µm/min, retrograd flow afstand er i µm, lamellipodial fremspring afstand er i µm og tid er i sekunder.

9. analyse af Protein Diffusion og mobilitet på Photoactivation

Bemærk: Den metode, der præsenteres her beskriver analyse af actin monomer mobilitet ved at ansætte photoactivation af actin smeltet til PA-normal god landbrugspraksis, som illustreret ved visualisering og kvantificering af protein diffusion gennem cytosol.

  1. Til måling af diffusion af photoactivatable actin fra en cytosole region, samt ophobning i et lamellipodial område, brug Metamorph til at bestemme intensitet over tid i følgende regioner (illustreret i figur 3en ): en cytosole photoactivated region (PA); en lamellipodial region, i hvilke photoactivated proteiner forventes at akkumulere over tid (Lam); en region uden for cellen anvendes til normalisering af baggrunden fluorescens (ud).
  2. Ved fastsættelsen af actin inden for cytosol mobilitet, måle forskellige cytosole områder (Se figur 3en, regioner R1-R5). Bemærk at photobleaching erhvervelse ikke kan bestemmes på en lignende måde at FRAP, skyldes en stigning i focal- og til sidst celle-dækkende fluorescens ved aktivering.
  3. Overføre intensitetsværdierne for alle regioner fra Metamorph ind i et Excel-regneark, som beskrevet i trin 7.4.
  4. For at undersøge satsen for forskydning af photoactivatable actin fra regionen cytosole i photoactivation eller sin sats vedtægter i et lamellipodial område (begge repræsenteret som procent intensiteten af regionen cytosole photoactivated på tidspunkt 0) , generere fluorescens kurver fra data i trin 9.3. Gælde følgende ligninger:
    Equation 7   Ligning 7
    Equation 8   Ligning 8
    hvor: PATn er intensiteten af en cytosole photoactivated region for hver ramme af interesse efter photoactivation; LAMTn er intensiteten af en lamellipodial region for hver ramme af interesse efter photoactivation; UDTn er intensiteten af en region taget uden for cellen (baggrunden) for hver ramme af interesse efter photoactivation; PAT-1 er intensiteten af en cytosole photoactivated region før photoactivation; LAMT-1 er intensiteten af en lamellipodial region før photoactivation; T-1 er intensiteten af en region taget uden for cellen (baggrunden) før photoactivation; PAT0 er intensiteten af en cytosole photoactivated region på tidspunkt 0 (dvs. første ramme efter photoactivation); og ud afT0 er intensiteten af en region taget uden for cellen (baggrund) på tidspunkt 0 (dvs. første ramme efter photoactivation).
  5. Valgfrit, for bedre visualisering af data, normalisere intensitet kurver til 0 ved at fratrække intensiteten af den første ramme efter photoactivation fra hver efterfølgende ramme.
    Bemærk: Den følgende analysemetode (trin 9.6-9.8) giver også mulighed for beregning af cytosole spredningen af photoactivated actin inden for cytosol.
  6. Måle intensiteterne for cytosole regioner, som placeres fortløbende distalt fra regionen aktivering.
  7. For at repræsentere intensiteten af disse regioner som procent intensitet i regionen photoactivated på tidspunkt 0, anvende ligning 8, hvor lamellipodial intensitet er erstattet med intensiteter for hver cytosole ROI. Størrelsen og antallet af regioner kan variere afhængigt af cellen størrelse og spredning afstand skal måles.
  8. At udlede en kvantificerbare værdi for antallet af photoactivated protein infiltrerer hver cytosole region, Indsæt tid og værdier af kurven af fluorescens intensitet stigning for hver region i Sigma plot (svarende til FRAP analysen i afsnit 7), skal du bruge Ligning 2 og ligning 4 at udlede halvleg af fluorescens-intensiteten at nå et plateau. Sammenligne t1/2 værdier mellem forskellige eksperimentelle grupper.

Representative Results

Figur 1 g h Vis fase kontrast billeder af en NIH3T3 fibroblast celle forudgående og 10 min efter mikroinjektion af Rac1, som er en lille Rho-familien GTPase i stand til at inducere lamellipodia dannelse gennem dens samspil med den komplekse bølge. Cellen er først visualiseret før mikroinjektion (figur 1g), for at bekræfte sin levedygtighed og morfologi, fx manglende lamellipodia. På 10 min efter mikroinjektion, har cellen klart ændret dets morfologi, som forventes fra denne behandling, og angiver en vellykket injektion (figur 1h).

For enkelhed og klarhed giver vi næste eksemplarisk resultater for FRAP og photoactivation analyse i celler, der ikke har været desuden microinjected.

