Summary
Hier beschrijven we een protocol voor het onderzoek naar de prenylation en 5'-Guanosinetrifosfaat (GTP)-laden van Rho GTPase. Dit protocol bestaat uit twee gedetailleerde methoden, namelijk membraan fractionering en een GTPase-linked immunosorbent assay. Het protocol kan worden gebruikt voor het meten van de prenylation en de GTP laden van verschillende andere kleine GTPases.
Abstract
De Rho GTPase familie behoort tot de superfamilie Ras en bestaat uit ongeveer 20 leden bij de mens. Rho GTPases zijn belangrijk bij de regulering van diverse cellulaire functies, met inbegrip van cytoskeletal dynamics, beweeglijkheid van de cel, cel polariteit, axonale begeleiding, vesiculaire handel en controle van de celcyclus. Wijzigingen in de signalering van Rho GTPase spelen een essentiële regulerende rol in vele pathologische voorwaarden, zoals kanker, ziekten van het centrale zenuwstelsel en immuunsysteem-afhankelijke ziekten. De posttranslationele wijziging van Rho GTPases (d.w.z., prenylation door mevalonate traject tussenproducten) en bindende GTP zijn belangrijke factoren die van invloed zijn op de activering van dit eiwit. In dit document vindt u twee essentiële en eenvoudige methoden om een breed scala van Rho GTPase prenylation en GTP bindende activiteiten te detecteren. Details van de technische procedures die zijn gebruikt zijn uitgelegd stap voor stap in dit manuscript.
Introduction
Rho GTPases zijn een groep van kleine eiwitten (21-25 kDa), die zijn goed bewaard in de gehele evolutie, en vormen een unieke onderfamilie in de Ras-superfamilie van kleine GTPases. In elke onderfamilie binnen deze superfamilie is er een gedeelde G domein kern dat bij de GTPase activiteit en nucleotide exchange1 betrokken is. Het verschil tussen de Rho-familie en de andere onderfamilies van de Ras is de aanwezigheid van een "Rho invoegen domein" binnen de 5th β strand en de 4th -α-helix in de kleine GTPase domein2.
Gebaseerd op de recente classificatie, Rho GTPases worden beschouwd als een familie van signalering eiwitten die in het Ras GTPase superfamilie3past. Zoogdieren Rho GTPases hebben 22 leden op basis van hun specifieke functie en de algemene karakterisering4 in die RhoA, Rac1 en Cdc42 tot de meest bestudeerde leden in deze groep behoren. Rho GTPases zijn gekoppeld aan intracellulaire signalering trajecten via een strak gereguleerde mechanisme dat afhankelijk van de moleculaire schakelaars via eiwit posttranslationele modificaties5 is.
GTP laden en hydrolyse zijn essentiële mechanismen in de cyclus van de activering/deactivering van kleine Rho GTPases en gereglementeerde via GTPase-activeren eiwitten (hiaten). Hiaten zijn verantwoordelijk voor de GTP hydrolyse en werken in concert met guanine nucleotide uitwisseling factoren (GEFs) die verantwoordelijk voor de reactie van de GTP-laden zijn. Rho BBP dissociatie remmers (GDIs) nadere regulering van kleine Rho GTPases via bindende aan de BBP-gebonden Rho GTPases. Dit remt BBP dissociatie en vergemakkelijkt het vastleggen van kleine Rho GTPases uit de buurt van de actieve intracellulaire membraan-sites. Er is ook meer regulering van Rho GTPase eiwitten waarbij de prenylation voor GDIs die regelt zowel nucleotide hydrolyse en uitwisseling en besturingselementen BBP/GTP fietsen1,6,7,8.
Zowel de GTP-laden en de Rho GTPase prenylation zijn betrokken bij het verkeer van Rho GTPase tussen cytosol en celmembranen door de lipofiele eigenschappen van deze eiwitten1,9te wijzigen. De bovengenoemde regelgevers interactie met fosfolipiden van de celmembraan en andere modulerende eiwitten van het BBP/GTP exchange activiteit10. Bovendien blokkeren GDIs, dissociatie-remmers, zowel de GTP hydrolyse en de uitwisseling van BBP/GTP. GDIs remmen de dissociatie van de inactieve Rho eiwitten van BBP en dus hun interactie met stroomafwaartse effectoren. GDIs regelen ook de fietsen van GTPases tussen het cytosol en membraan in de cel. De activiteit van Rho GTPases hangt voor een groot deel hun beweging om de celmembraan; Dus, GDIs worden beschouwd als kritische toezichthouders die GTPases in het cytoplasma sekwestreren kunnen via hun hydrofobe regio/domeinen11,12te verbergen.
Voor Rho GTPase in alle stadia van de cyclus van de activering een optimale signalering en functie hebben, is de dynamische cyclus van GTP-laden/GTP hydrolyse van cruciaal belang. Elke vorm van wijzigingen in dit proces kan leiden tot daaropvolgende wijzigingen in cel functies geregeld door Rho GTPase, zoals cel polariteit, proliferatie, voedselproductie, cytokinese, migratie, hechting en overleving13,14.
Het huidige protocol biedt lezers met een gedetailleerde methode om te controleren kleine RhoA GTPase activering via het onderzoek van hun prenylation en BBP/GTP laden. Deze methode kan ook worden gebruikt om de prenylation en de GTP binding van een breed scala van kleine GTPases te detecteren. De GTPase-linked immunosorbent analyse kan worden gebruikt voor het meten van het niveau van de activering van andere soorten GTPases, zoals Rac1, Rac2, Rac3, H-, K- of N-Ras, Arf en Rho15. De farmacologische agent simvastatine wordt gebruikt als een voorbeeld, zoals het werd onlangs gemeld te worden betrokken bij de regulering van de kleine Rho GTPase prenylation en activiteit8,9,14,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bepaling van de lokalisatie van de RhoA met behulp van membraan/Cytosol fractionering
-
Cel cultuur en simvastatin behandeling
- Zaad 50.000 van U251 cellen in een 100 mm schotel en cultuur hen in de Dulbecco bewerkt Eagle's medium (DMEM) (hoge glucose, 10% foetale runderserum [FBS]).
- Wanneer 30% heuvels, de cellen te behandelen door het verwijderen van het medium en medium simvastatine-bevattende toe te voegen aan het (10 µM van simvastatine opgelost in dimethylsulfoxide [DMSO]) en incubeer gedurende 36 uur bij 37 ° C8. DMSO alleen gebruiken als het besturingselement van een voertuig.
Opmerking: 10 miljoen cellen zijn nodig voor het cytosol en membraan versplintering van de cellen.
-
Verzameling cellen
- Verwijder de cellen uit de 37 ° C incubator. Kijk naar de cellen onder een microscoop te bevestigen de confluentie.
Opmerking: De cellen moet 70% - 80% heuvels. - Het medium gecombineerd, wassen van de cellen 1 x met koude-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Voeg 5 mL van ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) buffer (KCl: 400 mg/L, NaCl: 6800 mg/L, NaHCO3: 2200 mg/L, NaH2PO4. H2O: 140 mg/L, D-glucose: 1000 mg, Dinatrium van het EDTA: 373 mg/L) per plaat en plaats de cellen terug in de incubator van de 37 ° C gedurende 5 minuten.
- Na 5 min van incubatie, verzamelen de EDTA met de cellen in een tube van 15 mL met hetzelfde bedrag van medium als EDTA.
Opmerking: Medium in de buis neutraliseert de EDTA en voorkomt eventuele verdere vertering van de celmembranen. - Plaats de buis in een koelbox en gaat u verder met de centrifuge.
- Instellen van de centrifuge tot 1.500 x g bij 4 ° C en draai de cellen gedurende 5 minuten.
- De bovendrijvende vloeistof verwijderen zonder de pellet te verstoren en voeg 1 mL koude PBS. Meng de cellen goed.
- Breng het mengsel van de cel (oplossing) tot een nieuwe 1,5 mL koker, centrifuge bij 1.500 x g bij 4 ° C, en spin de cellen gedurende 5 minuten.
- Controleer de grootte van de pellet (voor het schatten van de omvang van de buffer voor de volgende stap). Leg de monsters op ijs. Verwijder het supernatant volledig zonder de pellet te verstoren.
- Ijskoude buffer die ik (10 mM Tris-HCl [pH 7.5], 0.1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 1 mM dithiothreitol en proteaseinhibitor cocktail), meng de monsters goed door omhoog en omlaag pipetteren toevoegen, en vervolgens overgaan tot ultrasoonapparaat.
- Verwijder de cellen uit de 37 ° C incubator. Kijk naar de cellen onder een microscoop te bevestigen de confluentie.
-
Ultrasoonapparaat
- Instellen van het ultrasoonapparaat voor vijf cycli, 5 s elk, en herhaal 3 x.
- Voer de ultrasoonapparaat op ijs. Ga verder met de ultracentrifuge.
Opmerking: Ijs en koude toestand behouden de eiwitten en de resultaten betrouwbaarder te maken.
-
Ultracentrifugatie
- Gebruik een ultracentrifuge te scheiden van de cel homogenates in cytoplasmatische en membraan breuken. De centrifuge ingesteld op 100.000 x g gedurende 35 min. bij 4 ° C. Zoals in Figuur 1weergegeven, controleert u de grootte van de pellet.
Opmerking: De Fractie van het membraan is aan de onderkant van de buis en de rest is andere cytoplasmatische onderdelen. - Het supernatant volledig verzamelen terwijl het voorzichtig niet te verstoren de pellet. De bovendrijvende substantie is de cytosolische breuk. Plaats de bovendrijvende substantie in een nieuw label buis.
- Voeg 300 µL van dissociatie buffer (buffer II) (50 mM Tris-HCl [pH 7.5], 0,15 M NaCl, 1 mM dithiothreitol, 1% SDS, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA en proteaseinhibitor cocktail) naar de pellet (de membraan-breuk bevat). Meng goed door pipetteren omhoog en omlaag.
- Ga naar eiwit bepaling en de bereiding van de monsters van de westelijke vlek (immunoblot analyse).
- Gebruik een ultracentrifuge te scheiden van de cel homogenates in cytoplasmatische en membraan breuken. De centrifuge ingesteld op 100.000 x g gedurende 35 min. bij 4 ° C. Zoals in Figuur 1weergegeven, controleert u de grootte van de pellet.
-
Immunoblotting
- Bereiden de cel eiwitten uittreksels uit de gescheiden breuken in lysis-buffermengsel (20 mM Tris-HCl [pH 7.5], 0.5 mM PMSF, 0,5% niet-ionogene wasmiddel-40, 100 µM β-glycerol-3-fosfaat, en 0,5% proteaseinhibitor cocktail).
- De eiwitconcentratie met behulp van de Lowry methode8 meten en berekenen van het volume van de lysis buffer (20 mM Tris-HCl [pH 7.5], 0.5 mM PMSF, 0,5% nondenaturing wasmiddel, octylphenoxypolyethoxyethanol, 100 µM β-glycerol-3-fosfaat en 0,5% protease inhibitor cocktail) te normaliseren van de concentratie van eiwit tussen de monsters.
- Verwarm de monsters bij 90 ° C gedurende 5 minuten en laden van 15-20 µL van de monsters op een 15% SDS-pagina gel te scheiden van de eiwitten.
Opmerking: Laden 1 µg van eiwitten voor elk monster. Bereken het volume dat moet dienovereenkomstig worden uitgevoerd. - De gescheiden eiwitten overbrengen in nylon membranen onder voorwaarden (500 nM glycine, 50 mM Tris-HCl, en 20% methanol) voor 2 h, bij kamertemperatuur (RT) bij 100 V verminderen.
