Summary
여기 prenylation과 guanosine-5'-3 인산 염 (GTP)를 조사 하는 프로토콜 설명-Rho GTPase의 로드. 이 프로토콜 두 가지 상세 방법의 구성, 즉 막 분류 및 GTPase 연결 된 immunosorbent 분석 결과. Prenylation와 GTP를 측정 하기 위한 프로토콜을 사용할 수 있습니다 다른 작은 GTPases 다른 로드.
Abstract
Rho GTPase 가족 Ras superfamily 속하는 고 인 간에 있는 약 20 명의 회원을 포함 한다. Rho GTPases cytoskeletal 역학, 세포 운동 성, 세포 극성, axonal 지침, 기공을 밀매 및 세포 주기 통제를 포함 하 여 다양 한 세포 기능 조절에 중요 하다. Rho GTPase 신호에 변화는 암, 중추 신 경계 질환, 면역 시스템에 종속 질병 등 많은 병 적인 조건에서 필수적인 규제 역할을 재생합니다. (즉, mevalonate 통로 중간에 의해 prenylation)로 GTPases 그리고 GTP 바인딩 posttranslational 수정이이 단백질의 활성화에 영향을 미치는 중요 한 요소는. 이 문서에 두 가지 필수 및 간단한 방법 Rho GTPase의 광범위 한 범위 prenylation 및 GTP 바인딩 활동 감지 제공 됩니다. 사용 된 기술 절차의 세부 사항 설명 단계가이 원고에서.
Introduction
Rho GTPases 작은 단백질 (21-25 kDa), 진화를 통해 잘 보존 되 고 작은 GTPases의 Ras superfamily에 독특한 subfamily를 형성의 그룹입니다. 이 superfamily 내의 각 subfamily에 공유 G 도메인 코어 GTPase 활동 및 뉴클레오티드 교환1에 관련 된 있다. 로 가족과 다른 Ras 서브패밀리가 차이 5번째 β 물가 및 작은 GTPase 도메인2에 4번째 α 나선 내의 "로 삽입 도메인"의 존재 이다.
최근의 분류에 따라, Rho GTPases Ras GTPase superfamily3에 맞는 단백질 신호의 가족으로 간주 됩니다. 포유류로 GTPases 22 회원 그들의 특정 기능 및 일반적인 특성4 RhoA, Rac1, 및 Cdc42이이 그룹에서 가장 공부 회원 가운데는에 따라 있다. Rho GTPases 분자 스위치를 통해 단백질 posttranslational 수정5에 의존 하는 긴밀 하 게 규제 메커니즘 세포내 신호 통로 통해 에 연결 된다.
GTP 로드 및 가수분해 활성화/비활성화 주기의 작은 GTPases에는 필수적인 메커니즘 고 규제 통해 GTPase 활성화 단백질 (간격). 간격은 GTP 가수분해에 대 한 책임은 GTP-로드 반응에 대 한 책임은 구 아닌 뉴클레오티드 교환 요인 (조달)와 협력 하 여 작업 하 고. 로 GDP 분리 억제제 (GDIs) 추가 GDP 바인딩된 Rho GTPases 바인딩을 통해 작은 GTPases Rho의 제공합니다. 이 GDP 분리를 억제 하 고 작은 GTPases 활성 세포내 막 사이트에서의 격리를 용이 하 게. 또한 있다 더 뉴클레오티드 가수분해 및 교환 및 컨트롤 GDP 또는 GTP 사이클링1,6,,78GDIs의 prenylation를 포함 하는 Rho GTPase 단백질의 규칙.
GTP-로드 및 Rho GTPase prenylation는 이러한 단백질1,9닥터지 속성을 변경 하 여 cytosol와 세포 막 사이 Rho GTPase의 운동에 참여. 상기 레 귤 레이 터는 세포 막의 인지질과 GDP 또는 GTP 교류 활동10의 다른 변조 단백질 상호 작용. 또한, GDIs, 분리 억제제, GTP 가수분해와 GDP 또는 GTP exchange 모두 차단합니다. GDIs는 GDP에서 비활성 Rho 단백질의 분리 하 고, 따라서, 다운스트림 이펙터와의 상호 작용을 억제합니다. GDIs는 또한 cytosol 및 셀에서 막 사이 GTPases의 순환 조절. Rho GTPases의 활동; 세포 막에 그들의 움직임에 큰 정도에 따라 따라서, GDIs는 그들의 소수 성 지역/도메인11,12숨어 통해 세포질에서 GTPases 격리 수 있습니다 중요 한 레 귤 레이 터로 간주 됩니다.
Rho GTPase는 최적의 신호 및 기능 활성화 사이클의 모든 단계에 있는, GTP-로드/GTP 가수분해의 동적 주기 중요 하다. 이 과정에서 변경의 모든 종류 셀 함수 Rho GTPase, 세포 극성, 확산, morphogenesis, cytokinesis, 마이그레이션, 접착, 및 생존13,14등 규제에 변경 될 수 있습니다.
현재 프로토콜 제공 한다 독자 작은 RhoA GTPase 활성화를 통해 모니터링 하는 자세한 방법을 그들의 prenylation 및 GDP 또는 GTP 로드의 조사를. 이 메서드는 또한 prenylation 및 다양 한 작은 GTPases의 GTP 바인딩 감지 하 사용할 수 있습니다. GTPases Rac1, Rac2, Rac3, H, K, 또는 N-Ras, Arf, 고로15등의 다른 종류의 활성화의 수준을 측정 하는 GTPase 연결 된 immunosorbent 분석 결과 사용할 수 있습니다. 최근 작은 Rho GTPase prenylation 및 활동8,9,,1416의 규칙에서 포함 되기 위하여 보고 되었다 예를 들어, 약리 에이전트 simvastatin 사용 됩니다.
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Protocol
1. 멤브레인/Cytosol 분류를 사용 하 여 RhoA 지역화의 결정
-
세포 문화와 simvastatin 치료
- 셀 100 m m에서 접시와 Dulbecco의에 문화 U251의 50000 씨가 글의 중간 (DMEM) (높은 포도 당, 10% 태아 둔감 한 혈 청 [FBS]) 수정.
