Summary
Burada tarif biz prenilasyon ve guanozin-5'-trifosfat (GTP) araştırmak için bir protokol-Rho GTPazlar yükleme. Bu protokol iki detaylı yöntemi oluşur, yani membran ayırma ve GTPazlar bağlı immunosorbent assay. Protokolü prenilasyon ve GTP ölçmek için kullanılabilir diğer küçük GTPases'den başka bir yükleme.
Abstract
Rho GTPazlar aile Ras süper ait olan ve yaklaşık 20 üyesi insanlarda içeren. Rho GTPases hücre iskeleti dynamics, hücre hareketliliği, hücre polarite, aksonlar rehberlik, veziküler kaçakçılığı ve hücre döngüsünün kontrolü de dahil olmak üzere çeşitli hücresel fonksiyonları Yönetmelikte önemlidir. Rho GTPazlar sinyal değişiklikleri birçok patolojik koşulları, kanser, merkezi sinir sistemi hastalıkları ve bağışıklık sistemine bağlı hastalıklar gibi önemli bir düzenleyici rol oynamaktadır. Rho GTPases (yani, prenilasyon mevalonate yolu intermediates tarafından) ve GTP bağlama ardından değişiklik bu proteinin aktivasyonu etkileyen önemli faktörler vardır. Bu yazıda, Rho GTPazlar geniş aralığı prenilasyon ve GTP bağlama faaliyetleri tespit etmek için iki temel ve basit yöntem sağlanır. Kullanılmış olan teknik prosedürler ayrıntılarını açıklanmıştır adım adım bu el yazması.
Introduction
Rho GTPases de evrim korunmuş ve küçük GTPases Ras süper benzersiz bir alt form küçük proteinler (21-25 kDa), bir grubuz. Bu üst aile içinde her alt familya içinde GTPazlar etkinlik ve nükleotid exchange1söz konusu paylaşılan bir G etki alanı çekirdek vardır. Bir "Rho Ekle etki" 5inci β iplikçik ve küçük GTPazlar etki alanı24th α helix içindeki varlığı Rho aile ve diğer Ras alt familyaya arasındaki farktır.
Son sınıflandırmaya göre dayanarak, Rho GTPases Ras GTPazlar süper3içine sığacak proteinler sinyal bir aile olarak kabul edilir. Memeli Rho GTPases özel bir fonksiyonu ve RhoA, Rac1 ve Cdc42 bu grubun en okudu üyeleri arasında olan genel karakterizasyonu4 bağlı 22 üye var. Rho GTPases hücre içi sinyal yolları üzerinden için moleküler anahtarları ile protein ardından değişiklikler5üzerinde bağımlı olan sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir mekanizma bağlanır.
Yükleme GTP ve hidroliz temel mekanizmaları küçük Rho GTPases etkinleştirme/devre dışı bırakılması döngüsünde olan ve düzenlenmiş üzerinden GTPazlar aktive protein (boşluk). Boşluklar GTP hidroliz için sorumlu ve GTP-yükleme tepki için sorumlu olan guanin nükleotid Satım faktörler (GEFs) ile uyum içinde çalışmak. Rho GSYİH ayrılma inhibitörleri (GDIs) daha fazla GSYİH bağlı Rho GTPases için düzenleme, küçük Rho GTPases üzerinden bağlama sağlamak. Bu GSYİH ayrılma engeller ve küçük Rho GTPases etkin hücre içi membran siteleri uzak, iyon kolaylaştırır. Ayrıca daha fazla Rho GTPazlar proteinlerin nükleotit hidroliz ve değişimi ve denetimleri GSYİH/GTP1,6,7,8Bisiklete binme düzenleyen prenilasyon GDIs, ilgili yönetmelik olduğunu.
GTP-yükleme ve Rho GTPazlar prenilasyon Rho GTPazlar hareketi sitozol ve hücre zarlarında arasında bu proteinler1,9lipofilik özelliklerini değiştirerek söz konusu. Yukarıda belirtilen düzenleyiciler hücre membran fosfolipitler ve GSYİH/GTP Satım aktivite10modülasyonlu diğer proteinler ile etkileşim. Ayrıca, GDIs, ayrılma inhibitörleri, GTP hidroliz ve GSYİH/GTP değişimi engellemek. GDIs ayrılma GSYİH üzerinden etkin olmayan Rho proteinlerin ve bu nedenle, onların etkileşim ile aşağı akım effectors inhibe. GDIs da GTPases sitozol ve hücre membran arasında Bisiklete binme düzenler. Rho GTPases aktivite büyük ölçüde kendi hareketi hücre zarı için bağlıdır; Böylece, GDIs GTPases onların hidrofobik bölge/etki alanları11,12gizleme ile sitoplazma içinde çekilmek olabilir kritik düzenleyiciler olarak kabul edilmektedir.
Rho GTPazlar'ın bir optimum sinyal ve işlevi onun harekete geçirmek döngüsünün tüm aşamalarında olması gerekir GTP-yükleme/GTP hidroliz dinamik döngüsünü çok önemlidir. Değişiklikler bu süreçte her türlü hücre polarite, nükleer silahların yayılmasına karşı morfogenez, sitokinez, geçiş, yapışma ve hayatta kalma13,gibi14Rho GTPazlar tarafından düzenlenir hücre işlevlerinde değişiklikler neden olabilir.
Geçerli protokol okuyucuları onların prenilasyon ve GSYİH/GTP yükleme incelenmesi küçük RhoA GTPazlar harekete geçirmek yolu ile izlemek için detaylı bir yöntemle sağlar. Bu yöntem aynı zamanda prenilasyon ve küçük GTPases geniş bir GTP bağlama algılamak için kullanılabilir. GTPazlar bağlı immunosorbent assay harekete geçirmek-in GTPases, Rac1, Rac2, Rac3, H, K- veya N-Ras, Arf ve Rho15gibi diğer tür düzeyini ölçmek için kullanılabilir. Bu son zamanlarda küçük Rho GTPazlar prenilasyon etkinlik8,9,14,ve16Yönetmelikte dahil olmak bildirildi gibi farmakolojik Ajan simvastatin örnek olarak kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. membran/sitozol ayırma kullanarak RhoA lokalizasyon tespiti
-
Hücre kültür ve simvastatin tedavisi
- Tohum 50.000 hücreleri 100 mm çanak ve onları Dulbecco'nın kültür U251 kartal Orta (DMEM) (yüksek glikoz, % 10 fetal Sığır serum [FBS]) değiştiren.
