Summary
כאן נתאר פרוטוקול לחקור את prenylation ואת guanosine-5'-טריפוספט (GTP)-טעינה של GTPase רו. פרוטוקול זה מורכב משתי שיטות מפורט, כלומר assay ממברנה fractionation ו- immunosorbent של GTPase-מקושרים. הפרוטוקול יכול לשמש כדי למדוד את prenylation ואת GTP העמסת שונים GTPases קטנים אחרים.
Abstract
משפחת רו GTPase שייך superfamily ראס וכוללת כ-20 חברים בבני אדם. Rho GTPases חשובים בוויסות תאיים מגוונים, כולל cytoskeletal dynamics, תנועתיות תא, התא קוטביות, הדרכה עצב, סחר vesicular בקרה מחזור התא. שינויים ב- Rho GTPase איתות תפקיד חיוני הרגולציה של מצבים פתולוגיים רבים, כגון סרטן, מחלות מערכת העצבים המרכזית, מחלות מערכת החיסון תלוית. שינוי posttranslational של GTPases רו (קרי, prenylation על ידי intermediates מסלול mevalonate) ואיגוד GTP הם גורמי מפתח אשר משפיעים ההפעלה של חלבון זה. בנייר זה, שתי שיטות פשוטות וחיוני ניתנים לגילוי של prenylation מגוון רחב של רו GTPase ופעילויות איגוד GTP. הפרטים של ההליכים טכני כי שימשו מוסברים צעד אחר צעד בכתב היד.
Introduction
רו GTPases הם קבוצה של חלבונים קטנים (21-25 kDa), אשר ההכפלה שמורים היטב במהלך האבולוציה, בצורה של תת ייחודי superfamily Ras של GTPases קטן. כל תת משפחה בתוך superfamily הזה, יש גרעין משותף G תחום מעורב של GTPase פעילות נוקלאוטיד exchange1. ההבדל בין המשפחה רו את subfamilies ראס אחרים הוא הנוכחות של "תחום הוספה רו" בתוך סטרנד βth 5, סליל αth 4 את תחום GTPase קטן2.
בהתבסס על הסיווג האחרונות, רו GTPases נחשבים משפחה של איתות חלבונים שמתאימים לתוך superfamily GTPase בראס3. GTPases Rho יונקים יש 22 חברים המבוסס על התפקוד המסוים שלהם אפיון כללי4 שבה RhoA, Rac1 ו- Cdc42 הם בין בני למד ביותר בקבוצה זו. Rho GTPases מקושרות אל תאיים איתות המסלולים באמצעות מנגנון מוסדר באופן הדוק אשר תלויה מתגים מולקולריים באמצעות חלבון שינויים posttranslational5.
GTP טעינה, הידרוליזה מנגנונים חיוניים במחזור הפעלה/ביטול הפעלה של GTPases רו קטן והם מוסדרים באמצעות הפעלת GTPase חלבונים (רווחים). פערים אחראים הידרוליזה GTP, לעבוד ביחד עם גואנין נוקלאוטיד exchange גורמים (GEFs) אשר אחראים על התגובה GTP-טעינה. התמ ג רו דיסוציאציה מעכבי (GDIs) לספק עוד יותר רגולציה של רו GTPases קטנים באמצעות איגוד GTPases רו התמ ג מכורך. זה מעכב את התמ ג דיסוציאציה ואסטמה ומקילה על sequestering של GTPases רו קטן מן האתרים פעיל ממברנה תאיים. יש גם עוד יותר רגולציה של חלבונים רו GTPase המערבים את prenylation של GDIs המסדירה נוקלאוטיד הידרוליזה של exchange והן פקדי התמ ג/GTP רכיבה על אופניים1,6,7,8.
GTP-טעינה והן GTPase רו prenylation מעורבים בתנועה של GTPase רו בין ציטוזול קרום התא על-ידי שינוי המאפיינים lipophilic של אלה חלבונים1,9. הרגולטורים הנ ל אינטראקציה עם פוספוליפידים של קרום התא וחלבונים modulating אחרים מתוך התמ ג/GTP המרת פעילות10. יתר על כן, GDIs, מעכבי דיסוציאציה, לחסום את הידרוליזה GTP והן ההחלפה התמ ג/GTP. GDIs לעכב את הדיסוציאציה של החלבונים רו לא פעילים מן התמ ג ו, לכן, האינטראקציה שלהם עם effectors במורד הזרם. GDIs גם לווסת את המחזוריות של GTPases בין ציטוזול קרום התא. הפעילות של רו GTPases תלויה במידה רבה את תנועתם אל קרום התא; לפיכך, GDIs נחשבים הרגולטורים קריטי זה יכול sequester GTPases בציטופלסמה דרך מסתיר את אזור הידרופובי/תחומים11,12.
עבור GTPase רו יש אופטימלי איתות ותפקוד בשלבים השונים של מחזור ההפעלה שלה, מחזור דינמי של הידרוליזה GTP-טעינה/GTP היא קריטית. כל סוג של שינויים בתהליך זה עלול לגרום השינויים הבאים בפונקציות תא מווסתות על-ידי רו GTPase, כגון תא קוטביות, התפשטות, מורפוגנזה, ציטוקינזה, הגירה, אדהזיה והישרדות13,14.
בפרוטוקול הנוכחי מספק לקוראים שיטה מפורטת כדי לפקח קטן RhoA GTPase הפעלה דרך החקירה של prenylation שלהם, התמ ג/GTP טעינה. שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לזהות את GTP ואיגוד של מגוון רחב של GTPases קטן, prenylation. וזמינותו GTPase-מקושרים immunosorbent יכול לשמש כדי למדוד את רמת ההפעלה של סוגים אחרים של GTPases, כגון Rac1, Rac2, Rac3, H-, קיי- או N-ראס, הב ו רו15. סימבסטטין סוכן תרופתי משמש כדוגמה, כפי שדווח לאחרונה להיות מעורב ברגולציה של קטן GTPase רו prenylation ופעילות8,9,14,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. קביעת לוקליזציה RhoA באמצעות ממברנה/ציטוזול Fractionation
-
טיפול תרבות, סימבסטטין תא
- זרע 50,000 U251 בתאים 100 מ מ צלחת, תרבות אותם של Dulbecco ששינה בינוני הנשר (DMEM) (גלוקוז גבוהה, 10% סרום שור בעובר [FBS]).
- כאשר 30% confluent, מתייחסים לתאים על-ידי הסרת המדיום והוספת בינוני המכיל סימבסטטין אליו (10 מיקרומטר סימבסטטין מומס דימתיל סולפוקסיד [דימתיל סולפוקסיד]), תקופת דגירה של h 36-37 מעלות צלזיוס8. השתמש דימתיל סולפוקסיד לבד כפקד הרכב.
הערה: 10 מיליון תאים יש צורך את fractionation ציטוזול ואת הממברנה של התאים.
-
אוסף של תאים
- להסיר התאים החממה 37 º C. תראה התאים במיקרוסקופ כדי לאשר את confluency.
הערה: התאים צריכים להיות confluent 70% - 80%. - האחות של המדיום, לשטוף את התאים 1 x עם קרות באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS). הוסף 5 מ של ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) מאגר (אשלגן כלורי: 400 מ ג/ליטר, NaCl: 6800 מ ג/ליטר, NaHCO3: 2200 מ ג/ליטר,2PO NaH4. H2o: 140 מ"ג/ליטר, D-גלוקוז: 1,000 מ ג, ניתרן EDTA: 373 מ ג/ליטר) לכל צלחת והמקום התאים חזרה לתוך החממה 37 º C למשך 5 דקות.
- אחרי 5 דקות של דגירה, לאסוף את EDTA עם תאי בשפופרת 15 מ"ל המכיל את אותה כמות של בינוני כמו EDTA.
הערה: יש בינוני בצינור מנטרלת את EDTA ומונעת כל עיכול נוספות של קרום התא. - הכנס את הצינור מקרר והמשך לצנטריפוגה.
- להגדיר לצנטריפוגה ל x 1,500 גרם ב 4 ° C, לסובב את התאים עבור 5 דקות.
- להסיר את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר ולהוסיף 1 מ"ל של PBS קר. מערבבים היטב את התאים.
- להעביר את התערובת תא (פתרון) צינור 1.5 mL החדש, צנטריפוגה-x 1,500 g ב- 4 ° C, ולסובב את התאים עבור 5 דקות.
- בדוק את גודל גלולה (עבור הערכת היקף המאגר לשלב הבא). מניחים את הדוגמאות על קרח. למחוק את תגובת שיקוע לחלוטין מבלי להפריע בגדר.
- הוסף את המאגר הקר שאני (10 מ מ טריס-HCl [pH 7.5] 0.1 מ מ EDTA, 0.1 מ מ EGTA, 1 מ dithiothreitol, מעכב פרוטאז קוקטייל), לערבב את הדגימות היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה, לאחר מכן, המשך sonication.
- להסיר התאים החממה 37 º C. תראה התאים במיקרוסקופ כדי לאשר את confluency.
-
Sonication
- להגדיר את sonicator עבור 5 מחזורים, 5 s כל, ו- x 3. אני חוזר.
- לבצע את sonication על קרח. להמשיך ultracentrifuge.
הערה: קרח, במצב קר לשמר את החלבונים ולהפוך את התוצאות אמין יותר.
-
Ultracentrifugation
- השתמש ultracentrifuge כדי להפריד את homogenates תא לתוך cytoplasmic ושברים ממברנה. הגדר לצנטריפוגה x 100,000 g עבור 35 דקות ב 4 º C. כפי שמוצג באיור1, לבדוק את גודל גלולה.
הערה: השבר ממברנה היא בתחתית הצינורית ו. רכיבים cytoplasmic אחרים. - לאסוף את תגובת שיקוע לחלוטין תוך נזהר שלא להפריע בגדר. תגובת שיקוע הוא השבר cytosolic. מקם את תגובת שיקוע בשפופרת שכותרתו החדש.
- להוסיף 300 µL מאגר דיסוציאציה (מאגר II) (50 מ מ טריס-HCl [pH 7.5] 0.15 מ' NaCl, dithiothreitol 1 מ מ, 1% מרחביות, 1 מ"מ EDTA, 1 מ"מ EGTA, מעכבי פרוטאז קוקטייל) כדי בגדר (מכיל את השבר קרום). מערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה.
- המשך קביעת חלבון, הכנת הדוגמא תספיג חלבון (ניתוח immunoblot).
- השתמש ultracentrifuge כדי להפריד את homogenates תא לתוך cytoplasmic ושברים ממברנה. הגדר לצנטריפוגה x 100,000 g עבור 35 דקות ב 4 º C. כפי שמוצג באיור1, לבדוק את גודל גלולה.
-
Immunoblotting
- להכין החלבון תא תמציות מן השברים מופרדים במאגר פירוק (20 מ"מ טריס-HCl [pH 7.5], 0.5 מ מ PMSF, 0.5% ללא יונית דטרגנט-40, 100 מיקרומטר β-גליצרול 3-פוספט, ו- 0.5% פרוטאז מעכב קוקטייל).
- למדוד את ריכוז חלבון באמצעות שיטת לאורי8 ולחשב את עוצמת הקול של המאגר פירוק (20 מ מ טריס-HCl [pH 7.5], 0.5 מ מ PMSF, דטרגנט nondenaturing 0.5%, octylphenoxypolyethoxyethanol, 100 מיקרומטר β-גליצרול 3-פוספט ו- 0.5% קוקטייל מעכב פרוטאז) לנרמל את הריכוז של חלבון בין הדגימות.
- מחממים את הדגימות ב 90 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות וטען µL 15-20 של הדגימות על ג'ל מרחביות-דף 15% כדי להפריד את החלבונים.
הערה: לטעון µg 1 של חלבון עבור כל דגימה. לחשב את עוצמת הקול צריך לפעול בהתאם. - להעביר את החלבונים מופרדים ניילון ממברנות תחת צמצום תנאים (500 ננומטר גליצין, 50 מ מ טריס-HCl ו 20% מתנול) h 2, בטמפרטורת החדר (RT) ב- 100 וולט.
הערה: כדי לאשר את העברת חלבון מוצלחת, השתמש כתם צבע מאכל פונסו או לדמיין את סמן חלבון על הקרום. - לחסום את הקרומים עם 5% שומן חלב יבשים, 1 x באגירה טריס תמיסת מלח המכיל חומרי ניקוי (דטרגנט nonionic TBS/0.01%; TBST) כדי לחסום את איגוד נוגדן ספציפי ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה או ב- RT לשעה.
- להוסיף נוגדנים העיקרי לניתוח immunoblotting, דגירה בין לילה ב 4 º C.
הערה: בניסוי זה, Rac1/2/3 ', ' cdc42 ', ' RhoA ', GAPDH, פן-קדהרין שהשתמשו 1:1,000 לדילול חלב 1% 1 x TBST. פאן-קדהרין GAPDH שימשו כדי לאשר ממברנה וטוהר שבר cytosolic, בהתאמה. - לשטוף את הקרומים 3 x עם מאגר כביסה עם 1 x TBST למשך 20 דקות.
- דגירה בקרום עם הארנב נגד חזרת peroxidase (HRP)-מצומדת נוגדנים משניים עבור הנוגדנים העיקרי בהתאמה (עבור 1h-RT).
- לשטוף את שהכלים x 3 עבור 20 דקות ולפתח אותם עם זיהוי משופרת chemiluminescence (ECL).
2. מדידה של המטען GTP RhoA שימוש Assay הפעלה G-חלבון קטן
- ספירת 10,000 תאים למ"ל ותרבות התאים U251 100 מ מ מגישים.
- כאשר הם 30% confluent, פנקו את התאים עם סימבסטטין כפי שמתואר בשלב 1.1.2.
- להביא את הצלחות תרבות מתוך החממה. תראה התאים במיקרוסקופ כדי לאשר confluency. ודא כי התאים נמצאים confluent 70% - 80%. מניחים על צלחת פטרי על הקרח וארוקן את המדיה, לשטוף את התאים 3 x עם PBS קר כקרח (pH 7.2).
- מחוק לגמרי מגניב. להטות את צלחת פטרי על הקרח דקה נוספת להסיר את כל שרידי PBS.
הערה: PBS שיורית משפיע לרעה זה וזמינותו. - Lyse תאי נפח 700 µL של פירוק כקרח מאגר המכיל מעכבי פרוטאז, פוספטאז.
הערה: 700 µL היא בדרך כלל מספיק עבור 100 מ מ פטרי. ראה טבלה 1 כדי למצוא את הנפח הנכון עבור כל כלי תרבות. - לקצור את התא lysate עם מגרד התא. שיפוע לצלחת תרבות עבור טכניקה זו.
- להעביר את lysate cryotube קר כקרח שכותרתו ולשמור אותו בקרח.
- מערבבים ביסודיות באמצעות מערבולת. שמור µL 10 של lysate עבור וזמינותו חלבון, כדי למדוד את ריכוז חלבון במדגם.
- Snap-הקפאת התא הנותרים lysate של חנקן נוזלי.
הערה: להכין aliquots מרובים של תא lysate לפני snap-הקפיאה אותם, כדי להימנע מחזורים ההקפאה/ההפשרה חוזרות ונשנות אשר יכול להוביל לאובדן הפעילות של RhoA GTPase. - להעביר את cryotubes מוקפאים snap מקפיא-80 ° C ולאחסן את הדגימות עבור וזמינותו GTPase-מקושרים immunosorbent.
הערה: אל תאחסן את הדגימות לתקופה העולה על 14 ימים. עובדת במהירות ואני לעולם לא אעזוב את הדוגמאות על הקרח יותר מ 10 דקות. אף פעם לא להתמודד עם צלחות פטרי כל בו זמנית. - למדוד את ריכוז חלבון באמצעות שיטת לאורי8 ולחשב את עוצמת הקול של המאגר פירוק לנרמל את הריכוז של חלבון בין הדגימות.
הערה: הריכוז הכי טוב בדרך כלל 1 מ"ג/מ"ל; עם זאת, 0.3 - 2 מ"ג/מ"ל ניתן לזיהוי. - להכין את הפקד ריק על-ידי הוספת µL 60 פירוק מאגר µL 60 מחייב מאגר microtube.
הערה: הפקד ריק יש נוגדנים לכל פרט אנטיגן והוא משמש עבור החיסור של הרקע. - להכין פקד חיובי על-ידי הוספת µL 12 של חלבון שליטה רו µL 48 פירוק המאגר, µL 60 מחייב המאגר.
הערה: הפקד חיובי יש נוגדנים לכל בתוספת אנטיגן מאושרות עבור Rho-A-GTP. - לוקח את הצלחת זיקה רו מהתיק שלה ומניחים אותו על קרח.
- להמיס את האבקה בתוך הבארות עם 100 µL של קרח מים מזוקקים. לקחת את הצלחת על קרח.
- להפשיר את lysates תא מוקפאים snap באמבט מים מוגדר 25 º C.
- להוסיף נפח מחושב של מאגר פירוק כקרח (מתוך שלב 2.11) כל מדגם לנרמל את הריכוז של חלבון.
הערה: הסר את PBS לאחר שטיפת התאים (באמצעות של העצמות שפופרת ריק) כדי למנוע גרימת שינויים בהרכב של המאגר פירוק. להשוות החלבון הדגימה כדי ריכוז בין 0.8 ל- 2 מ"ג/מ"ל על השוואה בין דוגמאות של מבחני הפעלת GTPase. בטבלה 2 מספק פרטים אודות מאגר שישמש עבור זה וזמינותו. - להעביר 60 µL של הדגימות כקרח מנורמל microtubes ולהוסיף 60 µL של איגוד המאגר; לערבב את הדגימות ביסודיות ולשמור אותם על קרח.
- לחלוטין להסיר את המים/הפתרונות microplate על ידי מצליף נמרצת, ואחריו חמש עד שבע הברזים קשה על מזרון מעבדה.
- להוסיף 50 µL של הדגימות מנורמל, פקד ריק פקד חיובי הבארות שבו כפילויות.
- מניחים את הצלחת על תפקודי לב / נשימה למשך 30 דקות ב 4 ° C-300 סל ד.
הערה: הצעד חזק חשוב מאוד, מומלץ להשתמש ניעור צלחת מסלולית-300 סל ד. - נקה דגימות מן הלוח על ידי מצליף ולשטוף אותם 2 x עם 200 µL לרחוץ את מאגר ב RT. נמרצות להסיר המאגר הכביסה מן הבארות לשטוף אחרי זה על ידי מצליף, ולאחריו הקשה, ולשמור את הצלחת על הספסל-RT.
- להוסיף 200 µL RT אנטיגן מאגר מכל קידוח, דגירה-RT למשך 2 דקות.
- קפיצי את הפתרון מן הבארות. ולשטוף את בארות 3 x עם 200 µL לרחוץ את מאגר-RT.
- להוסיף 50 µL של טריות 1/250 נוגדן anti-RhoA העיקרי מכל קידוח.
- למקם את הצלחת תפקודי לב / נשימה למשך 45 דקות ב 300 סל ד מוגדר 25 º C. קפיצי את הפתרון מן הבאר.
- חזור על השלבים כביסה 2 x (שלב 2.24).
- להוסיף 50 µL של טריות 1/250 נוגדן anti-RhoA משנית בכל טוב.
- למקם את הצלחת על גבי תפקודי לב / נשימה למשך 45 דקות ב 300 סל ד מוגדר 25 º C.
- להכין את ריאגנט לזיהוי HRP על ידי ערבוב נפחים שווים של ריאגנט A וריאגנט B.
- קפיצי את הפתרון מכל קידוח ולשטוף הבארות 3 x עם 200 µL לרחוץ את מאגר-RT.
- להוסיף 50 µL של ריאגנט לזיהוי HRP טריות כל טוב.
- לקרוא את האות זורח בתוך 3-5 דקות כדי לקבל את האות המרבי ולנתח את התוצאות באמצעות חבילת תוכנה מתאימה.
הערה: קריאות חייב להילקח תוך 3-5 דקות כדי לקבל את האות המרבי. הפעלת "צלחת מבחן" כדי לאשר את פירוק תקין נפח המאגר משמש את lysates תא כך ריכוז חלבון גבוה מספיק כדי לזהות פעילות RhoA GTPase. (צלחת הבדיקה היא צלחת של תאים המשמשות לקביעת ריכוז חלבון נופל בתוך הטווח המקובל וכן כדי לקבוע אם היקף המאגר פירוק בשימוש מתאים). הפקד חיובי יש לקרוא 4 - ל 10 פי גבוה יותר הבארות ריק אם זה בטווח ליניארי. אם לא, ואז להתאים את luminometer על ידי ייעוץ היצרן. ההגדרות עבור luminometer מקבלים בטבלה3. - הזן נתונים גולמיים עמודות שבו הכותרות לקרוא לדוגמה, זאת אומרת, סטיית תקן, rep1, rep2, rep3, ו rep4, אשר נועד להציג את המספר של משכפל נעשה על כל דגימה.
- תחת זאת אומרת, הזן את הנוסחה =average(Xn:Yn) שבו X = את מציין העמודה עבור rep1, Y = את מציין העמודה עבור rep4ו- n = מציין את השורה של השורה להיות עבד.
- תחת סטיית תקן, הזן את הנוסחה = stdev (Xn:Yn) שבו X = את מציין העמודה עבור rep1, Y = את מציין העמודה עבור rep4ו- n = מציין את השורה של השורה להיות עבד.
- הזן את הנתונים שכפל לתוך rep1, rep2, וכו '
- לאחר הזנת הנתונים, השתמש בשיטה לחץ וה גרור כדי לבחור את הדגימה, כלומר, על סטיית תקן.
- לאחר מכן, תוכנה לניתוח נתונים, בחר בפונקציה עבור תרשים גורם אשר נראה ריבוע עם תרשים עמודות מיני בפנים.
הערה: פעולה זו מעלה את התרשים ביצוע תהליך שבו זה אפשרי עיצוב תרשימים בהתבסס על נתונים שהוזנו. - לבחור תרשים טורים , עבור ערכי הקלט, לייעד את המספרים מתכוון .
הערה: התרשים עבור מספרי מתכוון נוצרת לראשונה, לאחר מכן, המיועד העמודה סטיית התקן עבור קווי השגיאה ציר ה-y. כדי לעשות זאת, לחץ פעמיים על הסורגים גרף, בחר בכרטיסיה ציר ה-y שגיאה , לחץ על האפשרות מותאם אישית ולאחר בחר את האזור בגליון העבודה כדי להזין את המיקום של נתוני סטיית תקן . ניתן לראות את ההבדל בין הקבוצות צריכים להיות מושווה לאחר היצירה של התרשימים הרצוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
קרום Fractionation:
Ultracentrifugation שימש את fractionation של הממברנה ורכיבים ציטוזול. כפי שמוצג באיור1, תגובת שיקוע מכיל את השבר cytosolic ומכיל בגדר השבר ממברנה. השפע של RhoA cytosolic andmembrane שברים מתקבל מתאי U251 נבדקה לאחר הטיפול עם סימבסטטין באמצעות immunoblotting. הטוהר וטעינה שליטה של השבר ממברנה, ציטוזול שאושרו על-ידי פאן-קדהרין ו- GAPDH בהתאמה. כפי שמוצג באיור2, הטיפול סימבסטטין הפחית את כמות מאוגד-ממברנה RhoA GTPase, בזמן זה הגדיל את התוכן cytosolic שלה. . זה עקבי עם השפעת סטטינים ידוע על רוברטסונית של GTPases מבוסס על עיכוב של RhoA prenylation. סימבסטטין מעכב את prenylation של RhoA GTPase, לכן, unprenylated RhoA אין אפשרות עוגן בתוך קרומי התאים פלזמה, אשר תוצאות בריכוזים גבוהים יותר cytosolic שלה.
RhoA-GTP מאוגדים:
אנו למדוד חלבון GTP מכורך RhoA שימוש assay immunosorbent מקושר GTPase והראה כי סימבסטטין באופן משמעותי (P < 0.05) גדל RhoA מאוגד-GTP בתאים U251 (איור 3). לכן, בעוד סימבסטטין עכבות RhoA GTPase חלבון prenylation (איור 2), זה גם הגדילה שלה GTP טעינת לעומת תאי בקרה. זה מצביע על העובדה כי prenylation ו GTP מחייב את שניכם לשחק תפקיד פעילות, רגולציה של RhoA GTPase. לקבלת פרטים נוספים לגבי תופעה זו, נא עיין הפרסום המקורי באמצעות פרוטוקול זה8.
איור 1 : הצג סכימתי של שברים cytosolic ואת קרום לאחר ultracentrifugation. בגדר מכיל את השבר ממברנה ומכיל תגובת שיקוע השבר cytosolic.
איור 2 : סימבסטטין משתנה הלוקליזציה של RhoA. U251 תאים שטופלו סימבסטטין (10 מיקרומטר; 12, 24 ו- 36 h), השפע של RhoA ממברנה, שברים cytosolic נקבע ע י immunoblotting. שפע GAPDH, פן-קדהרין הוערכה גם לשלוט לטעינה בחלקים cytosolic ואת קרום וכדי לאשר היעדרה של זיהום cytosolic בחלקים הממברנה. הנתונים הם בדרך כלל 3 ניסויים עצמאית באמצעות ראשי תרבויות שונות. דמות זו שונתה מ. אליזאדה et al. 8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : סימבסטטין ממיקרו פעילות RhoA GTPase. Immunosorbent מקושר GTPase וזמינותו שימש כדי למדוד חלבון רו מאוגד-GTP בתאים U251. תנאים שונים נבדקו עבור h 36, כולל הרעבה, סימבסטטין (10 מיקרומטר). עבור ניסוי, חלבון RhoA צורונים פעילים המסופק בערכה שימש פקד חיובי. התוצאות מבוטא זאת אומרת ± SD של משכפל שני בניסויים עצמאית (* P < 0.001). דמות זו שונתה מ. אליזאדה et al. 8.
| כלי התרבות התא | פני השטח (2ס מ) | מאגר פירוק (µl) | |
| מנות | 35 מ מ | 9 | 100 |
| 60 מ מ | 21 | 300 | |
| 100 מ מ | 55 | 700 | |
| 150 מ מ | 145 | 1500 | |
| צלחות | 6-ובכן | 9.4 / טוב | 100 |
| 12-ובכן | 3.8 / טוב | 70 | |
| 24-ובכן | 1.9 / טוב | 40 | |
| מבחנות | T-25 | 25 | 250 |
| T-75 | 75 | 1000 | |
| T-150 | 150 | 1500 | |
טבלה 1: מומלצת כרכים של מאגר פירוק תאים U251. אמצעי האחסון נמצא מתכווננת עבור סוגי תאים שונים.
| שם מאגר פירוק | פירוק מאגר הרכב | היעד G-חלבון קטן | הערות |
| GL35 | טריס (1 X GL36), MgCl2 (8 X GL36), NaCl (2 X GL36), IGEPAL (1 X GL36), מרחביות (5 X GL36) | Cdc42 | רכיבים זהים GL36, הרכב משתנה כדלקמן; |
| GL36 | ניסוח קניינית של טריס pH 7.5, MgCl2 NaCl, IGEPAL, למען חברה דמוקרטית | RalA | מאגר סטנדרטי, תואם עם מבחני immunosorbent ביותר GTPase-מקושרים. |
| GL36 | ניסוח קניינית של טריס pH 7.5, MgCl2 NaCl, IGEPAL, למען חברה דמוקרטית | Rac1 | מאגר סטנדרטי, תואם עם מבחני immunosorbent ביותר GTPase-מקושרים. |
| GL36 | ניסוח קניינית של טריס pH 7.5, MgCl2 NaCl, IGEPAL, למען חברה דמוקרטית | Rac1, 2, 3 | מאגר סטנדרטי, תואם עם מבחני immunosorbent ביותר GTPase-מקושרים. |
| GL36 | ניסוח קניינית של טריס pH 7.5, MgCl2 NaCl, IGEPAL, למען חברה דמוקרטית | ראס | מאגר סטנדרטי, תואם עם מבחני immunosorbent ביותר GTPase-מקושרים. |
| GL36 | ניסוח קניינית של טריס pH 7.5, MgCl2 NaCl, IGEPAL, למען חברה דמוקרטית | RhoA | מאגר סטנדרטי, תואם עם מבחני immunosorbent ביותר GTPase-מקושרים. |
| GL36 | ניסוח קניינית של טריס pH 7.5, MgCl2 | Arf1 | מאגר סטנדרטי, תואם עם מבחני immunosorbent ביותר GTPase-מקושרים. |
בטבלה 2: Assay פירוק מאגרי immunosorbent מקושרים-רשימה של GTPase ומומלץ פירוק הרכב עבור קטן GTPases.
| פרמטרים | הערות | ||
| רווח | אפשרות לרווח מכווננת את הרגישות המכונה. רוב luminometers השתמש כיול אוטומטי או כיול מוגבלת לפונקציה. המשתמש צריך לקרוא את רווח נמוך, בינוני, גבוה על מנת לראות אם חומר הקריאה בתוך הטווח. ליניארית שהיקפו משתנה מכשירים שונים. | ||
| זמן אינטגרציה | מומלץ יש אפשרות זו הנמוכות כמו גבוהה מאוד פעמים אולי לקרוא מהטווח ליניארי. זה עשוי לדרוש עבודה מיותרת כמו באמצעות דילול התחתון או נוגדנים ראשיים ומשניים. שילוב הזמן משתנה במכשירים שונים. | ||
| רועדת | מומלץ להשתמש 5s את טלטול מסלולית. זה לא קריטי כמו שאר הפרמטרים על דיוק וזמינותו. | ||
| טמפרטורה | טמפרטורת החדר מומלץ | ||
| סוג לוח | השתמש לפי הלוח שאתה משתמש. בדרך כלל הצלחת הוא 96-ובכן, שטוח ולבן. | ||
| מסננים | מסננים עירור או פליטת אינם הכרחיים לצורך הפריה חוץ גופית. עירור ניתן לקבוע כל הערך הרצוי והוא אופטימלי עבור פליטת nm 430-445. להשאיר את החללים של המסנן ריק. אם זו לא אופציה, | ||
טבלה 3: תיאור מפורט של הגדרות luminometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מתארים שיטה מדויקת למדוד קטן GTPase prenylation ואיגוד GTP כמוצג GTPase קטן subcellular לוקליזציה (ממברנה לעומת ציטוזול) ו GTP רו טעינה. GTPases קטנים באים לידי ביטוי התאים האיקריוטים, ממלאים תפקידים חיוניים ב תאית שגשוג, תנועתיות ומבנה. Prenylation ואיגוד GTP מעורבים בוויסות פעילות GTPase; לכן, מבחני כדי להעריך את prenylation ואת GTP קשירה של חלבונים אלה הם כלים חשובים עבור תא ביולוגים1,8.
בהתבסס על תוצאות מחקר שנערך לאחרונה, רו חלבון GTP טעינת תא מסוג מסוים8, לכן, שונה בין סוגי תאים שונים. כמו כן, לוקליזציה subcellular ו- geranylgeranylation (GGT) של חלבונים רו הם הצעדים הקובע בוויסות של תפקידם. זה גם הלאה מווסת על ידי הגומלין של החלבונים אפקטור בתאוריה, גאפ ו- GDI עבור GTPases הגדולות.
סימבסטטין ידוע להגביר את טעינת Rac GTP ב ומונוציטים THP-1, להקטין את prenylation של Rac בנוכחות גירוי β עמילואיד, ולהפחית את תגובות דלקתיות של תאים אלה17. אנו יודעים גם כי תא T הפונקציה אינה מושפעת GTP רו טעינת אך, ליתר דיוק, GGT של רו קובע פונקציה18,19. לכן, אנו ממליצים, על מנת לזהות פעילות GTPase רו, prenylation וטעינה GTP חייב בו זמנית להימדד בתאים.
ראוי לציין, כדי להשיג את טוהר גבוהה cytosolic ושברים ממברנה, הצעדים החשובים ביותר של הפרוטוקול הן את sonication את ultracentrifugation. עבור Rho GTP-איגוד וזמינותו, השלב הקריטי ביותר הוא snap-הקפאה lysates תא לפני עיבוד סדרתי. שלבים חשובים אלה יפיקו תוצאות עקביות, לשחזור במחקר של GTPases במערכות החיים.
צעד. מפתח לבדוק חלבון מבנה או קרום תאיים מסוים הוא הפרדת תאים סלולריים אחד מהשני. Fractionation מנצלת המאפיינים של כל תא הסלולר, כמו גודל, צורה, צפיפות מטען משטח צפיפות קליל20. הוא בעיקר מבוסס על צנטריפוגה דיפרנציאלית בתקשורת של צמיגות גבוהה ב 4 º C. שיטת fractionation ממברנה אשר שימש כאן מתבסס בעיקר על גודלו של כל תא, על מהירות גבוהה הכבידה איפה, לאחר ultracentrifugation, קרום חלבונים נלך לתחתית הצינור וישארו החלבונים cytosolic תגובת שיקוע.
חשוב לציין כי דגימות המכילה ריכוז חלבון גבוה, אולי, רמות גבוהות של פערים פוטנציאלי יכול להשבית המטרה GTPase. בעיה זו יכול להתרחש אפילו במאגר פירוק, עלול להוביל תוצאות שליליות שגויות. אחד מפתח הפרמטרים הקובעים את ההצלחה הפארמצבטית של GTPase פעילות assay תוצאות היא בריאותם של התגובה של התאים נמצא בשימוש ב- ניסוי8. מומלץ מאוד כי החוקרים לזהות את תנאי הגידול האופטימלית/מתאים והשעה ההכפלה עבור התאים תחת מחקר כדי לקבוע GTPase ההפעלה/עיכוב. בנוסף, הפעילות GTPase של כל GTPases קטן, והיא היא, אפוא, ירידות רגישים מהירה באמצעות הידרוליזה של מולקולת GTP חייב האנזים דרך הפעולה של פערים (במהלך ואחרי בהליך פירוק התא ). פעולה זו גורמת איון מהירה של GTPase עניין. לכן, מומלץ מאוד שכי פירוק התא מתבצעת במהירות ב 4 ° C, כדי להשיג תוצאות לשחזור מדויק.
ישנם מספר גורמים בהתאם לתנאי הניסוי, הקובעות את התא האחרון lysate. ראשית, הסכום הכולל של RhoA GTPase שורת תאים או רקמות ספציפיות: הסכום של RhoA GTPase אנדוגני הוא משתנה בסוגים שונים של תאים ורקמות; לכן, זה יכול לגרום לתגובה יותר נמרצים activator או deactivator. שנית, כמות הפעלה/ביטול הפעלה של מושגת בתנאים ניסיוני: זה חשוב לקחת בחשבון כי כ 2% עד 10% של GTPase קטן סלולרי הכולל מופעל כבר בתגובה גירוי ספציפי8. מידת הביטול אך ורק גם תלוי בסוג של גירויים, וזה משתנה בתהליך שונה תאים ורקמות. לכן, עבור כל סוג של קטן רו GTPase פעילות assay, ההרכב של תא מאגר וסלולר פירוק הוא מכריע. טבלה 3 מציגה את ההרכב המומלץ של המאגר פירוק החלבונים GTPase ספציפיים לכל.
ריכוז חלבון lysate תא מנורמל היא דרישה גדולה מכיוון שהיא מאפשרת חוקרים כדי להשוות את הפעילות GTPase דוגמאות שונות. לכן, שטיפת התאים של כל הדגימות בכל התנאים עם PBS קר הוא חובה להסיר את החלבון התקשורת תרביות רקמה. . זה גם הכרחי כי כל ריאגנטים, מאגרי משמשים בטמפרטורות קרות (4 ° C) בכל השלבים של הניסוי. זו הטמפרטורה הקרה יצמצם את הידרוליזה של GTPases, כולל רו GTPase, במהלך הכנת הדוגמא. . זה קריטי כי זה עיבוד של תא lysates מתנהל במהירות (תוך 10-15 דקות בסך הכל) כדי למנוע את אובדן פעילות RhoA GTPase יתר על כן, הוא הצעד החשוב ביותר של הכנת lysate תא snap-ההקפאה של aliquots של lysate בחנקן נוזלי כדי לשמור על הפעילות RhoA אנזימטי GTPase קטן. הדבר חשוב במיוחד אם יש timepoints שונים או מספר דוגמאות לניסוי. לאחר הכנת lysates מוקפאים snap, ניתן לשמור הדגימות מבלי לאבד את פעילותם GTPase רו ב-80 מעלות צלזיוס.
פרוטוקול שסופק עבור הניתוח של קרום עיגון של RhoA GTPase מייצג רק כלי עקיף כדי למדוד את prenylation של GTPases קטן, והוא לא מסוגל ישירות לזהות או לכמת את הכריכה של שאריות isoprenoid אל החלבון היעד. זהו אחד המגבלות מעט מאוד של זה וזמינותו. לכן, זה נותן הערכת prenylation של חלבונים. הוגדרו כמה גישות, המסוגלים למדוד ישירות מטרים (farnesylation) ו/או GGT farnesyl טרנספראז ו/או geranylgeranyl transferase, בהתאמה, בתאים בתרבית והן חיות וגידולים האדם, נגזר. מבחני להשתמש ניידות electrophoretic משמרת, [3H] farnesyl diphosphate [3H] geranylgeranyl diphosphate, חומצה mevalonic [3H] תיוג, ואחריו immunoprecipitation ומרחביות-דף21.
השתמשנו וזמינותו immunosorbent RhoA GTPase-מקושרים כדי לזהות כל עיגון ממברנה ופעילות של RhoA GTPase. זה מורכב של חלבון Rho-GTP-איגוד אשר מקושר הבארות של צלחת 96-ובכן. אז, GTP מכורך רו פעיל ב lysates תאים או רקמות נקשר הבארות, בעוד התמ ג מכורך רו לא פעיל הוא שטף במהלך השלבים כביסה. . אז, RhoA מאוגדים, פעיל ב הבארות יזוהו באמצעות נוגדן ספציפי RhoA chemiluminescence. זה אפשרי לקבוע את מידת RhoA ההפעלה על-ידי השוואת קריאות מכל תא מופעל ל'לא lysates. סרום רעב (שימוש ללא סרום בינוני על תאים בתרבית) משמש בדרך כלל כדי להשבית RhoA בתרבות רקמה. יש גם לציין כי טווח של וזמינותו GTPase-מקושרים immunosorbent ההפעלה דורשת 10-50 µg של חלבון איתור RhoA GTPase פעילות.
מומלץ מאוד כי דגימות ללא טיפול יש רמות נמוכות של הסלולר הבזליים של GTPase פעילות (בקרת מצב). לדוגמה, התא הנכון הרעבה תנאים יכול downregulate GTPase פעילות ומספקים תנאים אידיאליים כדי להציג את ההפעלה שלהם בתנאים ניסיוני. כמו כן, מבחני הפעלת וניגוד מבוצעות בצורה הזמן - ולא מנה-תגובה כדי לקבל את התגובות הפעלה/עיכוב GTPase הטוב ביותר. חשוב מכך, במהלך הכנת התאית, זה מאוד חשוב להשתמש תאים אשר אינם overconfluent (> 70%), כדי למנוע כל nonresponsiveness של התאים לגירויים הפעלה/עיכוב.
Luminometers ונבדלים זה מזה מבחינת רגישות ובחומר מוחלטת. לכן, על מנת לקבוע כי הוא בטווח ליניארי, אנו מציעים הפעלת וזמינותו של GTPase-מקושרים immunosorbent עם ריק ופקד חיובי. אם וזמינותו היא מתוך הטווח. ליניארית (הפקד חיובית צריך להיות 4 x - x 10 גבוה יותר מאשר קריאת מאגר בלבד) או את הקריאה ריק הוא גבוה יותר מאשר 9-10 מיליון, אז מומלץ לשימוש נוסף דילולים נוגדן. יתר על כן, מומלץ מאוד מכיילת את luminometer לקרוא בתוך הטווח. ליניארית של וזמינותו לפני תחילת וזמינותו.
ישנם גם יתרונות וזמינותו GTPase-מקושרים immunosorbent ששווה להזכיר. מבחני immunosorbent מקושר GTPase לשפר את העיצוב הנוכחי ניסיוני ולאפשר הטכנולוגיה להקל על ניסויים שלא היו אפשריים עם pull-דאונס הישן טכניקות22. מבחני immunosorbent מקושר GTPase מספקים גם הדיוק והרגישות המאפשר ניתוח של פעילות GTPase בהכנות בעבר לתחום נפתחים מבחני23. מספר מחקרים שנערכו לאחרונה לעומת מבחני הפעלת immunosorbent GTPase-מקושרים עם pull-דאונס וסיכם assay GTPase-מקושרים immunosorbent הזה יש כמה יתרונות ברורים, כלומר זה מקושר GTPase immunosorbent מבחני נעלים עקב שלהם היכולת להשתמש כמויות קטנות של חלבונים22,24, רגישות גדולה יותר שלהם24, ו שלהם מדידות כמותיים23. ערכת assay GTPase-מקושרים immunosorbent זמין ב- luminometric או גירסאות זיהוי ערכי צבע מוחלטים, איפה מבחני luminometric רגישים יותר. Assay GTPase-מקושרים immunosorbent הזה מבוססת על פרוטוקול די פשוטה ומהירה, דורש רק כמויות קטנות של מדגם, וזה מניב תוצאות כמותיות ומדויקות. לכן, ייתכן רעיון טוב כדי להמשיך ולפתחו הזה assay לזהות סוגים אחרים של חלבונים מבוססת GTPase שורות תאים שונים ותאי תרביות רקמה עם ירידה לפרטים הרבה יותר גבוה, דיוק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
איציק רז Ghavami נתמכה על ידי בריאות מדע מרכז ההפעלה מענק, CHRIM ההפעלה מענק מחקר מניטובה החדש החוקר הפועלים גרנט. . ג'אבד אליזאדה נתמכה על ידי מניטובה מחקר studentship. דאגה Shojaei נתמך על ידי מענק בריאות קרן המדע פועל להאיץ MITACS הבתר. עאדל רזאא'י מוגדם נתמכה על ידי NSERC הפועלים גרנט אשר נערך על ידי ג'וסף וו גורדון. אמיר א Zeki נתמכה על ידי כל הפרס NIH/NHLBI K08 (1K08HL114882-01A1). מארק ג' לוס בחביבות מודה התמיכה של NCN להעניק #2016/21/B/NZ1/02812, נתמך על ידי LE ביבליקום המכון ללימודים מתקדמים (אזור מרכז-ואל דה לה לואר, צרפת) דרך חכמה הלואר עמק כללי תוכנית שלה והיתה שותפה במימון מאת מארי פעולות Sklodowska-קירי, להעניק #665790. סימון דה סילבה רוזה נתמכה על ידי UMGF studentship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM high Glucose | VWR (Canada) | VWRL0101-0500 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR (Canada) | CA45001-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR (Canada) | 97062-806 | |
| EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid) | VWR (Canada) | CA71007-118 | |
| EGTA (Ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) | VWR (Canada) | CAAAJ60767-AE | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | VWR (Canada) | CA97061-340 | |
| Ammonium Persulfate | VWR (Canada) | CABDH9214-500G | |
| Tris-Hydroxymethylaminomethane | VWR (Canada) | CA71009-186 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution | Biorad (Canada) | 1610158 | |
| TEMED | Biorad (Canada) | 1610801 | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma/Aldrich (Canada) | P8340-5ML | 1:75 dilution |
| Rho-GTPase Antibody Sampler Kit | Cell Signaling (Canada) | 9968 | 1:1000 dilution |
| Pan-Cadherin antibody | Cell Signaling (Canada) | 4068 | 1:1000 dilution |
| GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology (USA) | sc-69778 | 1:3000 dilution |
| RhoA G-LISA Activation Assay (Luminescence format) | Cytoskeleton Inc. (USA) | BK121 | Cytoskeleton I. G-LISA Activation Assays Technical Guide. 2016. |
| RhoA Antibody | Cell Signaling | 2117 | |
| ECL | Amersham-Pharmacia Biotech | RPN2209 | |
| Anti-Rabbit IgG (whole molecule) Peroxidase antibody | Sigma | A6154-1ML | |
| SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | 1612071A | Spectrophotometer |
| Nonidet P-40 | Sigma | 11332473001 | non-denaturing detergent, octylphenoxypolyethoxyethanol |
| DMSO | Sigma | D8418-50ML | |
| PBS | Sigma | P5493-1L | |
| Phophatase Inhibitor cocktail | Sigma | P5726-5ML | 1:75 Dilution |
References
- Yeganeh, B., et al. Targeting the mevalonate cascade as a new therapeutic approach in heart disease, cancer and pulmonary disease. Pharmacology & Therapeutics. 143 (1), 87-110 (2014).
- Valencia, A., Chardin, P., Wittinghofer, A., Sander, C. The ras protein family: evolutionary tree and role of conserved amino acids. Biochemistry. 30 (19), 4637-4648 (1991).
- Hall, A.
- Rojas, A. M., Fuentes, G., Rausell, A., Valencia, A. The Ras protein superfamily: evolutionary tree and role of conserved amino acids. The Journal of Cell Biology. 196 (2), 189-201 (2012).
- Cherfils, J., Zeghouf, M. Regulation of small GTPases by GEFs, GAPs, and GDIs. Physiological Reviews. 93 (1), 269-309 (2013).
- Shojaei, S., et al. Perillyl Alcohol (Monoterpene Alcohol), Limonene. Enzymes. 36, 7-32 (2014).
- Ghavami, S., et al. Airway mesenchymal cell death by mevalonate cascade inhibition: integration of autophagy, unfolded protein response and apoptosis focusing on Bcl2 family proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (7), 1259-1271 (2014).
- Alizadeh, J., et al. Mevalonate Cascade Inhibition by Simvastatin Induces the Intrinsic Apoptosis Pathway via Depletion of Isoprenoids in Tumor Cells. Scientific Reports. 7, 44841 (2017).
- Ghavami, S., et al. Mevalonate cascade regulation of airway mesenchymal cell autophagy and apoptosis: a dual role for p53. PLoS One. 6 (1), e16523 (2011).
- Tang, Y., Olufemi, L., Wang, M. T., Nie, D. Role of Rho GTPases in breast cancer. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 13, 759-776 (2008).
- DerMardirossian, C., Bokoch, G. M. GDIs: central regulatory molecules in Rho GTPase activation. Trends in Cell Biology. 15 (7), 356-363 (2005).
- Garcia-Mata, R., Boulter, E., Burridge, K. The 'invisible hand': regulation of RHO GTPases by RHOGDIs. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 493-504 (2011).
- Etienne-Manneville, S., Hall, A.
- Ghavami, S., et al. Geranylgeranyl transferase 1 modulates autophagy and apoptosis in human airway smooth muscle. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 302 (4), L420-L428 (2012).
- Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406 (6795), 532-535 (2000).
- Ghavami, S., et al. Statin-triggered cell death in primary human lung mesenchymal cells involves p53-PUMA and release of Smac and Omi but not cytochrome c. Biochimica et Biophysica Acta. 1803 (4), 452-467 (2010).
- Cordle, A., Koenigsknecht-Talboo, J., Wilkinson, B., Limpert, A., Landreth, G. Mechanisms of statin-mediated inhibition of small G-protein function. Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 34202-34209 (2005).
- Waiczies, S., Bendix, I., Zipp, F. Geranylgeranylation but not GTP-loading of Rho GTPases determines T cell function. Science Signaling. 1 (12), pt3 (2008).
- Waiczies, S., et al. Geranylgeranylation but not GTP loading determines rho migratory function in T cells. Journal of Immunology. 179 (9), 6024-6032 (2007).
- Satori, C. P., Kostal, V., Arriaga, E. A. Review on Recent Advances in the Analysis of Isolated Organelles. Analytica Chimica Acta. 753, 8-18 (2012).
- Berndt, N., Sebti, S. M. Measurement of protein farnesylation and geranylgeranylation in vitro, in cultured cells and in biopsies, and the effects of prenyl transferase inhibitors. Nature Protocols. 6 (11), 1775-1791 (2011).
- Keely, P. J., Conklin, M. W., Gehler, S., Ponik, S. M., Provenzano, P. P. Investigating integrin regulation and signaling events in three-dimensional systems. Methods in Enzymology. 426, 27-45 (2007).
- Oliver, A. W., et al. The HPV16 E6 binding protein Tip-1 interacts with ARHGEF16, which activates Cdc42. British Journal of Cancer. 104 (2), 324-331 (2011).
- Moniz, S., Matos, P., Jordan, P. WNK2 modulates MEK1 activity through the Rho GTPase pathway. Cellular Signalling. 20 (10), 1762-1768 (2008).
