Rilevazione di piccolo GTPase prenilazione e GTP Binding mediante frazionamento di membrana e GTPase-collegata dell'immunosorbente

Javad Alizadeh; Shahla Shojaei; Simone da Silva Rosa; Adel Rezaei Moghadam; Amir A. Zeki; Mohammad Hashemi; Marek J. Los; Joseph W. Gordon; Saeid Ghavami

doi:10.3791/57646

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Articolo metodologico

Rilevazione di piccolo GTPase prenilazione e GTP Binding mediante frazionamento di membrana e GTPase-collegata dell'immunosorbente

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DOI:

10.3791/57646

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11 novembre 2018

Javad Alizadeh¹^,² , Shahla Shojaei¹^,²^,³ , Simone da Silva Rosa¹ , Adel Rezaei Moghadam¹^,² , Amir A. Zeki⁴ , Mohammad Hashemi⁵ , Marek J. Los⁶^,⁷^,⁸ , Joseph W. Gordon¹^,⁹ , Saeid Ghavami¹^,²^,¹⁰

¹Department of Human Anatomy and Cell Science, Rady Faculty of Health Sciences, Max Rady College of Medicine, University of Manitoba, ²Biology of Breathing Theme, Children Hospital Research Institute of Manitoba, University of Manitoba, ³Department of Biochemistry, School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Isfahan University of Medical Sciences, ⁴Division of Pulmonary, Critical Care, and Sleep Medicine, Department of Internal Medicine, Center for Comparative Respiratory Biology and Medicine, ⁵Department of Clinical Biochemistry, School of Medicine, Zahedan University of Medical Sciences, ⁶Department of Molecular Biology, School of Pharmacy with the Division of Laboratory Medicine in Sosnowiec, Medical University of Silesia, ⁷Centre de biophysique moléculaire - UPR 4301, Centre national de la recherche scientifique (CNRS) CS80054, ⁸LinkoCare Life Sciences AB, ⁹College of Nursing and Children's Hospital Research Institute of Manitoba, Rady Faculty of Health Sciences, University of Manitoba, ¹⁰Health Policy Research Center, Institute of Health, Shiraz University of Medical Sciences

In questo articolo

Sommario

Qui descriviamo un protocollo per studiare la prenilazione e guanosina-5'-trifosfato (GTP)-caricamento di Rho GTPasi. Questo protocollo è costituito da due metodi dettagliati, vale a dire del kit membrana frazionamento e un GTPase-collegata dell'immunosorbente. Il protocollo può essere utilizzato per misurare la prenilazione e GTP caricamento di diverse altre piccole GTPasi.

Abstract

La famiglia di Rho GTPasi appartiene alla superfamiglia Ras e comprende circa 20 membri in esseri umani. Rho GTPasi sono importanti nella regolazione di diverse funzioni cellulari, tra cui la dinamica del citoscheletro, motilità cellulare, polarità cellulare, guida assonale, traffico vescicolare e controllo del ciclo cellulare. Cambiamenti nella segnalazione di GTPasi Rho svolgono un ruolo normativo essenziale in molte condizioni patologiche, quali cancro, malattie del sistema nervoso centrale e malattie del sistema immunitario-dipendente. La modifica di posttranslational di Rho GTPasi (cioè, prenilazione di mevalonate pathway intermedi) e grippaggio di GTP sono fattori chiave che influenzano l'attivazione di questa proteina. In questa carta, sono disponibili due metodi semplici ed essenziali per rilevare una vasta gamma di Rho GTPasi prenilazione e attività obbligatorie di GTP. Dettagli delle procedure tecniche che sono state utilizzate sono spiegati passo dopo passo in questo manoscritto.

Introduzione

Rho GTPasi sono un gruppo di piccole proteine (21-25 kDa), che sono ben conservate nel corso dell'evoluzione e formano un'unica sottofamiglia della superfamiglia Ras di piccolo GTPases. In ciascuna sottofamiglia all'interno di questa superfamiglia, c'è un nucleo di dominio condiviso di G che è coinvolto nella attività GTPasica e del nucleotide exchange¹. La differenza tra la famiglia di Rho e le altre sottofamiglie di Ras è la presenza di un "dominio di inserto Rho" all'interno del filo del β^th 5 e il 4^th α elica in piccole GTPasi dominio².

Secondo la classificazione rece....