- Ne zaman % 30 birleşmesi, orta kaldırma ve simvastatin içeren orta bunu (dimetil sülfoksit [DMSO] çözünmüş simvastatin 10 µM) ekleyerek hücreleri tedavi ve 37 ° C836 h için kuluçkaya. DMSO yalnız bir araç denetimi olarak kullanın.
Not: 10 milyon hücre hücreleri sitozol ve membran ayırma için ihtiyaç vardır.
-
Hücreler topluluğu
- Hücreleri 37 ° C kuluçka makinesi kaldırın. Confluency onaylamak için mikroskop altında hücreleri bakın.
Not: Hücreleri % 70-%80 birleşmesi olmalıdır. - Orta Aspire edin, hücreleri 1 yıkama x soğuk fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ile. Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) arabellek 5 mL ekleyin (KCl: 400 mg/L, NaCl: 6800 mg/L, NaHCO3: 2200 mg/L, NaH2PO4. H2O: 140 mg/L, D-glikoz: 1000 mg, EDTA disodyum: 373 mg/L) plaka ve hücreleri geri 5 min için 37 ° C kuluçka makinesi içine yer.
- EDTA orta aynı miktarı içeren bir 15 mL tüp hücrelerle EDTA, kuluçka 5 dk sonra toplamak.
Not: Orta tüp EDTA etkisiz hale getirir ve hücre zarlarında herhangi bir daha fazla sindirim engeller. - Tüp bir buz kutusuna koyun ve Santrifüj için devam edin.
- 5 min için hücreleri spin ve santrifüj 1.500 x g 4 ° C'de için ayarlayın.
- Pelet bozmadan süpernatant çıkarın ve 1 mL soğuk PBS ekleyin. Hücreler iyice karıştırın.
- Yeni 1,5 mL Tüp, santrifüj 1.500 x g 4 ° C'de, hücre karışımı (çözüm) aktarmak ve 5 min için hücreleri spin.
- (Sonraki adım için arabellek hacmi tahmin etmek için) Pelet boyutunu denetleyin. Örnekleri buza koyun. Süpernatant tamamen Pelet bozmadan atmak.
- Buz gibi soğuk arabellek (10 mM Tris-HCl [pH 7,5], 0,1 mM EDTA, 0,1 mM EGTA, 1 mM dithiothreitol ve proteaz inhibitörü kokteyl), ben de yukarı ve aşağı pipetting örnekleri karışımı ekleyin ve sonra sonication için devam edin.
- Hücreleri 37 ° C kuluçka makinesi kaldırın. Confluency onaylamak için mikroskop altında hücreleri bakın.
-
Sonication
- Beş çember, 5 sonicator ayarla s her ve tekrar 3 x.
- Sonication buz üzerinde gerçekleştirin. Ultracentrifuge için devam edin.
Not: Buz ve soğuk durumu proteinleri korumak ve sonuçları daha güvenilir olmasını sağlamak.
-
Ultrasantrifüj
- Bir ultracentrifuge hücre homogenates sitoplazmik içine ayırmak için kullanın ve membran kesirler. 100.000 x g 4 ° C'de 35 dk santrifüj ayarla Şekil 1' de gösterildiği gibi Pelet boyutunu denetleyin.
Not: Membran kesir tüp çok altında ve dinlenme sitoplazmik diğer bileşenler. - Süpernatant tamamen Pelet bozmamaya dikkat edin olurken toplamak. Süpernatant sitozolik kesir var. Yer süpernatant yeni etiketli bir tüp.
- Ayrılma arabelleği (arabellek II) 300 µL ekleyin (50 mM Tris-HCl [pH 7,5], 0.15 M NaCl, 1 mM dithiothreitol, % 1 SDS, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA ve proteaz inhibitörü kokteyl) (membran kesir içeren) Pelet için. Mix de yukarı ve aşağı pipetting.
- Protein belirlenmesi ve western blot (immunoblot Analizi) numune hazırlama için devam edin.
- Bir ultracentrifuge hücre homogenates sitoplazmik içine ayırmak için kullanın ve membran kesirler. 100.000 x g 4 ° C'de 35 dk santrifüj ayarla Şekil 1' de gösterildiği gibi Pelet boyutunu denetleyin.
-
Immunoblotting
- Hücre proteini lizis arabelleği (20 mM Tris-HCl [pH 7,5], 0,5 mM PMSF, %0,5 non-iyonik deterjan-40, 100 µM β-gliserol 3-fosfat ve %0,5 proteaz inhibitörü kokteyl) ayrılmış kesirler özleri hazırlayın.
- Lowry yöntemi8 kullanarak protein konsantrasyonu ölçümü ve lizis arabellek (20 mM Tris-HCl [pH 7,5], 0,5 mM PMSF, % 0.5 nondenaturing deterjan, octylphenoxypolyethoxyethanol, 100 µM β-gliserol 3-fosfat ve % 0,5 hacmini hesaplamak örnek arasında protein konsantrasyonu normalize etmek proteaz inhibitörü kokteyl).
- Örnekleri 5 min için 90 ° C'de ısı ve 15-20 µL proteinler ayırmak için % 15 SDS-sayfa jel üzerinde örnekleri yükleyin.
Not: her örnek için protein 1 µg yükleyin. Buna göre çalıştırılması gerekiyor hacim hesaplamak. - Ayrılmış proteinlerin 100 V (RT) Oda sıcaklığında 2 h için koşullar (500 nM glisin, 50 mM Tris-HCl ve % 20 metanol) azaltılması altında naylon membranlar aktarın.
