Summary
Aqui descrevemos um protocolo para investigar a Prenilação e guanosina-5'-trifosfato (GTP)-carregamento de GTPase. Esse protocolo consiste em dois métodos detalhados, nomeadamente o fracionamento de membrana e uma GTPase-lig da imunoabsorção do ensaio. O protocolo pode ser utilizado para medir a Prenilação e GTP carregamento de diferentes outras GTPases pequenas.
Abstract
A família de GTPase pertence à superfamília de Ras e inclui aproximadamente 20 membros em seres humanos. As GTPases Rho são importantes na regulação das diversas funções celulares, incluindo a dinâmica do citoesqueleto, motilidade celular, polaridade da célula, orientação axonal, tráfico vesicular e controlo do ciclo celular. Mudanças na sinalização de GTPase desempenham um papel essencial de regulamentar em muitas condições patológicas, tais como câncer, doenças do sistema nervoso central e doenças do sistema imunológico-dependente. A modificação pós-traducional de vinculação de GTP e GTPases Rho (ou seja, Prenilação por intermediários de via do mevalonato) são fatores-chave que afetam a ativação desta proteína. Neste trabalho, dois métodos simples e essenciais são fornecidos para detectar uma gama ampla de GTPase Prenilação e atividades de vinculação de GTP. Detalhes dos procedimentos técnicos que têm sido utilizados são explicadas passo a passo neste manuscrito.
Introduction
As GTPases Rho são um grupo de pequenas proteínas (21-25 kDa), que são bem conservadas ao longo da evolução e formar uma única subfamília na superfamília de Ras de pequenas GTPases. Cada subfamília dentro desta superfamília, há um núcleo de domínio compartilhado G que está envolvido na atividade GTPase e nucleotídeos troca1. A diferença entre a família Rho e as outras subfamílias de Ras é a presença de um "domínio de inserção de Rho" dentro da vertente β 5th eth 4 hélice α no pequeno domínio GTPase2.
Com base na classificação recente, as GTPases Rho são consideradas uma família de proteínas que se encaixam a superfamília de Ras GTPase3de sinalização. Mamíferos GTPases Rho tem 22 membros com base em sua função específica e caracterização geral4 em que RhoA, Rac1 e Cdc42 estão entre os membros mais estudado neste grupo. As GTPases Rho estão ligadas intracelular sinalização percursos através de um mecanismo rigidamente regulamentado, que é dependente de interruptores molecular através de modificações do posttranslational proteína5.
GTP carregando hidrólise mecanismos essenciais no ciclo de ativação/desativação de pequenas GTPases Rho e são regulamentados através de proteínas GTPase-ativando (lacunas). As lacunas são responsáveis para a hidrólise de GTP e trabalham em conjunto com guanina nucleotídeo troca fatores (GEFs) que são responsáveis para a reação de GTP-carregamento. Inibidores de dissociação de Rho PIB (GDIs) fornecem mais regulamento de pequenas GTPases Rho através de ligação para o PIB-limite Rho GTPases. Isto inibe a dissociação do PIB e facilita o sequestro de pequenas GTPases Rho longe de sites a membrana intracelular ativa. Há também mais Regulamento das proteínas de GTPase envolvendo a Prenilação de GDIs que regula tanto a hidrólise de nucleotídeos e troca e controles PIB/GTP ciclismo1,6,7,8.
Tanto GTP-carregamento Prenilação de GTPase são envolvidos no movimento de GTPase entre citosol e membranas celulares, alterando as propriedades lipofílicas destas proteínas1,9. Os reguladores acima referido interagirem com fosfolipídios da membrana celular e outras proteínas modulação do PIB/GTP troca atividade10. Além disso, GDIs, inibidores de dissociação, bloqueiam tanto a hidrólise de GTP e a troca GDP/GTP. GDIs inibir a dissociação das proteínas Rho inativas do PIB e, portanto, sua interação com a jusante efetores. GDIs também regular o ciclismo de GTPases entre o citosol e a membrana na célula. A atividade de GTPases Rho depende em grande medida seu movimento para a membrana da célula; assim, GDIs são considerados como reguladores críticos que podem sequestrar as GTPases no citoplasma através de esconder sua região hidrofóbica/domínios11,12.
Para ter uma ótima sinalização e função em todas as fases do seu ciclo de ativação de GTPase, o ciclo dinâmico da hidrólise de GTP-carregamento/GTP é crucial. Qualquer tipo de alterações neste processo pode resultar em alterações subsequentes na célula funções regulamentadas de GTPase, tais como célula polaridade, proliferação, morfogênese, citocinese, migração, adesão e sobrevivência13,14.