Analyse af omsætningen af EGFP-mærkede VASP på lamellipodium spids er vist i figur 2a-f. Bemærk at VASP desuden mål til spirende og fokale sammenvoksninger, små og forlængede prikker i celle indvendige18,19. Fluorescens-intensiteten af en lamellipodial region med en klar VASP ophobning på spidsen var bleget og måles i hvert tidsinterval, ved at følge konturen af ROI, før, under og efter blegning som lamellipodium stikker fremad. Da bleget EGFP-VASP proteiner genbruges af ikke-bleget molekyler på disse steder, er gradvis genopretning af fluorescens observeret (figur 2b). FRAP opsving kurve fremstillet på denne måde og normaliserede pre blegemiddel intensiteten (udtrykt i 1) kan ses i figur 2c. Photobleaching effektivitet kan variere og var ca. 20% af værdien inden blegning i dette eksempel, som bestemmes ud fra værdien på t0 (den første ramme efter photobleaching). Forhøjelsen af fluorescens når et plateau i eksemplet vist på omkring 80% af fluorescens før blegning. I en statisk struktur i tid løbet af eksperimentet, såsom en fokal vedhæftning, forskellen mellem pre blegemiddel intensitet og plateau fluorescens nået efter inddrivelse er defineret som den immobile fraktion (IF, rød pil i figur 2 c, e), der henviser til, at mængden af fluorescens genoprettet mellem tidspunktet for blegning og fuld recovery er defineret som den mobile fraktion (grøn dobbelthovedet pil i figur 2c, e). Bemærk, at i en dynamisk skiftende struktur som den lamellipodium spids analyseres her, omfanget af, hvis kan ikke kun repræsenterer immobile molekyler, men også stammer fra en reduktion af fremspring hastighed, som EGFP-VASP intensitet er kendt for at afhænge af dette parameter18. For at beregne halvleg af recovery, blev en fit kurve lavet på Sigma plot (figur 2d). I dette tilfælde skal værdien af parameteren "b" udvundet fra at løse ligningen 2 svarer til 0.0754, som når anvendes til logaritmisk funktion (ligning 4) resulterer i en anslået halvleg af inddrivelse af 9.19 s (figur 2d , langt højre panel), som er relativt hurtigt i denne særlige celle i forhold til gennemsnitlige offentliggjort tidligere5. Det skal bemærkes, at inddrivelse halv-gange kan undertiden variere betydeligt fra celle til celle inden for samme population. For at opnå repræsentative resultater, anbefaler vi derfor, bestemmelse af denne parameter som gennemsnit fra mindst 15-20 celler. Til at illustrere grad af varians, aritmetiske EGFP-VASP opsving i gennemsnit fra 15 celler for hvert tidspunkt blev genereret (figur 2e), og gennemsnitlig kurve passer oprettet og vises i en analog mode (figur 2 f).

Polymerisering satsen for lamellipodial actin netværk udgøres af summen af fremad netværk fremspring og retrograd flow. FRAP kan anvendes til at måle actin polymerisering satsen af transfecting celler (i dette tilfælde B16-F1) med EGFP-tagged β-actin og photobleaching en fremspringende lamellipodial region (fig. 2g). Analyse af lamellipodial actin netværk polymerisering, er fluorescens opsving efter blegning af EGFP-mærkede β-actin vurderet over tid. Som polymerisering af actin monomerer skrider frem i pigtråd enderne af lamellipodial actin filamenter (som alle peger i retning af den forreste20), er netværket konstant omplantede bagud og skrider fremad, priser der kan være let opnået gennem polariseret inddrivelse af fluorescens efter photobleaching. Fluorescens inddrivelsen af lamellipodium er afsluttet, så snart det blegede område har nået overgangszone mellem den bageste del af lamellipodium og lamel, som er karakteriseret ved en lavere massefylde på mere vandret arrangeret glødetrådens bundter drejning over meget langsommere end hvad er observeret i lamellipodium. Som illustreret i figur 2g, kan fluorescens recovery visualiseres som en linje vandret til kanten og flyde baglæns mod lameller, som giver mulighed for måling af afstande fremspring og retrograd flow (individuelt repræsenteret i panelet længst til højre i figur 2g som orange og røde dobbelthovedet pil, henholdsvis).

Vi har også anvendt photoactivation i B16-F1 celler transfekteret med PA-normal god landbrugspraksis-actin at spore actin monomerer inden for cytosol mobilitet og sats deres vedtægter i fremspringende lamellipodia. Som illustreret i figur 3a, b, en cytosole region var photoactivated ved udsættelse for en 405 nm laser, mens billeder blev erhvervet på normal god landbrugspraksis kanal hver 1,5 s til at visualisere fordelingen af normal god landbrugspraksis-mærket, photoactivated aktin. Photoactivated normal god landbrugspraksis-actin kan ses spreder det cytosole området i figur 3b. Sats af fluorescens intensitet nedgang i regionen photoactivated cytosole er repræsenteret som procentdelen af den oprindelige intensitet på t0 (første ramme efter photoactivation; Figur 3 c). Photoactivated actin også integrerer på spidsen af lamellipodia, hvor nye actin monomerer er føjet til de voksende pigtråd enderne af forlængede actin filamenter i fremspring. For at beregne rente lamellipodial vedtægter, målte vi fluorescens-intensiteten over tid af et to-dimensionelle kontur/område cirka 5 µm i bredde og 1 µm i højden; regionen var konstant re placeret på spidsen af lamellipodium som det stak. Aktin inkorporeringen var repræsenteret som procentdelen af fluorescens intensitet i regionen photoactivated cytosole på t0 (figur 3d). Som forlængelse af actin filamenter skred frem, blev nye actin monomerer indarbejdet lamellipodial foran. En brøkdel af disse actin monomerer stammer stochastically fra det cytosole pool hvor monomerer var photoactivated. Dette resulterer i den hurtige stigning af fluorescens i lamellipodia i de første 20 s efter photoactivation. Som ny monomerer bliver tilføjet til lamellipodial front, tidligere indarbejdet actin monomerer flow med filamenter mod lamel af retrograd flow. Over tid, ROI er helt fyldt med fluorescerende monomerer og et plateau i Fluorescens er nået (figur 3d). En gradvis nedgang i Fluorescens er derefter observeret når efter udbredelsen af photoactivated monomerer i hele cellen, er ikke-photoactivated actin monomerer i stigende grad bliver igen tilføjet lamellipodial foran. Dette fald i fluorescens vil finde en ny plateau, som vil blive nået, så snart en balance i hele cellen mellem photoactivated og ikke-photoactivated monomerer er nået (data ikke vist).