Not: başarılı protein aktarımı onaylamak için Ponceau leke kullanın veya protein işaretçiyi membran üzerinde görselleştirin. - %5 yağsız Kuru süt ve 1 x Tris arabelleğe alınmış serum deterjan (TBS/0.01% Noniyonik deterjan; içeren membranlar engellemek TBST) 1 h için spesifik olmayan antikor bağlama gecede 4 ° C'de veya RT engellemek için.
- İmmunoblotting analiz için birincil antikorlar ekleyin ve bir gecede 4 ° C'de kuluçkaya
Not: Bu deneyde, Rac1/2/3, cdc42, RhoA, GAPDH ve pan-Cadherin 1:1,000 seyreltme % 1 süt 1'de kullanılan x TBST. Pan-Cadherin ve GAPDH membran ve sitozolik kesir saflık, sırasıyla onaylamak için kullanılmıştır. - Membranlar 3 yıkama x 1 çamaşır arabelleği ile x TBST 20 dk için.
- Membranların Anti-tavşan horseradish peroksidaz (HRP) ile kuluçkaya-Konjüge ikincil antikor ilgili birincil karşı antikorlar (için 1 h RT olarak).
- Lekesi yıkama 3 x 20 dk için ve onları gelişmiş Kemiluminesan (ECL) algılama ile geliştirmek.
2. RhoA GTP küçük G-protein harekete geçirmek tahlil kullanarak yük ölçümü
- Sayısı 10.000 hücre/mL ve Kültür 100 mm U251 hücrelerde çanağı.
- % 30 birleşmesi olduklarında, simvastatin hücrelerle 1.1.2. adımda açıklandığı gibi davran.
- Kuluçka makinesi dışında kültür tabakaları getir. Confluency onaylamak için mikroskop altında hücreleri bakın. Hücreleri % 70-%80 birleşmesi olduğundan emin olun. Buzda Petri kabına yerleştirin, medya Aspire edin ve hücreleri 3 yıkama x buz gibi PBS (pH 7.2) ile.
- PBS Aspire edin. Petri kabına PBS tüm kalıntıları çıkarmak bir dakika için buza yatırın.
Not: Kalan PBS bu tahlil olumsuz etkiler. - Fosfataz ve proteaz inhibitörleri içeren buz gibi lizis arabellek 700 µL hacmi hücreleri parçalayıcı.
Not: 700 µL genellikle yeterince bir 100 için Petri kabına mm'dir. Bkz. Tablo 1 her kültür araç için uygun birimi bulamıyor. - Lysate hücre hücre sıyırıcı hasat. Bu teknik kültür plaka eğim.
- Lysate etiketli bir buz gibi cryotube transfer ve buz üzerinde tutun.
- İyice bir girdap kullanarak karıştırın. Lysate örnek protein konsantrasyonunu ölçmek için protein tayini için 10 µL tutun.
- Ek-kalan hücre sıvı azot lysate donma.
Not: birden fazla aliquots hücrenin ek-RhoA GTPazlar aktivitesinin kaybına yol açabilir tekrarlanan donma/çözülme döngüsü önlemek için soğuğa daha önce lysate hazırlayın. - Ek donmuş cryotubes-80 ° C dondurucu aktarın ve örnekleri için GTPazlar bağlı immunosorbent assay depolayın.
Not: örnekleri 14 gün daha uzun süre tutmayın. Hızlı çalışın ve asla örnekleri 10 dk daha uzun süre buz bırakmaktır. Asla tüm Petri yemekler aynı anda işlemek. - Lowry yöntemi8 kullanarak protein konsantrasyonu ölçümü ve örnek arasında protein konsantrasyonu normalize etmek lizis arabellek hacmi hesaplamak.
Not: En iyi konsantrasyonu 1 mg/mL öyledir; Ancak, 0.3 - 2 mg/mL tespit olabilir. - Boş bir denetim için bir microtube lizis arabelleği 60 µL ve bağlama arabellek 60 µL ekleyerek hazırlayın.
Not: Boş denetim antijen hariç tüm reaktifler ve arka plan çıkarma için kullanılır. - Olumlu bir denetim 12 µL Rho denetim protein, 48 µL lizis arabelleği ve 60 µL bağlama arabelleği ekleyerek hazırlayın.
Not: Tüm reaktifler artı Rho-A-GTP için onaylanan bir antijen pozitif kontrol vardır. - Rho benzeşme plaka onun çanta dışarı alın ve buz üzerinde yerleştirin.
- Buz gibi soğuk distile su 100 µL Wells'le toz geçiyoruz. Plaka buz üzerinde tutun.
- Ek donmuş hücre lysates 25 ° C'ye ayarla bir su banyosu içinde çözülme
- Buz gibi lizis arabelleğinden (adım 2.11) protein konsantrasyonu normalize etmek her örnek için hesaplanan hacmi ekleyin.
Not: PBS lizis arabellek bileşiminde değişiklikler neden önlemek için (bir vakum tüplü aspiratör kullanarak) hücreleri yıkadıktan sonra kaldırın. Örnek protein konsantrasyonu 0.8 ve 2 mg/mL GTPazlar harekete geçirmek deneyleri örnekleri arasında doğru bir karşılaştırma için arasında eşitlemek. Tablo 2 bu tahlil için kullanılacak arabellek hakkında ayrıntılar sağlar. - Mikrotüpler için normalleştirilmiş buz gibi örneklerin 60 µL nakletmek ve arabellek bağlama 60 µL eklemek; örnekleri iyice karıştırın ve buz üzerinde tutun.
- Tamamen su/çözümleri Mikroplaka dinç flicking tarafından 5-7 sabit musluklar bir laboratuvar mat ardından kaldırın.
- Çoğaltmaları wells için 50 µL normalleştirilmiş örnekleri, boş bir denetim ve olumlu bir denetim ekleyin.
- Plaka bir orbital çalkalayıcı 300 rpm'de 4 ° C'de 30 dakika yerleştirin.
Not: Sallama adım çok önemlidir ve orbital plaka shaker 300 devir / dakikada kullanmak için önerilir. - Plaka örneklerinden flicking tarafından temizleyin ve yıkayın 2 x 200 µL, arabellek şiddetle dik yıkama ile çamaşır arabellek kuyulardan her yıkama sonra flicking tarafından dokunarak, takip kaldırın ve plaka bankta RT. tutun
- Her şey için RT antijen sunan arabelleği 200 µL ekleyin ve RT 2 min için kuluçkaya.