O protocolo atual oferece aos leitores com um método detalhado para monitorar pequeno RhoA GTPase ativação através de investigação de suas Prenilação e PIB/GTP de carregamento. Esse método também pode ser usado para detectar a Prenilação e vinculação de GTP de uma vasta gama de pequenas GTPases. A GTPase de imunoabsorção pode ser usada para medir o nível de ativação de outros tipos de GTPases, tais como Rac1, Rac2, RAP3, H, K ou N-Ras, Arf e Rho15. A agente farmacológico sinvastatina é usada como um exemplo, como recentemente foi relatado para ser envolvido na regulação do pequeno de GTPase Prenilação e atividade8,9,14,16.
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Protocol
1. determinação da localização de RhoA usando membrana/citosol fracionamento
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Tratamento com células cultura e sinvastatina
- Semente de 50.000 de U251 células em um 100 mm prato e cultura-los em Dulbecco modificado médio da águia (DMEM) (alta glicose, 10% de soro fetal bovino [FBS]).
- Quando 30% confluente, tratar as células, removendo o meio e acrescentando que contêm simvastatin médio-lhe (10 µM de sinvastatina dissolvida em Dimetilsulfóxido [DMSO]) e incube por 36 h a 37 ° C8. Uso de DMSO sozinho como um controle de veículo.
Nota: 10 milhões de células são necessárias para o fracionamento do citosol e membrana das células.
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Coleção de células
- Remova as células da incubadora a 37 ° C. Olhe para as células sob um microscópio para confirmar a confluência.
Nota: As células devem ser confluente de 70-80%. - Aspire o meio, lavar as células 1 x com frio fosfato salino (PBS). Adicionar 5 mL de tampão de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) o ácido (KCl: 400 mg/L, NaCl: 6800 mg/L, NaHCO3: 2200 mg/L, NaH2PO4. H2O: 140 mg/L, D-glicose: 1.000 mg, dissódico EDTA: 373 mg/L) por placa e lugar as células de volta para a incubadora de 37 ° C por 5 min.
- Depois de 5 min. de incubação, colete o EDTA com as células em um tubo de 15 mL contendo a mesma quantidade de meio como EDTA.
Nota: Ter médio no tubo neutraliza o EDTA e impede qualquer digestão mais das membranas celulares. - Colocar o tubo em uma caixa de gelo e prossiga para a centrífuga.
- Configurar o centrifugador para 1.500 x g a 4 ° C e girar as células por 5 min.
- Remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento e adicione 1 mL de PBS frio. As células se misturam bem.
- Transfira a mistura de célula (solução) para um novo tubo de 1,5 mL, centrifugar a 1.500 x g a 4 ° C e girar as células por 5 min.
- Verificar o tamanho da pelota (para estimar o volume da reserva para o próximo passo). Coloca as amostras no gelo. Desprezar o sobrenadante completamente sem perturbar o sedimento.
- Adicionar tampão gelada (10 mM Tris-HCl [pH 7,5], 0,1 mM EDTA, EGTA de 0,1 mM, 1mm ditiotreitol e coquetel de inibidor de protease), misturar as amostras bem pipetando para cima e para baixo e em seguida, proceder à sonication.
- Remova as células da incubadora a 37 ° C. Olhe para as células sob um microscópio para confirmar a confluência.
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Sonication
- Definir o sonicador de cinco ciclos, 5 s cada e repita 3x.
- Execute o sonication no gelo. Prossiga para o se.
Nota: Gelo e fria condição preservar as proteínas e tornar os resultados mais confiáveis.
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Ultracentrifugação
- Use um se separar a célula homogenates em citoplasmática e fracções de membrana. Definir o centrifugador para 100.000 x g durante 35 minutos a 4 ° C. Como mostrado na Figura 1, verificar o tamanho da pelota.
Nota: A fração de membrana é na parte inferior do tubo e o resto é outros componentes citoplasmáticos. - Recolha o sobrenadante completamente, tomando cuidado para não perturbar a pelota. O sobrenadante é a fração citosólica. Coloque o sobrenadante em um tubo recém rotulado.
- Adicionar 300 µ l de tampão de dissociação (amortecedor II) (50 mM Tris-HCl [pH 7,5], 0,15 M NaCl, 1mm ditiotreitol, SDS 1%, 1 mM EDTA, 1mm EGTA e coquetel de inibidor de protease) ao pellet (contém a fração de membrana). Misture bem pipetando para cima e para baixo.
- Proceda à determinação da proteína e preparação da amostra de borrão ocidental (análise de immunoblot).
- Use um se separar a célula homogenates em citoplasmática e fracções de membrana. Definir o centrifugador para 100.000 x g durante 35 minutos a 4 ° C. Como mostrado na Figura 1, verificar o tamanho da pelota.
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Immunoblotting
- Prepare a proteína de célula extratos de frações separadas em tampão de lise (20 mM Tris-HCl [pH 7,5], 0.5 mM PMSF, detergente não-iônico de 0,5%-40, 100 µM β-glicerol-3-fosfato e 0,5% inibidor da protease cocktail).