- 때 30% 합칠 매체를 제거 하 고 simvastatin 포함 된 매체 (디 메 틸 sulfoxide [DMSO]에 녹아 simvastatin의 10 µ M), 그것에 추가 하 여 셀을 취급 하 고 37 ° C8에서 36 h에 품 어. 혼자 DMSO를 사용 하 여 차량 통제로.
참고: 10 백만 셀은 셀의 cytosol 그리고 막 분별이 필요 하다.
-
셀의 컬렉션
- 37 ° C 배양 기에서 셀을 제거 합니다. confluency 확인을 현미경으로 세포를 봐.
참고: 셀 70%-80% 합칠 이어야 한다. - 매체를 발음, 셀 1을 씻고 차가운 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 x. Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 버퍼의 5 mL을 추가 (KCl: 400 mg/L, NaCl: 6800 mg/L, NaHCO3: 2200 mg/L, NaH2포4. H2소개할 140 mg/L, D-포도 당: 1000 mg, EDTA disodium: 373 mg/L) 플레이트와 셀 5 분 동안 37 ° C 배양 기에 다시 장소 당.
- 외피의 5 분 후 EDTA로 매체의 동일한 금액을 포함 하는 15 mL 튜브에 세포와 EDTA를 수집 합니다.
참고: 튜브에 매체를 데 EDTA를 중화 하 고 세포 막의 어떤 더 소화를 방지 합니다. - 얼음 상자에 튜브를 놓고는 원심 분리기를 진행 합니다.
- 1500 x g 4 ° C에서 원심 분리기를 설정 하 고 5 분 동안 세포를 스핀.
- 펠 릿을 방해 하지 않고는 상쾌한을 제거 하 고 차가운 PBS의 1 mL을 추가. 셀을 잘 섞는다.
- 새로운 1.5 mL 튜브, 4 ° C에서 1500 x g 에서 원심 분리기를 셀 혼합물 (솔루션)를 전송 및 5 분에 대 한 셀을 회전.
- (다음 단계에 대 한 버퍼의 볼륨 추정)에 대 한 펠 릿 크기를 확인 하십시오. 얼음에 샘플을 놓습니다. 펠 릿을 방해 하지 않고는 상쾌한을 완전히 삭제.
- (10 mM Tris HCl [pH 7.5], 0.1 mM EDTA, 0.1 m m EGTA, 1 m m dithiothreitol, 및 프로 테아 제 억제 물 칵테일), 혼합 샘플 잘 아래로, pipetting 차가운 버퍼를 추가 하 고, 진행 쥡니다.
- 37 ° C 배양 기에서 셀을 제거 합니다. confluency 확인을 현미경으로 세포를 봐.
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쥡니다
- 5 사이클, 5는 sonicator 설정 s 각, 그리고 반복 3 배.
- 얼음에는 쥡니다를 수행 합니다. ultracentrifuge로 이동 합니다.
참고: 얼음과 차가운 조건 단백질을 보존 하 고 더 신뢰할 수 있는 결과 만들.
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Ultracentrifugation
- 세포질로 셀 homogenates를 분리 하는 ultracentrifuge를 사용 하 여 막 분수. 4 ° c.에 35 분 100000 x g 에서 원심 분리기를 설정 그림 1에서 보듯이, 펠 릿 크기를 확인 합니다.
참고: 막 일부분은 튜브의 맨 아래에 하 고 나머지는 다른 세포질 구성 요소. - 펠 릿을 방해 하지 않도록 주의 하면서 완전히는 상쾌한을 수집 합니다. 상쾌한 cytosolic 분수입니다. 새로 분류 관에 상쾌한 장소입니다.
- 분리 버퍼 (버퍼 2 세)의 300 µ L 추가 (50 m Tris HCl [pH 7.5] m, 0.15 M NaCl, 1 m m dithiothreitol, 1 %SDS, 1 mM EDTA, 1mm EGTA, 및 프로 테아 제 억제 물 칵테일) (막 분수를 포함 한다) 하는 펠 릿을. 아래로 pipetting으로 잘 섞는다.
- 단백질 결정 및 서쪽 오 점 (immunoblot 분석) 샘플 준비를 진행 합니다.
- 세포질로 셀 homogenates를 분리 하는 ultracentrifuge를 사용 하 여 막 분수. 4 ° c.에 35 분 100000 x g 에서 원심 분리기를 설정 그림 1에서 보듯이, 펠 릿 크기를 확인 합니다.
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Immunoblotting
- 세포의 용 해 버퍼 (20 mM Tris HCl [pH 7.5] 0.5 m m 0.5% 비 이온 세제-40, 100 µ M β-글리세롤 3 인산 염, 그리고 0.5% 프로 테아 제 억제 물 칵테일 PMSF)에서 분리 된 분수에서 추출 세포 단백질 준비.
- Lowry 방법8 을 사용 하 여 단백질 농도 측정 하 고 세포의 용 해 버퍼 (20 mM Tris HCl [pH 7.5], 0.5 밀리미터 PMSF, 0.5 %nondenaturing 세제, octylphenoxypolyethoxyethanol, 100 µ M β-글리세롤 3 인산 염, 및 0.5%의 볼륨 계산 프로 테아 제 억제 물 칵테일) 샘플 사이 단백질의 농도 정상화.
- 5 분 동안 90 ° C에서 샘플을 열 고 단백질을 분리 하는 15 %SDS 페이지 젤에 샘플의 15-20 µ L을 로드 합니다.
참고: 각 샘플에 대 한 단백질의 1 µ g를 로드 합니다. 그에 따라 실행 해야 하는 볼륨을 계산 합니다. - 조건 (500 nM 글리신, 50 mM Tris HCl, 및 20% 메탄올) 실 온 (RT) 100 V에서 2 h, 감소에서 나일론 막 분리 단백질을 전송 합니다.