Mobilitet af actin monomerer i hele cytosol blev afledt ved at måle fluorescens intensiteter i regioner af samme størrelse placeret distalt fra photoactivated-regionen (illustreret på figur 3en af farvekodede regioner mærket R1-R5). Som illustreret i figur 3e, fluorescens intensitet i hver af disse regioner er gradvist faldende væk fra den cytosolically photoactivated region, som brøkdel af photoactivated actin monomerer bliver i stigende grad fortyndes med ingen-aktiveret (dvs. ikke-fluorescerende) monomerer. Derudover toppen af Fluorescens er nået senere: de fjernere målte regionen er beliggende, fra photoactivated-regionen, jo længere tid, der kræves til aktin monomerer til diffus i disse regioner. En repræsentativ værdi for graden af actin monomer perkolatnedsivning i hver region kan være afledt af kvantificere halv tid for at nå fluorescens plateau. Jo mere fjerntliggende regionen, jo længere det tager for photoactivated actin til diffuse ind i det, og dermed mere tid er nødvendig for den fluorescerende plateau nås, i sidste ende fører til en højere t1/2 værdi (figur 3e).

Figure 1
Figur 1 : Imaging kammer forsamling og mikroinjektion procedure. (en) Imaging kammer komponenter. (b) silikone fedt er omhyggeligt smurte rundt om åbningen af en plastik sealer. (c) coverslip er placeret med den celle-side opad ind i midten af den billeddiagnostiske afdeling åbning. (d) en sikker tætning er etableret af positionering af plastik sealer på toppen af coverslip og ved at stramme side klemmer. (e) mikroskopi medium er pipetted ind i kammeret slot. (f) den billeddiagnostiske afdeling er placeret på stadiet mikroskop, varme detektor og elektroder er knyttet til en opvarmning enhed pre-sæt til 37 ° C, og celler er tilladt at tilpasse i mindst 30 min før mikroskopi er indledt. I dette eksempel stadiet mikroskop er også udstyret med en micromanipulator til at udføre microinjections og mikroinjektion nålen er dyppet i det medium, der dækker cellelag i den billeddiagnostiske afdeling. (g) et NIH3T3 fibroblast celle er visualiseret før mikroinjektion af fasekonstrastmikroskopi. Røde Kors i perinuclear rum angiver placeringen af den fremtidige mikroinjektion, hvilket svarer til en høj cytoplasmatisk region på grund af nærhed til den voluminøse kernen. (h) 10 min efter mikroinjektion med Rac1, cellen reagerer af fremtrædende dannelsen af lamellipodia omkring hele cellen periferien (angivet af grønne pile). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: FRAP tillader fastsættelse af satserne for protein omsætning eller lamellipodial actin polymerisering. (en) repræsentative eksempel på B16-F1 celle udtrykker EGFP-VASP før photobleaching af en lamellipodial region, som angivet. Forskelligt farvede konturer/figurer er mærket for at angive, hvilke regioner blev anset for fluorescens intensitet målinger over tid. Bemærk den røde kontur markeret med et udråbstegn, som etiketter en cytosole region placeret i et område, der indeholder flere vesikler og celle overflade flæser. Dynamiske områder som dette bør undgås for at vælge regioner af fluorescens reference, da de er kendetegnet ved stærkt kortvarige udsving af fluorescens, potentielt forårsager upræcise resultater. (b) Lamellipodial region EGFP-VASP udtrykker cellens før og efter photobleaching. Inddrivelse af fluorescerende signal efter photobleaching inden for området markeret i lilla er visualiseret over tid. Pilen angiver spidsen af en microspike, beriget til VASP sandsynligvis på grund af den høje koncentration af actin filamenter polymerizing der19. (c) et eksempel på en FRAP opsving kurve som afledt af kvantificere fluorescerende intensiteten af photobleached lamellipodium (lilla omrids) i b. røde og grønne linjer til højre angiver henholdsvis immobile og mobile fraktioner. (d) A passer FRAP opsving kurve i c (venstre panel) og et eksempel på den beregningsmetode, der anvendes til at udlede halv restitutionstid (højre panel). (e) et eksempel på en FRAP opsving kurve afledt af gennemsnit fluorescens opsving kurver af 15 celler, med SEM barer angiver graden af variation inden for den stikprøve befolkning. (f) en curve fit afledt af gennemsnit FRAP opsving kurven passer til 15 celler (venstre panel) og et eksempel på den beregningsmetode, der anvendes til at udlede halv restitutionstid (højre panel). (g) Time-lapse paneler af fremspringende lamellipodium af en B16-F1 celle udtrykker EGFP-tagged β-actin før og efter blegning af en lamellipodial region som angivet, efterfulgt af fluorescens opsving i lamellipodium over tid. På den yderste højre panel, værdier målt for fremspring og retrograd afstande leveres (i orange og rød, henholdsvis). Beregninger under panelerne billedet afslører, hvordan summen af fremspring og retrograd afstande bruges til at udlede polymerisering hastighed af lamellipodial actin netværk. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Photoactivation af PA-normal god landbrugspraksis-actin for monomer sporing i hele cellen. (en) A repræsentativt eksempel på en B16-F1 celle udtrykker PA-normal god landbrugspraksis-actin før udløser photoactivation i et cytosole region, som er angivet med den røde cirkel (PA). Forskelligt farvede konturer er mærket for at angive, hvilke regioner blev anset for fluorescens intensitet målinger over tid. (b) en illustration af den tidsmæssige fordeling af PA-normal god landbrugspraksis-actin følgende photoactivation. Bemærk den gradvise reduktion af fluorescens i photoactivated, cytosole region (rød cirkel), som photoactivated actin diffunderer fra det. På grund af deres diffusion front og montage i netværket, er photoactivated actin monomerer gradvist udvidet i lamellipodia (cyan region) og hele cytosol (forskellige farvekodede regioner) i et afhængig af afstand og tid mode. (c) repræsentative, tidsmæssige tilbagegang af fluorescens i photoactivated cytosole region (rød kontur i b). (d) tidsmæssige ændringer i fluorescens intensitet i regionen lamellipodial (cyan kontur i b). (e) kurver repræsentant af de tidsmæssige ændringer i fluorescens intensiteten af cytosole regioner (farvekodede i b) på grund af positionering i variabel afstand fra området af photoactivation. Bemærk hvordan halv-gange for at nå fluorescens plateau (angivet i forklaringen til højre) stige med afstanden i betragtning region til området af photoactivation, sandsynligvis korrelerede med den øgede gange nødvendigt for udbredelse af actin monomerer i den respektive region. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Her kan vi diskutere kritisk trin i de teknikker, der beskrives i denne artikel, og hvordan de kan være optimeret til anvendelse i forskellige forsøgsbetingelser.

Mikroinjektion er en metode, der kan anvendes til at overvåge i celler de instant effekter fra at indføre eksogene proteiner, hæmmere eller narkotika. Det kan være særlig fordelagtig for bestemmelse af funktionerne af proteinerne i vanskelige at transfect celletyper eller i situationer, hvor langsigtede udtryk ikke er ønsket. Det skal bemærkes, at overlevelsen af visse celletyper varierer afhængigt af den ekstracellulære matrix de udsås på. Mest endotel, epithelial eller fibroblast-lignende celletyper, selv små lide fisk keratocytes (Se Dang et al. 21 og Anderson og Cross22) kan sprøjtes med succes. Men der er undtagelser, såsom B16-F1 celler seedede på laminin, der udgør en fremragende modelsystem af celle migration, men er uforenelig med indsprøjtning på denne type af undergrundens af ukendt årsag. For NIH3T3 fibroblastceller udføre vi rutinemæssigt injektioner på fibronektin undergrundens og yderligere photomanipulation teknikker såsom FRAP (selv med photoactivation, vist for B16-F1 celler her) kan udføres lige så godt i disse fibroblaster (jf. f.eks. Köstler et al. 3). det skal også overvejes, at forskellige proteiner, ifølge deres funktionelle egenskaber og eksperiment mål, kan tage forskellige mængder af tid til at forårsage ændringer, varierende fra sekunder til timer. En fordel ved teknikken er, at dosis/koncentration af udefrakommende agent kan styres mere præcist på det enkelte celle niveau end f.eks., når du bruger plasmid Transfektion. Derudover er fluorescerende tagging af et protein ikke en nødvendighed for at sikre sin tilstedeværelse i den celle, som kan øge fleksibiliteten, hvis simultan multi-kanal visualisering af andre fluorescently markeret proteiner er nødvendige. Mikroinjektion kan være særligt nyttigt for analyse instant effekter af specifikke proteiner eller protein blandinger på dynamiske ændringer i celle morfologi eller cytoskeleton (fx Dang et al. 21 for et eksempel på instant effekter på migration af Arp2/3 komplekse hæmmer Arpin). En ulempe ved teknikken er dens invasionsevne, som kan forårsage celleskader eller påvirke celle morfologi. Derfor en vigtig overvejelse, når du udfører microinjections overvågning celle levedygtighed. Metoden indført her er afhængig af manuelle manipulation. I betingelser, der er testet til at være kompatibel med vellykket injektioner, såsom fibroblaster vokser på fibronektin undergrundens, tillader manuel injektion protokollen beskrevet her en i nærheden af 100% succesrate; Dette er afgørende, når du kombinerer denne tilgang med avancerede og tidskrævende opfølgende forsøg herunder video mikroskopi eller FRAP, som er offentliggjort tidligere3. Dette udelukker ikke, at lejlighedsvis, individuelle celler måske lider af en mikroinjektion begivenhed, som sikkert kan genkendes af pludselige ændringer i kontrast af både kernen og cytoplasmaet, efterfulgt af celle kant retraktion. Disse sjældne eksperimentelle tilfælde er udelukket, og således ikke anses for yderligere analyser.