- Medir a concentração de proteína usando o método de Lowry8 e calcular o volume de lise (20 mM Tris-HCl [pH 7,5], 0.5 mM PMSF, 0,5% de detergente nondenaturing, octylphenoxypolyethoxyethanol, 100 µM β-glicerol-3-fosfato e 0,5% coquetel de inibidor de protease) para normalizar a concentração de proteína entre as amostras.
- Aquecer as amostras a 90 ° C por 5 min e 15-20 µ l das amostras em um gel de SDS-PAGE de 15% para separar as proteínas de carga.
Nota: Carga de 1 µ g de proteína para cada amostra. Calcule o volume que precisa ser executado em conformidade. - Transferi as proteínas separadas para membranas de nylon sob reduzir condições (500 nM glicina, 50 mM Tris-HCl e 20% metanol) por 2h, à temperatura ambiente (RT) a 100 V.
Nota: Para confirmar a transferência bem-sucedida de proteína, use Ponceau mancha ou visualizar o marcador de proteína na membrana. - Bloquear as membranas com leite em pó desnatado 5% e 1 x salino Tris contendo o detergente (TBS/0.01% detergente não iônico; TBST) para bloquear a ligação de anticorpos inespecíficos a 4 ° C durante a noite ou em RT por 1h.
- Acrescente os anticorpos primários para análise de immunoblotting e incubar durante a noite a 4 ° C.
Nota: Neste experimento, Rac1/2/3, cdc42, RhoA, GAPDH e pancaderina foram usados em uma diluição de 1:1,000 em leite de 1% em 1 x TBST. Pancaderina e GAPDH foram usados para confirmar a membrana e pureza de fração citosólica, respectivamente. - Lave as membranas 3 x com um tampão de lavagem com 1 x TBST por 20 min.
- Incubar as membranas com peroxidase de antirábano coelho (HRP)-anticorpo secundário conjugado para os respectivos anticorpos primários (para 1 h, a RT).
- Lave os borrões 3x por 20 min e desenvolvê-los com deteção melhorada quimioluminescência (ECL).
2. medição da carga de GTP de RhoA usando um ensaio pequeno G-proteína de ativação
- Contagem de 10.000 células/mL e cultura as células U251 100mm prato.
- Quando eles são 30% confluente, trate as células com sinvastatina, conforme descrito na etapa 1.1.2.
- Leva os pratos de cultura fora da incubadora. Olhe para as células ao microscópio para confirmar a confluência. Certifique-se de que as células são 70% - 80% de Confluencia. Coloque o prato de Petri no gelo, aspirar a mídia e lavar as células 3 x com gelada PBS (pH 7,2).
- Aspire a PBS. Incline o prato de Petri no gelo por um minuto adicional remover todos os restos de PBS.
Nota: PBS Residual afeta negativamente neste ensaio. - Lise as células em um volume de 700 µ l de tampão de Lise gelada contendo inibidores de protease e fosfatase.
Nota: 700 µ l é geralmente suficiente para uma placa de Petri de 100mm. Consulte a tabela 1 para encontrar o volume adequado para cada navio de cultura. - O lisado celular da colheita com o raspador de célula. Incline o prato de cultura para esta técnica.
- Transfira o lisado para um rotulado criotubo gelado e mantê-lo no gelo.
- Misture cuidadosamente usando um vórtice. Manter 10 µ l do lisado para o ensaio da proteína, para medir a concentração de proteína na amostra.
- Snap-congelar as células restantes lisado em nitrogênio líquido.
Nota: Prepare várias alíquotas de lisado antes do snap-congelamento-los, para evitar os ciclos de congelamento/descongelamento repetidos que podem levar à perda da atividade de RhoA GTPase celular. - Transferir o cryotubes snap-congelado para um freezer-80 ° C e armazenar as amostras para o teste de imunoadsorção de GTPase.
Obs.: Não armazene as amostras durante mais de 14 dias. Trabalhar rapidamente e nunca deixe as amostras no gelo por mais de 10 min. Nunca manipular todos os pratos de Petri simultaneamente. - Medir a concentração de proteína usando o método de Lowry8 e calcular o volume da lise para normalizar a concentração de proteína entre as amostras.
Nota: A melhor concentração geralmente é de 1 mg/mL; no entanto, 0.3 - 2 mg/mL pode ser detectável. - Prepare um controle em branco, acrescentando 60 µ l de tampão de Lise e 60 µ l de tampão de ligação para um microtubo.
Nota: O controle em branco tem todos os reagentes, exceto o antígeno e é usado para a subtração do fundo. - Prepare um controlo positivo, acrescentando 12 µ l de proteína de controle Rho, 48 µ l de tampão de Lise e 60 µ l de tampão de ligação.
Nota: O controlo positivo tem todos os reagentes mais um antígeno confirmado para Rho-A-GTP. - Levar o prato de afinidade de Rho fora de seu saco e coloque-o no gelo.
- Dissolva o pó em poços com 100 µ l de água destilada gelada. Manter a placa no gelo.
- Descongele os lysates célula snap-congelado em um banho de água situado a 25 ° C.
- Adicione o volume calculado de Lise gelada (da etapa 2.11) para cada amostra para normalizar a concentração de proteína.
Nota: Retire a PBS após lavar as células (usando um aspirador de tubo de vácuo) para evitar causando alterações na composição da lise. Equalize a proteína de amostra para uma concentração entre 0,8 e 2 mg/mL para uma comparação exata entre as amostras em ensaios de ativação GTPase. A tabela 2 fornece detalhes sobre a reserva a ser utilizado para este teste. - Transferir 60 µ l das amostras geladas normalizadas para microtubos e adicionar 60 µ l de binding buffer; Homogeneizar as amostras e mantê-los no gelo.
- Remova completamente as água/soluções de microplate por agredir vigorosa, seguido por cinco a sete torneiras difícil num tapete de laboratório.
- Adicione 50 µ l de amostras normalizadas, um controle em branco e um controlo positivo nos poços em duplicatas.
- Coloque a placa em um agitador orbital por 30 min a 4 ° C a 300 rpm.
Nota: A etapa de agitação é muito importante, e é recomendável usar o agitador orbital placa a 300 rpm. - Limpar as amostras da placa por agredir e lavá-los 2 x com 200 µ l de tampão de lavagem em RT. vigorosamente remover o tampão de lavagem dos poços depois de cada lavagem, passando rapidamente, seguido por rosqueamento e manter a placa no banco no RT
- Adicionar 200 µ l de tampão de apresentadoras RT a cada poço e incubar a RT por 2 min.
- Agite a solução dos poços e lavar os poços 3 x com 200 µ l de tampão de lavagem em RT
- Adicione 50 µ l de acabadas anticorpo primário anti-RhoA de 1/250 a cada poço.
- Coloque a placa em um agitador orbital por 45 min a 300 rpm definido como 25 ° C. Agite a solução do poço.
- Repita as etapas de lavagem 2 x (etapa 2.24).
- Adicione 50 µ l de acabadas anticorpo secundário anti-RhoA de 1/250 a cada poço.
- Coloque a placa em cima de um agitador orbital por 45 min a 300 rpm definido como 25 ° C.
- Preparar o reagente de detecção HRP misturando volumes iguais de Reagente A e do reagente B.
- Agite a solução de cada poço e lavar os poços 3 x com 200 µ l de tampão de lavagem em RT
- Adicione 50 µ l de reagente de deteção de HRP preparada para cada poço.
- Leia o sinal luminescente dentro de 3-5 min para obter o máximo sinal e analisar os resultados usando um pacote de software apropriado.
Nota: As leituras devem ser tomadas dentro de 3-5 min para obter o máximo sinal. Executar uma placa de"teste" para confirmar a Lise adequada volume de tampão está sendo usado para os lisados celulares para que a concentração de proteína é alta o suficiente para detectar atividade de RhoA GTPase. (Uma placa de teste é um prato de células usado para determinar se a concentração de proteína está dentro do intervalo aceitável e, também, para determinar se o volume da lise sendo usado é apropriado). O controle positivo deve ler 4 - a 10 vezes mais alto que os poços em branco se for no intervalo linear. Se não, em seguida, ajuste o luminómetro consultando o fabricante. As configurações para o luminómetro são dadas na tabela 3. - Insira os dados brutos nas colunas onde os títulos leia amostra, quer dizer, desvio padrão, rep1, rep2, rep3e rep4, que é para mostrar o número de repetições a ser feito em cada amostra.
- Em dizer, insira a fórmula =average(Xn:Yn) onde X = o designador de coluna para rep1, Y = o designador de coluna para rep4e n = o designador de linha da linha sendo trabalhado.
- Em desvio-padrão, insira a fórmula = DESVPAD (Xn:Yn) onde X = o designador de coluna para rep1, Y = o designador de coluna para rep4e n = o designador de linha da linha sendo trabalhado.
- Entra os replicar dados em rep1, rep2, etc.
- Depois de inserir os dados, use o método de clique e arraste para selecionar a amostra, quer dizere desvio padrão.
- Em software de análise de dados, selecione a função para o gráfico, fazendo que se parece com um quadrado com um gráfico de barras mini dentro.
Nota: Isso traz o gráfico tornando processo onde é possível aos gráficos de desenho baseados nos dados inseridos. - Escolher o gráfico de colunas e valores de entrada, designar os números de dizer .
Nota: O gráfico para os números de dizer é feito primeiro, e em seguida, a coluna de desvio padrão para as barras de erro do eixo y é designada. Para fazer isso, clique duas vezes em barras de gráfico, selecione a guia de erro do eixo y , clique a opção personalizada e selecione a área da planilha digitar a localização dos dados do desvio-padrão . A diferença entre os grupos que precisam ser comparados pode ser vista após a criação dos gráficos desejados.