- Fiske kuyulardan çözüm ve kuyu 3 yıkama x 200 µL, arabellek RT. yıkama ile
- Taze hazırlanmış 1/250 anti-RhoA birincil antikor 50 µL her şey için ekleyin.
- 45 dk 300 rpm 25 ° C'ye ayarlamak için bir orbital çalkalayıcı plaka yerleştirin Kuyu çözümden hafifçe vur.
- 2 çamaşır adımları yineleyin x (adım 2.24).
- Taze hazırlanmış 1/250 anti-RhoA ikincil antikor 50 µL her şey için ekleyin.
- Plaka 45 dk 300 rpm 25 ° C'ye ayarlamak için bir orbital çalkalayıcı üstüne yerleştirin
- HRP algılama reaktif reaktif A ve reaktif b eşit miktarda karıştırılarak hazırlamak
- Fiske çözüm her kuyudan dışarı ve kuyu 3 yıkama x 200 µL, arabellek RT. yıkama ile
- Taze hazırlanmış HRP algılama reaktif 50 µL her şey için ekleyin.
- Yüksek sinyal elde etmek ve bir uygun yazılım paketi kullanarak sonuçları analiz için 3-5 dk içinde ışıklı sinyal okuyun.
Not: Okuma, yüksek sinyal almak için 3-5 dk içinde alınmalıdır. "Testi plaka" çalıştırmak protein konsantrasyonu RhoA GTPazlar bir etkinlik tespit için yüksek olması uygun lizis onaylamak için arabellek birim hücre lysates için kullanılıyor. (Bir testi plaka protein konsantrasyonu kabul edilebilir aralıkta düşerse belirlemek ve kullanılan lizis arabellek hacmi uygun olup olmadığını belirlemek için kullanılan hücre plakadır.) Doğrusal aralığında ise olumlu denetim boş kuyu daha yüksek 4 - için 10 - kat okumalısınız. Eğer değilse, sonra luminometer üretici Danışmanlık tarafından ayarlayın. Ayarları luminometer için Tablo 3' te verilmiştir. - Ham veri çoğaltır yapılmaktadır sayısını her örnek göstermek için olan rep4ve nerede başlıkları okumak örnek, demek, Standart sapma, rep1, rep2, rep3sütunları girin.
- Demekaltında formül =average(Xn:Yn) girin nerede X rep1, Y için sütun belirleyicisi = sütun belirleyicisi rep4ve n = varlık amele üstünde satır satır göstergesini =.
- Formül stdev (Xn:Yn) = Standart sapmagirin nerede X rep1, Y için sütun belirleyicisi = sütun belirleyicisi rep4ve n = varlık amele üstünde satır satır göstergesini =.
- Rep1, rep2, vb girin veri Çoğalt
- Verileri girdikten sonra tıkırtı ve çekme yöntemi örnek, demekve Standart sapmaseçmek için kullanın.
- Sonra veri analiz yazılımı, hangi ile bir mini bar grafiği'nin içini bir kare gibi görünüyor yapmak grafik için işlevi seçin.
Not: Bu grafik yapım süreci girilen verilere göre tasarım grafikler için mümkün olduğu kadar getiriyor. - Sütun grafiği seçin ve giriş değerleri için demek numaraları atayın.
Not: Grafik demek numaralar için ilk yapılır ve sonra y hata çubukları için Standart sapma sütun atanır. Bunu yapmak için üzerinde grafik çubukları çift tıklatın, y ekseni hata sekmesini seçin, özel seçeneğini tıklatın ve alanı Standart sapma verilerin konumunu girmek için çalışma sayfasında seçin. Karşılaştırılacak grupları arasındaki fark istenen grafik oluşturulduktan sonra görülebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Membran ayırma:
Ultrasantrifüj membran ve sitozol bileşenleri ayırma için kullanıldı. Şekil 1' de gösterildiği gibi süpernatant sitozolik kesir ve Pelet membran kesir içerir. RhoA bereket U251 hücrelerden elde edilen sitozolik andmembrane kesirler tedavi sonrası immunoblotting kullanarak simvastatin ile incelenmiştir. Saflık ve membran ve sitozol kesir kontrolünü yükleme pan-Cadherin ve GAPDH tarafından sırasıyla teyit edildi. Sitozolik içeriği artarken Şekil 2' de gösterildiği gibi simvastatin tedavi membran bağlı RhoA GTPazlar, miktarı azalır. Bu RhoA prenilasyon inhibisyonu dayalı GTPases translocation bilinen statinler etkileri ile tutarlıdır. RhoA GTPazlar prenilasyon simvastatin engeller ve bu nedenle, unprenylated RhoA onun yüksek sitozolik konsantrasyonlarda sonuç hücre plazma zarı, çapa değiştiremiyor.
RhoA-GTP bağlı:
Biz bir GTPazlar bağlı immunosorbent assay kullanarak GTP bağlı RhoA protein ölçülen ve o simvastatin önemli ölçüde gösterdi (P < 0,05) GTP bağlı RhoA U251 hücrelerinde (Şekil 3) arttı. Bu nedenle, simvastatin RhoA GTPazlar protein prenilasyon (Şekil 2) inhibe ederken, aynı zamanda onun GTP kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında yükleme arttı. Bu prenilasyon ve her ikisi de bağlama GTP bir rol RhoA GTPazlar düzenlenmesi ve aktivite oyun aslında puan. Bu olay ile ilgili daha fazla bilgi için lütfen bu protokolü8kullanarak özgün yayın bakın.
Resim 1 : Şematik ultrasantrifüj sonra sitozolik ve membran kesirler. Pelet membran kesir ve süpernatant sitozolik kesir içerir.
Resim 2 : Simvastatin değiştirir RhoA lokalizasyonu. U251 hücreleri simvastatin ile tedavi (10 µM; 12, 24 ve 36 h) ve RhoA bereket membran ve sitozolik kesirler immunoblotting tarafından tespit edildi. GAPDH ve pan-Cadherin bereket için yükleme sitozolik ve membran kesirler ve membran kesirler sitozolik kirlenme eksikliği onaylamak için denetime de değerlendirildi. Genellikle farklı birincil kültürler kullanarak üç bağımsız deneylerden verilerdir. Bu rakam Alizade ve ark. değiştirildi 8. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Simvastatin modüle RhoA GTPazlar etkinlik. GTPazlar bağlı immunosorbent assay GTP bağlı Rho protein U251 hücrelerdeki ölçmek için kullanıldı. Farklı koşullarda açlık ve simvastatin (10 µM) de dahil olmak üzere 36 h için test edildi. Her deneme için yapısal etkin bir RhoA protein kit ile sağlanan olumlu bir denetim olarak kullanıldı. Sonuçlar iki çoğaltır bağımsız deneylerde ortalama ± SD olarak ifade edilir (* P < 0.001). Bu rakam Alizade ve ark. değiştirildi 8.
| Hücre kültür gemi | Yüzey alanı (cm2) | Lizis arabellek (µl) | |
| Yemekleri | 35 mm | 9 | 100 |
| 60 mm | 21 | 300 | |
| 100 mm | 55 | 700 | |
| 150 mm | 145 | 1500 | |
| Plakaları | 6-iyi | 9.4 / iyi | 100 |
| 12-şey | 3.8 / iyi | 70 | |
| 24-şey | 1.9 / iyi | 40 | |
| Şişeler | T-25 | 25 | 250 |
| T-75 | 75 | 1000 | |
| T-150 | 150 | 1500 | |
Tablo 1: Lizis arabellek hacimleri U251 hücreler için önerilen. Farklı hücre tipleri için ayarlanabilir bir birimdir.
| Lizis arabellek adı | Lizis arabellek oluşturma | Küçük G-Protein hedef | Notlar |
| GL35 | Tris (1 X GL36), MgCl2 (8 X GL36), NaCl (2 X GL36), IGEPAL (1 X GL36), SDS (5 X GL36) | Cdc42 | GL36 aynı bileşenleri, kompozisyon aşağıdaki gibi değişir; |
| GL36 | Tris pH 7.5, MgCl2, NaCl, IGEPAL ve SDS tescilli bir formülasyon | RalA | Standart bir arabellek, en GTPazlar bağlı immunosorbent deneyleri ile uyumlu. |
| GL36 | Tris pH 7.5, MgCl2, NaCl, IGEPAL ve SDS tescilli bir formülasyon | Rac1 | Standart bir arabellek, en GTPazlar bağlı immunosorbent deneyleri ile uyumlu. |
| GL36 | Tris pH 7.5, MgCl2, NaCl, IGEPAL ve SDS tescilli bir formülasyon | Rac1, 2, 3 | Standart bir arabellek, en GTPazlar bağlı immunosorbent deneyleri ile uyumlu. |
| GL36 | Tris pH 7.5, MgCl2, NaCl, IGEPAL ve SDS tescilli bir formülasyon | RAS | Standart bir arabellek, en GTPazlar bağlı immunosorbent deneyleri ile uyumlu. |
| GL36 | Tris pH 7.5, MgCl2, NaCl, IGEPAL ve SDS tescilli bir formülasyon | RhoA | Standart bir arabellek, en GTPazlar bağlı immunosorbent deneyleri ile uyumlu. |
| GL36 | Tris pH 7.5, MgCl2 tescilli bir formülasyon | Arf1 | Standart bir arabellek, en GTPazlar bağlı immunosorbent deneyleri ile uyumlu. |
Tablo 2: GTPazlar liste bağlı immunosorbent lizis arabellekleri tahlil ve lizis kompozisyon küçük GTPases için önerilen.
| Parametreleri | Notlar | ||
| KAZANÇ | KAZANÇ seçeneği makine duyarlılığı ayarlar. Çoğu Luminometreler otomatik kalibrasyon veya sınırlı Kalibrasyon işlevini kullanın. Kullanıcı okuma farklı aletler değişir doğrusal Aralık içinde olup olmadığını için düşük, orta ve yüksek kazanç okumalısınız. | ||
| ENTEGRASYON ZAMAN | Bu, en düşük fiyat çok yüksek olabilir kez olarak, bu seçeneği doğrusal Aralık dışında okumak için tavsiye edilir. Bu alt seyreltme veya birincil ve ikincil antikorları kullanarak gibi gereksiz iş gerektirebilir. ENTEGRASYON zaman da farklı aletler değişir. | ||
| SALLAYARAK | Bu 5s kullanmak için tavsiye edilir yörünge Çalkalamalı. Bu testin doğruluk için diğer parametreler olarak kritik olarak değil. | ||
| SICAKLIK | Oda sıcaklığında önerilir | ||
| PLAKA TÜRÜ | Kullanmakta olduğunuz plaka göre kullanın. Genellikle plaka 96-şey, düz ve beyaz. | ||
| FİLTRELER | Uyarma veya emisyon filtre ışıldama için gerekli değildir. Uyarma istenen herhangi bir değer ayarlanabilir ve en iyi emisyon 430-445 nm aralığıdır. Filtre alanlarını boş bırakın. Eğer bu bir seçenek değil, | ||
Tablo 3: Luminometer ayarlarının detaylı açıklaması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada küçük GTPazlar prenilasyon ve küçük GTPazlar hücre altı yerelleştirme (membran karşı sitozol) ve Rho GTP yükleme gösterilen GTP bağlama ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Küçük GTPases ökaryotik hücrelerde ifade edilir ve hücre proliferasyonu, hareketliliği ve yapısı içinde önemli rol oynarlar. Prenilasyon ve GTP bağlama GTPazlar aktivite Yönetmelikte söz konusu; Bu nedenle, deneyleri prenilasyon ve GTP bağlama bu proteinlerin değerlendirmek için hücre biyologları1,8için önemli araçlardır.
Yeni bir çalışma sonuçlarına göre Rho protein GTP yükleme hücre tipi belirli8' dir ve bu nedenle, farklı hücre tipleri arasında farklıdır. Ayrıca, hücre altı yerelleştirme ve geranylgeranylation (GGT) Rho proteinlerin belirleyici tür ile işlevlerine adımlardır. Bu da daha fazla efektör proteinler GEF, GAP ve GDI etkileşimi için büyük GTPases tarafından düzenlenmiştir.
Simvastatin THP-1 monosit Rac GTP yükleme artırmak, Rac prenilasyon amiloid β stimülasyon huzurunda azaltmak ve bu hücreleri17inflamatuar yanıt-e doğru azaltmak bilinmektedir. Ayrıca T-hücre işlevi Rho yükleme GTP tarafından etkilenmez ama aksine, Rho GGT işlevi18,19belirler, biliyoruz. Bu nedenle, Rho GTPazlar bir etkinlik tespit amacıyla prenilasyon ve GTP yükleme aynı anda hücrelerde ölçülmesi gerekir, önerilir.
Not yüksek saflıkta sitozolik ve membran kesirler, elde etmek için en önemli iletişim kuralının sonication ve ultrasantrifüj adımlardır. Rho GTP-bağlama tahlil için en önemli adım ek-hücre lysates sıralı işleme önce dondurma olduğunu. Aşağıdaki önemli adımları oturma sistemlerinde çalışmada GTPases, tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar doğurur.
Belirli bir hücre içi yapısı veya membran protein incelemek için önemli bir adım hücresel kompartmanlarda birbirinden ayrılmasıdır. Ayırma boyutu ve şekli, yüzey ücret yoğunluk ve neşeli yoğunluğu20gibi hücresel her bölmesi özelliklerini kullanır. Esas olarak yüksek viskozite 4 ° C'de medyada fark Santrifüjü temel Burada kullanılan membran ayırma yöntemi esas olarak her bölmesi boyutunu ve ultrasantrifüj sonra nereye membran proteinlerinin tüp alt kısmına gidin ve sitozolik protein kalır yüksek çekim hızı dayanmaktadır süpernatant.
Bu Not için örnekler içeren yüksek protein konsantrasyonları ve muhtemelen, boşluklar yüksek düzeyde potansiyel hedef GTPazlar devre dışı önemlidir. Bu sorun bile lizis arabellekte oluşabilir ve yanlış olumsuz sonuçlara neden olabilir. Başarı belirleyen anahtar parametreleri ve tekrarlanabilirlik GTPazlar etkinliği tahlil sonuçlarının sağlık ve yanıt verme hızını deneme8' kullanılan hücre biridir. Müfettişler hücrelerin altında eğitim GTPazlar harekete geçirmek/inhibisyon belirlemek için katlama zaman ve en iyi/uygun büyüme koşulları tanımlamak önerilir. Ayrıca, Bütün küçük GTPases GTPazlar etkinliğini sıkı bir şekilde düzenlenmiştir ve bu nedenle, duyarlı hızlı düşüşler ile hidroliz GTP molekülünün enzim üzerinden için boşluklar eylem (sırasında ve sonrasında hücre lizis yordamı bağlı olduğu ). Bu eylem ilgi GTPazlar hızlı inactivation içinde oluşur. Bu nedenle, bu hücre lizis hızla doğru ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için 4 ° C'de gerçekleştirilir önerilir.
Son hücre lysate belirlemek deneysel şartlarına bağlı olarak çeşitli faktörler vardır. Öncelikle, RhoA GTPazlar toplam miktarı hücre veya belirli doku: endojen RhoA GTPazlar hücre ve dokulara; farklı değişken miktarıdır Bu nedenle, bu bir harekete geçirmek veya deactivator daha güçlü bir tepki neden olabilir. İkinci, deneysel koşullar altında elde etkinleştirme/devre dışı bırakılması miktarı: yaklaşık %2 %10 toplam hücresel küçük GTPazlar muhtemelen belirli uyarıcı8yanıt olarak etkin olduğunu dikkate almak önemlidir. Devre dışı bırakma de yalnızca uyaranlara türüne bağlıdır ve farklı hücrelere ve dokulara değişkendir. Bu nedenle, küçük Rho GTPazlar etkinliği tahlil her türü için lizis arabellek ve hücresel yuvası bileşimi çok önemlidir. Tablo 3 lizis arabellek her belirli küçük GTPazlar protein için önerilen kompozisyonu gösterir.
Farklı örnekleri GTPazlar etkinliğini karşılaştırmak müfettişler sağladığından normalleştirilmiş hücre lysate protein konsantrasyonu önemli bir gereksinimdir. Bu nedenle, her koşulda soğuk PBS ile tüm örneklerini hücrelerden yıkama protein doku kültürü ortamdan kaldırmak için zorunludur. Tüm reaktifler ve arabellekleri denemenin her adımda soğuk sıcaklıklarda (4 ° C) kullanılır esastır. Bu soğuk sıcaklık GTPases numune hazırlama sırasında Rho GTPazlar, dahil olmak üzere, hidroliz en aza indirmek olacaktır. Bu hücre lysates bu işleme hızla (içinde 10-15 dk toplam) RhoA GTPazlar aktivite kaybı önlemek için yapılır önemlidir. Ayrıca, ek-aliquots lysate, RhoA küçük GTPazlar enzimatik aktivite korumak için sıvı azot içinde dondurma için hücre lysate hazırlık en önemli adım olduğunu. Farklı timepoints veya deneyinde birden çok örneği varsa, bu özellikle önemlidir. Rho GTPazlar faaliyetlerini kaybetmeden ek donmuş lysates hazırlanması sonra örnekleri-80 ° C'de tutulabilir.
Membran RhoA GTPazlar ankraj analiz için sağlanan iletişim kuralı yalnızca küçük GTPases prenilasyon ölçmek için dolaylı bir aracını temsil eder ve doğrudan tespit veya bağlama hedef protein isoprenoid kalıntılarının ölçmek mümkün değildir. Bu çok az sınırlamalar bu testin biridir. Bu nedenle, proteinlerin prenilasyon bir tahmin sağlar. Bazı yaklaşımlar doğrudan FT (farnesylation) ve/veya GGT farnesyl transferaz ve/veya geranylgeranyl transferaz, sırasıyla, kültürlü hücreleri hem de hayvanlar ve insan kaynaklı tümörler ölçmek mümkün olan tanımladınız. Deneyleri elektroforetik hareketlilik shift, [3 H] farnesyl nükleotittir ve [3 H] geranylgeranyl nükleotittir ve etiketleme, ardından immunoprecipitation ve SDS-sayfa21[3 H] mevalonic asit kullanın.
RhoA GTPazlar bağlı immunosorbent assay herhangi bir membran Ankraj ve RhoA GTPazlar etkinliğini algılamak için kullanılan. 96-şey plaka wells için bağlantılı bir Rho GTP bağlayıcı protein oluşur. Yani, GSYİH bağlı etkin olmayan Rho uzakta yıkama adımları uyguladığınızda yıkarken GTP bağlı etkin Rho hücre veya doku lysates içinde wells için bağlar. O zaman, Wells ilişkili, aktif RhoA bir RhoA özgü antikor ve Kemiluminesan kullanarak tespit edilecektir. Nonactivated için aktif hücre lysates üzerinden okuma karşılaştırarak RhoA harekete geçirmek derecesini saptamak mümkündür. Serum açlık (serum-Alerjik orta kültürlü hücreleri üzerinde kullanımı) genellikle doku kültüründe RhoA devre dışı bırakabilirsiniz için kullanılır. Ayrıca harekete geçirmek GTPazlar bağlı immunosorbent assay's aralığı 10-50 µg protein RhoA GTPazlar aktivite tespiti için gerektirir belirtilmelidir.
Tedavi edilmemiş örnekleri GTPazlar etkinliği (denetim durumu) düşük bazal hücresel düzeyde olması önerilir. Örnek olarak, uygun hücre açlık can tümleyici GTPazlar aktivite koşulları ve onların harekete geçirmek deneysel koşullar altında göstermek için ideal koşulları sağlamak. Ayrıca, etkinleştirme ve inhibisyon deneyleri en iyi GTPazlar harekete geçirmek/inhibisyon yanıt almak için bir zaman ve doz yanıt şekilde gerçekleştirilir. Daha da önemlisi, hücresel hazırlık sırasında overconfluent olmayan hücreleri kullanmak çok önemlidir (> % 70), hücre harekete geçirmek/inhibisyon uyaranlara karşı herhangi bir nonresponsiveness önlemek için.
Luminometreler büyük duyarlılık ve mutlak değerler açısından farklılıklar göstermektedir. Bu nedenle, doğrusal Aralık içinde olup olmadığını belirlemek için bir boşluk ve olumlu bir denetimi ile bir GTPazlar bağlı immunosorbent assay çalıştıran öneririz. Tahlil dışında ise doğrusal Aralık (olumlu denetim 4 x - 10 x salt arabellek okuma daha yüksek olmalıdır) veya boş okuma 9-10 milyondan daha büyük o zaman daha fazla antikor dilutions kullanılması önerilir. Ayrıca, tahlil başlamadan önce testin doğrusal Aralık içinde okumak için luminometer ayarlanması önerilir.
Da kayda değer olan GTPazlar bağlı immunosorbent assay avantajı vardır. GTPazlar bağlı immunosorbent deneyleri deneysel tasarım geliştirmek ve teknoloji ile eski çekme-çıkışlar teknikleri22mümkün değildi deneyler kolaylaştırmak etkinleştirin. GTPazlar bağlı immunosorbent deneyleri de algılama hassasiyeti ve analizler GTPazlar aktivitesinin hazırlıkları daha önce açılan deneyleri23yasak sağlar duyarlılık sağlar. Son yıllarda yapılan çalışmalarda birkaç GTPazlar bağlı immunosorbent harekete geçirmek deneyleri çekme-çıkışlar ile karşılaştırıldığında ve o GTPazlar bağlı immunosorbent assay bazı açık avantajları vardır, yani GTPazlar bağlı immunosorbent deneyleri nedeniyle üstün olan sonucuna onların az miktarda protein22,24, onların daha fazla duyarlılık24ve onların nicel ölçümler23kullanabilme. GTPazlar bağlı immunosorbent assay kiti luminometric veya Renkölçer algılama sürümleri, luminometric deneyleri daha duyarlı nerede mevcuttur. Bu GTPazlar bağlı immunosorbent assay bir oldukça basit ve hızlı protokolüne dayanan, sadece küçük miktarlarda örnek için ve nicel ve doğru sonuçlar verir. Bu nedenle, daha fazla protein GTPazlar tabanlı diğer türleri farklı hücre satırları ve doku kültürü hücreleri bir çok daha yüksek özgüllük ve doğruluk ile algılamak için bu tahlil geliştirmek için iyi bir fikir olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Saeid Ghavami sağlık bilim merkezi işletim Grant tarafından grant ve araştırma Manitoba yeni araştırmacı bursu işletim işletim CHRIM desteklenmiştir. Javad Alizade araştırma Manitoba öğrencilik tarafından desteklenmiştir. Şahla Shojaei bir sağlık Bilim Vakfı faaliyet hibe ve MITACS hızlandırmak doktora sonrası bursu tarafından desteklenmiştir. Adel Rezaei Moghadam Joseph W. Gordon tarafından düzenlenen hibe işletim bir NSERC tarafından desteklenmiştir. Amir A. Zeki NIH/NHLBI K08 Ödülü (1K08HL114882-01A1) tarafından desteklenmiştir. Marek J. Los nazikçe destekten NCN vermek #2016/21/B/NZ1/02812, onun akıllı Loire Valley Genel Program aracılığıyla Advanced Studies (bölge merkezi-Val de Loire, Fransa) LE STUDIUM Enstitüsü tarafından desteklenen ve eş Marie tarafından finanse eder Sklodowska-Curie eylemleri, #665790 verin. Simone da Silva Rosa UMGF öğrencilik tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM high Glucose | VWR (Canada) | VWRL0101-0500 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR (Canada) | CA45001-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR (Canada) | 97062-806 | |
| EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid) | VWR (Canada) | CA71007-118 | |
| EGTA (Ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) | VWR (Canada) | CAAAJ60767-AE | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | VWR (Canada) | CA97061-340 | |
| Ammonium Persulfate | VWR (Canada) | CABDH9214-500G | |
| Tris-Hydroxymethylaminomethane | VWR (Canada) | CA71009-186 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution | Biorad (Canada) | 1610158 | |
| TEMED | Biorad (Canada) | 1610801 | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma/Aldrich (Canada) | P8340-5ML | 1:75 dilution |
| Rho-GTPase Antibody Sampler Kit | Cell Signaling (Canada) | 9968 | 1:1000 dilution |
| Pan-Cadherin antibody | Cell Signaling (Canada) | 4068 | 1:1000 dilution |
| GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology (USA) | sc-69778 | 1:3000 dilution |
| RhoA G-LISA Activation Assay (Luminescence format) | Cytoskeleton Inc. (USA) | BK121 | Cytoskeleton I. G-LISA Activation Assays Technical Guide. 2016. |
| RhoA Antibody | Cell Signaling | 2117 | |
| ECL | Amersham-Pharmacia Biotech | RPN2209 | |
| Anti-Rabbit IgG (whole molecule) Peroxidase antibody | Sigma | A6154-1ML | |
| SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | 1612071A | Spectrophotometer |
| Nonidet P-40 | Sigma | 11332473001 | non-denaturing detergent, octylphenoxypolyethoxyethanol |
| DMSO | Sigma | D8418-50ML | |
| PBS | Sigma | P5493-1L | |
| Phophatase Inhibitor cocktail | Sigma | P5726-5ML | 1:75 Dilution |
References
- Yeganeh, B., et al. Targeting the mevalonate cascade as a new therapeutic approach in heart disease, cancer and pulmonary disease. Pharmacology & Therapeutics. 143 (1), 87-110 (2014).
- Valencia, A., Chardin, P., Wittinghofer, A., Sander, C. The ras protein family: evolutionary tree and role of conserved amino acids. Biochemistry. 30 (19), 4637-4648 (1991).
- Hall, A. Rho family GTPases. Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1378-1382 (2012).
- Rojas, A. M., Fuentes, G., Rausell, A., Valencia, A. The Ras protein superfamily: evolutionary tree and role of conserved amino acids. The Journal of Cell Biology. 196 (2), 189-201 (2012).
- Cherfils, J., Zeghouf, M. Regulation of small GTPases by GEFs, GAPs, and GDIs. Physiological Reviews. 93 (1), 269-309 (2013).
- Shojaei, S., et al. Perillyl Alcohol (Monoterpene Alcohol), Limonene. Enzymes. 36, 7-32 (2014).
- Ghavami, S., et al. Airway mesenchymal cell death by mevalonate cascade inhibition: integration of autophagy, unfolded protein response and apoptosis focusing on Bcl2 family proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (7), 1259-1271 (2014).
- Alizadeh, J., et al. Mevalonate Cascade Inhibition by Simvastatin Induces the Intrinsic Apoptosis Pathway via Depletion of Isoprenoids in Tumor Cells. Scientific Reports. 7, 44841 (2017).
- Ghavami, S., et al. Mevalonate cascade regulation of airway mesenchymal cell autophagy and apoptosis: a dual role for p53. PLoS One. 6 (1), e16523 (2011).
- Tang, Y., Olufemi, L., Wang, M. T., Nie, D. Role of Rho GTPases in breast cancer. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 13, 759-776 (2008).
- DerMardirossian, C., Bokoch, G. M. GDIs: central regulatory molecules in Rho GTPase activation. Trends in Cell Biology. 15 (7), 356-363 (2005).
- Garcia-Mata, R., Boulter, E., Burridge, K. The 'invisible hand': regulation of RHO GTPases by RHOGDIs. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 493-504 (2011).
- Etienne-Manneville, S., Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 420 (6916), 629-635 (2002).
- Ghavami, S., et al. Geranylgeranyl transferase 1 modulates autophagy and apoptosis in human airway smooth muscle. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 302 (4), L420-L428 (2012).
- Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406 (6795), 532-535 (2000).
- Ghavami, S., et al. Statin-triggered cell death in primary human lung mesenchymal cells involves p53-PUMA and release of Smac and Omi but not cytochrome c. Biochimica et Biophysica Acta. 1803 (4), 452-467 (2010).
- Cordle, A., Koenigsknecht-Talboo, J., Wilkinson, B., Limpert, A., Landreth, G. Mechanisms of statin-mediated inhibition of small G-protein function. Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 34202-34209 (2005).
- Waiczies, S., Bendix, I., Zipp, F. Geranylgeranylation but not GTP-loading of Rho GTPases determines T cell function. Science Signaling. 1 (12), pt3 (2008).
- Waiczies, S., et al. Geranylgeranylation but not GTP loading determines rho migratory function in T cells. Journal of Immunology. 179 (9), 6024-6032 (2007).
- Satori, C. P., Kostal, V., Arriaga, E. A. Review on Recent Advances in the Analysis of Isolated Organelles. Analytica Chimica Acta. 753, 8-18 (2012).
- Berndt, N., Sebti, S. M. Measurement of protein farnesylation and geranylgeranylation in vitro, in cultured cells and in biopsies, and the effects of prenyl transferase inhibitors. Nature Protocols. 6 (11), 1775-1791 (2011).
- Keely, P. J., Conklin, M. W., Gehler, S., Ponik, S. M., Provenzano, P. P. Investigating integrin regulation and signaling events in three-dimensional systems. Methods in Enzymology. 426, 27-45 (2007).
- Oliver, A. W., et al. The HPV16 E6 binding protein Tip-1 interacts with ARHGEF16, which activates Cdc42. British Journal of Cancer. 104 (2), 324-331 (2011).
- Moniz, S., Matos, P., Jordan, P. WNK2 modulates MEK1 activity through the Rho GTPase pathway. Cellular Signalling. 20 (10), 1762-1768 (2008).