Men en halv-automatiske tilgang er også almindeligt anvendt, for eksempel ansættelse af hurtige (< 300 ms) maskine-kontrolleret nål sænke sammenfaldende med indsprøjtning pres stigning, således at nålen kun skal være placeret over hver celle før respektive injektion. Succesraten for halv-automatiske injektioner er pr. definition lavere end den manuelle metode beskrevet ovenfor, blot fordi det er optimeret til hastighed, efterfulgt af en analyse af flere celler, der med held at overlevet denne behandling; Det er således ikke afhængig vellykket injektion af en enkelt celle. Derfor, i stedet for enkelt celle analyse, halv-automatiske injektioner er bedre egnet til at analysere injektion effekter af flere hundrede celler, fx af video mikroskopi ved lav forstørrelse eller celle fiksering og farvning. Uanset den detaljerede temacenter mikroinjektion udgør ikke en end-point assay, men kan kombineres med en række teknikker, herunder FRAP eller photoactivation3.

Ved fastsættelsen af protein omsætning sats af FRAP, intensiteten af laser skal optimeres, afhængigt af mikroskop setup og billeddannelse (forstørrelse, mål, etc., samt celletype, struktur og fluorescerende proteiner for photobleaching). Bemærk, at på optimal laser power, effektiv blegning er kombineret med den mindst mulige solskader, for at undgå svind eller komplet retraktion af struktur under analyse (f.eks. lamellipodia eller filopodia) eller endda skader på cellulært niveau. Ideelt set bør mindst 70 – 80% af blegning effektivitet opnået, selv om komplet blegning kan blive hæmmet af ekstremt hurtig omsætning af protein, i hvilket tilfælde, noget over 50% kan også være acceptable. Optimal blegning magt for en given struktur og fluorescerende farvestof bør afprøves eksperimentelt, starter fra et lavt laser power efterfulgt af sin gradvis stigning. Naturligvis, enhver fluorescerende farvestof kan pr. definition være bleget med laserlys tæt på dens højdepunkt af excitation (488 nm til ofte anvendte grønne farvestoffer såsom FITC eller EGFP). Men lasere med kortere bølgelængder, som nær-UV-lasere, levere højere magter og kan dermed også bruges til effektiv blegning af almindeligt anvendte farvestoffer. Vi rutinemæssigt anvender en 405 nm diodelaser (120 mW) til blegning af både EGFP og røde fluorescerende farvestoffer (f.eks mCherry), omend med lidt lavere effektivitet i tilfælde af den sidstnævnte (data ikke vist). Som 405 nm-diode kan også bruges til photoactivation af PA-normal god landbrugspraksis (se nedenfor), forlener det dette system med maksimal fleksibilitet.

405 nm-laser beføjelser mellem 65 – 100 mW blev anvendt for B16-F1 cellestrukturer og fluorescerende proteiner photobleached her. Når du analyserer en photobleached region, er det vigtigt at overveje, om den givne struktur er bevaret i sin oprindelige form over analysen tidsperiode. For eksempel, når du analyserer omsætning af proteiner i lamellipodia tips, bør sikres om krumning af lamellipodia er væsentligt ændret over tid, som ændringer i krumning kan føre til unøjagtige resultater, hvis region/contour analyseres ikke fuldt ud omfatte helhed i strukturen i hver målte ramme. Derudover skal det bemærkes, at bundter indlejret i lamellipodia, såsom microspikes, kan medføre afvigelser i fluorescens intensitet. Som illustreret i figur 2b (hvid pil i 9 s tidsramme), en microspike-lignende struktur er beliggende ved siden af den målte photobleached region, men forbliver uden for det i hele varigheden af måling, og dermed hidføre ikke hvilken som helst unøjagtighed. Vigtige overvejelser ved valg af placering og størrelse af analyserede regioner er for analyse af protein omsætning, at deres fluorescens over tid ikke bør blive betydeligt påvirket af ændringer i celle morfologi eller faktorer andet end hårdt at undgå Køb photobleaching. Eksempelvis bør strukturer yder betydelige kvantitative bidrag til de analyserede struktur ikke flytte ud af den målte region under analysen; Derudover bør uafhængige, fluorescerende enheder såsom vesikulære strukturer, som tiltrækker proteinet ikke indgå felt af interesse under analysen. For fastsættelsen af den lamellipodial actin polymerisering, bør sikres at analyseres ingen tilbagetrækningskraften eller ruffling (dvs. opad foldning) lamellipodia, som dette vil stærkt påvirker nøjagtigheden af resultaterne. Derudover retraktion af lamellipodial regioner vises måske som hurtige bageste translokation, potentielt fører til overvurdering af satserne for lamellipodial actin polymerisering. En ekstra overvejelse er afstanden af intracellulære normalisering regioner (taget som reference standpunkter til korrektion af erhvervelse photobleaching) fra den faktiske placering af photobleaching, som bør være stor nok til at undgå direkte indflydelse af photobleached området.

Når du opretter optimale betingelser for photoactivation af PA-normal god landbrugspraksis-tagged konstruktioner, udvises forsigtighed bør undgå instant blegning under photoactivation. I vores arbejde, de bedste resultater blev opnået med laser beføjelser 5 - 10 gange lavere end normalt ansat til blegning af EGFP. For image erhvervelse af photoactivated molekyler, bør eksponeringstid og tidsintervallet mellem rammer optimeres ved at overveje størrelsen af regioner og strukturer til at være photoactivated og analyseret, samt den potentielle mobilitet af photoactivated proteiner til andre subcellulært placeringer. Som for alle typer af fluorescens imaging er vedligeholdelse af cellernes levedygtighed afgørende for at opnå fysiologisk relevante resultater.

I princippet, grøn til rød photoconversion af fluorescerende proteiner som mEos eller Dronpa varianter12 udgør en lige så kraftfuld metode til følgende dynamics og omsætning af subcellulært strukturer som lamellipodium (Se f.eks. Burnette et al. 23). fordelen, at den sidstnævnte metode i modsætning til PA-normal god landbrugspraksis ville være mulighed for at følge protein dynamics før og efter konvertering med to forskellige farver, uden at skulle Co udtrykke en ekstra røde fluorescerende proteiner. I vores foreløbige eksperimenter var kontrast ændring omfang og intensitet af fluorescerende signal opnået ved photoactivation af PA-normal god landbrugspraksis dog større i forhold til photoconverted sonder, måske på grund af de overlegne spektrale beskrivere grønne versus rød fluorescerende sonder (data ikke vist). Under alle omstændigheder har detaljerede undersøgelser af actin glødetrådens omsætning i celle-kant fremspring såsom lamellipodia eller Vaccinia virus-induceret actin haler hidtil kun været udgivet ved hjælp af PA-normal god landbrugspraksis derivater5,6,24.

Når man overvejer hvilken celle region at analysere efter photoactivation, flere faktorer skal tages i betragtning, som er drøftet ved hjælp af det specifikke eksempel vist her (indarbejdelse af actin monomerer frontviden celle ved aktivering i cytosol), men kan helt sikkert ekstrapoleres til forskellige analoge videnskabelige problemer. Først, når måling sats lamellipodial indarbejdelse af cytosolically photoactivated proteiner, for eksempel, i forskellige eksperimentelle betingelser (som vist i Dimchev et al. 6), størrelser af cytosole regioner og deres afstande til lamellipodial kanter skal være sammenlignelige mellem eksperimentelle grupper. Det er også vigtigt at overveje, når photoactivating cytosole regioner, celle-tykkelsen er større i synspunkter tættere til kernen. Aktivering tykkere cellulære regioner kan resultere i større mængder af aktiverede proteiner, at fordelingen af protein skal aktiveres fordeles homogen måde i cytosol. Endelig kan udtrykket niveauer af protein skal aktiveres, helt sikkert være meget varierende i individuelle celler. Alle disse overvejelser af variation er det afgørende at sammenligne indarbejdelse niveauer af cytosolically aktiveret proteiner andetsteds i cellen i forhold til den samlede fluorescens opnået ved aktivering i specifikke regioner.

Vi har beskrevet hvordan mikroinjektion kan bruges som et redskab til at undersøge virkningerne af proteiner på celle morfologi og har illustreret dette ved at demonstrere den potente induktion af lamellipodial strukturer i NIH3T3 fibroblastceller microinjected med den små GTPase Rac1. Vi har tidligere anvendt denne teknik til at blande sig med Arp2/3 funktion i celler microinjected med C-terminale WCA domæne af Scar/bølge3. Forskellige parametre i microinjected celler kan analyseres af andre assays, såsom FRAP eller photoactivation. Vi har beskrevet, hvordan FRAP og photoactivation kan være ansat for at undersøge subcellulært dynamics og mobilitet af actin monomerer. FRAP er blevet brugt af vores gruppe tidligere5 at undersøge omsætning af proteiner lokalisering til lamellipodia, såsom VASP, Abi, cortactin, cofilin, og capping protein eller belyse omsætningen af komponenter i fokale sammenvoksninger i tilstedeværelsen og fravær af Rac signalering4. Desuden måler actin polymerisering satser kan ske ved photobleaching EGFP-tagged β-actin5, men findes alternative metoder. Sporing fluorescerende inhomogeneities som set af levende celle imaging-kompatible sonder mærkning cellular actin filamenter, såsom Lifeact25, kan også være ansat6,26. Fordelen her er at overekspression af β-actin kan undgås, som er i stand til at øge celle kant fremspring og migration, og dermed potentielt interfererer med den specifikke analyse eller eksperimenterende spørgsmål (Se fx Kage et al. 26; Peckham et al. 27). en klar ulempe for Lifeact sonde udgør imidlertid sin hurtig on/off kinetik af binding til actin filamenter, således at blegning af actin glødetrådens strukturer mærket af Lifeact i cellerne indeholder oplysninger kun på sonden omsætning, men ikke omsætning af actin filamenter, som binder den25. Sporing af fluorescens inhomogeneities ansat tidligere6,26 giver et praktisk kompromis, meget lig den udbredte sporing af fluorescens prikker indarbejdet i trådformede cytoskeletal strukturer (Se fx laks og Waterman28), men kan ikke være så ligetil at bruge og så præcis som FRAP af EGFP-mærkede F-actin strukturer. Photoactivation er blevet anvendt ved os til estimering satser af monomere actin indarbejdelse i fremspringende lamellipodia, såvel som dens mobilitet i hele cytosol, i forbindelse med eksperimentelt tuned cytosole F-actin niveauer6. Teknikken er nyttig, når undersøge mobilitet og fordeling af proteiner fremstillet af relativt store områder, såsom cytosole regioner. Imidlertid fremstillet undersøge fordelingen af proteiner af forholdsvis små photoactivated strukturer; fx vækst kegler kan være udfordrende på grund af lavt antal fluorescerende molekyler aktiveret, svage signaler og dermed manglende følsomhed. Mulige alternative teknikker til photoactivation eller photoconversion af fluorescens (se ovenfor) kan omfatte inverse FRAP, som bygger på photobleaching hele cellen undtagen ROI, efterfulgt af tracking mobilitet af fluorescerende molekyler væk fra denne region. Teknikken kræver ikke overekspression photoactivatable versioner af proteiner, men altid indebærer udsættelse for en usædvanlig høj dosis af laser power, potentielt forårsager uønskede bivirkninger såsom solskader.