Opmerking: Om te bevestigen de overdracht succesvol eiwit, gebruik Ponceau vlek of markering eiwit op de membraan visualiseren. - Blokkeren van de membranen met 5% nonfat melkpoeder en 1 x Tris-buffered saline met wasmiddel (TBS/0.01% nonionic wasmiddel; TBST) blokkeren van niet-specifieke antilichaam-bindende bij 4 ° C's nachts of bij RT gedurende 1 uur.
- Toevoegen van primaire antilichamen immunoblotting p.a. en na een nacht bebroeden bij 4 ° C.
Opmerking: In dit experiment, Rac1/2/3, cdc42, RhoA, GAPDH en pan-cadherine werden gebruikt bij een verdunning 1:1,000 in 1% melk in 1 x TBST. Pan-cadherine en GAPDH werden gebruikt om te bevestigen membraan en cytosolische breuk zuiverheid, respectievelijk. - Wassen van de membranen 3 x met een buffer van wassen met 1 x TBST voor 20 min.
- Incubeer de membranen met anti-konijn horseradish peroxidase (HRP)-geconjugeerd secundair antilichaam voor de respectievelijke primaire antilichamen (voor 1 h op RT).
- Wassen van de vlekken 3 x voor 20 min en ontwikkelen ze met Verbeterde Chemiluminescentie (ECL) detectie.
2. meting van de RhoA GTP belasting met behulp van een kleine G-eiwit activering Assay
- Graaf 10.000 cellen/mL en cultuur de U251 cellen in een 100 mm schotel.
- Als ze 30% heuvels, behandelen de cellen met simvastatine, zoals beschreven in stap 1.1.2.
- Breng de platen van de cultuur uit de incubator. Kijk naar de cellen onder de Microscoop te bevestigen confluentie. Zorg ervoor dat de cellen 70% - 80% heuvels. Plaats de petrischaal op ijs, gecombineerd de media en wassen van de cellen 3 x met ijskoude PBS (pH 7,2).
- De PBS gecombineerd. Kantel de petrischaal op ijs voor een extra minuut te verwijderen alle restanten van PBS.
Opmerking: Residuele PBS negatieve gevolgen heeft voor deze test. - Lyse de cellen in een volume van 700 µL van ijskoude lysis buffer die protease en phosphatase inhibitors.
Opmerking: 700 µL is meestal genoeg voor een 100 mm petrischaal. Zie tabel 1 te vinden van het juiste volume voor ieder vaartuig cultuur. - Oogst de lysate-cel met de cel schraper. De hellingshoek van de cultuur-plaat voor deze techniek.
- De lysate overbrengen naar een gelabelde ijskoude cryotube en houd het op ijs.
- Meng grondig met behulp van een vortex. Houd 10 µL van de lysate voor de eiwit-assay, voor het meten van de eiwitconcentratie in de steekproef.
- Module-freeze de resterende cel lysate in vloeibare stikstof.
Opmerking: Bereiden meerdere aliquots van cel lysate vóór het module-invriezen hen, om te voorkomen dat herhaalde vorst/dooi-cycli die tot het verlies van activiteit van RhoA GTPase leiden kunnen. - De cryotubes module-bevroren overbrengen in een vriezer-80 ° C en op te slaan van de monsters voor de GTPase-linked immunosorbent assay.
Opmerking: Bewaar niet de monsters langer dan 14 dagen. Snel werken en nooit verlaten de monsters op ijs langer dan 10 min. Nooit alle petrischalen gelijktijdig te verwerken. - De eiwitconcentratie met behulp van de Lowry methode8 meten en berekenen van het volume van de lysis buffer te normaliseren van de concentratie van eiwit tussen de monsters.
Opmerking: De beste concentratie is meestal 1 mg/mL; 0,3 - 2 mg/mL kan echter aantoonbaar. - Bereid een blanco-controle door 60 µL van lysis buffer en 60 µL van bindende buffer toe te voegen aan een microtube.
Opmerking: De blanco-controle heeft alle reagentia met uitzondering van het antigeen en wordt gebruikt voor het aftrekken van de achtergrond. - Bereid een positieve controle door 12 µL van Rho controle eiwit, 48 µL van lysis buffer, en 60 µL van bindende buffer toe te voegen.
Opmerking: De positieve controle heeft alle reagentia plus een bevestigde antigeen voor Rho-A-GTP. - Neem de Rho affiniteit plaat uit zijn zak en plaats het op het ijs.
- Los het poeder in de putjes met 100 µL van ijskoude gedistilleerd water. Houd de plaat op ijs.
- Ontdooien van de module-bevroren cel lysates in een bad van water, ingesteld op 25 ° C.
- Voeg de berekende hoeveelheid ijskoude lysis-buffermengsel (uit stap 2.11) aan elk monster voor het normaliseren van de eiwitconcentratie toe.
Opmerking: Verwijder de PBS na het wassen van de cellen (met behulp van een vacuüm buis aspirator) om te voorkomen dat wijzigingen in de samenstelling van de lysis-buffermengsel. Egaliseren van de proteïne van de steekproef tot een concentratie tussen 0,8 en 2 mg/mL voor een nauwkeurige vergelijking tussen monsters in GTPase activering testen. Tabel 2 bevat informatie over de buffer moet worden gebruikt voor deze test. - 60 µL van de genormaliseerde ijskoude monsters overbrengen slangen en voeg 60 µL van bindende buffer; Meng de monsters en houd ze op het ijs.
- Volledig verwijderen de water/oplossingen uit de microplate door krachtige flicking, gevolgd door vijf tot zeven harde tikjes op de mat van een lab.
- Breng 50 µL van de genormaliseerde monsters, een blanco-controle, en een positieve controle in de putjes in duplicaten.
- Plaats de plaat op een roteerschudapparaat gedurende 30 minuten bij 4 ° C bij 300 omwentelingen per minuut.
Opmerking: De schudden stap is zeer belangrijk, en het is aanbevolen om gebruik van de orbitale plaat shaker bij 300 omwentelingen per minuut. - Duidelijk van de monsters van de plaat door flicking en was ze 2 x met 200 µL buffer op RT. krachtig te wassen verwijder de buffer wassen uit de putten na elke wasbeurt door flicking, gevolgd door te onttrekken, en houd de plaat op de Bank op RT.
- Voeg 200 µL van RT antigeen-presenteren buffer aan elk putje en Incubeer bij RT gedurende 2 min.
- Ledig de oplossing van de putten en was de putjes goed 3 x met 200 µL van het wassen van buffer op RT.
- Voeg 50 µL van vers bereide 1/250 anti-RhoA primair antilichaam aan elk putje.
- Plaats de plaat op een roteerschudapparaat voor 45 min op 300 rpm ingesteld op 25 ° C. Ledig de oplossing uit de put.
- Herhaal de stappen wassen 2 x (stap 2.24).
- Voeg 50 µL van vers bereide 1/250 anti-RhoA secundair antilichaam aan elk putje.
- Plaats de plaat op de top van een roteerschudapparaat voor 45 min op 300 rpm ingesteld op 25 ° C.
- Bereid het reagens HRP detectie door het mengen van gelijke hoeveelheden reagens A en B. reagens
- De oplossing van elk putje ledig en was de putjes goed 3 x met 200 µL van het wassen van buffer op RT.
- Voeg 50 µL van vers bereide HRP detectie reagens aan elk putje.
- Lees de verlichte signaal binnen 3-5 min verkrijgen het maximale signaal en analyseren de resultaten met behulp van een geschikte softwarepakket.
Opmerking: Lezingen moeten men binnen 3-5 min om het maximale signaal. Uitvoeren van een "test plaat" om te bevestigen de juiste lysis buffervolume wordt gebruikt voor de cel lysates zodat de eiwitconcentratie is hoog genoeg om te detecteren RhoA GTPase activiteit. (Een test-plaat is een plaat van cellen die worden gebruikt om te bepalen als de eiwitconcentratie binnen het acceptabele bereik valt en ook om te bepalen of het volume van de lysis-buffermengsel worden gebruikt geschikt is.) De positieve controle moet lezen 4 - tot 10 keer hoger dan de lege putten als er in het lineaire bereik. Als dat niet het geval is, dan de luminometer aanpassen door het raadplegen van de fabrikant. De instellingen voor de luminometer zijn gegeven in tabel 3. - Onbewerkte gegevens invoert in de kolommen waar de koppen lezen monster betekenen, standaarddeviatie, rep1, rep2, rep3, en rep4, die is aan te tonen van het aantal replicatieonderzoeken worden gedaan op elk monster.
- Voer de formule =average(Xn:Yn) onder het betekenen, waarbij X de aanduiding van de kolom voor rep1, Y = de aanduiding van de kolom voor rep4, en n = = de aanduiding van de rij van de rij wordt gewerkt.
- Voer de formule = stdev (Xn:Yn) onder standaarddeviatie, waarbij X de aanduiding van de kolom voor rep1, Y = = de aanduiding van de kolom voor rep4en n = de aanduiding van de rij van de rij wordt gewerkt.
- De gegevens repliceren aangaan met rep1, rep2, enz.
- Na het invoeren van de gegevens, door de klik-en-belemmering-methode te gebruiken om te selecteren van het monster, betekenen, en de standaarddeviatie.
- Selecteer vervolgens in de software van de analyse van de gegevens, de functie voor grafiek maken die lijkt op een plein met een mini staafdiagram binnen.
Opmerking: Dit brengt de grafiek makende proces waar men kan ontwerp grafieken die zijn gebaseerd op de gegevens die worden ingevoerd. - Kies kolomdiagram en invoerwaarden, wijzen de cijfers betekenen .
Opmerking: De grafiek voor de getallen betekenen voor het eerst wordt gemaakt, en vervolgens de kolom van de standaarddeviatie voor de foutbalken van de y-as is aangewezen. Om dit te doen, dubbelklik op de grafiek-bars, selecteer het lusje van de y-as fout , klikt u op de optie aangepast en selecteer het gebied in het werkblad om het invoeren van de locatie van de gegevens van de standaarddeviatie . Het verschil tussen de groepen die moeten worden vergeleken, kan na de oprichting van de gewenste grafieken worden gezien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Membraan fractionering:
Ultracentrifugatie werd gebruikt voor de versplintering van membraan en cytosol onderdelen. Zoals blijkt uit Figuur 1, het supernatant de cytosolische breuk bevat en de pellet de breuk van het membraan bevat. De overvloed van RhoA in cytosolische andmembrane breuken U251 cellen verkregen werd onderzocht na de behandeling met simvastatin immunoblotting gebruiken. De zuiverheid en het laden van de controle van de membraan en cytosol breuk werden bevestigd door pan-cadherine en GAPDH respectievelijk. Zoals afgebeeld in Figuur 2, verlaagde de behandeling van simvastatine het bedrag van membraan-gebonden RhoA GTPase, terwijl het inhoudelijk cytosolische verhoogd. Dit komt overeen met de bekende gevolgen van statines op de translocatie van GTPases gebaseerd op de remming van RhoA prenylation. Simvastatine remt de prenylation van RhoA GTPase en unprenylated RhoA daarom niet in staat te verankeren in het plasma van de celmembranen, waardoor haar hogere cytosolische concentraties.
RhoA-GTP Bound:
We gemeten GTP-gebonden RhoA eiwit met behulp van een GTPase-linked immunosorbent analyse en toonde dat simvastatin significant (P < 0.05) verhoogd GTP-gebonden RhoA in U251 cellen (Figuur 3). Daarom, terwijl simvastatine geremd RhoA GTPase eiwit prenylation (Figuur 2), steeg het ook haar GTP laden in vergelijking met de controle cellen. Dit wijst op het feit dat prenylation en GTP bindend beide een rol in de activiteit en regulering van RhoA GTPase spelen. Raadpleeg voor meer informatie over dit verschijnsel, de oorspronkelijke publicatie met behulp van dit protocol8.