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Representative Results
Fracionamento de membrana:
Ultracentrifugação foi usada para o fracionamento dos componentes de membrana e citoplasma. Como mostrado na Figura 1, o sobrenadante contém a fração citosólica e o sedimento contém a fração de membrana. A abundância de RhoA em andmembrane citosólica frações obtidos de células U251 foi examinada após o tratamento com sinvastatina usando immunoblotting. A pureza e controle da fração de membrana e citoplasma de carregamento foram confirmados por pancaderina e GAPDH, respectivamente. Como mostrado na Figura 2, o tratamento de sinvastatina reduziu a quantidade de membrana-limite RhoA GTPase, enquanto aumentou seu conteúdo citosólico. Isto é consistente com os efeitos conhecidos sobre a translocação de GTPases baseadas a inibição de RhoA Prenilação de estatinas. Sinvastatina inibe a Prenilação de RhoA GTPase, e portanto, unprenylated RhoA é incapaz de ancorar em membranas de plasma da pilha, que resulta em sua maior concentração citosólica.
Limite de RhoA-GTP:
Nós medido proteína RhoA GTP-limite usando um teste de imunoadsorção de GTPase e mostrou aquele simvastatin significativamente (P < 0.05) aumentou RhoA GTP-limite nas células U251 (Figura 3). Portanto, enquanto simvastatin inibidas Prenilação de proteína RhoA GTPase (Figura 2), também aumentou sua GTP em comparação com as células de controle de carregamento. Isso aponta para o fato de que a Prenilação e GTP ligação ambos desempenham um papel na atividade e regulamento de RhoA GTPase. Para obter detalhes adicionais sobre este fenômeno, por favor referir-se a publicação original usando este protocolo8.
Figura 1 : Visão esquemática das frações citosol e membrana após ultracentrifugação. A pelota contém a fração de membrana e o sobrenadante contém a fração citosólica.
Figura 2 : Sinvastatina altera a localização de RhoA. U251 células foram tratadas com sinvastatina (10 µM; 12, 24 e 36 h) e a abundância de RhoA na membrana e frações citosólica foi determinada pelo immunoblotting. A abundância GAPDH e pancaderina também foi avaliada para controle para carregamento no citosol e membrana frações e para confirmar a ausência de contaminação citosólica nas fracções da membrana. Os dados são normalmente de três experimentos independentes usando diferentes culturas primárias. Esta figura foi modificada de Alizadeh et al 8. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Sinvastatina modula a actividade de RhoA GTPase. A GTPase de imunoabsorção foi usada para medir a proteína GTP-limite Rho nas células U251. Diferentes condições foram testadas para 36h, incluindo fome e sinvastatina (10 µM). Para cada experimento, uma proteína RhoA constitutivamente ativa, fornecida no kit foi usada como controle positivo. Os resultados são expressos como a média ± DP de duas repetições em experimentos independentes (* P < 0,001). Esta figura foi modificada de Alizadeh et al 8.
| Navio de cultura celular | Área de superfície (cm2) | Tampão de lise (µ l) | |
| Pratos | 35 mm | 9 | 100 |
| 60 mm | 21 | 300 | |
| 100 mm | 55 | 700 | |
| 150 mm | 145 | 1500 | |
| Placas | 6-poços | 9.4 / bem | 100 |
| 12-poços | 3.8 / bem | 70 | |
| 24-bem | 1.9 / bem | 40 | |
| Garrafas térmicas | T-25 | 25 | 250 |
| T-75 | 75 | 1000 | |
| T-150 | 150 | 1500 | |
Tabela 1: Recomendou volumes de lise de células U251. O volume é ajustável para diferentes tipos de células.
| Nome de tampão de Lise | Composição de tampão de Lise | G-proteína alvo | Notas |
| GL35 | Tris (1 X GL36), MgCl2 (8 X GL36), NaCl (2 X GL36), IGEPAL (1 X GL36), SDS (5 X GL36) | CDC42 | Componentes idênticos para GL36, composição varia da seguinte forma; |
| GL36 | uma formulação patenteada de Tris pH 7,5, MgCl2, NaCl, IGEPAL e SDS | RalA | Tampão-padrão, compatível com mais de GTPase-lig da imunoabsorção ensaios. |
| GL36 | uma formulação patenteada de Tris pH 7,5, MgCl2, NaCl, IGEPAL e SDS | Rac1 | Tampão-padrão, compatível com mais de GTPase-lig da imunoabsorção ensaios. |
| GL36 | uma formulação patenteada de Tris pH 7,5, MgCl2, NaCl, IGEPAL e SDS | Rac1, 2, 3 | Tampão-padrão, compatível com mais de GTPase-lig da imunoabsorção ensaios. |
| GL36 | uma formulação patenteada de Tris pH 7,5, MgCl2, NaCl, IGEPAL e SDS | Ras | Tampão-padrão, compatível com mais de GTPase-lig da imunoabsorção ensaios. |
| GL36 | uma formulação patenteada de Tris pH 7,5, MgCl2, NaCl, IGEPAL e SDS | RhoA | Tampão-padrão, compatível com mais de GTPase-lig da imunoabsorção ensaios. |
| GL36 | uma formulação patenteada de Tris pH 7,5, MgCl2 | Arf1 | Tampão-padrão, compatível com mais de GTPase-lig da imunoabsorção ensaios. |
Tabela 2: Lista de GTPase-lig da imunoabsorção ensaio buffers de Lise e recomendado a composição de Lise para pequenas GTPases.