참고: 성공적인 단백질 전송 확인, Ponceau 얼룩 사용 하거나 멤브레인에 단백질 마커를 시각화 합니다. - 5% 탈지 말린 우유와 세제 (TBS/0.01% 비 세제;를 포함 하는 1 x Tris 버퍼 염 막 차단 TBST) 특이 항 체 바인딩 또는 RT 하룻밤에 4 ° C에서 1 시간에 대 한 차단에
- Immunoblotting 분석에 대 한 1 차 항 체를 추가 하 고 하룻밤 4 ° c.에 품 어
참고:이 실험에서 Rac1/2/3, cdc42, RhoA, GAPDH, 및 팬 Cadherin 사용 되었다 1에 1% 우유에 희석 1:1,000에 x TBST. 팬-Cadherin와 GAPDH 막 각각 cytosolic 분수 순도 확인에 사용 되었다. - 3 막 세척 세척 버퍼 1 x 20 분에 대 한 x TBST.
- 반대로 토끼 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)와 막 품 어-(RT에서 1 시간)에 대 한 각 기본 항 체에 대 한 활용 된 이차 항 체.
- 에 말을 씻어 20 분에 대 한 3 배 향상 된 화학 (ECL) 감지 그들을 개발 하 고.
2. 작은 G-단백질 활성화 분석 결과 사용 하 여 RhoA GTP 부하의 측정
- 수 10, 000 셀/mL와 문화 100 m m에서 U251 셀 접시.
- 1.1.2 단계에서 설명한 대로 30% 합칠 때, 셀 simvastatin 취급 합니다.
- 인큐베이터에서 배양 배지를 가져온다. Confluency 확인 하려면 현미경 세포를 봐. 셀 70%-80% 합칠 인지 확인 합니다. 얼음에 페 트리 접시를 놓고, 미디어, 발음 및 3 셀을 씻어 얼음 처럼 차가운 PBS (pH 7.2) x.
- PBS 발음 PBS의 모든 잔재를 제거 하는 추가 분에 대 한 얼음에 페 트리 접시를 기울기.
참고: 잔여 PBS는 부정적인이 분석 결과 적용 됩니다. - 셀 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제제를 포함 하는 얼음 세포의 용 해 버퍼의 700 µ L 볼륨에 lyse
참고: 700 µ L는 일반적으로 충분히 100 mm 페 트리 접시에 대 한. 표 1 각 문화 선박에 대 한 적절 한 볼륨을 찾을 수를 참조 하십시오. - 셀 스 크레이 퍼와 세포 lysate를 수확. 이 기술에 대 한 문화 접시 경사.
- 레이블이 지정 된 얼음 cryotube는 lysate 전송 하 고 얼음에 그것을 유지.
- 소용돌이 사용 하 여 철저 하 게 혼합. 단백질 분석 결과, 샘플에서 단백질 농도 측정에 대 한 lysate의 10 µ L을 유지.
- 스냅-동결 나머지 세포 lysate 액체 질소.
참고: 셀 스냅-동결 그들을 피하기 위해 RhoA GTPase의 활동의 손실에 지도할 수 있는 반복 된 냉동/해 동 주기 전에 lysate의 여러 aliquots를 준비 합니다. - 스냅-냉동 cryotubes-80 ° C 냉장고를 전송 고 GTPase 연결 된 immunosorbent 분석 결과 대 한 샘플을 저장 합니다.
참고: 팬 들은 14 일 이상에 대 한 샘플의 정보를 저장 하지 마십시오. 신속 하 게 작업 하 고 10 분 이상 얼음 샘플을 떠나지 않을. 결코 동시에 모든 접시를 처리 합니다. - Lowry 방법8 을 사용 하 여 단백질 농도 측정 하 고 계산 샘플 사이 단백질의 농도 정상화 하는 세포의 용 해 버퍼의 볼륨.
참고: 최고의 농도 보통 1 mg/mL; 그러나, 0.3-2 mg/mL 수 있습니다 감지. - microtube에 세포의 용 해 버퍼의 60 µ L 및 바인딩 버퍼의 60 µ L을 추가 하 여 빈 컨트롤을 준비 합니다.
참고: 빈 제어 항 원 제외 하 고 모든 시 약은 고 배경 빼기 위해 사용 된다. - 12 µ L로 제어 단백질의 세포의 용 해 버퍼의 48 µ L, 바인딩 버퍼의 60 µ L을 추가 하 여 긍정적인 통제를 준비 합니다.
참고: 긍정적인 통제는 모든 시 약 플러스로-A-GTP에 대 한 확인 된 항 원. - 그 가방로 선호도 접시 하 고 얼음에 그것을 배치.
- 얼음 처럼 차가운 증류수의 100 µ L 우물에 분말을 디졸브. 얼음에 플레이트를 유지.
- 25 ° c.로 설정 물 욕조에 스냅 냉동 세포 lysates 녹여
- 계산 된 양의 단백질 농도 정상화에 각 샘플 (2.11 단계)에서 얼음 세포의 용 해 버퍼를 추가 합니다.
참고: 세포의 용 해 버퍼의 구성에 변화를 초래 하지 않도록을 (를 사용 하 여 진공 튜브 흡 인기) 셀을 세척 후 PBS를 제거 합니다. 샘플 단백질 0.8 사이의 GTPase 활성화 분석 실험에서 샘플 간의 정확한 비교를 위해 2 mg/mL 농도를 맞춰야합니다 표 2 는이 분석 결과에 사용할 버퍼에 대 한 정보를 제공 합니다. - 정규화 된 얼음 샘플의 60 µ L microtubes에 전송 하 고 바인딩 버퍼; 60 µ L을 추가 샘플을 철저 하 게 혼합 하 고 얼음에 그들을 유지.
- 완전히 물/솔루션에서에서 제거는 미 판 활발 한 터치 하 여 실험실 매트에 5 ~ 7 하드 도청 뒤.
- 중복에 우물을 정규화 된 샘플, 빈 제어, 그리고 긍정적인 통제의 50 µ L를 추가 합니다.
- 300 rpm에서 4 ° C에서 30 분 동안 궤도 통에 접시를 놓습니다.
참고: 떨고 단계는 매우 중요 하다, 그리고 300 rpm에서 궤도 격판덮개 셰이 커를 사용 하는 것이 좋습니다. - 터치 하 여 접시에서 샘플을 취소 하 고 그들을 세척 2 x 200 µ L에서 실시간 적극적으로 버퍼를 세척 세척 버퍼 우물에서 각 세척 후 flicking, 두 드려서, 다음을 실시간에 벤치에 접시를 유지
- 각 우물에 RT 항 원 제시 버퍼의 200 µ L을 추가 하 고 2 분에 대 한 RT에서 품 어.
- 우물에서 솔루션으로 터치 하 고 씻어 우물 3 실시간에 버퍼를 세척의 200 µ L x
- 각 우물에 갓된 1/250 안티-RhoA 1 차적인 항 체의 50 µ L를 추가 합니다.
- 300 rpm 설정 25 ° c에서 45 분 동안 궤도 통에 접시를 놓으십시오 우물에서 솔루션을 터치 합니다.
- 세척 단계 2를 반복 (단계 2.24) x.
- 각 우물에 갓된 1/250 안티 RhoA 이차 항 체의 50 µ L를 추가 합니다.
- 25 ° c.로 설정 하는 300 rpm에서 45 분 동안 궤도 통 위에 접시를 놓습니다
- HRP의 검출 시 약 시 약 A와 B. 시 약의 동일한 볼륨을 혼합 하 여 준비
- 각 우물에서 솔루션으로 터치 한 우물 3 세척 실시간에 버퍼를 세척의 200 µ L x
- 각 우물에 갓된 HRP 검출 시 약의 50 µ L를 추가 합니다.
- 최대 신호를 적절 한 소프트웨어 패키지를 사용 하 여 결과 분석 하는 3-5 분 이내 발광 신호를 읽어.
참고: 읽기 해야 합니다 이동 3-5 분 이내 최대 신호를 얻을. "테스트 플레이트" 실행 적절 한 세포를 확인 하기 위해 버퍼 볼륨 사용 되 고 세포 lysates 단백질 농도 충분히 높은 RhoA GTPase 활동 감지. (테스트 플레이트 단백질 농도 허용 범위 내에서 떨어지는 경우 확인 하 고 적절 한 세포의 용 해 버퍼 사용 중인 볼륨 인지 확인 하는 데 사용 하는 셀의 접시가입니다.) 긍정적인 통제 읽어야 한다 4-에 10 배 빈 우물 보다 높은 선형 범위 내에 있는 경우. 그렇지 않은 경우에 루미 노 제조 업체를 컨설팅 하 여 조정 합니다. 표 3에 루미 노에 대 한 설정은 제공 됩니다. - 고 열 어디 제목을 읽고 샘플, 의미, 표준 편차, rep1, rep2, rep3, rep4, 각 샘플에 수행 되는 복제의 수를 표시 하는 원시 데이터를 입력 합니다.
- 의미, 입력 수식 =average(Xn:Yn) 어디 X rep1, Y에 대 한 열 지정자 = = rep4, 및 n 열 지정자에 근무 중인 행의 행 번호를 =.
- 표준 편차 stdev (Xn:Yn) = 수식 입력 여기서 X rep1, Y에 대 한 열 지정자 = = rep4, 및 n 열 지정자에 근무 중인 행의 행 번호를 =.
- Rep1, rep2, 등 으로 복제 데이터를 입력
- 데이터를 입력 한 후 샘플, 의미, 및 표준 편차를 선택할 클릭 및 드래그 메서드를 사용 합니다.
- 그런 다음 데이터 분석 소프트웨어에서 차트 만들기는 내부 미니 바 차트와 광장 처럼 보이는 대 한 함수를 선택 합니다.
참고:이 차트 만드는 과정은 디자인 차트 입력 한 데이터에 따라 불가능 한다. - 세로 막대형 차트 를 선택 하 고, 입력된 값에 대 한 의미 번호 지정.
참고: 의미 숫자에 대 한 차트를 만든 처음, 그리고 y 축 오차 막대에 대 한 표준 편차 열 지정 다음. 이렇게 하려면 그래프 막대를 두 번 클릭 하 고, y 축 오류 탭을 선택 하 고, 사용자 지정 옵션을 클릭 한 표준 편차 데이터의 위치를 입력 하려면 워크시트에서 영역을 선택. 원하는 차트의 창조 후에 비교 하는 데 필요한 그룹 사이의 차이 볼 수 있습니다.
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Representative Results
막의 분류:
Ultracentrifugation 막과 cytosol 부품의 분류를 위해 사용 되었다. 그림 1에서 보듯이 상쾌한 cytosolic 분수를 포함 하 고 펠 릿 포함 막 분수. U251 세포에서 얻은 cytosolic andmembrane 분수에 RhoA의 풍부한 simvastatin immunoblotting를 사용 하 여 함께 치료 후 시험 되었다. 순 결 하 고 막 그리고 cytosol 분수의 제어 로드 팬 Cadherin GAPDH에 의해 각각 확인 되었다. 그림 2에서처럼 simvastatin 치료 그것의 cytosolic 콘텐츠 증가 하면서 막 도약 RhoA GTPase의 양을 감소. 이것은 RhoA prenylation의 억제에 따라 GTPases의 전 좌에 스타 틴의 알려진된 효과와 일치입니다. Simvastatin 억제 RhoA GTPase, prenylation 그리고 따라서, unprenylated RhoA는 수 없습니다 셀 플라즈마 막에서 앵커의 높은 cytosolic 농도 귀착되는.
RhoA-GTP 바인딩:
우리 GTP 바인딩된 RhoA 단백질 GTPase 연결 된 immunosorbent 분석 결과 사용 하 여 측정 하 고 그 simvastatin을 크게 나타났다 (P < 0.05) GTP 바인딩된 RhoA U251 셀 (그림 3)에 증가. 따라서, simvastatin 저해 RhoA GTPase 단백질 prenylation (그림 2), 하는 동안 컨트롤 셀에 비해 로드의 GTP도 증가. 이것 prenylation와 GTP 모두 바인딩 활동 및 RhoA GTPase의 규정에의 역할을 할 수 있다는 사실에 가르킨다. 이 현상에 대 한 자세한 내용은8이 프로토콜 사용 하 여 원래 게시를 참조 하십시오.