Figuur 1 : Schematische weergave van de cytosolische en membraan breuken na ultracentrifugatie. De pellet de breuk van het membraan bevat en het supernatant de cytosolische breuk bevat.
Figuur 2 : Simvastatine verandert de lokalisatie van RhoA. U251 cellen werden behandeld met simvastatine (10 µM; 12, 24 en 36 h) en de overvloed van RhoA in de membraan en cytosolische fracties werd bepaald door immunoblotting. De overvloed van GAPDH en pan-cadherine evalueerden ook aan besturingselement voor het laden in de cytosolische en membraan breuken en te bevestigen van het ontbreken van cytosolische verontreiniging in de membraan breuken. De gegevens zijn meestal afkomstig van drie onafhankelijke experimenten met behulp van verschillende primaire culturen. Dit cijfer is gewijzigd van Alizadeh et al. 8. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Simvastatine moduleert RhoA GTPase activiteit. De GTPase-linked immunosorbent analyse werd gebruikt voor het meten van de GTP-gebonden Rho eiwit in U251 cellen. Verschillende omstandigheden werden getest voor 36 h, met inbegrip van honger en simvastatine (10 µM). Voor elk experiment, werd een constitutively actieve RhoA eiwit waarin de kit gebruikt als positieve controle. De resultaten worden uitgedrukt als de gemiddelde ± SD van twee replicaat-organismen in onafhankelijke experimenten (* P < 0,001). Dit cijfer is gewijzigd van Alizadeh et al. 8.
| Cel cultuur vaartuig | Oppervlakte (cm2) | Lysis-buffermengsel (µl) | |
| Gerechten | 35 mm | 9 | 100 |
| 60 mm | 21 | 300 | |
| 100 mm | 55 | 700 | |
| 150 mm | 145 | 1500 | |
| Platen | 6-well | 9.4 / goed | 100 |
| 12-well | 3.8 / goed | 70 | |
| 24-well | 1.9 / goed | 40 | |
| Kolven | T-25 | 25 | 250 |
| T-75 | 75 | 1000 | |
| T-150 | 150 | 1500 | |
Tabel 1: Aanbevolen hoeveelheid lysis-buffermengsel voor U251 cellen. Het volume is instelbaar voor verschillende soorten cellen.
| Lysis Buffer naam | Lysis Buffer samenstelling | Kleine G-eiwit Target | Notities |
| GL35 | Tris (1 X GL36), MgCl2 (8 X GL36), NaCl (2 X GL36), IGEPAL (1 X GL36), SDS (5 X GL36) | Cdc42 | Identieke componenten te GL36, samenstelling varieert als volgt; |
| GL36 | een gepatenteerde formulering van Tris pH 7.5, MgCl2, NaCl, IGEPAL en SDS | RalA | Standaard buffer, compatibel met meeste GTPase-linked immunosorbent assays. |
| GL36 | een gepatenteerde formulering van Tris pH 7.5, MgCl2, NaCl, IGEPAL en SDS | Rac1 | Standaard buffer, compatibel met meeste GTPase-linked immunosorbent assays. |
| GL36 | een gepatenteerde formulering van Tris pH 7.5, MgCl2, NaCl, IGEPAL en SDS | Rac1, 2, 3 | Standaard buffer, compatibel met meeste GTPase-linked immunosorbent assays. |
| GL36 | een gepatenteerde formulering van Tris pH 7.5, MgCl2, NaCl, IGEPAL en SDS | RAS | Standaard buffer, compatibel met meeste GTPase-linked immunosorbent assays. |
| GL36 | een gepatenteerde formulering van Tris pH 7.5, MgCl2, NaCl, IGEPAL en SDS | RhoA | Standaard buffer, compatibel met meeste GTPase-linked immunosorbent assays. |
| GL36 | een gepatenteerde formulering van Tris pH 7.5, MgCl2 | Arf1 | Standaard buffer, compatibel met meeste GTPase-linked immunosorbent assays. |
Tabel 2: Lijst van GTPase-linked immunosorbent assay lysis buffers en aanbevolen lysis van de compositie voor kleine GTPases.
| Parameters | Notities | ||
| WINST | GAIN optie past de gevoeligheid van de machine. De meeste luminometers gebruik automatische kalibratie of beperkte kalibratiefunctie. Gebruiker moet de winst op laag, gemiddeld en hoog lezen om te zien of de lezing is de lineaire gasgroep die in de verschillende instrumenten varieert. | ||
| INTEGRATIE TIJD | Het is aanbevolen om deze optie op haar laagste als de zeer hoge tijden kan lezen de lineaire bereik hebben. Dit wellicht overbodig werk zoals het gebruik van lagere verdunning of primaire en secundaire antilichamen. INTEGRATIE tijd varieert ook in verschillende instrumenten. | ||
| SCHUDDEN | Het is aanbevolen om gebruik van de 5s orbitale SCHUDDEN. Het is niet zo kritisch als andere parameters voor de juistheid van de bepaling. | ||
| TEMPERATUUR | Kamertemperatuur wordt aanbevolen | ||
| PLAAT TYPE | Gebruik volgens de plaat die u gebruikt. De plaat is meestal 96-Wells, vlakke en witte. | ||
| FILTERS | Excitatie of emissie filters zijn niet vereist voor luminescentie. Excitatie kan worden ingesteld op elke gewenste waarde en optimaal bereik voor emissie is 430-445 nm. De ruimten van het filter leeg laat. Als dit geen optie is, | ||
Tabel 3: Een gedetailleerde beschrijving van instellingen voor luminometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we een nauwkeurige methode voor het meten van kleine GTPase prenylation en GTP bindende weergegeven als kleine GTPase subcellular localisatie (membraan versus cytosol) en Rho GTP laden. Kleine GTPases worden uitgedrukt in eukaryote cellen en spelen een essentiële rol in de cellulaire proliferatie, beweeglijkheid en structuur. Zowel prenylation als GTP bindend zijn betrokken bij de regulering van GTPase activiteit; Daarom zijn testen om te evalueren van de prenylation en de GTP binding van deze eiwitten belangrijke hulpmiddelen voor cel biologen1,8.
Op basis van de resultaten van een recente studie, Rho eiwit GTP laden is celtype specifieke8, en daarom, verschilt tussen de verschillende soorten cellen. Ook zijn de subcellular localisatie en geranylgeranylation (GGT) van Rho eiwitten de bepalende stappen bij de regulering van hun functie. Dit is ook verder geregeld door de wisselwerking tussen de effector eiwitten GEF, GAP en GDI voor de grote GTPases.
Simvastatine is bekend dat Rac GTP laden in THP-1 monocyten verhogen, verlagen van de prenylation van Rac in aanwezigheid van amyloïde β stimulatie en inflammatoire reacties van deze cellen17verminderen. We weten ook dat T-cel-functie wordt niet beïnvloed door Rho GTP laden, maar veeleer de GGT van Rho functie18,19 bepaalt. Daarom is het raadzaam dat, om op te sporen Rho GTPase activiteit, zowel de prenylation als de GTP laden gelijktijdig moeten worden gemeten in cellen.
Van de nota, hoge zuiverheid cytosolische en membraan breuken, te bereiken zijn de belangrijkste stappen van het protocol de ultrasoonapparaat en de ultracentrifugatie. Voor de Rho GTP-bindende assay, de meest kritische stap is module-bevriezing de cel lysates vóór de sequentiële verwerking. Na deze belangrijke stappen zal produceren consistente en reproduceerbare resultaten in de studie van GTPases in levende systemen.
Een belangrijke stap te onderzoeken van een bepaalde intracellulaire structuur of membraan eiwit is de scheiding van cellulaire compartimenten van elkaar. Fractionering maakt gebruik van de eigenschappen van elke cellulaire compartiment, zoals grootte en vorm, oppervlakte ladingsdichtheid en uitbundige dichtheid20. Het is hoofdzakelijk gebaseerd op differentiële centrifugeren in media met hoge viscositeit bij 4 ° C. De membraan fractionering methode die werd hier gebruikt is voornamelijk gebaseerd op de grootte van elk compartiment en hoge gravitationele snelheid waar, na ultracentrifugatie, membraaneiwitten Ga naar de onderkant van de buis en de cytosolische eiwitten blijven de supernatant.
Het is belangrijk om op te merken dat monsters met eiwitrijk concentraties en, eventueel, hoge niveaus van lacunes potentieel kunnen inactivering van het doel GTPase. Dit probleem kan optreden zelfs in lysis-buffermengsel en kan leiden tot valse negatieve resultaten. Een van de belangrijkste parameters die bepalend zijn voor het succes en de reproduceerbaarheid van GTPase activiteit assay resultaten is de gezondheid en de responsiviteit van de cellen die worden gebruikt in de experiment-8. Het is raadzaam dat onderzoekers identificeren de optimale/passende groei omstandigheden en verdubbeling tijd voor de cellen onder studie om de GTPase activering/inhibitie. Bovendien, de GTPase activiteit van alle kleine GTPases is strak geregeld en is daarom gevoelig voor snelle afname via hydrolyse van het molecuul GTP gebonden aan het enzym via de actie van leemten (tijdens en na de ingreep van de lysis van de cel ). Deze actie resulteert in de snelle inactivering van de GTPase van belang. Daarom is het sterk aanbevolen dat lysis van de cel wordt snel uitgevoerd bij 4 ° C, om nauwkeurige en reproduceerbare resultaten te bereiken.
Er zijn verschillende factoren afhankelijk van experimentele omstandigheden die bepalend zijn voor de laatste cel lysate. Ten eerste, het totale bedrag van RhoA GTPase in het cellijn of specifieke weefsel: het bedrag van de endogene RhoA GTPase is variabele in verschillende soorten cellen en weefsels; Daarom kan dit resulteren in een meer krachtige reactie op een activator of deactivator. Tweede, het bedrag van de activering/deactivering bereikt onder de experimentele omstandigheden: het is belangrijk om te overwegen of ongeveer 2% tot 10% van de totale cellulaire kleine GTPase eventueel geactiveerd is in reactie op een bepaalde prikkel8. De hoeveelheid deactivering ook uitsluitend afhankelijk van het type van stimuli en het variabel in verschillende cellen en weefsels. Daarom, voor elk type kleine Rho GTPase activiteit assay, de samenstelling van de lysis buffer en cellulaire compartiment is cruciaal. Tabel 3 toont de aanbevolen samenstelling van de lysis-buffermengsel voor elke specifieke kleine GTPase proteïne.
De genormaliseerde cel lysate eiwitconcentratie is een belangrijke voorwaarde, omdat hierdoor onderzoekers te vergelijken de GTPase activiteit van verschillende monsters. Wassen van de cellen van alle monsters in alle omstandigheden met koude PBS is daarom verplicht om het eiwit uit de weefselkweek media verwijderen. Het is ook essentieel dat alle reagentia en buffers worden gebruikt bij koude temperaturen (4 ° C) in alle stappen van het experiment. Deze koude temperatuur zal het minimaliseren van de hydrolyse van GTPases, met inbegrip van Rho GTPase, tijdens de bereiding. Het is essentieel dat deze verwerking van cel lysates snel (in 10-15 min in totaal) verloopt om te voorkomen dat het verlies van RhoA GTPase activiteit. Bovendien is de meest belangrijke stap van de cel lysate voorbereiding aan module-freeze aliquots van het lysate in vloeibare stikstof te handhaven van de RhoA kleine GTPase enzymatische activiteit. Dit is vooral belangrijk als er verschillende timepoints of meerdere monsters in het experiment. Na de voorbereiding van module-bevroren lysates, kunnen de monsters zonder verlies van hun activiteit Rho GTPase in-80 ° C worden gehouden.
Het meegeleverde protocol voor de analyse van de membraan verankering van RhoA GTPase vertegenwoordigt slechts een indirect hulpmiddel voor het meten van de prenylation van kleine GTPases en is niet in staat om direct detecteren of het kwantificeren van de binding van de terpenoïde residuen aan de target-eiwit. Dit is een van de weinige beperkingen van deze test. Dus, het geeft een schatting van de prenylation van eiwitten. Aantal benaderingen zijn vastgesteld, die kunnen direct meten FT (farnesylation) en/of GGT door farnesyl transferase en/of geranylgeranyl transferase, respectievelijk, zowel in dieren en de mens afkomstige tumoren in gekweekte cellen. De testen gebruiken elektroforetische mobiliteit shift, [3H] farnesyl (III) difosfaat en [3H] geranylgeranyl (III) difosfaat en [3H] mevalonic zuur labeling, gevolgd door immunoprecipitation en SDS-pagina21.
We gebruikten de RhoA GTPase-linked immunosorbent analyse om detecteren elke membraan verankering en de activiteit van RhoA GTPase. Het bestaat uit een Rho-GTP-bindend-proteïne die is gekoppeld aan de wells van een 96-wells-plaat. Dus, de Rho GTP-gebonden actief in de cel of het weefsel lysates bindt aan de putten, terwijl het BBP-gebonden inactief Rho is weggespoeld tijdens de stappen wassen. Vervolgens zal de afhankelijke, actieve RhoA in de putjes met behulp van een RhoA-specifieke antilichaam en Chemoluminescentie worden gedetecteerd. Het is mogelijk om te bepalen van de mate van RhoA activering door het vergelijken van de lezingen van geactiveerde tot nonactivated cel lysates. Serum honger (het gebruik van serumvrij medium op gekweekte cellen) wordt meestal gebruikt om de inactivering van RhoA in de weefselkweek. Het moet ook worden vermeld dat de GTPase-linked immunosorbent analyse van bereik van de activering 10-50 µg van eiwitten voor de detectie van RhoA GTPase activiteit vereist.
Het is raadzaam dat onbehandeld monsters lage basale cellulaire niveaus van GTPase activiteit (status hebben). Als voorbeeld, goede cel honger voorwaarden kan downregulate GTPase activiteit en bieden ideale omstandigheden om te laten zien van hun activering onder proefomstandigheden. Ook, zowel activering en inhibitie testen worden uitgevoerd in een tijd - en dosis-respons-manier om de beste GTPase activering/inhibitie reacties. Belangrijker, tijdens de voorbereiding van het cellulaire, het is heel belangrijk om het gebruik van cellen die niet overconfluent (> 70%), om te voorkomen dat eventuele nonresponsiveness van de cellen op activering/inhibitie stimuli.
Luminometers verschillen sterk qua gevoeligheid en absolute lezingen. Daarom, om te bepalen dat er in het lineaire bereik, wij stellen voor een GTPase-linked immunosorbent analyse met een blanco en een positieve controle uitgevoerd. Als de bepaling van de lineaire bereik (de positieve controle moeten 4 x - 10 x hoger dan de buffer-alleen-lezen) of de lege lezing is hoger dan 9-10 miljoen, dan is het aanbevolen om gebruik verder antilichaam verdunningen. Bovendien raden wij kalibreren van het luminometer te lezen binnen het lineaire bereik van de bepaling voor het begin van de test.
Er zijn ook voordelen aan de GTPase-linked immunosorbent analyse, die zijn het vermelden waard. GTPase-linked immunosorbent assays verbeteren van de huidige experimentele design en technologie om experimenten die niet mogelijk met oude pull-downs technieken22 wareninschakelen. De GTPase-linked immunosorbent assays bieden ook nauwkeurigheid van de detectie en gevoeligheid waarmee analyses van GTPase activiteit in preparaten eerder ontoegankelijk voor pull-down assays23. Een aantal recente studies vergeleken GTPase-linked immunosorbent activering testen met een pull-downs en geconcludeerd dat GTPase-linked immunosorbent analyse heeft een aantal duidelijke voordelen, namelijk dat GTPase-linked immunosorbent assays superieur vanwege zijn hun mogelijkheid om het gebruik van kleine hoeveelheden eiwit22,24, hun grotere gevoeligheid24, en hun kwantitatieve metingen23. De GTPase-linked immunosorbent assay kit is beschikbaar in luminometric of colorimetrische detectie versies, waar de luminometric tests zijn gevoeliger. Deze GTPase-linked immunosorbent analyse is gebaseerd op een vrij eenvoudige en snelle protocol, vereist slechts kleine hoeveelheden van het monster, en levert kwantitatieve en nauwkeurige resultaten. Daarom zou het een goed idee om deze test te sporen van andere soorten GTPase gebaseerde proteïnen in verschillende cellijnen en weefselkweek cellen met een veel hogere specificiteit en nauwkeurigheid verder te ontwikkelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Saeid Ghavami werd gesteund door een Health Science Centrum operationele subsidie, CHRIM operationele subsidie en Manitoba nieuwe onderzoeker werkzaam onderzoeksbeurs. Javad Alizadeh werd ondersteund door onderzoek Manitoba studententijd. Shahla Shojaei werd gesteund door een subsidie van Health Science Foundation actief en de MITACS versnellen postdoctoral fellowship. Adel Rezaei Moghadam werd gesteund door een subsidie die werd gehouden door Joseph W. Gordon operationele NSERC. Amir A. Zeki werd gesteund door de NIH/NHLBI K08 award (1K08HL114882-01A1). Marek J. Los kandidatuur erkent de steun van Nereus Carpit NOCTEM verlenen #2016/21/B/NZ1/02812, ondersteund door LE STUDIUM Institute for Advanced Studies (regio Centre-Val de Loire, Frankrijk) door zijn slimme algemene programma van de Loire-vallei en medegefinancierd door de Marie Sklodowska-Curie-acties, verlenen #665790. Simone da Silva Rosa werd gesteund door UMGF studententijd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM high Glucose | VWR (Canada) | VWRL0101-0500 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR (Canada) | CA45001-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR (Canada) | 97062-806 | |
| EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid) | VWR (Canada) | CA71007-118 | |
| EGTA (Ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) | VWR (Canada) | CAAAJ60767-AE | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | VWR (Canada) | CA97061-340 | |
| Ammonium Persulfate | VWR (Canada) | CABDH9214-500G | |
| Tris-Hydroxymethylaminomethane | VWR (Canada) | CA71009-186 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution | Biorad (Canada) | 1610158 | |
| TEMED | Biorad (Canada) | 1610801 | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma/Aldrich (Canada) | P8340-5ML | 1:75 dilution |
| Rho-GTPase Antibody Sampler Kit | Cell Signaling (Canada) | 9968 | 1:1000 dilution |
| Pan-Cadherin antibody | Cell Signaling (Canada) | 4068 | 1:1000 dilution |
| GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology (USA) | sc-69778 | 1:3000 dilution |
| RhoA G-LISA Activation Assay (Luminescence format) | Cytoskeleton Inc. (USA) | BK121 | Cytoskeleton I. G-LISA Activation Assays Technical Guide. 2016. |
| RhoA Antibody | Cell Signaling | 2117 | |
| ECL | Amersham-Pharmacia Biotech | RPN2209 | |
| Anti-Rabbit IgG (whole molecule) Peroxidase antibody | Sigma | A6154-1ML | |
| SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | 1612071A | Spectrophotometer |
| Nonidet P-40 | Sigma | 11332473001 | non-denaturing detergent, octylphenoxypolyethoxyethanol |
| DMSO | Sigma | D8418-50ML | |
| PBS | Sigma | P5493-1L | |
| Phophatase Inhibitor cocktail | Sigma | P5726-5ML | 1:75 Dilution |
References
- Yeganeh, B., et al. Targeting the mevalonate cascade as a new therapeutic approach in heart disease, cancer and pulmonary disease. Pharmacology & Therapeutics. 143 (1), 87-110 (2014).
- Valencia, A., Chardin, P., Wittinghofer, A., Sander, C. The ras protein family: evolutionary tree and role of conserved amino acids. Biochemistry. 30 (19), 4637-4648 (1991).
- Hall, A.
- Rojas, A. M., Fuentes, G., Rausell, A., Valencia, A. The Ras protein superfamily: evolutionary tree and role of conserved amino acids. The Journal of Cell Biology. 196 (2), 189-201 (2012).
- Cherfils, J., Zeghouf, M. Regulation of small GTPases by GEFs, GAPs, and GDIs. Physiological Reviews. 93 (1), 269-309 (2013).
- Shojaei, S., et al. Perillyl Alcohol (Monoterpene Alcohol), Limonene. Enzymes. 36, 7-32 (2014).
- Ghavami, S., et al. Airway mesenchymal cell death by mevalonate cascade inhibition: integration of autophagy, unfolded protein response and apoptosis focusing on Bcl2 family proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (7), 1259-1271 (2014).
- Alizadeh, J., et al. Mevalonate Cascade Inhibition by Simvastatin Induces the Intrinsic Apoptosis Pathway via Depletion of Isoprenoids in Tumor Cells. Scientific Reports. 7, 44841 (2017).
- Ghavami, S., et al. Mevalonate cascade regulation of airway mesenchymal cell autophagy and apoptosis: a dual role for p53. PLoS One. 6 (1), e16523 (2011).
- Tang, Y., Olufemi, L., Wang, M. T., Nie, D. Role of Rho GTPases in breast cancer. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 13, 759-776 (2008).
- DerMardirossian, C., Bokoch, G. M. GDIs: central regulatory molecules in Rho GTPase activation. Trends in Cell Biology. 15 (7), 356-363 (2005).
- Garcia-Mata, R., Boulter, E., Burridge, K. The 'invisible hand': regulation of RHO GTPases by RHOGDIs. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 493-504 (2011).
- Etienne-Manneville, S., Hall, A.
- Ghavami, S., et al. Geranylgeranyl transferase 1 modulates autophagy and apoptosis in human airway smooth muscle. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 302 (4), L420-L428 (2012).
- Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406 (6795), 532-535 (2000).
- Ghavami, S., et al. Statin-triggered cell death in primary human lung mesenchymal cells involves p53-PUMA and release of Smac and Omi but not cytochrome c. Biochimica et Biophysica Acta. 1803 (4), 452-467 (2010).
- Cordle, A., Koenigsknecht-Talboo, J., Wilkinson, B., Limpert, A., Landreth, G. Mechanisms of statin-mediated inhibition of small G-protein function. Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 34202-34209 (2005).
- Waiczies, S., Bendix, I., Zipp, F. Geranylgeranylation but not GTP-loading of Rho GTPases determines T cell function. Science Signaling. 1 (12), pt3 (2008).
- Waiczies, S., et al. Geranylgeranylation but not GTP loading determines rho migratory function in T cells. Journal of Immunology. 179 (9), 6024-6032 (2007).
- Satori, C. P., Kostal, V., Arriaga, E. A. Review on Recent Advances in the Analysis of Isolated Organelles. Analytica Chimica Acta. 753, 8-18 (2012).
- Berndt, N., Sebti, S. M. Measurement of protein farnesylation and geranylgeranylation in vitro, in cultured cells and in biopsies, and the effects of prenyl transferase inhibitors. Nature Protocols. 6 (11), 1775-1791 (2011).
- Keely, P. J., Conklin, M. W., Gehler, S., Ponik, S. M., Provenzano, P. P. Investigating integrin regulation and signaling events in three-dimensional systems. Methods in Enzymology. 426, 27-45 (2007).
- Oliver, A. W., et al. The HPV16 E6 binding protein Tip-1 interacts with ARHGEF16, which activates Cdc42. British Journal of Cancer. 104 (2), 324-331 (2011).
- Moniz, S., Matos, P., Jordan, P. WNK2 modulates MEK1 activity through the Rho GTPase pathway. Cellular Signalling. 20 (10), 1762-1768 (2008).