| Parâmetros | Notas | ||
| GANHO DE | Opção de ganho ajusta a sensibilidade da máquina. A maioria dos luminometers usar calibração automática ou função limitada da calibração. Usuário deve ler o ganho em baixa, média e alta para ver se a leitura está dentro da escala linear que varia em diferentes instrumentos. | ||
| TEMPO DE INTEGRAÇÃO | É recomendável ter esta opção no seu mais baixo como o Altíssimo vezes pode ler fora da escala linear. Isso pode exigir trabalho desnecessário, como o uso de menor diluição ou anticorpos primários e secundários. TEMPO de integração também varia em diferentes instrumentos. | ||
| A TREMER | É recomendável usar o 5s agita orbital. Não é tão crítico como outros parâmetros para a precisão do ensaio. | ||
| TEMPERATURA | Recomenda-se temperatura ambiente | ||
| TIPO DE PRATO | Usar de acordo com a placa que você está usando. Geralmente a placa é de 96 poços, liso e branco. | ||
| FILTROS | Filtros de excitação ou emissão não são necessários para luminescência. Excitação pode ser definida para qualquer valor desejado e gama óptima para emissão é de 430-445 nm. Os espaços do filtro deixe em branco. Se isto não é uma opção, | ||
Tabela 3: Uma descrição detalhada das configurações do luminómetro.
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Discussion
Aqui nós descrevemos um método exato para medir pequena GTPase Prenilação e vinculação de GTP mostrado como pequena GTPase Localização subcellular (membrana contra citosol) e Rho GTP carregando. As GTPases pequenas são expressos em células eucarióticas e desempenham um papel essencial na proliferação celular, mobilidade e estrutura. Ambos Prenilação e vinculação de GTP estão envolvidos na regulação da atividade GTPase; Portanto, os ensaios para avaliar a Prenilação e vinculação de GTP destas proteínas são ferramentas importantes para a célula biólogos1,8.
Baseado nos resultados de um estudo recente, Rho proteína GTP a carregar é o tipo de célula específico8e portanto, difere entre diferentes tipos de células. Além disso, a Localização subcellular e geranylgeranylation (GGT) de proteínas Rho são as etapas determinantes na regulação da sua função. Isto também é regulado pela interação das proteínas efetoras GEF, GAP e GDI para as major GTPases.
Sinvastatina é conhecida por aumentar a carga de Rac GTP em monócitos THP-1, diminuir a Prenilação de Rac na presença de estimulação β amiloide e reduzir as respostas inflamatórias destas células17. Também sabemos que a função de células T não é afetada pelo GTP Rho carregando mas, pelo contrário, a GGT de Rho determina função18,19. Portanto, recomendamos que, a fim de detectar atividade de GTPase, tanto Prenilação e carregamento de GTP devem ser simultaneamente medidos nas células.
Digno de nota, para alcançar alta pureza citosólica e fracções de membrana, os passos mais importantes do protocolo são o sonication e a ultracentrifugação. Para o ensaio de Rho GTP-vinculação, o passo mais crítico é snap-congelamento os lisados celulares antes processamento sequencial. Seguindo estes passos importantes produzirá resultados consistentes e reprodutíveis no estudo de GTPases em sistemas vivos.
Um passo fundamental para examinar uma determinada proteína estrutura ou membrana intracelular é a separação dos compartimentos celulares entre si. Fracionamento tira proveito das propriedades de cada compartimento celular, como o tamanho e forma, densidade de carga superficial e densidade flutuante20. Baseia-se principalmente na centrifugação diferencial em mídia de alta viscosidade a 4 ° C. O método de fracionamento de membrana que foi usado aqui baseia-se principalmente sobre o tamanho de cada compartimento e alta velocidade gravitacional onde, após ultracentrifugação, proteínas de membrana vai para o fundo do tubo e as proteínas cytosolic permanecem na sobrenadante.
É importante notar que as amostras contendo concentrações de alta proteína e, possivelmente, níveis elevados de lacunas potencialmente podem inativar o alvo de GTPase. Esse problema pode ocorrer mesmo em Lise e pode levar a resultados falsos negativos. Dentre os principais parâmetros que determinam o sucesso e a reprodutibilidade dos resultados de ensaio de atividade GTPase são a saúde e a capacidade de resposta das células sendo usado no experimento8. É altamente recomendável que os investigadores identificam as condições de crescimento ideal/apropriado e tempo de duplicação para as células em estudo para determinar a ativação/inibição de GTPase. Além disso, a atividade GTPase de todas as GTPases pequenas é fortemente regulamentada e, portanto, suscetíveis à rápida diminui através de hidrólise da molécula de GTP ligado a enzima através a ação das lacunas (durante e após o procedimento de lise celular ). Esta ação resulta em inativação rápida da GTPase de interesse. Portanto, é altamente recomendável que lysis da pilha é executada rapidamente a 4 ° C, para obter resultados precisos e reprodutíveis.
Existem vários fatores dependendo das condições experimentais que determinam o lisado celular total final. Primeiro, a quantidade total de RhoA GTPase na linhagem de células ou tecidos específicos: a quantidade de endógena RhoA GTPase é variável em diferentes tipos de células e tecidos; Portanto, isso pode resultar em uma resposta mais vigorosa a um ativador ou deactivator. Segundo, a quantidade de ativação/desativação alcançada nas condições experimentais: é importante considerar que aproximadamente 2% a 10% do total de celular GTPase pequeno possivelmente é ativada em resposta a um estímulo específico8. A quantidade de desativação também exclusivamente depende do tipo de estímulos e é variável em diferentes células e tecidos. Portanto, para cada tipo de ensaio de atividade de GTPase pequeno, a composição do compartimento celular e tampão de Lise é crucial. A tabela 3 mostra a composição recomendada da lise para cada proteína específica de GTPase pequena.
A concentração de proteína lisado celular normalizado é um requisito importante porque permite que os investigadores comparar a atividade GTPase de amostras diferentes. Portanto, lavar as células de todas as amostras em todas as condições com PBS frio é obrigatório para remover a proteína dos meios de cultura de tecidos. Também é essencial que todos os reagentes e buffers são usados em baixas temperaturas (4 ° C) em todas as etapas do experimento. Esta temperatura fria minimizará a hidrólise de GTPases, incluindo de GTPase, durante a preparação da amostra. É fundamental que esse processamento de lisados celulares é conduzido rapidamente (de 10-15 minutos no total) para evitar a perda de atividade de RhoA GTPase. Além disso, é o passo mais importante da preparação lisado celular snap-congelamento em nitrogênio líquido para manter a actividade enzimática RhoA pequena GTPase alíquotas do lisado. Isto é especialmente importante se houver diferentes momentos ou amostras múltiplas no experimento. Após a preparação da lysates snap-congelados, as amostras podem ser mantidas no-80 ° C sem perder a sua actividade de GTPase.
O protocolo fornecido para a análise da membrana de ancoragem de RhoA GTPase constitui apenas um instrumento indirecto para medir a Prenilação de GTPases pequenas e não é capaz de diretamente detectar ou quantificar a vinculação do isoprenoid resíduos para a proteína do alvo. Esta é uma das poucas limitações deste teste. Portanto, dá uma estimativa da Prenilação de proteínas. Foram definidas algumas abordagens que são capazes de medir diretamente FT (farnesylation) e/ou GGT farnesil transferase e/ou geranylgeranyl transferase, respectivamente, em culturas de células e em animais e humanos-derivado de tumores. Os ensaios de usam shift mobilidade electrophoretic, difosfato de farnesil [3H] e difosfato de geranylgeranyl [3H] e o ácido mevalónico [3H] rotulagem, seguido por imunoprecipitação e SDS-PAGE21.
Usamos a RhoA GTPase de imunoabsorção para detectar qualquer ancoragem da membrana e a atividade de RhoA GTPase. Consiste de uma proteína Rho-GTP-ligação que está ligada aos poços de uma placa de 96 poços. Então, o GTP-limite ativo Rho em células ou tecidos lisados vincula aos poços, enquanto o PIB-limite inativo Rho lavada durante as etapas de lavagem. Em seguida, o RhoA amarrado, ativo em poços será detectado utilizando um anticorpo específico de RhoA e quimioluminescência. É possível determinar o grau de ativação de RhoA, comparando as leituras de lisados celulares registrados para nonactivated. Fome de soro (o uso de meio livre de soro em culturas de células) é usado geralmente para inactivar RhoA em cultura de tecidos. Também deve ser mencionado que o intervalo do ensaio de imunoadsorção de GTPase de ativação requer 10-50 µ g de proteína para a detecção de atividade de RhoA GTPase.
É altamente recomendável que as amostras não tratadas têm baixos níveis de celulares basais da atividade GTPase (estado do controle). Como exemplo, fome de célula apropriada condições pode downregulate GTPase atividade e oferecem condições ideais para mostrar sua ativação em condições experimentais. Além disso, ensaios de ativação e a inibição são executados de forma a obter as melhores respostas de ativação/inibição de GTPase de tempo e dose-resposta. Mais importante, durante a preparação do celular, é muito importante o uso de células que não são overconfluent (> 70%), para evitar qualquer nonresponsiveness das células aos estímulos de ativação/inibição.
Luminometers diferem consideravelmente em termos de sensibilidade e leituras absolutas. Portanto, a fim de determinar o que é na faixa linear, sugerimos executando um teste de imunoadsorção de GTPase com um branco e um controlo positivo. Se o ensaio é de intervalo linear (o controle positivo deve ser 4x - 10x maior do que o buffer de somente leitura) ou a leitura em branco é superior a 9 milhões, em seguida, recomenda-se usar ainda mais diluições de anticorpo. Além disso, é altamente recomendável calibrar o luminómetro ler dentro da escala linear do ensaio antes de iniciar o ensaio.
Também existem vantagens para o teste de imunoadsorção de GTPase que vale a pena mencionar. Ensaios de GTPase-lig da imunoabsorção melhorar o atual desenho experimental e habilitar a tecnologia facilitar experiências que não eram possíveis com antigas técnicas de menus pendentes22. Os ensaios de GTPase-lig da imunoabsorção também fornecem precisão de deteção e sensibilidade que permite análises de atividade GTPase em preparações previamente proibido para ensaios suspensos23. Alguns estudos recentes comparados a ensaios de ativação GTPase-lig da imunoabsorção com pull-downs e concluiu que GTPase de imunoabsorção tem algumas vantagens claras, ou seja que ensaios de imunoadsorção de GTPase são superiores devido a sua capacidade de usar pequenas quantidades de proteína22,24, sua maior sensibilidade24e suas medições quantitativas23. O kit de ensaio de imunoadsorção de GTPase está disponível em luminometric ou versões de Detecção colorimétrica, onde os ensaios de luminometric são mais sensíveis. Este teste de imunoadsorção de GTPase é baseado em um protocolo bastante simples e rápido, requer apenas pequenas quantidades de amostra e produz resultados precisos e quantitativos. Portanto, seria uma boa ideia para desenvolver ainda mais este ensaio para detectar outros tipos de proteínas GTPase-baseado em células de cultura de tecidos e linhas celulares diferentes com uma muito maior especificidade e precisão.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Saeid Ghavami foi apoiado por uma saúde ciência centro operacional Grant, CHRIM funcionamento grant e Manitoba novo investigador operando bolsa de investigação. Javad Alizadeh foi apoiado pela bolsa de estudo de pesquisa de Manitoba. Shahla Shojaei foi apoiado por uma subvenção de funcionamento de fundação de ciência saúde e a sociedade pós-doutorada MITACS acelerar. Adel Rezaei Moghadam foi apoiado por um NSERC operacional de concessão que foi realizada por Joseph W. Gordon. Amir r. Zeki foi apoiado pelo prêmio NIH/NHLBI K08 (1K08HL114882-01A1). Marek J. Los gentilmente reconhece o apoio do NCN conceder #2016/21/B/NZ1/02812, apoiado por LE STUDIUM Instituto de estudos avançados (região centro-Val de Loire, França) através do seu programa geral de vale de Loire esperto e co-financiado pela Marie Acções de Sklodowska-Curie, grant #665790. Simone da Silva Rosa foi apoiada pela bolsa de estudo UMGF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM high Glucose | VWR (Canada) | VWRL0101-0500 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR (Canada) | CA45001-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR (Canada) | 97062-806 | |
| EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid) | VWR (Canada) | CA71007-118 | |
| EGTA (Ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) | VWR (Canada) | CAAAJ60767-AE | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | VWR (Canada) | CA97061-340 | |
| Ammonium Persulfate | VWR (Canada) | CABDH9214-500G | |
| Tris-Hydroxymethylaminomethane | VWR (Canada) | CA71009-186 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution | Biorad (Canada) | 1610158 | |
| TEMED | Biorad (Canada) | 1610801 | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma/Aldrich (Canada) | P8340-5ML | 1:75 dilution |
| Rho-GTPase Antibody Sampler Kit | Cell Signaling (Canada) | 9968 | 1:1000 dilution |
| Pan-Cadherin antibody | Cell Signaling (Canada) | 4068 | 1:1000 dilution |
| GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology (USA) | sc-69778 | 1:3000 dilution |
| RhoA G-LISA Activation Assay (Luminescence format) | Cytoskeleton Inc. (USA) | BK121 | Cytoskeleton I. G-LISA Activation Assays Technical Guide. 2016. |
| RhoA Antibody | Cell Signaling | 2117 | |
| ECL | Amersham-Pharmacia Biotech | RPN2209 | |
| Anti-Rabbit IgG (whole molecule) Peroxidase antibody | Sigma | A6154-1ML | |
| SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | 1612071A | Spectrophotometer |
| Nonidet P-40 | Sigma | 11332473001 | non-denaturing detergent, octylphenoxypolyethoxyethanol |
| DMSO | Sigma | D8418-50ML | |
| PBS | Sigma | P5493-1L | |
| Phophatase Inhibitor cocktail | Sigma | P5726-5ML | 1:75 Dilution |
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