그림 1 : Ultracentrifugation 후 cytosolic와 막 분수의 회로도 보기. 펠 릿 막 분수를 포함 하 고는 상쾌한 cytosolic 분수를 포함 되어 있습니다.
그림 2 : Simvastatin 변경 RhoA의 지역화. U251 셀 simvastatin으로 치료 되었다 (10 µ M; 12, 24, 그리고 36 h)와 막 cytosolic 분수에 RhoA의 풍부한 immunoblotting에 의해 결정 되었다. GAPDH 및 팬 Cadherin 풍부 로드 cytosolic와 막 분수에 고 막 분수에서 cytosolic 오염의 부족 확인에 대 한 제어를 평가 했다. 데이터는 일반적으로 다른 기본 문화권을 사용 하 여 3 개의 독립적인 실험에서. 이 그림 Alizadeh 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 8. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : Simvastatin RhoA GTPase 활동을 조절 한다. GTPase 연결 된 immunosorbent 분석 결과 U251 셀에 GTP 바인딩된 Rho 단백질을 측정 하기 위해 사용 되었다. 다른 조건 기아와 simvastatin (10 µ M)를 포함 하 여 36 h에 대 한 테스트 되었습니다. 각 실험에 대 한 키트에 제공 된 constitutively 활성 RhoA 단백질 긍정적인 제어로 사용 되었다. 결과 독립적인 실험에서 두 개의 복제의 평균 ± SD로 표현 된다 (* P < 0.001). 이 그림 Alizadeh 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 8.
| 세포 배양 용기 | 면적 (cm2) | 세포의 용 해 버퍼 (µ l) | |
| 요리 | 35 m m | 9 | 100 |
| 60 mm | 21 | 300 | |
| 100 m m | 55 | 700 | |
| 150 mm | 145 | 1500 | |
| 플레이트 | 6 잘 | 9.4/잘 | 100 |
| 12-잘 | 3.8/잘 | 70 | |
| 24-잘 | 1.9/잘 | 40 | |
| 플라스 크 | T-25 | 25 | 250 |
| T-75 | 75 | 1000 | |
| T-150 | 150 | 1500 | |
표 1: U251 세포 세포의 용 해 버퍼의 볼륨 권장. 볼륨은 다른 세포 유형 대 한 조정.
| 세포의 용 해 버퍼 이름 | 세포의 용 해 버퍼 구성 | 작은 G-단백질 대상 | 노트 |
| GL35 | 트리 스 (1 X GL36), MgCl2 (8 X GL36), NaCl (2 X GL36), IGEPAL (1 X GL36), SDS (5 X GL36) | Cdc42 | GL36에 동일한 구성 요소, 구성 변화 다음과 같습니다. |
| GL36 | 트리 스 pH 7.5, MgCl2, NaCl, IGEPAL 및 SDS의 독자적인 배합 | RalA | 표준 버퍼, 호환 가장 GTPase 연결 된 immunosorbent 분석 실험. |
| GL36 | 트리 스 pH 7.5, MgCl2, NaCl, IGEPAL 및 SDS의 독자적인 배합 | Rac1 | 표준 버퍼, 호환 가장 GTPase 연결 된 immunosorbent 분석 실험. |
| GL36 | 트리 스 pH 7.5, MgCl2, NaCl, IGEPAL 및 SDS의 독자적인 배합 | Rac1, 2, 3 | 표준 버퍼, 호환 가장 GTPase 연결 된 immunosorbent 분석 실험. |
| GL36 | 트리 스 pH 7.5, MgCl2, NaCl, IGEPAL 및 SDS의 독자적인 배합 | Ras | 표준 버퍼, 호환 가장 GTPase 연결 된 immunosorbent 분석 실험. |
| GL36 | 트리 스 pH 7.5, MgCl2, NaCl, IGEPAL 및 SDS의 독자적인 배합 | RhoA | 표준 버퍼, 호환 가장 GTPase 연결 된 immunosorbent 분석 실험. |
| GL36 | 트리 스 pH 7.5, MgCl2의 독점 배합 | Arf1 | 표준 버퍼, 호환 가장 GTPase 연결 된 immunosorbent 분석 실험. |
표 2: GTPase의 목록에 연결 된 immunosorbent 분석 결과 세포의 용 해 버퍼와 작은 GTPases에 대 한 세포 구성 권장.
| 매개 변수 | 노트 | ||
| 이득 | 이득 옵션 기계 감도 조정합니다. 대부분 luminometers 자동 보정 또는 제한 된 보정 기능을 사용합니다. 사용자는 읽기는 다른 악기에 따라 선형 범위 내에서 사용 하는 경우 보려면 낮은, 중간 및 높은 이득을 읽어야 한다. | ||
| 통합 시간 | 그것은 선형 범위 읽을 수도 시간 매우 높은 최저에서이 옵션을가지고 것이 좋습니다. 이 처럼 낮은 희석 또는 차 및 2 차 항 체를 사용 하 여 불필요 한 작업을 필요할 수 있습니다. 통합 시간 또한 다른 악기에 따라 다릅니다. | ||
| 떨고 | 5를 사용 하는 것이 좋습니다 궤도 동요. 그것은 분석 결과의 정확성에 대 한 다른 매개 변수 만큼 중요입니다. | ||
| 온도 | 실내 온도 것이 좋습니다. | ||
| 격판덮개 유형 | 사용 하는 플레이트에 따라 사용 합니다. 보통 접시 96-글쎄, 평평 하 고 흰색 이다. | ||
| 필터 | 여기 또는 필터 발광에 대 한 필요 하지 않습니다. 여기 원하는 값에 설정할 수 있습니다 그리고 방출에 대 한 최적의 범위는 430-445 nm. 필터의 공간을 비워 둡니다. 이 옵션을 하지 않으면 | ||
표 3: 루미 노 설정에 대 한 자세한 설명.
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Discussion
여기는 작은 GTPase prenylation 및 작은 GTPase subcellular 지 방화 (cytosol 대 막)와 로드로 GTP로 표시 하는 GTP 바인딩 측정 하는 정확한 방법에 설명 합니다. 작은 GTPases 진 핵 세포에 표현 되 고 세포질 확산, 운동 성, 및 구조에서 필수적인 역할. Prenylation와 GTP 바인딩 GTPase 활동의 규칙에 관련 된 따라서, prenylation 및이 단백질의 GTP 바인딩 분석 실험 세포 생물학1,8에 대 한 중요 한 도구입니다.
최근 연구의 결과에 따라, Rho 단백질 GTP 로드 셀 유형 특정8, 이며 따라서 다른 세포 유형 마다 다릅니다. 또한, subcellular 지 방화 및 Rho 단백질의 geranylgeranylation (GGT) 그들의 기능의 규제에서 결정 단계입니다. 이것은 또한 더 주요 GTPases에 대 한 GEF, 간격, 및 GDI effector 단백질의 상호 작용에 의해 통제 된다.
THP 1 monocytes에 Rac GTP 로드를 증가, 아 밀 로이드 β 자극의 Rac의 prenylation를 감소 하 고 이러한 셀17에서 선 동적인 응답을 감소 Simvastatin 알려져 있다. 우리는 또한 T-세포 기능 로드로 GTP에 의해 영향을 받지 않습니다 하지만 오히려, Rho의 GGT 기능18,19결정 알아요. 따라서, Rho GTPase 활동을 탐지 하기 위해 prenylation와 GTP 로드 합니다 동시에 측정 셀에 하는 것이 좋습니다.
메모, 순도 cytosolic 및 막 분수의 프로토콜의 가장 중요 한 단계 하는 쥡니다는 ultracentrifugation. 로 GTP-바인딩 분석 결과 대 한 가장 중요 한 단계는 스냅-동결 세포 lysates 순차적 처리 하기 전에. 이 중요 한 단계 생활 시스템에서 GTPases의 연구에서 일관 되 고 재현 가능한 결과 생산할 예정 이다.
특정 세포내 구조 또는 막 단백질을 검사 하는 주요 단계 다른 세포질 구획의 분리 이다. 분별은 같은 크기와 모양, 표면 충전 밀도 및 부 력 밀도20각 세포질 구획의 속성을 활용 합니다. 그것은 주로 미디어에 4 ° c.에 고 점도의 차동 원심에 기반 여기 사용 된 막 분류 방법을 주로 기반 각 구획의 크기에 높은 중력 속도 곳에, ultracentrifugation, 후 튜브의 하단에가 서 막 단백질 그리고 cytosolic 단백질에 남아 있는 상쾌한입니다.
그것은 중요 한 유의 하 포함 하 고 단백질 농도 샘플링 하 고, 가능 하 게, 간격의 높은 수준의 잠재적 대상 GTPase를 비활성화. 이 문제는 세포의 용 해 버퍼에도 발생할 수 있으며 틀린 부정적인 결과 이어질 수 있습니다. GTPase 활동 분석 결과의 재현성 및 성공을 결정 하는 주요 매개 변수 중 하나는 건강 및 실험8에서 사용 되 고 세포의 응답 이다. 조사 GTPase 활성화/억제를 결정 하는 연구에서 셀에 대 한 두 배로 시간과 최적/적절 한 성장 조건 확인 것이 좋습니다. 또한, 모든 작은 GTPases GTPase 활동 긴밀 하 게 규제 되며, 따라서, GTP 분자의 가수분해를 통해 취약 급속 한 감소를 통해 효소에 바인딩된 작업 간격의 (동안 셀 세포 절차 후 ). 이 작업의 GTPase의 빠른 비활성화에 발생합니다. 따라서, 세포 세포는 급속 하 게 정확 하 고 재현 가능한 결과 달성 하기 위해 4 ° C에서 수행 하는 것이 좋습니다.
최종 세포 lysate를 결정 하는 실험 조건에 따라 여러 가지 요인이 있다. 첫째, 세포 선 또는 특정 조직에서 RhoA GTPase의 총 금액: 생 RhoA GTPase의 크기는 변수를 다른 종류의 세포와 조직; 따라서,이 활성기 또는 deactivator에 대 한 더 활발 한 응답 될 수 있습니다. 둘째, 활성화/비활성화 실험 조건 하에서 달성의 금액: 약 2% ~ 10%의 총 세포 작은 GTPase 활성화8특정 자극 대 한 응답에서 가능 하 게 고려 하는 것이 중요 하다. 비활성화의 금액 또한 전적으로 자극의 종류에 따라 그리고 다른 세포와 조직에 변수. 따라서, 각 유형의 작은 Rho GTPase 활동 분석 결과 대 한 세포의 용 해 버퍼 및 세포질 구획의 조성은 중요 합니다. 표 3 에 각 특정 작은 GTPase 단백질에 대 한 세포의 용 해 버퍼의 권장된 구성을 보여 줍니다.
정규화 된 세포 lysate 단백질 농도의 다른 샘플 GTPase 활동을 비교 하는 조사를 수 있기 때문에 주요 요구 사항입니다. 따라서 세척 차가운 PBS 가진 모든 조건에서 모든 샘플에서 세포 조직 배양에서 단백질을 제거 필수입니다. 또한 모든 시 약 및 버퍼 실험의 모든 단계에서 찬 온도 (4 ℃)에서 사용 되는 필수적 이다. 이 차가운 온도 GTPases, Rho GTPase 샘플 준비 하는 동안 등의 가수분해를 최소화 합니다. 그것은 중요 한 세포 lysates의이 처리는 RhoA GTPase 활동의 손실을 피하기 위하여 급속 하 게 (총에서 10-15 분)에 실시. 또한, 세포 lysate 준비의 가장 중요 한 단계는 스냅-동결 aliquots는 lysate의 RhoA 작은 GTPase 효소 활동을 유지 하기 위해 액체 질소에 것입니다. 이것은 다른 timepoints 또는 실험에 여러 샘플 하는 경우에 특히 중요 하다입니다. 스냅-냉동 lysates의 준비 후 그들의 Rho GTPase 활동을 잃지 않고 샘플-80 ° C에 보관 수 있습니다.
RhoA GTPase의 막 정박의 분석에 대 한 제공 된 프로토콜 작은 GTPases의 prenylation를 측정 하는 간접 도구만 나타내고는 직접 감지 하거나 계량 대상 단백질에 isoprenoid 잔류물의 바인딩 수 없습니다. 이이 분석 결과의 아주 몇 가지 제한 사항 중 하나입니다. 따라서, 그것은 단백질의 prenylation의 추정을 제공합니다. 어떤 접근을 직접 측정할 수 피트 (farnesylation) 및 GGT farnesyl 전이 효소 및 geranylgeranyl 전이 효소에 의해 각각, 배양된 세포와 동물과 인간에서 파생 된 종양에 정의 되었습니다. 분석 사용 하 여 전기 이동 기동성 교대, [3h] farnesyl diphosphate와 [3h] geranylgeranyl diphosphate, 라벨, immunoprecipitation 및 SDS 페이지21[3h] mevalonic 산.
우리는 RhoA GTPase 연결 된 immunosorbent 분석 결과 막 정박와 RhoA GTPase의 활동 검색 사용. Rho-GTP 묶는 단백질 96 잘 접시의 우물에 연결 된 그것에 의하여 이루어져 있다. 그래서, 셀 또는 조직 lysates의 GTP 바인딩된 활성화로 우물, GDP 바인딩된 비활성로 세척 단계 동안 씻는 동안 바인딩합니다. 그런 다음, 우물에 바인딩된, 활성 RhoA RhoA 특정 항 체와 화학을 사용 하 여 검색 됩니다. Nonactivated를 활성화 된 세포 lysates에서 신호를 비교 하 여 RhoA 활성화의 정도 확인 가능 하다. 혈 청 기아 (배양된 세포에 혈 청 자유로운 매체의 사용) 일반적으로 조직 문화에 RhoA을 비활성화 하는 데 사용 됩니다. 그것은 또한 활성화의 GTPase 연결 된 immunosorbent 분석 실험의 범위에서는 단백질의 10-50 µ g 사용 하 여 RhoA GTPase 활동의 탐지에 대 한 언급 되어야 합니다.
치료 샘플 낮은 기저 세포 수준의 GTPase 활동 (컨트롤 상태)는 것이 좋습니다. 예를 들어, 적절 한 셀 기아 수 downregulate GTPase 활동 조건 하 고 이상적인 조건을 실험 조건 하에서 그들의 활성화를 보여을 제공 합니다. 또한, 활성화 그리고 금지 분석 실험에 최고의 GTPase 활성화/억제 반응의 얻을 시간 및 복용량 응답으로 수행 됩니다. 더 중요 한 것은, 세포 준비 하는 동안 그것은 매우 overconfluent 되지 않은 셀을 사용 하는 것이 중요 (> 70%), 활성화/억제 자극을 세포의 어떤 nonresponsiveness을 피하기 위해.
Luminometers 및 절대 수치가 크게 다릅니다. 따라서, 그것은 선형 범위에 결정 하기 위하여 빈와 긍정적인 통제 GTPase 연결 된 immunosorbent 분석 실험을 실행 것이 좋습니다. 분석 결과 선형 범위 (긍정적인 통제는 4 배속-10 배 버퍼 전용 읽기 보다 더 높은 되어야 함) 또는 빈 읽기는 9-10 백만, 보다 높은 경우 추가 항 체 희석을 사용 하는 것이 좋습니다. 또한, 분석 결과 시작 하기 전에 분석 결과의 선형 범위 내에서 읽을 루미 노 보정 것이 좋습니다.
언급할 가치가 있는 GTPase 연결 된 immunosorbent 분석 결과 장점이 있습니다. GTPase 연결 된 immunosorbent 분석 실험 현재 실험 설계를 개선 하 고 오래 된 풀-다운 기법22불가능 했던 실험을 용이 하 게 하는 기술을 사용. GTPase 연결 된 immunosorbent 분석 실험은 또한 탐지 정확도 감도 준비에서 풀 다운 분석23이전 금지 GTPase 활동의 분석을 허용 하는 제공 합니다. 최근 연구의 몇 GTPase 연결 된 immunosorbent 풀 다운으로 활성화 분석 비교 하 고 결론을 GTPase 연결 된 immunosorbent 분석 결과 몇 가지 명확한 이점이 있다, 즉 GTPase 연결 된 immunosorbent 분석 실험으로 인해 우수한는 그들의 적은 양의 단백질22,24, 그들의 큰 감도24, 그리고 그들의 양적 측정23을 사용 하는 능력. GTPase 연결 된 immunosorbent 분석 실험 키트는 luminometric 또는 색도계 탐지 버전, 어디 luminometric 분석 실험 더 민감합니다. 이 GTPase 연결 된 immunosorbent 분석 결과 오히려 간단 하 고 빠른 프로토콜 기반, 적은 양의 샘플, 요구 하 고 양적 및 정확한 결과. 따라서, 추가 개발이 분석 결과 훨씬 더 높은 특이성 및 정확도 가진 다른 세포 및 조직 배양 세포에서 GTPase 기반 단백질의 다른 종류를 감지 하는 것이 좋습니다 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
Saeid Ghavami 건강 과학 센터 운영 부여, 부여와 연구 매니토바 새로운 탐정 운영 보조금 운영 하는 CHRIM에 의해 지원 되었다. 자바드 Alizadeh 연구 매니토바 재학에 의해 지원 되었다. Shahla Shojaei MITACS 가속 박사 친목 건강 과학 재단 운영 보조금 지원 했다. 아 델이 Moghadam 조셉 W. 고 든에 의해 개최 되었다 그랜트를 운영 하는 NSERC에 의해 지원 되었다. 아미르 A. Zeki NIH/NHLBI K08 수상 (1K08HL114882-01A1)에 의해 지원 되었다. 마렉 J. 로스 친절 하 게 인정에서 지원 NCN #2016/21/B/NZ1/02812, 고급 연구 (지역 센터-발 드 루아르, 프랑스)의 스마트 루아르 밸리 일반 프로그램을 통해 르 STUDIUM 연구소에서 지원 하 고 공동 투자는 마리에 의해 퀴리 Sklodowska 작업 # 665790를 부여 합니다. 시몬 다 실바로 사 UMGF 재학에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM high Glucose | VWR (Canada) | VWRL0101-0500 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR (Canada) | CA45001-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR (Canada) | 97062-806 | |
| EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid) | VWR (Canada) | CA71007-118 | |
| EGTA (Ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) | VWR (Canada) | CAAAJ60767-AE | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | VWR (Canada) | CA97061-340 | |
| Ammonium Persulfate | VWR (Canada) | CABDH9214-500G | |
| Tris-Hydroxymethylaminomethane | VWR (Canada) | CA71009-186 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution | Biorad (Canada) | 1610158 | |
| TEMED | Biorad (Canada) | 1610801 | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma/Aldrich (Canada) | P8340-5ML | 1:75 dilution |
| Rho-GTPase Antibody Sampler Kit | Cell Signaling (Canada) | 9968 | 1:1000 dilution |
| Pan-Cadherin antibody | Cell Signaling (Canada) | 4068 | 1:1000 dilution |
| GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology (USA) | sc-69778 | 1:3000 dilution |
| RhoA G-LISA Activation Assay (Luminescence format) | Cytoskeleton Inc. (USA) | BK121 | Cytoskeleton I. G-LISA Activation Assays Technical Guide. 2016. |
| RhoA Antibody | Cell Signaling | 2117 | |
| ECL | Amersham-Pharmacia Biotech | RPN2209 | |
| Anti-Rabbit IgG (whole molecule) Peroxidase antibody | Sigma | A6154-1ML | |
| SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | 1612071A | Spectrophotometer |
| Nonidet P-40 | Sigma | 11332473001 | non-denaturing detergent, octylphenoxypolyethoxyethanol |
| DMSO | Sigma | D8418-50ML | |
| PBS | Sigma | P5493-1L | |
| Phophatase Inhibitor cocktail | Sigma | P5726-5ML | 1:75 Dilution |
References
- Yeganeh, B., et al. Targeting the mevalonate cascade as a new therapeutic approach in heart disease, cancer and pulmonary disease. Pharmacology & Therapeutics. 143 (1), 87-110 (2014).
- Valencia, A., Chardin, P., Wittinghofer, A., Sander, C. The ras protein family: evolutionary tree and role of conserved amino acids. Biochemistry. 30 (19), 4637-4648 (1991).
- Hall, A.
- Rojas, A. M., Fuentes, G., Rausell, A., Valencia, A. The Ras protein superfamily: evolutionary tree and role of conserved amino acids. The Journal of Cell Biology. 196 (2), 189-201 (2012).
- Cherfils, J., Zeghouf, M. Regulation of small GTPases by GEFs, GAPs, and GDIs. Physiological Reviews. 93 (1), 269-309 (2013).
- Shojaei, S., et al. Perillyl Alcohol (Monoterpene Alcohol), Limonene. Enzymes. 36, 7-32 (2014).
- Ghavami, S., et al. Airway mesenchymal cell death by mevalonate cascade inhibition: integration of autophagy, unfolded protein response and apoptosis focusing on Bcl2 family proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (7), 1259-1271 (2014).
- Alizadeh, J., et al. Mevalonate Cascade Inhibition by Simvastatin Induces the Intrinsic Apoptosis Pathway via Depletion of Isoprenoids in Tumor Cells. Scientific Reports. 7, 44841 (2017).
- Ghavami, S., et al. Mevalonate cascade regulation of airway mesenchymal cell autophagy and apoptosis: a dual role for p53. PLoS One. 6 (1), e16523 (2011).
- Tang, Y., Olufemi, L., Wang, M. T., Nie, D. Role of Rho GTPases in breast cancer. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 13, 759-776 (2008).
- DerMardirossian, C., Bokoch, G. M. GDIs: central regulatory molecules in Rho GTPase activation. Trends in Cell Biology. 15 (7), 356-363 (2005).
- Garcia-Mata, R., Boulter, E., Burridge, K. The 'invisible hand': regulation of RHO GTPases by RHOGDIs. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 493-504 (2011).
- Etienne-Manneville, S., Hall, A.
- Ghavami, S., et al. Geranylgeranyl transferase 1 modulates autophagy and apoptosis in human airway smooth muscle. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 302 (4), L420-L428 (2012).
- Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406 (6795), 532-535 (2000).
- Ghavami, S., et al. Statin-triggered cell death in primary human lung mesenchymal cells involves p53-PUMA and release of Smac and Omi but not cytochrome c. Biochimica et Biophysica Acta. 1803 (4), 452-467 (2010).
- Cordle, A., Koenigsknecht-Talboo, J., Wilkinson, B., Limpert, A., Landreth, G. Mechanisms of statin-mediated inhibition of small G-protein function. Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 34202-34209 (2005).
- Waiczies, S., Bendix, I., Zipp, F. Geranylgeranylation but not GTP-loading of Rho GTPases determines T cell function. Science Signaling. 1 (12), pt3 (2008).
- Waiczies, S., et al. Geranylgeranylation but not GTP loading determines rho migratory function in T cells. Journal of Immunology. 179 (9), 6024-6032 (2007).
- Satori, C. P., Kostal, V., Arriaga, E. A. Review on Recent Advances in the Analysis of Isolated Organelles. Analytica Chimica Acta. 753, 8-18 (2012).
- Berndt, N., Sebti, S. M. Measurement of protein farnesylation and geranylgeranylation in vitro, in cultured cells and in biopsies, and the effects of prenyl transferase inhibitors. Nature Protocols. 6 (11), 1775-1791 (2011).
- Keely, P. J., Conklin, M. W., Gehler, S., Ponik, S. M., Provenzano, P. P. Investigating integrin regulation and signaling events in three-dimensional systems. Methods in Enzymology. 426, 27-45 (2007).
- Oliver, A. W., et al. The HPV16 E6 binding protein Tip-1 interacts with ARHGEF16, which activates Cdc42. British Journal of Cancer. 104 (2), 324-331 (2011).
- Moniz, S., Matos, P., Jordan, P. WNK2 modulates MEK1 activity through the Rho GTPase pathway. Cellular Signalling. 20 (10), 1762-1768 (2008).