Klart, photoactivation og FRAP ikke kan skelne om proteiner er på vej som monomerer, dimerer eller selv små oligomerer, og om de flytter i kombination med yderligere bindende partnere. Oplysninger af denne art kan fås i stedet fra fluorescens korrelations-spektroskopi teknikker29 eller, alternativt, FLIM-FRET30. Ikke desto mindre udgør FRAP og photoactivation ligetil tilgange for at vurdere direkte lokale og globale protein dynamics i celler, uanset protein af interesse, subcellulært placering eller celletype studerede.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi er taknemmelige til tyske Research Foundation (DFG) for økonomisk støtte (støtte Nr. RO2414/5-1 til KR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B16-F1 mouse skin melanoma cells  American Type Culture Collection, Manassas, VA CRL-6323
NIH-3T3 cells American Type Culture Collection, Manassas, VA CRL-1658
DMEM 4.5g/L glucose  Life Technologies, Thermno Fisher Scientific, Germany 41965-039
Ham’s F-12 medium Sigma-Aldrich N8641
Fetal calf serum  (FCS) PAA Laboratories, Linz, Austria A15-102
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich, Germany F7524 Lot054M3396
MEM Non essential amino acids  Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany 11140035
L-Glumatine 200mM (100x) Life Technolgies 25030-024
Pen-Strep 5000 U/mL Life technologies 15070063
Sodium Pyruvate (100 mM) Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany 11360-039
Laminin Sigma-Aldrich L-2020
Laminin coating buffer  Self-made: 50mM Tris ph7.4, 150mM NaCl
Fibronectin from human plasma  Roche Diagnostics, Mannheim, Germany 11 051 407 001
Jetpei Polyplus Transfection, Illkirch, France 101-10N
JetPei buffer Polyplus Transfection, Illkirch, France 702-50 150mM NaCl
PA-GFP-actin plasmid DNA  described in Koestler et al.2008
pEGFP-actin plasmid DNA Clontech, Mountain View, CA, USA
Rac1 protein for microinjection Purified as GST-tagged version, and cleaved from GST prior to injection
Microinjection buffer Self-made: 100mM NaCl, 50mM Tris-HCl ph7.5, 5mM MgCl2, 1mM DTT
Dextran, Texas Red, 70,000 MW, Lysine Fixable Molecular Probes, Thermno Fisher Scientific, Germany D1864
Microscope circular cover glasses 15mm, No.1  Karl Hecht, Aisstent, Sondheim, Germany 1001/15
Eppendorf Femtotips Microloader Tips Eppendorf, Hamburg, Germany 5242 956 003
Eppendorf Femtotip Microinjection Capillary Tips Eppendorf, Hamburg, Germany 930000035
Silicone Grease  ACC Silicones, Bridgewater, England SGM494
Aluminium Open Diamond Bath Imaging Chamber Warner instruments RC-26
Automatic temperature controller Warner Instruments TC-324B
Microscope: Axio Observer  Carl Zeiss, Jena, Germany
CoolSnap-HQ2 camera  Photometrics, Tucson, AZ
Lambda DG4 light source  Sutter Instrucment, Novato, CA
Laser source  Visitron Systems
Eppendorf FemtoJet microinjector  Eppendorf, Hamburg, Germany With built-in compressor for pressure supply
Nikon Narishige Micromanipulator system Nikon Instruments, Japan
Visiview software v2.1.4 Visitron Systems, Puchheim, Germany
Metamorph software v7.8.10 Molecular Devices, Sunnyvale, CA
Sigma Plot v.12 Systat Software Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).
  2. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
  3. Koestler, S. A., et al. Arp2/3 complex is essential for actin network treadmilling as well as for targeting of capping protein and cofilin. Mol Biol Cell. 24 (18), 2861-2875 (2013).
  4. Steffen, A., et al. Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation. J Cell Sci. 126, Pt 20 4572-4588 (2013).
  5. Lai, F. P., et al. Arp2/3 complex interactions and actin network turnover in lamellipodia. EMBO J. 27 (7), 982-992 (2008).
  6. Dimchev, G., et al. Efficiency of lamellipodia protrusion is determined by the extent of cytosolic actin assembly. Mol Biol Cell. 28 (10), 1311-1325 (2017).
  7. Koppel, D. E., Axelrod, D., Schlessinger, J., Elson, E. L., Webb, W. W. Dynamics of fluorescence marker concentration as a probe of mobility. Biophys J. 16 (11), 1315-1329 (1976).
  8. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
  9. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
  10. Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).
  11. Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging. Trends Cell Biol. 19 (11), 555-565 (2009).
  12. Kremers, G. J., Piston, D. Photoconversion of purified fluorescent proteins and dual-probe optical highlighting in live cells. J Vis Exp. (40), (2010).
  13. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Preparation of slides and coverslips for microscopy. CSH Protoc. 2008, 4988 (2008).
  14. Small, J. V., Rottner, K. Actin-based Motility. Carlier, M. F. , Springer. Dordrecht. (2010).
  15. Kaverina, I., et al. Enforced polarisation and locomotion of fibroblasts lacking microtubules. Curr Biol. 10 (12), 739-742 (2000).
  16. Small, J., Rottner, K., Hahne, P., Anderson, K. I. Visualising the actin cytoskeleton. Microsc Res Tech. 47 (1), 3-17 (1999).
  17. Mikhailov, A. V., Gundersen, G. G. Centripetal transport of microtubules in motile cells. Cell Motil Cytoskeleton. 32 (3), 173-186 (1995).
  18. Rottner, K., Behrendt, B., Small, J. V., Wehland, J. VASP dynamics during lamellipodia protrusion. Nat Cell Biol. 1 (5), 321-322 (1999).
  19. Svitkina, T. M., et al. Mechanism of filopodia initiation by reorganization of a dendritic network. J Cell Biol. 160 (3), 409-421 (2003).
  20. Small, J. V., Isenberg, G., Celis, J. E. Polarity of actin at the leading edge of cultured cells. Nature. 272 (5654), 638-639 (1978).
  21. Dang, I., et al. Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration. Nature. 503 (7475), 281-284 (2013).
  22. Anderson, K. I., Cross, R. Contact dynamics during keratocyte motility. Curr Biol. 10 (5), 253-260 (2000).
  23. Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nat Cell Biol. 13 (4), 371-381 (2011).
  24. Humphries, A. C., et al. Clathrin potentiates vaccinia-induced actin polymerization to facilitate viral spread. Cell Host Microbe. 12 (3), 346-359 (2012).
  25. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  26. Kage, F., et al. FMNL formins boost lamellipodial force generation. Nat Commun. 8, 14832 (2017).
  27. Peckham, M., Miller, G., Wells, C., Zicha, D., Dunn, G. A. Specific changes to the mechanism of cell locomotion induced by overexpression of beta-actin. J Cell Sci. 114, Pt 7 1367-1377 (2001).
  28. Salmon, E. D., Waterman, C. M. How we discovered fluorescent speckle microscopy. Mol Biol Cell. 22 (21), 3940-3942 (2011).
  29. Machan, R., Wohland, T. Recent applications of fluorescence correlation spectroscopy in live systems. FEBS Lett. 588 (19), 3571-3584 (2014).
  30. Becker, W. Fluorescence lifetime imaging--techniques and applications. J Microsc. 247 (2), 119-136 (2012).

Tags

Biologi spørgsmålet 135 mikroinjektion FRAP photoactivation PA-normal god landbrugspraksis actin lamellipodium cytoskeleton migration
Micromanipulation teknikker giver mulighed for analyse af morfogenetiske Dynamics og omsætning af Cytoskeletal regulatorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dimchev, G., Rottner, K.… More

Dimchev, G., Rottner, K. Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators. J. Vis. Exp. (135), e57643, doi:10.3791/57643 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter