Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Micromanipulation teknikker slik at analyse av Morfogenetiske Dynamics og omsetning av cellen cytoskjelett regulatorer

Published: May 12, 2018 doi: 10.3791/57643
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Division of Molecular Cell Biology, Zoological Institute, Technische Universität Braunschweig, 2Department of Cell Biology, Helmholtz Centre for Infection Research

Summary

Beskriver vi hvordan mikro- og photomanipulation teknikker som FRAP og photoactivation aktiverer fastsettelse av motilitet parametere og spatiotemporal dynamikken i proteiner i migrere celler. Eksperimentell readouts inkluderer subcellular dynamikk og omsetning av motilitet regulatorer eller underliggende begrepsordbok cytoskeleton.

Abstract

Undersøke spatiotemporal dynamikken i proteiner kan avsløre funksjonell betydning i ulike sammenhenger. I denne artikkelen er det diskutert hvordan fluorescerende utvinning etter photobleaching (FRAP) og photoactivation teknikker kan brukes til å studere spatiotemporal dynamikken i proteiner subcellular steder. Vi viser også hvordan disse teknikkene aktiverer enkelt bestemmelse av ulike parametere knyttet til utgangen cellen cytoskjelett regulering og celle motilitet. Videre beskrives microinjection celler i tillegg som et alternativ behandling (potensielt foregående eller utfyller de nevnte photomanipulation teknikkene) utløse umiddelbar effektene av translocated proteiner på cellen morfologi og funksjon. Micromanipulation som protein injeksjon eller lokal påføring av plasma membran-permeable narkotika eller cellen cytoskjelett hemmere kan tjene som kraftig verktøy registrere umiddelbare konsekvenser for en gitt behandling på cellen oppførsel på enkelt celle og subcellular nivå. Dette er eksemplifisert her ved umiddelbar induksjon av lamellipodial celle kanten protrusion av injeksjon av rekombinant Rac1 protein, som etablerte et kvart århundre siden. I tillegg gir vi en protokoll for å bestemme omsetningen av forbedret grønne fluorescerende protein (EGFP)-VASP, en utgangen filament polymerase fremtredende samler på lamellipodial tips av B16-F1 celler, sysselsetter FRAP og inkludert knyttet data analyse og montering kurve. Vi presenterer også retningslinjer for å estimere antallet lamellipodial utgangen nettverk polymerisasjon, som eksemplifisert ved celler som uttrykker EGFP-merket β-utgangen. Til slutt, instruksjoner er gitt å undersøke utbredelsen av utgangen monomer mobilitet i cellen cytoplasma, etterfulgt av utgangen innlemmelse i områder av rask filament montering, som tips av utstikkende lamellipodia, med photoactivation tilnærminger. Ingen av disse protokollene er begrenset til komponenter eller regulatorer av utgangen cytoskjelett, men kan enkelt utvides for å utforske i analoge mote spatiotemporal dynamikken og funksjon av proteiner i ulike ulike subcellular strukturer eller funksjonelle sammenhenger.

Introduction

Overvåking spatiotemporal dynamikken i proteiner og andre molekyler i levende celler har blitt et uunnværlig verktøy på mange felt i cellen og molekylærbiologi. Avanserte fluorescens mikroskopi teknikker inkludert fluorescens resonans energioverføring (bånd) og bånd-fluorescens levetid imaging (bånd-FLIM) eller FRAP fluorescens tap i photobleaching (vende) og photoactivation samt mange andre tillate for timelige og romlig sporing av protein-protein interaksjoner, conformational endringer, samt bestemme the kinetics av diffusjon og lokalisering av ulike proteiner i cellen1,2. FRAP og photoactivation teknikker, spesielt gjelder mye for å undersøke regulatorer av utgangen cytoskjelett og celle migrasjon. Disse teknikkene kan brukes alene eller i kombinasjon med ekstra micromanipulation teknikker som microinjection3, og involverer uttrykk for fluorescently-merket proteiner. De tillater estimering av the kinetics av protein tilknytning til utgangen-rike strukturer involvert i celle migrasjon, for eksempel filopodia eller lamellipodia, omsetningen av proteiner i fokal adhesjon4, eller forgrenet begrepsordbok nettverk5. De kan også bestemme lamellipodial utgangen polymerisasjon priser, vurdering av spredningen av monomerisk utgangen innen stoffer frekvensen av subcellular utgangen monomer translokasjon til polymerizing utgangen filamenter i stikker lamellipodia6, og andre parametere.

FRAP er en metode for å visualisere og kvantifisere mobilitet av proteiner i en levende celle, opprinnelig utviklet i 1970 av Axelrod7. Et område av interesse (ROI) i en celle, med fluorescently-merket proteiner, er transiently utsatt for en laser av høy intensitet, tilstrekkelig til å forårsake bleking av fluorophore molekyler stede i denne regionen under en gitt kort tidsperiode. Den ubleket, fluorescently merket proteiner ligger utenfor Avkastningen under bleking, diffus og infiltrere bleket regionen avhengig av deres spatiotemporal dynamikk, forårsaker forskyvning av photobleached molekyler over tid. Fluorescens utvinning i bleket regioner er avhengig av forskjellige faktorer, blant annet størrelsen og hastigheten av spredningen av et bestemt molekyl, og selvfølgelig sin omløpshastighet innenfor den antatte tilknyttede bleket struktur. Dermed løselig proteiner vil megle utvinning av fluorescens innen bleket Avkastningen raskt gjennom diffusjon, mens proteiner tett knyttet strukturer, for eksempel fokal adhesjon, vil ha lengre omsetning tid, som deres fluorescens utvinning vil avhenge både på spredningen av løselige brøkdel av protein og dissosiasjon-samarbeid kinetics i struktur-assosiert brøken. Fluorescens utvinning er vanligvis ervervet og kvantifisert til første nivå av pre blekemiddel intensiteten av fluorescens er nådd. Men oppstår dette ikke hvis en del av den første fluorescens tilhører den såkalte immobile brøken, som ikke kan fornyes ved diffusjon eller er fylle til meget langsom priser i forhold til fleste av molekylene bestående av mobile brøk. For å bestemme frekvensen av protein omsetning, genereres FRAP kurver som representerer omfanget av fluorescens utvinning over tid. Fra disse utvinning kurver, kan gjennomsnittlig halv-ganger av protein utvinning beregnes. Oppretter kurve passer gjennomsnittlig FRAP dataene, og dermed matematiske analyser, er det også mulig å avgjøre om den gjennomsnittlige omløpshastighet av mobile brøkdel er sammensatt av en homogen befolkningen av molekyler, eller om det er sammensatt av to eller flere subpopulasjoner av molekyler snu på hvordan. I tillegg til å estimere protein omsetning PR av kvantitative metoder, kan sporing utvinning av photobleached områder i lamellipodia også tillate for nøyaktig kvantifisering av lamellipodial motilitet parametre som retrograd flyt, protrusion, og utgangen polymerisasjon priser. Dermed utgjør FRAP et allsidig verktøy som skal brukes for å vurdere ulike parametere i strukturer av levende celler.

Photoactivation er en metode som brukes til å spore spredningen og mobilitet av proteiner eller molekyler som stammer fra et angitt mobilnettet sted. Teknikken bruker, for eksempel en variant av vill-type grønne fluorescerende protein (GFP), opprinnelig utviklet av Patterson og Lippincott-Schwartz8, som er mutert i en måte som tillater sine fluorescens økes svært ved eksponering til ultrafiolett (UV) lys (rundt 400 nm; her, 405 nm). Som beskrevet av Patterson et al., vill-type GFP chromophores eksisterer som en blandet befolkning på nøytral fenoler og anionic phenolates, som produserer en stor absorbansen peak på ca 397 nm og en mindre på 475 nm, henholdsvis. Ved bestråling av protein med UV lys gjennomgår befolkningen photoconversion, skiftende mot skjemaet anionic. Når opphisset av 488 nm, photoconverted/photoactivated protein utstillinger en 3-fold økning i fluorescens, utilstrekkelig i praksis for skille mellom aktivert og ingen-aktivert GFP på grunn av den høye indre bakgrunn fluorescensen. Imidlertid er en nedgang i bakgrunnen intensitet oppnådd ved å innføre en enkelt aminosyre mutasjon i GFP sekvensen (histidin substitusjon på posisjon 203). Den resulterende T203H mutant, også kjent som photoactivatable-GFP (PA-GFP) er preget av en betydelig reduksjon i absorbansen i mindre toppen, som ved bestråling med UV-lys er økt nesten 100-fold når senere opphisset av 488 nm lys. Derfor er overuttrykte PA-GFP-merket proteiner en utbredt tilnærming, som tillater fastsetting av diffusjon og motilitet av molekyler i celler. Vi har tidligere brukt PA-GFP-merket utgangen for å bestemme frekvensen av spredning av utgangen monomerer fra cytosolic områder, slik at ikke bare utforskning av mobilitet i stoffer, men også timepris innlemmelse i den utstikkende lamellipodial utgangen nettverk6. Mer nylig litteratur beskriver også roman, foto-cabriolet proteiner som kan i prinsippet brukes på en tilsvarende måte, men skjuler den potensielle fordelen skal være synlige før Foto-konvertering. Eksempler for denne gruppen av fluorescerende proteiner er Dendra2 og mEos29,10,11,12.

I denne artikkelen forklarer vi metodikk microinjecting celler med proteiner. Videre forklarer vi hvordan denne teknikken kan kombineres med FRAP, ved photobleaching proteiner involvert i utgangen cytoskjelett regulering og motilitet, og hvordan FRAP kurver og pause for gjenoppretting av mobile fraksjoner kan utledes. I tillegg gir vi et eksempel på hvordan FRAP teknikken kan brukes til å bestemme begrepsordbok polymerisasjon priser lamellipodial nettverk. Vi tilbyr også instruksjoner og tips om hvordan du utfører photoactivation eksperimenter, som kan brukes til å bestemme cytosolic mobilitet av monomerisk utgangen og priser til utgangen innlemmelse i lamellipodia. Disse teknikkene, selvfølgelig, er ikke bare begrenset til utgangen cytoskjelett komponenter, men potensielt nødvendig moderat tilpasning eller optimalisering, kan bli mye brukt til andre celletyper, eller for å undersøke ulike proteiner, strukturer, og parametere.

Protocol

1. dekkglassvæske vask og sterilisering

  1. Fordype 15 mm (diameter) dekker briller (no.1) i en 500 mL kolbe som inneholder en blanding av 40 mL 37% HCl og 60 mL 100% EtOH (ikke mer enn 100 coverslips per 100 mL vaske løsning).
    Merk: selv om nylig kjøpt, coverslips må strengt rengjøres før såing celler på sine overflater. Dette er fordi de kan inneholde tynne filmer av fett, som macroscopically usynlig, men kan effektivt forstyrre vedheft og riktig spredning av lever celler. Mens filmer kan fjernes effektivt med løsninger som inneholder syre eller base (se Fischer et al. 13), bruker vi rutinemessig syre/alkohol blandingen beskrevet ovenfor.
  2. Riste flasken inneholder dekk glassene i 30 min på en rotasjon shaker. Velg en hastighet som tillater cover glass være virvlet fritt, men sakte nok til å unngå hyppige bryte. Filtrer løsningen for å fjerne knust glass stykker om gjenbruk.
  3. Overføre cover glass til en kolbe som inneholder minst 200 mL sterilt vann og ruge på en rotasjon shaker, mens gjentatte ganger erstatte vannet til surt lukten har forsvunnet. Flere vasker over flere timer anbefales for fullstendig eliminering av HCL-EtOH spor.
  4. Tørr personlige cover briller på et ark filter.
  5. Sted cover glass nederst på en 10 cm (diameter) Petriskål dekket med filter papir, og varme tørre-sterilisere. Unngå autoklavering som dette vil føre til dekke briller for å holde sammen.

2. behandling av celler, Transfection og Seeding på Coverslips

  1. Vokse B16-F1 musen melanom celler i henhold til standard celle kultur forhold i DMEM (4,5 finans glukose) inneholder 10% fosterets kalv serum, 2 mM glutamin og 1% penicillin-streptomycin ved 37 ° C, 7% CO2.
  2. Vokse NIH3T3 fibroblast celler for microinjections i henhold til standard celle kultur forhold (vev kultur inkubator på 37 ° C, 7% CO2) i DMEM (4,5 finans glukose) inneholder 10% fosterets bovin serum, 1 mM natrium pyruvate, 1 x MEM ikke-essensielle aminosyrer , 2 mM glutamin og 1% penicillin-streptomycin.
  3. For transfections, vokse B16-F1 celler til 100% samløpet i en 10 cm form og ved en 1:5 forhold i en 3 cm (diameter) plast parabol.
  4. På samme dag, etter B16-F1 cellene var lov til å overholde minst 6 h, transfect med 500 ng/rett av photoactivatable PA-GFP-utgangen eller EGFP-merket β-utgangen plasmider DNA. Co transfections av PA-GFP-utgangen med mCherry-koding vektorer, blande totalt 1 µg av plasmider DNA per 3 cm rett.
  5. Transfect B16-F1 cellene med transfection reagensen (Tabell for materiale). En 3 cm rett, blande 200 µL av 150 mM NaCl inneholder 500 ng DNA konstruere med 200 µL av 150 mM NaCl som inneholder 1 µL av transfection reagensen (dvs. DNA (µg): reagens (µL) forholdet 1:2 ble brukt).
  6. Inkuber transfection blandingen for 20 min ved romtemperatur (RT) og Pipetter drop-wise på 3 cm rett som inneholder cellene. Forsiktig swirl parabolen for å mikse og ruge over natten ved 37 ° C, 7% CO2.
  7. Forberede laminin belegg bufferen som inneholder 50 mM Tris, pH 7.4 og 150 mM NaCl.
  8. B16-F1 cellene, pels 15 mm cover briller ved å spre 150 µL av laminin (25 µg/mL laminin belegg buffer) og ruge 1t på RT. For de NIH3T3 cellene, pels cover glass med fibronectin løsning (25 µg/mL i fosfat-bufret saltvann (PBS)) og Inkuber 1t på RT.
  9. Vask laminin - eller fibronectin-ruges cover glass med PBS, og Sug opp PBS og legge 2 mL av transfekterte celler.
  10. Frø transfekterte B16-F1 cellene (i 1:30 forholdet fra en confluent rett), på dagen etter transfection, på laminin-belagt coverslips. Frø NIH3T3 fibroblaster (i 1:20 forholdet fra en confluent rett) på fibronectin-belagt coverslips.
  11. At cellene å spredt på laminin - eller fibronectin-belagt cover briller overnatter i en vev kultur inkubator på 37 ° C før mikroskopi. Alternativt kan mikroskopi eksperimenter startes på samme dag, gitt at cellene kan spre for minst 2-3 h.

3. montering av mikroskopi Imaging kammer

  1. Bruk en varme ledende RC-26 aluminium imaging kammer for mikroskopi (figur 1en). Smøre silikon fett rundt konturene av plastikk tetningsmiddel åpningen bruker en sprøyte (figur 1b).
  2. Plass dekselet glasset med celler side opp på kammeret (figur 1c).
  3. Plass det plastikk tetningsmiddel på dekket glasset for å være en sikker sel mellom dekkglassvæske og kammeret. Fikse det plastikk tetningsmiddel (diagonalt for å unngå dekkglassvæske brudd) Drei de glidende klemmer på kammeret å unngå mediet lekker (figur 1d).
  4. Pipetter 37 ° C forvarmet mikroskopi medium i det sentrale området. For mellomstore redusert autofluorescence og dermed optimalisert for mikroskopi, bruk samme oppskrift som kultur medium beskrevet ovenfor, men med F12-HAM i stedet for DMEM, som i tillegg inneholder 20 mM HEPES for dyrking av celler i fravær av CO2 (figur 1e).
  5. Sett varmen detektoren i utpekte sporet av kammeret og koble elektrodene på kammeret til en TC-324B automatisk temperatur kontroller opprettholde en konstant temperatur på 37 ° C (figur 1f).
  6. Plasser en liten dråpe neddyppingsolje på målet og plasser kammeret på.
  7. Inkuber kammeret med celler i minst 10-30 min til å tillate dem å komme seg fra temperatur dråpe under montering og å tilpasse til mikroskopi medium.
  8. Før mikroskopi er startet, erstatte kultur mediet i den sentrale reservoaret av kammer (omtrent 800 µL) å unngå upassende konsentrasjon av mellomstore komponenter og serum på grunn av middels fordampning. Langvarig mikroskopi økter med åpne kamre krever rutinemessig endring av avdamping medium.

4. microinjection prosedyre

  1. Pels på coverslips, forberede cellene og montere tenkelig kammeret som beskrevet ovenfor.
  2. Tine en aliquot renset protein injiseres (vanligvis 10 µL eller mindre) og fortynne den med den riktige microinjection bufferen.
    Merk: Buffer komposisjon kan variere med protein og celle type, men pass på å bruke en pH mellom 6.95 og 8.00 og unngå å bruke PBS, som cellen ikke liker å være injisert med PBS.
  3. For Rac1 microinjection, forberede bufferen som inneholder 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT. Mg2 + ionene er avgjørende for små GTPase stabilitet.
    Merk: Protein konsentrasjoner vanligvis varierer fra 0,1 til 1 mg/mL (maksimum 2 mg/mL), avhengig av protein, eksperiment, og celle type.
  4. Eventuelt legge fluorescerende farge, for eksempel inert dekstran (0,5 µg/mL, 70 kDa) til protein løsningen, som kan bekrefte tilstedeværelse av nålen før injeksjoner og tillater dokumentasjon av vellykket injeksjoner etter eksperimentet.
    Merk: Eksperimentet her er ikke rettet mot følgende dynamikken i injisert Rac1, som ville bare være mulig ved direkte fluorescens merking av protein. Koplingen av proteiner med fluorescerende fargestoffer eller fusion til et fluorescerende protein er mulig, men unngå her som havner det risikoen for forstyrrer funksjonen signalnettverk, spesielt av små proteiner som Rho-serien GTPase Rac1 (20 kDa).
  5. Sentrifuge protein løsningen på 10.000 x g i minst 30 minutter for å fjerne protein aggregater som kan føre til p tilstopping hvis i microinjection kapillær.
  6. Laste inn en microinjection nål (microinjection kapillær) med 1 µL av injeksjon blanding fra baksiden med en fleksibel pipette tips/microloader tips.
  7. Hvis luftbobler i pinne-spissen, forsiktig Trykk p bunnen for å fjerne dem. Fortsette raskt å unngå tørking av pinne-spissen, som kan føre til p tilstopping.
  8. Nøye justere nål holder på micromanipulation enheten. Hvis bruker en invertert mikroskop for fase kontrast bildebehandling, før nålen lasting, at er det nok plass til å bevege nålen opp og ned uten hindrer mikroskop kondensatoren.
  9. På skru microcapillary på nål holder, legge trykk (20-50 hPa bakgrunn trykk) nålen bruker en microinjection press enhet før translocating pinne-spissen til celle kultur medium.
    Merk: Aktivere trykket når nålen er i medium vil resultere i mediet blir sugd kapillær kraft, og dermed forhindre injeksjon av løsningen rundt.
  10. Plasser nålen i synsfeltet (lettes ved hjelp av lav forstørrelse mål). En 40 X tørr målet for microinjection eksperimenter ble brukt her.
  11. Plasser pinne-spissen macroscopically i vertikal posisjon i forhold til midten av målet linsen (dette vil akselerere finne pinne-spissen). Bruk mikroskopet med kontrast optikk for å flytte pinne-spissen på det horisontale planet i forhold til synsfelt, på en optisk fly-godt over cellen laget.
    Merk: Nålen vises først som en skygge i synsfeltet og fokus flyet kan deretter justeres for å visualisere spissen. Når spissen av nålen er funnet, redusere optisk flyet etterfulgt av pinne-spissen ned en beliggenhet nær cellen laget.
  12. Sjekk nålen flyt ved å bytte til en fluorescerende kanal ved fluorescerende dekstran, og tune strømmen med press enhet for å få en konstant "bakgrunn" flyt.
    Merk: I denne artikkelen vi beskrive manuell injeksjon, noe som er formidlet av bryte gjennom plasma membranen via berøre cellen overflaten og milde bevegelse av pinne-spissen under konstant p flyt. Dette må skilles fra automatisk injeksjon enheter ledsaget av programmert nål redusere og nål TRYKKØKNING under injeksjon hendelser som er mer passende for injeksjon av høyere celle tall etterfulgt av en senere celle befolkningen analyse. Metoden beskrevet her er optimalisert for enkelt celle analyse av time-lapse mikroskopi før, under og etter microinjection.
  13. Finn en celle rundt og redusere nålen over cellen.
  14. Når du er klar til å microinject, lavere nålen gradvis mot celle perinuclear regionen med fine mutteren micromanipulator joystick, mens cellene i fokus.
  15. For microinjection, forsiktig trykk plasma membran av cellen, som kan være tilstrekkelig å trenge cellen, eller hjelpe forbigående membran brudd av en svært skånsom Trykk på mikroskopet oppsettet.
    Merk: En hvit prikk på pinne-spissen vil indikere kontakt med plasma membran; etter membran brudd, pinne-spissen vil forsegle, ledsaget av en skånsom flyt av injeksjon løsning i cellen.
  16. Stans injeksjon snarest flyt i cellen vises (ideelt i 0,3 s) ved å flytte opp pinne-spissen til medium. Når du bruker fluorescerende dekstran, kan vellykket injeksjoner være umiddelbart dokumentert av fluorescens.
  17. Eventuelt starte time-lapse bildeopptak før eller etter microinjection.
    Merk: Lokal anvendelse av narkotika eller hemmere kan kjøres på alle trinnene her, bortsett fra den microinjection hendelse per se. For lokale programmer, kan spredningen av aktive molekylet være kontrollert av flyt press, dokumentert av fluorescens og pinne-spissen kan plasseres i ønsket høyde. Eksempler på lokale programmet eksperimenter, se eksempelvis små og Rottner14 eller Kaverina et al. 15
  18. Etter microinjection, vent til effekten av protein oppstår. Ulike proteiner og avhengig av forventet resultat, kan inkubasjon ganger variere. For de små GTPase Rac1, responsen til lamellipodium dannelse kan være startet innen 1 min eller mindre, men tar ca 10-15 min gjennomsnittlig å fullt utvikle (figur 1g, h).
  19. Dommer levedyktigheten til cellene etter microinjection.
    Merk: Upassende eller skadelig injeksjoner kan skade cellen, som er ofte ledsaget av uspesifisert celle-edge retraksjon eller plasma membranen brudd.
    1. Unngå poking gjennom både øvre og nedre plasma membran, som kan oppstå av injeksjoner i flat mobilnettet regioner.
      Merk: Injeksjon volumer bør holdes til et minimum (ideelt < 5% av mobilnettet) og vil vanligvis være i området femtoliter. Nødvendig injeksjon volumer kan også styres av endringer i konsentrasjon, men Merk at for proteiner, konsentrasjoner > 2 mg/mL kan bli upraktisk på grunn av hyppige nål tilstopping. Men avhenger dette også på kvaliteten og oppførsel av renset protein; f.eksinjeksjon av fluorescently-kombinert begrepsordbok kompliseres av konsentrasjon-avhengige og uunngåelig polymerisasjon i pinne-spissen, og så den utføres sjelden i dag (se liten et al. 16).
  20. Før, under eller etter effekten av microinjection, FRAP eller photoactivation kan utføres på samme celle (se seksjon 5 og 6).

5. FRAP prosedyre

  1. Transfect celle type interesse (B16-F1 celler her) med plasmider DNA koding en fluorescently merket protein av interesse (her en EGFP-merket versjon av β-utgangen ble brukt). Ætt cellene på laminin-belagt coverslips (trinn 2.10).
  2. Samle tenkelig kammeret (del 3).
  3. Bruk følgende innstillinger for lamellipodial regionen photobleaching: 65 mW laser makt (variabel ifølge eksperimentelle oppsett og laser kilde); 10 laser strålen pikseldiameteren; 1 ms blekemiddel bor tid/bildepunkt. 500 ms GFP eksponeringstid; 1500 ms tidsintervall. Eksperimentelle resultater i dette papiret ble utført en 100 X 1.4NA apochromatic objektiv.
  4. Utføre laser kalibrering for å sikre nøyaktighet i dimensjonene av regionen photobleached. Før kalibrering flytte synsvinkelen til et område mangler alle celler/fluorescens signal og observere bildet på skjermen.
  5. Velg objektiv forstørrelsen ved å klikke på respektive forstørrelse og redusere laser makt (3-5 mW) i den "panelet | Intensitet"-menyen. For å starte Manuell kalibrering på Visiview programvare (v2.1.4), Velg den "Konfigurer | FRAP"og klikk på den" Kalibrer | Juster manuell"-menyen. Kontroller at laser kan erklæres som en skarp prikk. Hvis ikke, enten refokusere eller justere laser maskinvaren.
  6. Utføre kalibrering manuelt guiding laser til forhåndsbestemt programvare xy-koordinater. Dette angir at programvaren slik spesifikt mål at laseren et brukerdefinert område for gjeldende forstørrelse.
  7. Før utløser laser, Bytt til GFP kanalen og starte bilde/tid forfalle oppkjøpet.
  8. Manuelt trekke regionen skal photobleached på GFP kanalen, mens skjermen.
  9. Starte photobleaching av en manuell utløser av 405 nm laser, minst 3-4 bilder etter initiering av bildeopptak. Anskaffe rammer før photobleaching er nødvendig for normalisering av bildet i senere dataanalyse.

6. Photoactivation prosedyre

Merk: Programvare, mikroskop oppsett og innstillinger, unntatt laser makt, er like de for FRAP. I photoactivation, en viktig forskjell i forhold til FRAP, er at en 405nm-laser makt betydelig lavere enn som ansatt for photobleaching må brukes til å aktivere PA-GFP uten samtidig photobleaching den.

  1. Co transfect celle type interesse (B16-F1 celler her, se trinn 2.5) med plasmider DNA koding PA-GFP-utgangen og en annen fluorescently merket protein (f.eks mCherry eller mCherry-Lifeact).
    Merk: I de fleste tilfeller mCherry-positive celler vil også være positivt for PA-GFP-utgangen vektoren, sistnevnte ikke normalt sett på GFP kanalen før photoactivation. For å forbedre muligheten at mCherry-positive cellene er også positivt for PA-GFP, bruke 1:2 Hva forholdet mCherry:PA-GFP-utgangen. Etter denne protokollen, mer enn 90% av cellene uttrykke mCherry vises vellykket aktivering av PA-GFP-utgangen.
  2. Frø B16-F1 celler på laminin-belagt coverslips (trinn 2.10).
  3. Samle tenkelig kammeret (del 3).
  4. Før du starter photoactivation eksperimenter, eventuelt utføre laser kalibrering for den valgte målsettingen (trinn 5.4-5.6).
  5. Angi GFP/488 nm bildeopptak 500 ms eksponering og 1500 ms tidsintervall (avhengig av eksperimentell design).
  6. Justere programvare for å anskaffe tokanals eller trippel kanal time-lapse filmer av merke torget "Bølgelengde serien" og velge ønsket antall kanaler i den "Hent | Bølgelengde"-menyen. Det anbefales at tid forfalle filmene er kjøpt med kontrast og GFP kanaler.
    1. Du kan eventuelt også inkludere mCherry kanalen. men kan utsette celler med for mye lys indusere photodamage. Dette kunne vært unngått med oksygen åtseldyr som Oxyrase17, selv om effektiv behandling krever celle kammer tetting.
  7. Finne transfekterte celler i mCherry kanalen.
  8. Før utløser laser, starte image/tid forfalle oppkjøp og manuelt trekke regionen skal photoactivated på fase kontrast kanalen, mens skjermen.
  9. Starte photoactivation av en manuell utløser av 405 nm laser (intensitet ligger mellom 5-15 mW fra den "panelet | Intensitet"-menyen), minst 3-4 bilder etter bilde oppkjøpet innvielsen.

7. data analyse og presentasjon av FRAP resultater

Merk: Metoden presentert brukes for å undersøke omsetningen til en protein er akkumuleres på steder av dynamisk begrepsordbok forsamling, i dette tilfellet VASP, som knytter vedheft områder og tips av utstående lamellipodia. Vi analyserer omsetningen på lamellipodium spissen, men de samme prinsippene for analyse kan brukes for å undersøke omsetningen av VASP eller noen andre protein og andre subcellular rom.

  1. Åpne time-lapse filmene avledet fra Visiview på Metamorph programvare. Metamorph v7.8.10 ble brukt i denne artikkelen.
  2. Utlede intensitetsverdiene for photobleached regioner av manuelt skisserte respektive områder på Metamorph. Tegne en figur på spissen av lamellipodium som dekker hele eller en del av området photobleached, og justere sin posisjon på etterfølgende bilder hvis nødvendig (dvs. hvis kanten er stikker), for å spore endringer i lamellipodial intensiteter av det respektive komponentene under tips forskyvning.
  3. For korrigering av bakgrunn og photobleaching, analysere områder innenfor og utenfor cellen. Se figur 2en for representant regioner av målt intensiteter.
  4. Mens en avkastning er valgt, ekstra intensitet verdier på Metamorph ved hjelp av menyen "mål | Regionen mål". Sikre "Brukt tid" og "Gjennomsnittlig intensitet" velges i "Configure"-menyen. Klikk "Åpne log" og velg "Dynamisk datautveksling". Klikk "OK" for å åpne et Excel-regneark og klikk på "Åpne" knappen igjen for å lime inn Metamorph verdiene i Excel.
    Merk: Disse verdiene er brukt til å generere fluorescens utvinning kurvene.
  5. For genererer fluorescens utvinning kurver på den lamellipodium spissen photobleached regioner (normalisert til regionen intensitet før photobleaching), gjelde følgende ligning:
    Equation 1   Formel 1
    hvor: FRAPTn er photobleached regionen intensiteten for hver ramme rundt etter photobleaching; UtTn er en region intensitet tatt utenfor cellen (bakgrunn) for hver ramme rundt etter photobleaching; InsTn er to gjennomsnitt i regionen intensiteter for hver ramme rundt etter photobleaching (brukes til å normalisere for oppkjøpet photobleaching over tid); FRAPT-1 er photobleached regionen intensiteten før photobleaching; T-1 er en region intensitet tatt utenfor cellen (bakgrunn) før photobleaching; InsT-1 er to gjennomsnitt i regionen intensiteter for hver ramme rundt før photobleaching.
  6. For hver gang ramme rundt, kan du bruke Formel 1 for å få en fluorescens utvinning kurve som inneholder alle tidsrammer undersøkes. Hvor lenge er strengt avhengig protein under etterforskning. Når ukjent, utføre innledende eksperimenter å erverve omløpshastighet av protein.
  7. For å beregne den halve tiden av utvinning, lim inn verdiene for fluorescens utvinning kurven med tilsvarende tiden (i sekunder) i en Sigma tomt (v.12), og utføre en kurve ved hjelp av den "dynamiske passer veiviseren | Eksponentiell stige til maksimalt"verktøy. Velg mono-eksponentiell (single, 3 parametere) eller bi-eksponentiell (dobbeltrom, 4 parameterene) funksjoner, avhengig av den beste kurven.
  8. Bruk følgende formel for mono-eksponentiell funksjon:
    Equation 2   Ligning 2
  9. Bruk følgende formel for bi-eksponentiell funksjon:
    Equation 3   Formel 3
  10. Lime inn parametere "b" og "d" avledet fra Sigma Plot (ligning 2 eller formel 3) i Excel til å beregne den halve tiden av utvinning. Bruk de følgende formlene:
    Equation 4   Ligningen 4
    eller
    Equation 5   Ligningen 5
  11. Når mono-Eksponentialfunksjon resulterer i en nøyaktig kurve, gjelde bare ligningen 4.
  12. Når mono-Eksponentialfunksjon ikke resultere i et godt kurve, gjelde bi-eksponentiell formelen ved å løse både ligningen 4 og ligningen 5. Vurdere de resulterende to halv-gangene for utvinning som to forskjellige protein fraksjoner: en raskt og en sakte utveksle brøk, henholdsvis.

8. fastsettelse av Lamellipodial utgangen polymerisasjon frekvensen av FRAP

  1. Bestemme lamellipodial utgangen polymerisasjon frekvensen, transfect B16-F1 celler med EGFP-merket β-utgangen, og photobleach lamellipodial regionen (trinn 5.9) bruke 1,5 s tidsintervall og 500 ms GFP eksponering.
  2. Åpne time-lapse filmer fra Visiview i Metamorph, og kalibrere piksel/µm forholdet i henhold til mål brukes av den "mål | Kalibrere avstander"verktøy.
  3. Spille av time-lapse filmen og stoppe det på rammen når lamellipodial fluorescens utvinningen, som renner tilbake mot lamell som en linje, har nådd lameller og lenger bakover flyt kan spores.
  4. Mål avstanden i µm mellom spissen av lamellipodium og baksiden av gjenopprettede fluorescens. Denne avstanden tilsvarer summen av retrograd flyt og protrusion avstander.
  5. Alternativt separate protrusion fra retrograd flyt, merke lamellipodial spissen med en linje én ramme før photobleaching. Bruk linjen som referanse poeng i etterfølgende bilder å referere til utgangsposisjonen lamellipodium tips på tidspunktet for photobleaching; referansepunktet kan brukes til å måle protrusion avstand og retrograd flyt.
  6. Merk tiden (i sekunder) som kreves for fluorescens gjenoppretting etter photobleaching oppstår. Tiden kan beregnes manuelt fra Rammehastigheten eller visualisert ved Metamorph gjennom den "mål | Regionen mål"verktøy.
  7. Utlede begrepsordbok polymerisasjon hastigheten ved hjelp av følgende ligning (med noen ligningen parametere basert på Metamorph målinger fra trinn 8.4 og 8.6):
    Equation 6   Ligningen 6
    hvor utgangen polymerisasjon er i µm/min, retrograd flyt ligger i µm, lamellipodial protrusion avstanden er i µm og tid er i sekunder.

9. analyse av Protein diffusjon og Mobility på Photoactivation

Merk: Metoden presenteres her beskriver analyse av utgangen monomer mobilitet ved å bruke photoactivation av utgangen smeltet til PA-GFP, som illustrert ved visualisering og måling av protein spredning gjennom stoffer.

  1. For å måle spredningen av photoactivatable utgangen fra en cytosolic region, samt akkumulering innenfor et lamellipodial område, bruker Metamorph til å bestemme intensiteten over tid i følgende områder (illustrert i Figur 3en ): en cytosolic photoactivated region (PA); et lamellipodial område, på hvilke photoactivated proteiner forventes vil akkumuleres over tid (Lam); en region utenfor cellen brukes for normalisering av bakgrunnen fluorescens (ut).
  2. Når mobiliteten til utgangen innen stoffer, måle unike cytosolic områder (se Figur 3et, regioner R1-R5). Merk at photobleaching oppkjøpet ikke kan bestemmes på en lignende måte til FRAP, skyldes en økning i fokus- og til slutt cellen hele fluorescens ved aktivering.
  3. Overføre intensitetsverdiene for alle regioner fra Metamorph i et Excel-regneark, som beskrevet i trinn 7.4.
  4. For å undersøke graden av forskyvning av photoactivatable utgangen fra cytosolic regionen photoactivation eller dens rate selskap innenfor et lamellipodial område (begge representert som prosent intensitet av regionen cytosolic photoactivated gangen 0) , generere fluorescens kurver fra dataene i trinn 9.3. Bruk de følgende formlene:
    Equation 7   Ligningen 7
    Equation 8   Ligningen 8
    hvor: PATn er intensiteten i en cytosolic photoactivated region for hver ramme rundt etter photoactivation; LAMTn er intensiteten i et lamellipodial område for hver ramme rundt etter photoactivation; UTTn intensiteten i en region tatt utenfor cellen (bakgrunn) for hver ramme rundt følger photoactivation; PAT-1 er intensiteten av cytosolic photoactivated regionen før photoactivation; LAMT-1 er intensiteten av lamellipodial regionen før photoactivation; T-1 er intensiteten i en region tatt utenfor cellen (bakgrunn) før photoactivation; PAT0 er intensiteten av cytosolic photoactivated regionen gangen 0 (dvs. første ramme etter photoactivation); UTT0 er intensiteten i en region tatt utenfor cellen (bakgrunn) på tiden 0 (dvs. første ramme etter photoactivation).
  5. Eventuelt for bedre visualisering av dataene, normalisere intensitet kurver til 0 ved å trekke intensiteten i den første rammen etter photoactivation fra hver etterfølgende ramme.
    Merk: Følgende analysemetode (trinn 9.6-9.8) kan også beregne cytosolic spredning av photoactivated utgangen innen stoffer.
  6. Måle intensiteten for cytosolic regioner, som plasseres fortløpende distally fra regionen aktivisering.
  7. Representerer intensiteten av disse regionene som prosent intensitet av regionen photoactivated gangen 0, kan du bruke ligningen 8, der lamellipodial intensiteter er erstattet med intensiteter for hver cytosolic avkastning. Størrelsen og antallet regioner kan variere avhengig av cellen størrelse og spredning avstand skal måles.
  8. Få en kvantifiserbare for prisen av photoactivated protein infiltrere hver cytosolic region, lim tid og verdier av kurven av fluorescens intensitet økning for hvert område i Sigma handling (lik FRAP analyse i § 7), bruk Ligning 2 og ligningen 4 å utlede den halve tiden fluorescens intensitet nådd et platå. Sammenligne t1/2 verdiene mellom ulike eksperimentelle grupper.

Representative Results

Figur 1 g h Vis fase kontrast bilder av en NIH3T3 fibroblast celle før og 10 min post microinjection av Rac1, som er en liten Rho-familien GTPase i stand til å indusere lamellipodia formasjon gjennom bransjens samspill med BØLGEN komplekse. Cellen er først visualisert før microinjection (figur 1g), for å bekrefte sin levedyktighet og morfologi, f.eks mangel på lamellipodia. På 10 min post microinjection, har cellen åpenbart endret sin morfologi, som er forventet fra denne behandlingen, og angir en vellykket injeksjon (figur 1h).

For enkelhet og klarhet gir vi neste eksemplarisk resultater for FRAP og photoactivation analyse i celler som ikke er i tillegg microinjected.

Analyse av omsetningen av EGFP-merket VASP på lamellipodium spissen er vist i figur 2a-f. Merk at VASP i tillegg mål å begynnende og focal adhesjon, avlang og små prikker i cellen interiør18,19. Fluorescens intensiteten i et lamellipodial område med en klar VASP akkumulering på spissen var bleket og målt for hvert tidsrom, etter konturene av Avkastningen før, under og etter bleking som lamellipodium stikker fremover. Som bleket EGFP-VASP proteiner resirkuleres ved ikke-bleket molekyler på disse stedene, er gradvis gjenvinning av fluorescens observert (figur 2b). FRAP utvinning kurven innhentet i denne måten og normalisert til pre blekemiddel intensitet (uttrykt som 1) kan ses i figur 2c. Photobleaching effektivitet kan variere og var omtrent 20% av verdien før bleking i dette eksemplet som bestemmes av verdien ved t0 (det første bildet etter photobleaching). Økningen av fluorescens når et platå i eksempelet på omtrent 80% av fluorescens før bleking. I et statisk strukturdiagram i gang løpet av eksperimentet, som en fokal vedheft, forskjellen mellom pre blekemiddel intensiteten og platå fluorescens nådde etter utvinning er definert som immobile brøken (hvis rød pil i figur 2 c, e), mens mengden fluorescens gjenopprettet mellom tidspunktet for bleking og full gjenoppretting er definert som mobile brøken (grønn tohodet pil i figur 2c, e). Merk at i en dynamisk endre struktur som lamellipodium spissen analysert her, omfanget av hvis kan ikke bare representerer immobile molekyler, men også avledet fra en reduksjon i protrusion hastighet, som EGFP-VASP intensitet er kjent for avhengig av denne parameteren18. For å beregne den halve tiden av utvinning, ble en Tilpass kurve opprettet på Sigma tomt (figur 2d). I dette tilfellet verdien for parameteren "b" utvunnet fra løse ligning 2 er lik til 0.0754, som brukes på den logaritmiske funksjonen (ligningen 4) resulterer i en estimert pause for gjenoppretting av 9.19 s (figur 2d , høyre panel), som er relativt raskt i denne bestemt celle i forhold til gjennomsnittet publisert tidligere5. Det må bemerkes at utvinning halv-ganger kan variere betydelig fra celle til celle innen samme populasjon. For å få representativt resultater, anbefaler vi derfor å bestemme denne parameteren som et gjennomsnitt fra minst 15-20 celler. For å illustrere graden av avvik, aritmetiske gjennomsnittene av EGFP-VASP utvinning gjennomsnitt fra 15 celler for hvert tidspunkt ble generert (figur 2e), og gjennomsnittlig kurve passer opprettes og vises på en tilsvarende måte (figur 2 f).

Polymerisasjon frekvensen av lamellipodial utgangen nettverket består av summen av fremover nettverk protrusion og retrograd flyt. FRAP kan brukes for å måle begrepsordbok polymerisasjon frekvensen av transfecting celler (i dette tilfellet B16-F1) med EGFP-merket β-utgangen og photobleaching en fremstående lamellipodial region (figur 2g). For analyse av lamellipodial utgangen nettverk polymerisasjon vurderes fluorescens utvinning på bleking av EGFP-merket β-utgangen over tid. Som polymerisasjon av utgangen monomerer utvikler i piggete endene av lamellipodial utgangen filamenter (som alle peker mot fronten20), er nettverket kontinuerlig translocated rearwards og utvikler seg fremover, priser som kan være lett innhentet gjennom polarisert utvinning av fluorescens på photobleaching. Fluorescens utvinning av lamellipodium er fullført når sonen bleket har nådd sonen overgangen mellom den bakre delen av lamellipodium og lamell, som er preget av lavere tetthet av mer vannrett arrangert filament pakker snu mye saktere enn hva er observert i lamellipodium. Som illustrert i figur 2g, kan fluorescens utvinning visualiseres som en linje som er vannrett kanten og strømme bakover mot lamell, som lar måling avstanden protrusion og retrograd flyt (individuelt representert i det høyre panelet på figur 2g som oransje og rød dobbelthodet pil, henholdsvis).

Vi har også brukt photoactivation i B16-F1 celler transfekterte med PA-GFP-utgangen spore mobiliteten til utgangen monomerer innen stoffer og rate deres selskap innen utstående lamellipodia. Som illustrert i Figur 3a, b, en cytosolic region var photoactivated av eksponering for en 405 nm laser, mens bildene ble anskaffet på GFP kanal hver 1.5 s for å visualisere distribusjon av GFP-merket, photoactivated utgangen. Photoactivated GFP-utgangen kan sees spre av cytosolic regionen i Figur 3b. Frekvensen av fluorescens intensitet reduksjon i regionen photoactivated cytosolic representeres som prosent første intensiteten ved t0 (først-ramme etter photoactivation; Figur 3 c). Photoactivated utgangen kan også integreres på tuppen av lamellipodia, der nye begrepsordbok monomerer legges til voksende piggete ender elongating begrepsordbok filamenter under protrusion. For å anslå lamellipodial selskap, målt vi fluorescens intensiteten over tid en todimensjonal contour/regionen i ca 5 µm i bredde og 1 µm i høyden. regionen var konstant re plassert på spissen av lamellipodium som det utsparinger stakk. Utgangen innlemmelse var representert som prosent fluorescens intensiteten i regionen photoactivated cytosolic ved t0 (Figur 3d). Som forlengelse av utgangen filamenter kommet, ble nye begrepsordbok monomerer innlemmet lamellipodial foran. En brøkdel av disse begrepsordbok monomerer ble stochastically avledet fra cytosolic bassenget der monomerer var photoactivated. Dette resulterer i den raske økningen av fluorescens i lamellipodia i de første 20 s etter photoactivation. Som ny monomerer legges til lamellipodial fronten, tidligere innarbeidet begrepsordbok monomerer flyt med filamenter mot lameller av retrograd flyt. Over tid, Avkastningen er helt fylt med fluorescerende monomerer og et platå i fluorescens nås (Figur 3d). En gradvis nedgang i fluorescens er deretter observert når, etter spredningen av photoactivated monomerer hele cellen, legges ikke-photoactivated utgangen monomerer stadig re til lamellipodial foran. Denne nedgangen i fluorescens finner et nytt platå, som vil bli nådd så snart en saldo i hele cellen mellom photoactivated og ikke-photoactivated monomerer nås (data ikke vist).

Mobiliteten til utgangen monomerer gjennom stoffer avledet ved å måle fluorescens intensiteter i regioner like store plassert distally fra photoactivated regionen (eksemplifiseres på Figur 3et av fargekodet regioner merket R1-R5). Som illustrert i Figur 3e, fluorescens intensitet i hver av disse regionene er gradvis avtagende bort fra den cytosolically photoactivated-regionen, som brøkdel av photoactivated utgangen monomerer blir stadig mer utvannet med ingen-aktivert (dvs. ikke-fluorescerende) monomerer. Videre toppen av fluorescens nås senere: jo mer fjernt målt regionen ligger fra photoactivated regionen, jo lenger tiden som kreves for utgangen monomerer å spre inn i disse regionene. En representant verdi for graden av utgangen monomer infiltrasjon i hver region kan utledes ved kvantifisere halv tid nå fluorescens platået. Jo mer fjernt regionen, jo lenger det tar photoactivated utgangen å spre inn i det, og dermed mer tid er nødvendig for fluorescerende platået nås, til slutt fører til høyere1/2 verdien (Figur 3e).

Figure 1
Figur 1 : Imaging kammer forsamling og microinjection prosedyre. (en) Imaging kammer komponenter. (b) silikon fett er nøye smurt rundt åpningen av en plastikk tetningsmiddel. (c) i dekkglassvæske er plassert med celle-siden vendt opp inn i sentrum av tenkelig chamber åpning. (d) en sikker segl er etablert ved å plassere den plastikk tetningsmiddel på dekkglassvæske og ved å stramme siden klemmer. (e) mikroskopi medium er pipetted inn i kammeret sporet. (f) tenkelig kammeret er plassert på mikroskopet scenen, varme detektor og elektrodene er knyttet til en oppvarming enhet forhåndsinnstilt til 37 ° C og celler kan tilpasse for minst 30 min før mikroskopi er startet. I dette eksemplet mikroskop scenen er også utstyrt med en micromanipulator for å utføre microinjections og microinjection nålen er dyppet i mediet dekker cellen laget i tenkelig kammeret. (g) et NIH3T3 fibroblast celle er visualisert før microinjection av kontrast mikroskopi. Røde Kors i perinuclear skuffen angir plasseringen av den fremtidige microinjection, som tilsvarer en høy cytoplasmatiske område på grunn av nærheten til store kjernen. (h) 10 min etter microinjection med Rac1, cellen reagerer ved fremtredende dannelsen av lamellipodia rundt hele cellen periferien (angitt med grønne pilene). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: FRAP lar bfu av protein omsetning eller lamellipodial utgangen polymerisasjon. (en) representant eksempel B16-F1 cellen uttrykke EGFP-VASP før photobleaching av et lamellipodial område som angitt. Forskjellig fargede konturer/figurer er merket for å angi hvilke områder ble vurdert for fluorescens intensitet målinger over tid. Merk den rød konturen merket med et utropstegn, hvilke merker en cytosolic region i et område som inneholder flere blemmer og celle overflaten ruffles. Dynamisk områder som dette bør unngås for å velge regioner fluorescens referanse, som de er preget av sterke kortsiktige svingninger av fluorescens, potensielt forårsake unøyaktige resultater. (b) Lamellipodial regionen EGFP-VASP uttrykke cellen før og etter photobleaching. Utvinning av fluorescerende signal når photobleaching i regionen merket med lilla er visualisert over tid. Pilen viser spissen av en microspike, beriket for VASP trolig på grunn av utgangen filamenter polymerizing det19. (c) et eksempel på en FRAP utvinning kurve som avledet fra kvantifisere fluorescerende intensiteten av photobleached lamellipodium (lilla konturer) i b. røde og grønne linjer til høyre angir henholdsvis immobile og mobile fraksjoner. (d) en tilpasning av FRAP utvinning kurven i c (venstre panel) og et eksempel på beregningsmetoden brukes til å utlede halv gjenopprettingstid (høyre panel). (e) et eksempel på en FRAP utvinning kurve avledet fra snitt fluorescens utvinning kurvene i 15 celler, med SEM stolper som angir spredningsgraden i populasjonsutvalg. (f) en kurve passer avledet fra snitt FRAP utvinning kurve passer 15 celler (venstre panel) og et eksempel på beregningsmetoden brukes til å utlede halv gjenopprettingstid (høyre panel). (g) Time-lapse paneler for utstikkende lamellipodium i B16-F1 cellen uttrykke EGFP-merket β-utgangen før og etter bleking av lamellipodial regionen som er angitt, etterfulgt av fluorescens utvinning i lamellipodium over tid. På høyre panel, verdier målt for protrusion og retrograd avstander tilbys (i oransje og røde, henholdsvis). Beregninger under bildet panelene avslører hvordan summen av protrusion og retrograd avstander brukes til å utlede polymerisasjon rate av lamellipodial utgangen nettverket. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Photoactivation av PA-GFP-utgangen for monomer sporing gjennom cellen. (en) A representativt eksempel på en B16-F1 celle uttrykke PA-GFP-utgangen før utløser photoactivation i en cytosolic region som angitt av den røde sirkelen (PA). Forskjellig farget konturer er merket for å angi hvilke områder ble vurdert for fluorescens intensitet målinger over tid. (b) en illustrasjon av timelige fordelingen av PA-GFP-utgangen følgende photoactivation. Legg merke til gradvis reduksjon av fluorescens i photoactivated, cytosolic regionen (røde sirkelen), som photoactivated utgangen diffunderer fra det. På grunn av deres diffusjon til fronten og montering i nettverket, er photoactivated utgangen monomerer gradvis forbedret i lamellipodia (cyan-regionen) og hele stoffer (fargekodede regioner) på en avstand - og tidsavhengige måte. (c) representant, timelige nedgangen av fluorescens i photoactivated cytosolic regionen (rød kontur i b). (d) Temporal endringer i fluorescens intensiteten i regionen lamellipodial (cyan konturer i b). (e) kurver representant timelige endringene fluorescens intensitet cytosolic regioner (fargekodet i b) på grunn av posisjonering i variabel avstander fra området av photoactivation. Merk hvordan halv-ganger for å nå fluorescensen platået (angitt i forklaringen til høyre) øke med avstanden gitt regionen til området photoactivation, sannsynligvis samkjøre med den økte ganger nødvendig for spredning av utgangen monomerer i den respektive regionen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Her diskuterer vi avgjørende skritt i teknikkene som beskrives i denne artikkelen, og hvordan de kan optimaliseres for programmet i ulike eksperimentelle forhold.

Microinjection er en metode som kan brukes for å overvåke i cellene den øyeblikkelige effektene fra introdusere eksogene proteiner, hemmere eller narkotika. Det kan være spesielt fordelaktig for å bestemme funksjoner proteinene i vanskelig å transfect celletyper eller i situasjoner når langsiktige uttrykk ikke er ønsket. Det må bemerkes at overlevelse av visse celletyper varierer avhengig av den ekstracellulære matrisen de er seeded på. Mest endothelial, epithelial eller fibroblast-lignende celletyper, selv små liker fisk keratocytes (se Dang et al. 21 og Anderson og tvers22) kan med hell injiseres. Det finnes imidlertid unntak, for eksempel B16-F1 celler seeded på laminin, som utgjør en utmerket modellsystem av celle migrasjon, men er ikke kompatible med injeksjon på denne typen undergrunnen av ukjent grunn. For NIH3T3 fibroblast celler utfører vi rutinemessig injeksjoner på fibronectin undergrunnen og ekstra photomanipulation teknikker som FRAP (selv med photoactivation, vises B16-F1 celler her) like godt kan utføres i disse fibroblaster (se f.eks Köstler et al. 3). det må også betraktes som ulike proteiner, deres funksjonelle egenskaper og eksperimentet mål, kan ta forskjellige mengder tid å forårsake endringer, varierende fra sekunder til timer. En fordel med teknikken er at dosen/konsentrasjonen av eksogene agent kan kontrolleres mer nøyaktig på enkeltcelle nivå enn f.eksved plasmider transfection. I tillegg er fluorescerende merking av et protein ikke en nødvendighet for å garantere sin tilstedeværelse i cellen, som kan øke fleksibiliteten hvis samtidige flerkanals visualisering av andre fluorescently-merket proteiner. Microinjection kan være spesielt nyttig for å analysere øyeblikkelige effektene av spesifikke proteiner eller protein blandinger på dynamiske endringer på celle morfologi eller cytoskeleton (f.eks Dang et al. 21 for et eksempel på øyeblikkelige effekter på overføring av den Arp2/3 komplekse inhibitor Arpin). En ulempe ved teknikken er dens invasiveness, som kan forårsake celle skade eller påvirke celle morfologi. Derfor overvåker en viktig faktor når du utfører microinjections celle levedyktighet. Metoden innført her er avhengig av manuell manipulasjon. Betingelser testet med vellykket injeksjoner, som fibroblaster vokser på fibronectin undergrunnen, kan manuell injeksjon protokollen beskrevet her en nær 100% suksessrate; Dette er viktig når kombinere dette med sofistikert og tidkrevende oppfølgingseksperimenter inkludert video mikroskopi eller FRAP, som publisert tidligere3. Dette utelukker ikke at noen ganger, enkeltceller kan lide av en microinjection hendelse, som trygt kan gjenkjennes av plutselige forandringer av kontrast til både kjernen og cytoplasma, etterfulgt av cellen kanten retraksjon. Slike sjeldne eksperimentelle tilfeller er ekskludert og derfor ikke ansett for videre analyser.

Men en halv-automatiske tilnærming er også vanlig, for eksempel ansette rask (< 300 ms) maskin-kontrollerte nål redusere sammenfallende med injeksjon press økningen, slik at nålen har bare skal plasseres over hver celle før respektive injeksjon. Suksessrate på halv-automatiske injeksjoner er per definisjon lavere enn den manuelle fremgangsmåten beskrevet ovenfor, bare fordi den er optimalisert for hastighet, etterfulgt av analyse av flere celler som har overlevd denne behandlingen; dermed stole den ikke på vellykket injeksjon av en enkeltcelle. Derfor, i motsetning til én celle analyse, halv-automatiske injeksjoner er bedre egnet for å analysere injeksjon effekter av flere hundre celler, f.eks av video mikroskopi ved lav forstørrelse eller cellen fiksering og flekker. Uansett detaljert tilnærming ansatt, microinjection utgjør ikke en end-point analyse, men kan kombineres med en rekke teknikker, inkludert FRAP eller photoactivation3.

Når protein omløpshastighet av FRAP, intensiteten av laseren må være optimalisert, avhengig av mikroskopet oppsett og bildebehandling forholdene (forstørrelse, mål, etc., og celle type, strukturen og fluorescerende protein for photobleaching). Merk at på optimal laser makt, effektiv bleking er kombinert med minst mulig photodamage, for å unngå krymping eller fullføre tilbakekalling av strukturen under analyse (f.eks lamellipodia eller filopodia) eller med skade på cellenivå. Ideelt sett skal minst 70 – 80% av bleking effektivitet oppnås, men fullstendig bleking kan bli hindret av ekstremt rask omsetning av protein, som tilfellet noe over 50% kan også være akseptabelt. Optimal bleking effekt for en gitt struktur og fluorescerende fargestoff bør testes eksperimentelt, starter fra en lav laser makt etterfulgt av sin gradvis økning. Selvfølgelig noen fluorescerende farge kan per definisjon være bleket med laserlys nær sin topp på eksitasjon (488 nm for brukte grønne fargestoffer som FITC eller EGFP). Men lasere med kortere bølgelengde, som nær-UV lasere, leverer høyere makter og kan dermed også brukes for effektiv bleking av brukte fargestoffer. Vi rutinemessig bruker en 405 nm diode laser (120 mW) for bleking av både EGFP og røde fluorescerende fargestoffer (for eksempel mCherry), men med litt lavere effektivitet ved den sistnevnte (data ikke vist). Som 405 nm-dioden kan også brukes til photoactivation av PA-GFP (se nedenfor), endows dette systemet med maksimal fleksibilitet.

For B16-F1 celle strukturer og fluorescerende proteiner photobleached her, ble 405 nm-laser makt mellom 65-100 mW brukt. Når analysere et photobleached område, er det viktig å vurdere om gitt strukturen er bevart i sin opprinnelige form over analysen tidsperiode. For eksempel når analysere omsetning av proteiner på lamellipodia tips, utvises om Bøyningen på lamellipodia er betydelig endret over tid, som endringer i krumning kan føre til unøyaktige resultater hvis regionen/konturen analysert ikke fullt omfatte hele strukturen i hver målte ramme. I tillegg bør det bemerkes at pakker som er innebygd i lamellipodia, som microspikes, kan forårsake avvik i fluorescens intensitet. Som illustrert i figur 2b (hvit pil i 9 s tidsramme), en microspike-lignende struktur ligger ved målt photobleached regionen, men forblir utenfor gjennom hele mål, og dermed forårsaker ikke noen unøyaktighet. Analyse av protein omsetning er viktige betraktninger ved å velge plassering og størrelse på analysert regioner at deres fluorescens over tid ikke bør bli betydelig påvirket av endringer i celle morfologi eller faktorer enn hardt å unngå Kjøp photobleaching. For eksempel må strukturer gir betydelig kvantitative bidrag til analysert strukturen ikke flytte ut av regionen målt under analyse; i tillegg bør ubeslektet, fluorescerende enheter som vesicula strukturer som tiltrekker protein ikke angi feltet rundt under analyse. For å bestemme frekvensen av lamellipodial utgangen polymerisasjon, bør utvises at analyseres ikke trekke eller ruffling (dvs. oppover folding) lamellipodia, som dette vil sterkt påvirke nøyaktigheten av resultatet. I tillegg tilbakekalling av lamellipodial regioner kan vises som Hurtig bakover translokasjon, kan føre til overvurdering av andelen lamellipodial utgangen polymerisasjon. Tas er avstanden intracellulær normalisering regioner (tatt som referanse stillinger for korrigering av oppkjøpet photobleaching) fra den faktiske posisjonen til photobleaching, som bør være store nok til å unngå direkte innflytelse av photobleached området.

Når optimale forhold for photoactivation av PA-GFP-merket konstruerer, bør forsiktighet utvises for å unngå umiddelbar bleking under photoactivation. I vårt arbeid, de beste resultatene ble oppnådd med laser krefter 5 - 10 ganger lavere enn normalt ansatt for bleking av EGFP. For bildeopptak photoactivated molekyler, skal eksponeringstid og tidsintervallet mellom rammer være optimalisert med tanke på størrelsen på regioner og strukturer for å være photoactivated og analysert, og potensielle mobilitet av photoactivated proteiner til andre subcellular steder. Som for alle typer fluorescens bildebehandling er vedlikehold av cellen levedyktighet avgjørende for å få fysiologisk relevante resultater.

I prinsippet grønn til rød photoconversion fluorescerende proteiner som mEos eller Dronpa varianter12 utgjør en like kraftig metode for følgende dynamics og omsetning på subcellular strukturer som lamellipodium (se f.eks Burnette et al. 23). fordelen av sistnevnte metoden i motsetning til PA-GFP ville være muligheten til å følge protein dynamics før og etter konvertering med to forskjellige farger, uten behovet å co express en ekstra røde fluorescerende protein. Imidlertid våre foreløpige eksperimenter skyldtes omfanget av kontrast endring og intensitet av fluorescerende signal oppnådd ved photoactivation av PA-GFP større sammenlignet med photoconverted sonder, kanskje de overlegne spectral funksjonene av grønt mot rød fluorescerende sonder (data ikke vist). I alle fall publisert detaljerte studier begrepsordbok filament omsetning i celle-edge utstikkende deler som lamellipodia eller Vaccinia forårsaket av virus begrepsordbok haler så langt bare med PA-GFP derivater5,6,24.

Når du vurderer hvilket celle område å analysere følgende photoactivation, faktorer bør tas i betraktning, som drøftes med spesifikke eksempelet som vises her (innlemmelse av utgangen monomerer ytterst cellen ved aktivering i stoffer), men kan sikkert være extrapolated til ulike analoge vitenskapelige problemer. Først når måle frekvensen av lamellipodial innlemmelse av cytosolically photoactivated proteiner, for eksempel i forskjellige eksperimentelle forhold (som vist i Dimchev et al. 6), størrelser av cytosolic regioner og deres avstander lamellipodial kantene skal være sammenlignbare mellom eksperimentelle grupper. Det er også viktig å vurdere som photoactivating cytosolic regioner, celle tykkelsen er større i posisjoner nærmere til kjernen. Aktivere tykkere mobilnettet regioner kan resultere i høyere mengder aktivert proteiner, gitt at fordelingen av protein aktiveres er homogenously fordelt på stoffer. Endelig kan uttrykk nivåer av proteinet aktiveres sikkert være svært variabel i enkeltceller. Fordi alle disse hensynene på variasjon er det avgjørende å sammenligne innlemmelse nivåer av cytosolically aktivert proteiner andre steder i cellen i forhold til den totale fluorescensen oppnådd ved aktivering i bestemte regioner.

Vi har beskrevet hvordan microinjection kan brukes som et verktøy for å undersøke effekten av proteiner på celle morfologi og har eksemplifisert dette ved å demonstrere potente induksjon av lamellipodial strukturer i NIH3T3 fibroblast celler microinjected med den små GTPase Rac1. Vi har tidligere brukt denne teknikken for å forstyrre Arp2/3-funksjonen i celler microinjected med C-terminalen WCA domenet Scar/bølge3. Ulike parametere i microinjected celler kan analyseres av andre analyser, for eksempel FRAP eller photoactivation. Vi har beskrevet hvordan FRAP og photoactivation kan benyttes for å undersøke subcellular dynamikk og mobilitet av utgangen monomerer. FRAP har blitt brukt av vår gruppe tidligere5 å undersøke omsetningen av proteiner lokalisere til lamellipodia, som VASP, Abi, cortactin, cofilin, og capping protein eller Klargjørende omsetningen av komponenter i fokal adhesjon i nærvær og fravær av Rac signalering4. Videre måle begrepsordbok polymerisasjon priser kan oppnås ved photobleaching EGFP-merket β-utgangen5, men alternative metoder finnes. Sporing fluorescerende inhomogeneities sett av levende celle imaging-kompatible sonder merking mobilnettet begrepsordbok filamenter, som Lifeact25, kan også være ansatt6,26. Fordelen er at overuttrykte β-utgangen kan unngås, som kan øke celle kanten protrusion og migrasjon, og dermed potensielt forstyrrer den bestemte analysen eller eksperimentelle spørsmål (se f.eks webpakke et al. 26; Peckham et al. 27). men en distinkt ulempe av Lifeact sonden utgjør rapid/på kinetics av binding til utgangen filamenter, slik at bleking begrepsordbok filament strukturer merket av Lifeact i cellene gir informasjon på sonde omsetningen, men ikke omsetningen av utgangen filamenter, som binder det25. Sporing av fluorescens inhomogeneities ansatt tidligere6,26 gir en praktisk kompromiss, mye lik brukte sporing av fluorescens flekker innlemmet i trådformede cellen cytoskjelett strukturer (se f.eks laks og Waterman28), men kanskje ikke så rett frem til bruk og så presis som FRAP EGFP-merket F-utgangen strukturer. Photoactivation har blitt brukt av oss til å estimere antallet monomerisk utgangen inkorporering utstående lamellipodia, i tillegg til sin mobilitet gjennom stoffer i sammenheng med eksperimentelt innstilt cytosolic F-utgangen nivåene6. Teknikken er nyttig når undersøke mobilitet og distribusjon av proteiner avledet fra relativt store områder, for eksempel cytosolic regioner. Imidlertid avledet undersøke fordelingen av proteiner fra relativt liten photoactivated strukturer; f.eks veksten kjeglene kan være utfordrende på grunn av lavt antall fluorescerende molekyler aktivert, svake signaler, og dermed mangel på sensitivitet. Mulige alternativ teknikker for å photoactivation eller photoconversion av fluorescens (se ovenfor) kan inneholde inverse FRAP, som bygger på photobleaching hele cellen unntatt Avkastningen, etterfulgt av sporing mobilitet fluorescerende molekyler unna Denne regionen. Teknikken krever ikke overexpressing photoactivatable versjoner av proteiner, men alltid innebærer eksponering for en uvanlig høy dose av laser makt, potensielt forårsake uønskede bivirkninger som photodamage.

Tydelig, photoactivation og FRAP kan ikke skille om proteiner er bevegelige monomerer, dimers eller selv små oligomers, og om de flytter sammen med ekstra binding partnere. Informasjon av denne typen kan fås i stedet fra fluorescens korrelasjon spektroskopi teknikker29 eller alternativt FLIM-bånd30. Likevel utgjør FRAP og photoactivation enkle metoder for å vurdere direkte lokale og globale protein dynamikk i celler, uavhengig av protein av interesse, subcellular plassering eller celle type studerte.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi er takknemlige til tysk Research Foundation (DFG) for økonomisk støtte (grant Nr. RO2414/5-1 til KR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B16-F1 mouse skin melanoma cells  American Type Culture Collection, Manassas, VA CRL-6323
NIH-3T3 cells American Type Culture Collection, Manassas, VA CRL-1658
DMEM 4.5g/L glucose  Life Technologies, Thermno Fisher Scientific, Germany 41965-039
Ham’s F-12 medium Sigma-Aldrich N8641
Fetal calf serum  (FCS) PAA Laboratories, Linz, Austria A15-102
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich, Germany F7524 Lot054M3396
MEM Non essential amino acids  Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany 11140035
L-Glumatine 200mM (100x) Life Technolgies 25030-024
Pen-Strep 5000 U/mL Life technologies 15070063
Sodium Pyruvate (100 mM) Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany 11360-039
Laminin Sigma-Aldrich L-2020
Laminin coating buffer  Self-made: 50mM Tris ph7.4, 150mM NaCl
Fibronectin from human plasma  Roche Diagnostics, Mannheim, Germany 11 051 407 001
Jetpei Polyplus Transfection, Illkirch, France 101-10N
JetPei buffer Polyplus Transfection, Illkirch, France 702-50 150mM NaCl
PA-GFP-actin plasmid DNA  described in Koestler et al.2008
pEGFP-actin plasmid DNA Clontech, Mountain View, CA, USA
Rac1 protein for microinjection Purified as GST-tagged version, and cleaved from GST prior to injection
Microinjection buffer Self-made: 100mM NaCl, 50mM Tris-HCl ph7.5, 5mM MgCl2, 1mM DTT
Dextran, Texas Red, 70,000 MW, Lysine Fixable Molecular Probes, Thermno Fisher Scientific, Germany D1864
Microscope circular cover glasses 15mm, No.1  Karl Hecht, Aisstent, Sondheim, Germany 1001/15
Eppendorf Femtotips Microloader Tips Eppendorf, Hamburg, Germany 5242 956 003
Eppendorf Femtotip Microinjection Capillary Tips Eppendorf, Hamburg, Germany 930000035
Silicone Grease  ACC Silicones, Bridgewater, England SGM494
Aluminium Open Diamond Bath Imaging Chamber Warner instruments RC-26
Automatic temperature controller Warner Instruments TC-324B
Microscope: Axio Observer  Carl Zeiss, Jena, Germany
CoolSnap-HQ2 camera  Photometrics, Tucson, AZ
Lambda DG4 light source  Sutter Instrucment, Novato, CA
Laser source  Visitron Systems
Eppendorf FemtoJet microinjector  Eppendorf, Hamburg, Germany With built-in compressor for pressure supply
Nikon Narishige Micromanipulator system Nikon Instruments, Japan
Visiview software v2.1.4 Visitron Systems, Puchheim, Germany
Metamorph software v7.8.10 Molecular Devices, Sunnyvale, CA
Sigma Plot v.12 Systat Software Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).
  2. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
  3. Koestler, S. A., et al. Arp2/3 complex is essential for actin network treadmilling as well as for targeting of capping protein and cofilin. Mol Biol Cell. 24 (18), 2861-2875 (2013).
  4. Steffen, A., et al. Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation. J Cell Sci. 126, Pt 20 4572-4588 (2013).
  5. Lai, F. P., et al. Arp2/3 complex interactions and actin network turnover in lamellipodia. EMBO J. 27 (7), 982-992 (2008).
  6. Dimchev, G., et al. Efficiency of lamellipodia protrusion is determined by the extent of cytosolic actin assembly. Mol Biol Cell. 28 (10), 1311-1325 (2017).
  7. Koppel, D. E., Axelrod, D., Schlessinger, J., Elson, E. L., Webb, W. W. Dynamics of fluorescence marker concentration as a probe of mobility. Biophys J. 16 (11), 1315-1329 (1976).
  8. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
  9. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
  10. Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).
  11. Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging. Trends Cell Biol. 19 (11), 555-565 (2009).
  12. Kremers, G. J., Piston, D. Photoconversion of purified fluorescent proteins and dual-probe optical highlighting in live cells. J Vis Exp. (40), (2010).
  13. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Preparation of slides and coverslips for microscopy. CSH Protoc. 2008, 4988 (2008).
  14. Small, J. V., Rottner, K. Actin-based Motility. Carlier, M. F. , Springer. Dordrecht. (2010).
  15. Kaverina, I., et al. Enforced polarisation and locomotion of fibroblasts lacking microtubules. Curr Biol. 10 (12), 739-742 (2000).
  16. Small, J., Rottner, K., Hahne, P., Anderson, K. I. Visualising the actin cytoskeleton. Microsc Res Tech. 47 (1), 3-17 (1999).
  17. Mikhailov, A. V., Gundersen, G. G. Centripetal transport of microtubules in motile cells. Cell Motil Cytoskeleton. 32 (3), 173-186 (1995).
  18. Rottner, K., Behrendt, B., Small, J. V., Wehland, J. VASP dynamics during lamellipodia protrusion. Nat Cell Biol. 1 (5), 321-322 (1999).
  19. Svitkina, T. M., et al. Mechanism of filopodia initiation by reorganization of a dendritic network. J Cell Biol. 160 (3), 409-421 (2003).
  20. Small, J. V., Isenberg, G., Celis, J. E. Polarity of actin at the leading edge of cultured cells. Nature. 272 (5654), 638-639 (1978).
  21. Dang, I., et al. Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration. Nature. 503 (7475), 281-284 (2013).
  22. Anderson, K. I., Cross, R. Contact dynamics during keratocyte motility. Curr Biol. 10 (5), 253-260 (2000).
  23. Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nat Cell Biol. 13 (4), 371-381 (2011).
  24. Humphries, A. C., et al. Clathrin potentiates vaccinia-induced actin polymerization to facilitate viral spread. Cell Host Microbe. 12 (3), 346-359 (2012).
  25. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  26. Kage, F., et al. FMNL formins boost lamellipodial force generation. Nat Commun. 8, 14832 (2017).
  27. Peckham, M., Miller, G., Wells, C., Zicha, D., Dunn, G. A. Specific changes to the mechanism of cell locomotion induced by overexpression of beta-actin. J Cell Sci. 114, Pt 7 1367-1377 (2001).
  28. Salmon, E. D., Waterman, C. M. How we discovered fluorescent speckle microscopy. Mol Biol Cell. 22 (21), 3940-3942 (2011).
  29. Machan, R., Wohland, T. Recent applications of fluorescence correlation spectroscopy in live systems. FEBS Lett. 588 (19), 3571-3584 (2014).
  30. Becker, W. Fluorescence lifetime imaging--techniques and applications. J Microsc. 247 (2), 119-136 (2012).

Tags

Biologi problemet 135 Microinjection FRAP photoactivation PA-GFP begrepsordbok lamellipodium cytoskjelett overføring
Micromanipulation teknikker slik at analyse av Morfogenetiske Dynamics og omsetning av cellen cytoskjelett regulatorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dimchev, G., Rottner, K.… More

Dimchev, G., Rottner, K. Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators. J. Vis. Exp. (135), e57643, doi:10.3791/57643 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter