Summary
Her beskriver vi en protokoll for å undersøke prenylation og guanosine-5'-trifosfat (GTP)-lasting av Rho GTPase. Denne protokollen består av to detaljerte metoder, nemlig membran fraksjoneres og en GTPase-koblede immunosorbent analysen. Protokollen kan brukes for å måle prenylation og GTP lasting av ulike andre små GTPases.
Abstract
Rho GTPase familien tilhører Ras gruppe og inkluderer ca 20 medlemmer hos mennesker. Rho GTPases er viktige i regulering av ulike cellulære funksjoner, inkludert cellen cytoskjelett dynamics, celle motilitet, celle polaritet, axonal veiledning, vesicula smugling og celle syklus kontroll. Endringer i Rho GTPase signalering spiller en viktig regulerende rolle i mange pathological betingelser, som kreft, sentralnervesystemet sykdommer og immunsystemet-avhengige sykdommer. Posttranslational endring av Rho-GTPases (dvs., prenylation av mevalonate sti mellomprodukter) og GTP binding er viktige faktorer som påvirker aktiveringen av dette proteinet. I dette papiret, er to grunnleggende og enkle metoder forutsatt for å oppdage et bredt spekter av Rho GTPase prenylation og GTP bindende aktiviteter. Detaljer om de tekniske fremgangsmåtene som er brukt er forklart steg for steg i dette manuskriptet.
Introduction
Rho GTPases er en gruppe av små proteiner (21-25 kDa), som er godt bevart gjennom evolusjon, og danner en unik gruppe Ras gruppe av små GTPases. I hver gruppe i denne gruppe er det en felles G domene kjerne som er involvert i GTPase aktivitet og nukleotid exchange1. Forskjellen mellom Rho familie og andre Ras underfamilier er tilstedeværelsen av en "Rho sett inn domene" 5th β strand og de 4th α helix i små GTPase domene2.
Basert på den siste resultatlisten, anses Rho GTPases en familie av proteiner som passer inn i Ras GTPase gruppe3-signalisering. Pattedyr Rho GTPases har 22 medlemmer basert på spesifikk funksjon og generell karakteristikk4 som RhoA, Rac1 og Cdc42 er blant de fleste studert medlemmene i denne gruppen. Rho GTPases er knyttet til intracellulær signalnettverk trasé via en strengt regulert mekanismen som er avhengig av molekylære brytere via protein posttranslational modifikasjoner5.
GTP lasting og hydrolyse er viktige mekanismer i aktivering/deaktivering syklus av små Rho-GTPases og er regulert via GTPase-aktivere proteiner (hull). Hullene er ansvarlig for GTP hydrolyse og jobber sammen med guanine nukleotid exchange faktorer (GEFs) som er ansvarlig for GTP lasting reaksjonen. Rho BNP dissosiasjon hemmere (GDIs) gir ytterligere regulering av små Rho GTPases via binding til BNP-bundet Rho GTPases. Dette hemmer BNP dissosiasjon forenkler fremdeles lite Rho GTPases fra webområdene aktive intracellulær membran. Det er også ytterligere regulering av Rho GTPase proteiner som involverer prenylation av GDIs som regulerer både nukleotid hydrolyse og exchange og kontroller BNP/GTP sykling1,6,7,8.
Både GTP lasting og Rho GTPase prenylation er involvert i bevegelsen av Rho GTPase mellom stoffer og cellemembranene ved å endre egenskapene lipofile av disse proteinene1,9. Ovennevnte regulatorer samhandle med fosfolipider i cellemembranen og andre modulerende proteiner av BNP/GTP exchange aktivitet10. Videre blokkere GDIs, dissosiasjon hemmere, både GTP hydrolyse og BNP/GTP utveksling. GDIs hemmer av inaktive Rho proteiner fra BNP, og derfor deres samspill med nedstrøms effektor. GDIs også regulere sykling av GTPases mellom stoffer og membran i cellen. Aktiviteten til Rho GTPases avhenger i stor grad på deres bevegelse til cellemembranen; dermed regnes GDIs som kritisk regulatorer som kan beslaglegge GTPases i cytoplasma gjennom skjule sine hydrofobe regionen/domener11,12.
For Rho GTPase ha en optimal signalering og funksjon i alle stadier av syklusen aktivisering, er dynamisk syklusen GTP-lasting/GTP hydrolyse avgjørende. Alle typer endringer i denne prosessen kan medføre senere endringer i celle funksjoner regulert av Rho GTPase, for eksempel celle polaritet, spredning, morphogenesis, cytokinesis, overføring, vedheft og overlevelse13,14.
Gjeldende protokollen gir leserne med en detaljert metode for å overvåke liten RhoA GTPase aktivisering via etterforskningen av deres prenylation og BNP/GTP lasting. Denne metoden kan også brukes til å oppdage prenylation og GTP binding av en rekke små GTPases. GTPase-koblede immunosorbent analysen kan brukes til å måle nivået på aktivisering av andre typer GTPases, for eksempel Rac1, Rac2, Rac3, H, K- eller N-Ras, Arf og Rho15. Farmakologiske agent simvastatin brukes som et eksempel, som det ble nylig rapportert å være involvert i regulering av små Rho GTPase prenylation og aktivitet8,9,14,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fastsettelse av RhoA lokalisering med membran/stoffer fraksjoneres
-
Celle kultur og simvastatin behandling
- Ætt 50.000 U251 celler i en 100 mm rett og kultur dem i Dulbeccos endret Eagle's medium (DMEM) (høy glukose, 10% fosterets bovin serum [FBS]).
- Når 30% confluent, behandle cellene ved å fjerne mediet og legge simvastatin inneholder middels til det (10 µM av simvastatin oppløst i dimethyl sulfoxide [DMSO]) og ruge 36 h 37 ° C8. Bruke DMSO alene som et kjøretøy kontroll.
Merk: 10 millioner celler kreves av stoffer og membran fraksjoneres i cellene.
-
Samling celler
- Fjerne celler fra 37 ° C inkubator. Se på cellene under et mikroskop for å bekrefte confluency.
Merk: Cellene skal 70% - 80% confluent. - Sug opp mediet, vask cellene 1 x med kaldt fosfat-bufret saltvann (PBS). Legge til 5 mL ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) bufferen (KCl: 400 mg/L, NaCl: 6800 mg/L, NaHCO3: 2200 mg/L, NaH2PO4. H2O: 140 mg/L, D-glukose: 1000 mg, EDTA disodium: 373 mg/L) per plate og sted cellene tilbake i inkubator 37 ° C i 5 min.
- Etter 5 min med inkubering, samle EDTA med cellene i en 15 mL tube som inneholder samme mengde medium som EDTA.
Merk: Har middels i røret nøytraliserer EDTA og hindrer noen ytterligere fordøyelsen cellemembraner. - Sett røret i en isen boksen og videre til en sentrifuge.
- Sette opp i sentrifugen 1500 x g på 4 ° C og spinne celler for 5 min.
- Fjern nedbryting uten å forstyrre pellet og tilsett 1 mL kaldt PBS. Blandingen cellene.
- Overføre celle blandingen (løsning) til en ny 1,5 mL tube, sentrifuger 1500 x g ved 4 ° C, og spinne celler for 5 min.
- Sjekk pellet størrelsen (for å estimere mengden bufferen for neste trinn). Sett prøvene på is. Kast nedbryting helt uten å forstyrre pellet.
- Legg iskald buffer jeg (10 mM Tris-HCl [pH 7.5] 0,1 mM EDTA, 0,1 mM EGTA, 1 mM dithiothreitol og protease hemmer cocktail), blande prøvene godt av pipettering opp og ned, og deretter videre til sonication.
- Fjerne celler fra 37 ° C inkubator. Se på cellene under et mikroskop for å bekrefte confluency.
-
Sonication
- Angi sonicator for fem sykluser, 5 s hver, og gjenta 3 x.
- Utfør i sonication på is. Videre til ultracentrifuge.
Merk: Is og kalde tilstand bevare proteiner og gjøre resultatene mer pålitelig.
-
Ultracentrifugation
- Bruk en ultracentrifuge for å dele celle homogenates i cytoplasma og membran fraksjoner. Angi sentrifuge 100.000 x g for 35 min på 4 ° C. Som vist i figur 1, sjekk pellet størrelsen.
Merk: Membranen brøkdel er på bunnen av røret og resten er andre cytoplasmatiske komponenter. - Samle nedbryting helt mens å være forsiktig for ikke å forstyrre pellet. Nedbryting er cytosolic brøken. Plass nedbryting i et nylig merket rør.
- Legge til 300 µL av dissosiasjon buffer (buffer II) (50 mM Tris-HCl [pH 7.5] 0,15 M NaCl, 1 mM dithiothreitol, 1% SDS, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA og protease hemmer cocktail) til pellet (inneholder membran brøken). Bland godt av pipettering opp og ned.
- Videre til protein besluttsomhet og western blot (immunoblot analyse) eksempel forberedelse.
- Bruk en ultracentrifuge for å dele celle homogenates i cytoplasma og membran fraksjoner. Angi sentrifuge 100.000 x g for 35 min på 4 ° C. Som vist i figur 1, sjekk pellet størrelsen.
-
Immunoblotting
- Forberede celle protein utdrag fra atskilt fraksjoner i lyseringsbuffer (20 mM Tris-HCl [pH 7.5], 0,5 mM PMSF, 0,5% ikke-ioniske vaskemiddel-40, 100 µM β-glyserol 3-fosfat, og 0,5% protease hemmer cocktail).
- Måle protein konsentrasjonen bruker Lowry metoden8 og beregne volumet av lyseringsbuffer (20 mM Tris-HCl [pH 7.5], 0,5 mM PMSF, 0,5% nondenaturing vaskemiddel, octylphenoxypolyethoxyethanol, 100 µM β-glyserol 3-fosfat og 0,5% protease hemmer cocktail) å normalisere konsentrasjonen av protein mellom utvalgene.
- Varme prøvene ved 90 ° C i 5 min og laste 15-20 µL av prøvene på en 15% SDS side gel å skille proteiner.
Merk: Legg 1 µg protein for hvert utvalg. Beregne volumet som må kjøres tilsvarende. - Overføre atskilt proteiner til nylon membraner under redusere forhold (500 nM glysin, 50 mM Tris-HCl og 20% metanol) for 2t, ved romtemperatur (RT) ved 100 V.
Merk: For å bekrefte vellykket protein overføringen, bruk Ponceau flekken eller visualisere protein markøren på membranen. - Blokkere membraner med 5% nonfat tørket melk og 1 x Tris-bufret saline inneholder vaskemiddel (TBS/0.01% ikke-ionisert vaskemiddel; TBST) å blokkere uspesifikke antistoff bindingen på 4 ° C over natten eller RT 1t.
- Legg til primære antistoffer for immunoblotting analyse og ruge over natten på 4 ° C.
Merk: I dette eksperimentet, Rac1/2/3, cdc42, RhoA, GAPDH og pan-Cadherin ble brukt på en 1:1,000 fortynning i 1% melk i 1 x TBST. Pan-Cadherin og GAPDH ble brukt til å bekrefte membran og cytosolic brøkdel-renhet, henholdsvis. - Vask membraner 3 x med en vask buffer med 1 x TBST for 20 min.
- Inkuber membraner med anti-kanin pepperrotperoksidase (HRP)-konjugert sekundære antistoff for de respektive primære Antistoffene (for 1 h på RT).
- Vask blots 3 x for 20 min og utvikle dem med forbedret chemiluminescence (ECL) oppdagelsen.
2. måling av RhoA GTP belastningen ved hjelp av en liten G-protein aktivisering analysen
- Antall 10.000 celler/mL og kultur parabol U251 cellene i en 100 mm.
- Når de er 30% confluent, behandle cellene med simvastatin som beskrevet i trinn 1.1.2.
- Bringe kultur platene av inkubator. Se på cellene under mikroskop for å bekrefte confluency. Kontroller at cellene er 70% - 80% confluent. Plasser Petriskål på is, Sug opp media, og vask cellene 3 x med iskald PBS (pH 7.2).
- Sug opp PBS. Vipp Petriskål på is en ekstra minutt å fjerne alle rester av PBS.
Merk: Gjenværende PBS negativt påvirker denne analysen. - Lyse cellene i en 700 µL mengde iskald lyseringsbuffer inneholder protease og fosfatase hemmere.
Merk: 700 µL er vanligvis nok for en 100 mm Petriskål. Se tabell 1 finne riktig volumet for hver kultur fartøy. - Høste cellen lysate med cellen skrapen. Skråning kultur plate for denne teknikken.
- Overføre til lysate til en merket iskalde cryotube og holde det på is.
- Bland godt med en vortex. Holde 10 µL av lysate for protein analysen, måle protein konsentrasjonen i utvalget.
- Snapin-fryse gjenværende cellen lysate i flytende nitrogen.
Merk: Forberede Quidel cellen lysate før snapin-fryse dem, for å unngå gjentatte fryse/tine sykluser som kan føre til tap av aktiviteten til RhoA GTPase. - Overføre snapin-frozen-cryotubes til en-80 ° C fryser og lagre prøvene for GTPase-koblede immunosorbent analysen.
Merk: Ikke lagre prøvene lengre enn 14 dager. Arbeide raskt og aldri forlate prøvene på is lenger enn 10 min. Aldri håndtere alle Petri retter samtidig. - Måle protein konsentrasjonen bruker Lowry metoden8 og beregne volumet av lyseringsbuffer normalisere konsentrasjonen av protein mellom utvalgene.
Merk: Konsentrasjonen er vanligvis 1 mg/mL; men 0.3 - 2 mg/mL kan være synlig. - Forbered en tom kontroll ved å legge 60 µL av lyseringsbuffer og 60 µL bindende bufferen til en microtube.
Merk: Tom kontrollen har reagenser unntatt antigen og brukes for subtraksjon av bakgrunnen. - Forberede en positiv kontroll ved å legge til 12 µL Rho kontroll protein, 48 µL av lyseringsbuffer og 60 µL bindende bufferen.
Merk: Positiv kontrollen har reagenser pluss en bekreftet antigen for Rho-A-GTP. - Ta Rho affinitet plate ut av sin bag og plassere den på is.
- Oppløse pulveret i brønnene med 100 µL iskald destillert vann. Holde platen på is.
- Tine snapin-frosne celle lysates i et vannbad satt til 25 ° C.
- Legge til beregnede mengden iskald lyseringsbuffer (fra trinn 2.11) til hver prøve å normalisere protein konsentrasjonen.
Merk: Fjern PBS etter vask cellene (med en vakuumrør aspirator) for å unngå å forårsake endringer i sammensetningen av lyseringsbuffer. Utjevne prøve protein til en konsentrasjon mellom 0,8 og 2 mg/mL for en nøyaktig sammenligning mellom prøvene i GTPase aktivisering analyser. Tabell 2 gir detaljer om bufferen skal brukes for denne analysen. - Overføre 60 µL normalisert iskald prøvene til microtubes og legge til 60 µL av bindende buffer; Bland prøvene godt og holde dem på isen.
- Fjerne de vann løsningene fra microplate av energisk flicking, etterfulgt av fem til syv hardt trykk på lab mat.
- Legge til 50 µL normalisert prøvene, en tom kontroll og en positiv kontrollen i brønnene i duplikater.
- Plass platen på en orbital shaker i 30 min på 4 ° C på 300 rpm.
NOTE Det risting trinnet er svært viktig, og det anbefales å bruke orbital plate shaker på 300 rpm. - Fjern prøvene fra platen ved å sveipe og vaske dem 2 x med 200 µL vaske bufferen på RT. kraftig fjerne vaske bufferen fra brønnene etter hver vask ved å sveipe, etterfulgt av å tappe, og holde platen på benken på RT.
- Legg til 200 µL RT antigen-presentasjon bufferen i hver brønn og ruge på RT i 2 minutter.
- Sveiper ut løsningen fra brønnene og vaske brønnene 3 x med 200 µL vaske bufferen på RT.
- Legge til 50 µL nylagde 1/250 anti-RhoA primære antistoff i hver brønn.
- Plass platen på en orbital shaker i 45 min på 300 rpm satt til 25 ° C. Sveiper ut løsningen fra brønnen.
- Gjentar vask trinn 2 x (trinn 2.24).
- Legge til 50 µL nylagde 1/250 anti-RhoA sekundære antistoff i hver brønn.
- Plass platen på en orbital shaker i 45 min på 300 rpm satt til 25 ° C.
- Forberede HRP oppdagelsen reagensen ved å blande like volum reagens A og reagens B.
- Sveiper ut løsningen fra hver brønn og vaske brønnene 3 x med 200 µL vaske bufferen på RT.
- Legge til 50 µL av nylagde HRP oppdagelsen reagensen i hver brønn.
- Les selvlysende signalet innen 3-5 min å få maksimal signalet og analysere resultatene med en passende pakke.
Merk: Målingene må være tatt innen 3-5 minutter å få maksimal signalet. Kjøre en "test plate" for å bekrefte riktig lysis buffer volum brukes for celle-lysates slik at protein konsentrasjonen er høy nok til å oppdage RhoA GTPase aktivitet. (En test plate er en plate av celler som brukes til å finne hvis protein konsentrasjonen faller innenfor akseptable verdier og også avgjøre om volumet av lyseringsbuffer brukes er riktig.) Positiv kontrollen bør lese 4 - til 10 ganger høyere enn tomme brønnene hvis er lineær området. Hvis ikke, justere luminometer konsulenttjenester produsenten. Innstillingene for luminometer er gitt i tabell 3. - Angi rå data i kolonner der overskriftene lese utvalg, mener, Standardavvik, rep1, rep2, rep3og rep4, som er å vise antall gjentak blir gjort på hvert utvalg.
- Angi formelen =average(Xn:Yn) under mener, der X = kolonnen betegnelse for rep1, Y = kolonnen betegnelse for rep4og n = p betegnelse av raden på.
- Angi formelen = STDAV (Xn:Yn) under Standardavvik, der X = kolonnen betegnelse for rep1, Y = kolonnen betegnelse for rep4og n = p betegnelse av raden på.
- Angi Repliker data i rep1, rep2, osv.
- Etter inn dataene, kan du bruke metoden Klikk og dra til Velg Sample, meningog Standardavvik.
- Velg deretter funksjonen for diagrammet gjør som ser ut som en firkant med en mini stolpediagram i dataanalyse programvare.
Merk: Dette bringer opp diagrammet gjør prosessen der det er mulig å design diagrammer basert på dataene som er angitt. - Velg stolpediagram , og input-verdier, angi mener tallene.
Merk: Diagrammet for mener tallene er foretatt, og deretter kolonnen standardavviket for y-feilfelt angis. Dette Dobbeltklikk på grafen barer, Velg kategorien y feil , klikker du alternativet Egendefinert og merke området i regnearket til å angi plasseringen av standardavviket dataene. Forskjellen mellom gruppene som skal sammenlignes kan sees etter etableringen av ønsket listene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Membran fraksjoneres:
Ultracentrifugation ble brukt fraksjoneres membran og stoffer komponenter. Som vist i figur 1, nedbryting inneholder cytosolic brøken og pellet inneholder membran brøken. Overflod av RhoA i cytosolic andmembrane fraksjoner fra U251 celler ble undersøkt etter behandling med simvastatin bruker immunoblotting. Renhet og lasting kontroll av membran og stoffer brøken ble bekreftet av pan-Cadherin og GAPDH henholdsvis. Som vist i figur 2, redusert simvastatin behandling mengden av membran-bundet RhoA GTPase, mens den økte innholdet cytosolic. Dette stemmer overens med kjente effektene av statiner på translokasjon av GTPases basert på hemming av RhoA prenylation. Simvastatin hemmer prenylation av RhoA GTPase, og derfor unprenylated RhoA ikke kan tidfestes plasma cellemembraner, som resulterer i sin høyere cytosolic konsentrasjoner.
RhoA-GTP binding:
Vi målt GTP-bundet RhoA protein ved hjelp av en GTPase koblet immunosorbent analysen og viste at simvastatin signifikant (P < 0,05) økt GTP-bundet RhoA i U251 celler (Figur 3). Derfor, mens simvastatin hemmet RhoA GTPase protein prenylation (figur 2), det også økt sin GTP lasting sammenlignet med kontrollen cellene. Dette peker på at prenylation og GTP bindende både spille en rolle i aktivitet og regulering av RhoA GTPase. For flere detaljer om dette fenomenet, henvises til den opprinnelige publikasjonen bruker denne protokollen8.
Figur 1 : Skjematisk visning av cytosolic og membran fraksjoner etter ultracentrifugation. Pellet inneholder membran brøk og nedbryting inneholder cytosolic brøken.
Figur 2 : Simvastatin endrer lokalisering av RhoA. U251 celler ble behandlet med simvastatin (10 µM; 12, 24 og 36 h) og overflod av RhoA i membranen og cytosolic fraksjoner ble bestemt av immunoblotting. GAPDH og pan-Cadherin overflod ble også vurdert å kontrollere for lasting i cytosolic og membran fraksjoner og bekrefte at mangel på cytosolic forurensning i membranen fraksjoner. Dataene er vanligvis fra tre uavhengige eksperimenter med ulike primære kulturer. Dette tallet har blitt endret fra Alizadeh et al. 8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Simvastatin modulerer RhoA GTPase aktivitet. GTPase-koblede immunosorbent analysen ble brukt til å måle GTP-bundet Rho protein i U251 celler. Ulike forhold ble testet for 36 h, inkludert sult og simvastatin (10 µM). For hvert forsøk, ble et constitutively aktive RhoA protein i settet brukt som en positiv. Resultatene er uttrykt som gjennomsnittlig ± SD av to replikat uavhengig eksperimenter (* P < 0,001). Dette tallet har blitt endret fra Alizadeh et al. 8.
| Celle kultur fartøy | Areal (cm2) | Lyseringsbuffer (µl) | |
| Retter | 35 mm | 9 | 100 |
| 60 mm | 21 | 300 | |
| 100 mm | 55 | 700 | |
| 150 mm | 145 | 1500 | |
| Plater | 6-brønn | 9,4 / godt | 100 |
| 12-brønn | 3.8 / godt | 70 | |
| 24-brønn | 1.9 / godt | 40 | |
| Kolber | T-25 | 25 | 250 |
| T-75 | 75 | 1000 | |
| T-150 | 150 | 1500 | |
Tabell 1: Anbefalt av lyseringsbuffer for U251 celler. Volumet er justerbar for forskjellige celletyper.
| Lysis Buffer navn | Lysis Buffer sammensetning | Liten G-Protein mål | Notater |
| GL35 | Tris (1 X GL36), MgCl2 (8 X GL36), NaCl (2 X GL36), IGEPAL (1 X GL36), SDS (5 X GL36) | Cdc42 | Identiske komponenter til GL36, komposisjon varierer som følger; |
| GL36 | en proprietær formulering av Tris pH 7.5, MgCl2, NaCl, IGEPAL og SDS | RalA | Standard buffer, kompatibel med mest GTPase knyttet immunosorbent analyser. |
| GL36 | en proprietær formulering av Tris pH 7.5, MgCl2, NaCl, IGEPAL og SDS | Rac1 | Standard buffer, kompatibel med mest GTPase knyttet immunosorbent analyser. |
| GL36 | en proprietær formulering av Tris pH 7.5, MgCl2, NaCl, IGEPAL og SDS | Rac1, 2, 3 | Standard buffer, kompatibel med mest GTPase knyttet immunosorbent analyser. |
| GL36 | en proprietær formulering av Tris pH 7.5, MgCl2, NaCl, IGEPAL og SDS | RAS | Standard buffer, kompatibel med mest GTPase knyttet immunosorbent analyser. |
| GL36 | en proprietær formulering av Tris pH 7.5, MgCl2, NaCl, IGEPAL og SDS | RhoA | Standard buffer, kompatibel med mest GTPase knyttet immunosorbent analyser. |
| GL36 | en proprietær formulering av Tris pH 7.5, MgCl2 | Arf1 | Standard buffer, kompatibel med mest GTPase knyttet immunosorbent analyser. |
Tabell 2: Koblede listen av GTPase-immunosorbent analysen lysis buffere og anbefalt lyse komposisjon for små GTPases.
| Parametere | Notater | ||
| FÅ | FÅ alternativet justerer maskin følsomheten. De fleste luminometers bruker automatisk kalibrering begrenset kalibrering. Brukeren bør lese gevinst på lav, medium og høy for å se om lesing er innenfor de lineære som varierer i ulike instrumenter. | ||
| INTEGRERING TID | Det anbefales å ha dette alternativet lavest som den svært høye ganger kan lese ut av lineære området. Dette kan kreve unødig arbeid som bruker lavere fortynning eller primære og sekundære antistoffer. INTEGRERING tid varierer også i ulike instrumenter. | ||
| RISTING | Det anbefales å bruke 5-Erne orbital RISTING. Det er ikke like avgjørende som andre parametere for nøyaktigheten av analysen. | ||
| TEMPERATUR | Romtemperatur anbefales | ||
| SKIVETYPE | Bruk i henhold til platen du bruker. Platen er vanligvis 96-brønnen, flat og hvit. | ||
| FILTRE | Eksitasjon eller utslipp filtre er ikke nødvendig for Luminescence. Eksitasjon kan settes på alle ønsket verdi og optimal for utslipp er 430-445 nm. Tomt mellomrom filter. Hvis dette ikke er et alternativ, | ||
Tabell 3: En detaljert beskrivelse av luminometer innstillinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en nøyaktig metode for å måle små GTPase prenylation og GTP binding vises som små GTPase subcellular lokalisering (membran versus stoffer) og Rho GTP lasting. Små GTPases uttrykkes i eukaryote celler og spille viktige roller i mobilnettet spredning, motilitet og struktur. Både prenylation og GTP binding er involvert i regulering av GTPase aktivitet. Derfor er analyser å evaluere prenylation og GTP binding av disse proteinene viktige verktøy for celle biologer1,8.
Basert på resultatene av en fersk studie, Rho protein GTP lasting celle-type bestemt8, og derfor skiller seg blant forskjellige celletyper. Også er subcellular lokalisering og geranylgeranylation (GGT) Rho proteiner avgjørende skritt i regulering av deres funksjon. Dette er også regulert av samspillet mellom effektor proteiner GEF, GAP og GDI for den store GTPases.
Simvastatin er kjent for å øke Rac GTP lasting i THP-1 monocytter, redusere prenylation av Rac i nærvær av amyloid β stimulering og redusere inflammatorisk svar fra disse cellene17. Vi vet også at T-celle funksjonen påvirkes ikke av Rho GTP lasting, men snarere GGT Rho bestemmer funksjonen18,19. Vi anbefaler derfor at for å oppdage Rho GTPase aktivitet, både prenylation og GTP lasting må samtidig måles i celler.
Av notatet, høy renhet cytosolic og membran fraksjoner, er de viktigste trinnene av protokollen sonication og ultracentrifugation. For Rho GTP-bindende analysen, det viktigste trinnet er snapin-Underkjølt celle lysates før sekvensiell behandling. Følgende fremgangsmåte viktig produsere konsistente og reproduserbar resultater i studiet av GTPases i levende systemer.
Et viktig skritt for å undersøke et bestemt intracellulær struktur eller membran protein er separasjon av mobilnettet rom fra hverandre. Fraksjoneres drar fordel av egenskapene til hvert mobilnettet kammer, som størrelse og form, overflate kostnad tetthet og høy tetthet20. Det er hovedsakelig basert på differensial sentrifugering i medier av høy viskositet på 4 ° C. Membran fraksjoneres metoden som ble brukt her er hovedsakelig basert på størrelsen på hvert kammer og om gravitasjonsakselerasjonen høyhastighets hvor, etter ultracentrifugation, membran proteiner gå til bunnen av røret og cytosolic proteiner blir værende i den nedbryting.
Det er viktig å merke seg at prøver inneholder høy protein konsentrasjoner og, muligens, høye nivåer av hullene kan potensielt deaktivere målet GTPase. Dette problemet kan oppstå selv i lyseringsbuffer og kan føre til falske negative resultater. En av nøkkelparameterne som avgjør suksessen og reproduserbarhet GTPase aktivitet analysen resultater er helse og responsen til cellene som brukes i eksperimentet8. Det anbefales sterkt at etterforskerne identifisere optimal/passende vekst betingelsene og dobling tid for cellene i studie for å fastslå GTPase aktivisering/hemming. I tillegg GTPase aktiviteten til alle små GTPases er strengt regulert og er derfor utsatt for rask nedgang via hydrolyse av den GTP molekylet bundet til enzym via handlingen av hullene (under og etter celle lysis prosedyren ). Denne handlingen fører til rask inaktivering av GTPase rundt. Derfor er det sterkt anbefalt at cellen lysis utføres raskt ved 4 ° C, for å oppnå nøyaktig og reproduserbar resultater.
Det er flere faktorer avhengig av eksperimentelle forhold som bestemmer den siste cellen lysate. Først, den totale mengden RhoA GTPase i celle linje eller bestemt vev: endogene RhoA GTPase er variabel i ulike typer celler og vev; Derfor kan dette resultere i en mer energisk respons en aktivator eller deactivator. Andre, hvor mye aktivering/deaktivering oppnådd under eksperimentelle forhold: det er viktig å vurdere at ca 2% til 10% av den totale cellular liten GTPase aktiveres muligens svar på en bestemt stimulans8. Mengden deaktivering avhengig utelukkende av stimuli, og det er variabel i forskjellige celler og vev. Derfor for hver liten Rho GTPase aktivitet analysen er sammensetningen av lysis buffer og cellular rommet avgjørende. Tabell 3 viser anbefalt sammensetningen av lyseringsbuffer for hver bestemt små GTPase protein.
Normalisert celle lysate protein konsentrasjonen er et stort behov fordi etterforskere sammenligne GTPase aktiviteten til forskjellige prøver. Derfor er vaske cellene fra alle prøvene i alle forhold med kaldt PBS obligatorisk å fjerne protein fra vev kultur media. Det er også viktig at alle reagenser og buffere brukes på kalde temperaturer (4 ° C) i alle trinn av eksperimentet. Denne kald temperatur vil redusere hydrolyse av GTPases, inkludert Rho GTPase, under eksempel forberedelse. Det er viktig at denne behandling av celle lysates er gjennomført raskt (i 10-15 min totalt) for å unngå tap av RhoA GTPase aktivitet. Videre er viktigste celle lysate forberedelser til snapin-fryse dele den lysate i flytende nitrogen å opprettholde RhoA liten GTPase enzymatiske aktiviteten. Dette er spesielt viktig hvis det finnes forskjellige timepoints eller flere eksempler i eksperimentet. Etter utarbeidelse av snapin-frosne lysates, kan prøvene holdes i-80 ° C uten å miste sin Rho GTPase aktivitet.
Den angitte protokollen for analyse av membran forankring av RhoA GTPase representerer bare en indirekte for å måle prenylation av små GTPases og er ikke direkte oppdage eller kvantifisere binding av isoprenoid rester til målet protein. Dette er en av svært få begrensningene for denne analysen. Derfor gir en vurdering av prenylation av proteiner. Noen metoder er definert som kan direkte måle FT (farnesylation) og/eller GGT farnesyl transferase og/eller geranylgeranyl transferase, henholdsvis, både i kulturperler celler og dyr og menneske-avledet svulster. Analyser bruk electrophoretic mobilitet SKIFT, [3H] farnesyl diphosphate og [3H] geranylgeranyl diphosphate og [3H] mevalonic syre merking, etterfulgt av immunoprecipitation og SDS side21.
Vi brukte koblede RhoA GTPase-immunosorbent analysen for å finne membran forankring og aktiviteten til RhoA GTPase. Det består av en Rho-GTP-bindende protein som er knyttet til brønnene av en 96-brønns plate. Så, den GTP-bundet aktive Rho i cellen eller vev lysates binder til brønnene, mens BNP-bundet inaktive Rho vasket bort under vask trinnene. Deretter vil bundet, aktiv RhoA i brønnene oppdages ved hjelp av en RhoA-spesifikke antistoffer og chemiluminescence. Det er mulig å fastslå graden av RhoA aktivisering ved å sammenligne målinger fra aktivert å nonactivated celle lysates. Serum sult (bruk i serum-free mediet på kulturperler celler) brukes vanligvis til å deaktivere RhoA i vev kultur. Det bør også nevnes at GTPase knyttet immunosorbent analysens rekke aktivering krever 10-50 µg protein for påvisning av RhoA GTPase aktivitet.
Det anbefales sterkt at ubehandlet prøver har lav basale mobilnettet nivåer av GTPase aktivitet (kontroll tilstand). Som et eksempel, riktig celle sult forhold kan downregulate GTPase aktivitet og gir ideelle forhold å vise aktivisering under eksperimentelle forhold. Både aktivisering og hemming analyser utføres også i en tid - og dose-respons-måte å få de beste GTPase aktivisering/hemming svarene. Enda viktigere, under cellular forberedelse, det er svært viktig å bruke celler som ikke er overconfluent (> 70%), for å unngå eventuelle nonresponsiveness i cellene på aktivisering/hemming stimuli.
Luminometers variere sterkt følsomhet og absolutt målinger. Derfor, for å finne ut at det er i området lineær, foreslår vi kjører en GTPase koblet immunosorbent analysen med en tom og en positiv kontroll. Hvis analysen av lineær området (positiv kontrollen skal være 4 x - 10 x høyere enn bufferen bare lese) eller tom lesing er høyere enn 9-10 millioner, så det anbefales å bruke ytterligere antistoffer fortynninger. Dessuten, vi anbefaler kalibrere luminometer lese innen lineær analysen før analysen.
Det er også fordeler til den koblede GTPase-immunosorbent-analysen som er verdt å nevne. GTPase-koblede immunosorbent analyser forbedre dagens eksperimentelle design og aktiverer teknologi for å forenkle eksperimenter som ikke var mulig med gamle rullegardinlistene teknikker22. GTPase-koblede immunosorbent analyser tilbyr gjenkjenning nøyaktighet og sensitivitet som tillater analyser av GTPase aktivitet i forberedelser tidligere off-limits rullegardinmenyen analyser23. Et par nyere studier sammenliknet GTPase knyttet immunosorbent aktivisering analyser med rullegardinlistene og konkluderte med at GTPase knyttet immunosorbent analysen har noen klare fordeler, nemlig som GTPase-koblede immunosorbent analyser overlegen grunn deres muligheten til å bruke små mengder av protein22,24, deres større følsomhet24og deres kvantitative mål23. GTPase-koblede immunosorbent analysen kit er tilgjengelig i enten luminometric eller kolorimetrisk oppdagelsen versjoner, der luminometric analyser er mer følsomme. Denne GTPase-koblede immunosorbent analysen er basert på en ganske enkel og rask protokoll, krever bare små mengder av prøven, og gir kvantitative og nøyaktige resultater. Derfor kan det være lurt å videreutvikle denne analysen for å oppdage andre typer GTPase-baserte proteiner i ulike linjer og vev kultur celler med en mye høyere spesifisitet og nøyaktighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Saeid Ghavami ble støttet av helse Science Centre opererer tilskudd, CHRIM grant og Manitoba nye etterforsker opererer forskningsstipend. Javad Alizadeh ble støttet av forskning Manitoba studentship. Shahla Shojaei ble støttet av en helse Science Foundation opererer grant og MITACS akselerere postdoktorstipend. Adel Rezaei Moghadam ble støttet av en NSERC opererer stipend som ble holdt av Joseph W. Gordon. Amir A. Zeki ble støttet av NIH/NHLBI K08 prisen (1K08HL114882-01A1). Marek J. Los ber anerkjenner støtte fra NCN gi #2016/21/B/NZ1/02812, støttet av LE STUDIUM Institute for Advanced Studies (region sentrum-Val de Loire, Frankrike) gjennom Smart Loire Valley generelt Program og delfinansiert av Marie Sklodowska-Curie handlinger, gi #665790. Simone da Silva Rosa ble støttet av UMGF studentship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM high Glucose | VWR (Canada) | VWRL0101-0500 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR (Canada) | CA45001-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR (Canada) | 97062-806 | |
| EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid) | VWR (Canada) | CA71007-118 | |
| EGTA (Ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) | VWR (Canada) | CAAAJ60767-AE | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | VWR (Canada) | CA97061-340 | |
| Ammonium Persulfate | VWR (Canada) | CABDH9214-500G | |
| Tris-Hydroxymethylaminomethane | VWR (Canada) | CA71009-186 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution | Biorad (Canada) | 1610158 | |
| TEMED | Biorad (Canada) | 1610801 | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma/Aldrich (Canada) | P8340-5ML | 1:75 dilution |
| Rho-GTPase Antibody Sampler Kit | Cell Signaling (Canada) | 9968 | 1:1000 dilution |
| Pan-Cadherin antibody | Cell Signaling (Canada) | 4068 | 1:1000 dilution |
| GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology (USA) | sc-69778 | 1:3000 dilution |
| RhoA G-LISA Activation Assay (Luminescence format) | Cytoskeleton Inc. (USA) | BK121 | Cytoskeleton I. G-LISA Activation Assays Technical Guide. 2016. |
| RhoA Antibody | Cell Signaling | 2117 | |
| ECL | Amersham-Pharmacia Biotech | RPN2209 | |
| Anti-Rabbit IgG (whole molecule) Peroxidase antibody | Sigma | A6154-1ML | |
| SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | 1612071A | Spectrophotometer |
| Nonidet P-40 | Sigma | 11332473001 | non-denaturing detergent, octylphenoxypolyethoxyethanol |
| DMSO | Sigma | D8418-50ML | |
| PBS | Sigma | P5493-1L | |
| Phophatase Inhibitor cocktail | Sigma | P5726-5ML | 1:75 Dilution |
References
- Yeganeh, B., et al. Targeting the mevalonate cascade as a new therapeutic approach in heart disease, cancer and pulmonary disease. Pharmacology & Therapeutics. 143 (1), 87-110 (2014).
- Valencia, A., Chardin, P., Wittinghofer, A., Sander, C. The ras protein family: evolutionary tree and role of conserved amino acids. Biochemistry. 30 (19), 4637-4648 (1991).
- Hall, A.
- Rojas, A. M., Fuentes, G., Rausell, A., Valencia, A. The Ras protein superfamily: evolutionary tree and role of conserved amino acids. The Journal of Cell Biology. 196 (2), 189-201 (2012).
- Cherfils, J., Zeghouf, M. Regulation of small GTPases by GEFs, GAPs, and GDIs. Physiological Reviews. 93 (1), 269-309 (2013).
- Shojaei, S., et al. Perillyl Alcohol (Monoterpene Alcohol), Limonene. Enzymes. 36, 7-32 (2014).
- Ghavami, S., et al. Airway mesenchymal cell death by mevalonate cascade inhibition: integration of autophagy, unfolded protein response and apoptosis focusing on Bcl2 family proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (7), 1259-1271 (2014).
- Alizadeh, J., et al. Mevalonate Cascade Inhibition by Simvastatin Induces the Intrinsic Apoptosis Pathway via Depletion of Isoprenoids in Tumor Cells. Scientific Reports. 7, 44841 (2017).
- Ghavami, S., et al. Mevalonate cascade regulation of airway mesenchymal cell autophagy and apoptosis: a dual role for p53. PLoS One. 6 (1), e16523 (2011).
- Tang, Y., Olufemi, L., Wang, M. T., Nie, D. Role of Rho GTPases in breast cancer. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 13, 759-776 (2008).
- DerMardirossian, C., Bokoch, G. M. GDIs: central regulatory molecules in Rho GTPase activation. Trends in Cell Biology. 15 (7), 356-363 (2005).
- Garcia-Mata, R., Boulter, E., Burridge, K. The 'invisible hand': regulation of RHO GTPases by RHOGDIs. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 493-504 (2011).
- Etienne-Manneville, S., Hall, A.
- Ghavami, S., et al. Geranylgeranyl transferase 1 modulates autophagy and apoptosis in human airway smooth muscle. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 302 (4), L420-L428 (2012).
- Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406 (6795), 532-535 (2000).
- Ghavami, S., et al. Statin-triggered cell death in primary human lung mesenchymal cells involves p53-PUMA and release of Smac and Omi but not cytochrome c. Biochimica et Biophysica Acta. 1803 (4), 452-467 (2010).
- Cordle, A., Koenigsknecht-Talboo, J., Wilkinson, B., Limpert, A., Landreth, G. Mechanisms of statin-mediated inhibition of small G-protein function. Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 34202-34209 (2005).
- Waiczies, S., Bendix, I., Zipp, F. Geranylgeranylation but not GTP-loading of Rho GTPases determines T cell function. Science Signaling. 1 (12), pt3 (2008).
- Waiczies, S., et al. Geranylgeranylation but not GTP loading determines rho migratory function in T cells. Journal of Immunology. 179 (9), 6024-6032 (2007).
- Satori, C. P., Kostal, V., Arriaga, E. A. Review on Recent Advances in the Analysis of Isolated Organelles. Analytica Chimica Acta. 753, 8-18 (2012).
- Berndt, N., Sebti, S. M. Measurement of protein farnesylation and geranylgeranylation in vitro, in cultured cells and in biopsies, and the effects of prenyl transferase inhibitors. Nature Protocols. 6 (11), 1775-1791 (2011).
- Keely, P. J., Conklin, M. W., Gehler, S., Ponik, S. M., Provenzano, P. P. Investigating integrin regulation and signaling events in three-dimensional systems. Methods in Enzymology. 426, 27-45 (2007).
- Oliver, A. W., et al. The HPV16 E6 binding protein Tip-1 interacts with ARHGEF16, which activates Cdc42. British Journal of Cancer. 104 (2), 324-331 (2011).
- Moniz, S., Matos, P., Jordan, P. WNK2 modulates MEK1 activity through the Rho GTPase pathway. Cellular Signalling. 20 (10), 1762-1768 (2008).
