Summary
Lavoratori minori delle specie di formica Colobopsis explodens vengono sezionati per isolare il contenuto simile alla cera nei loro serbatoi mandibular ipertrofico della ghiandola per analisi e successiva estrazione con solvente-facendo gas cromatografia spettrometria di massa. L'annotazione e l'identificazione dei costituenti volatili utilizzando il software open-source MetaboliteDetector inoltre è descritta.
Abstract
Lo scopo di questo manoscritto è di presentare un protocollo che descrive l'analisi metabolomica di Bornean 'formiche che esplode' appartenente al gruppo Colobopsis cylindrica (COCY). Per questo scopo, la specie di modello c. explodens è usato. Le formiche appartenenti alla casta minore lavoratore possiedono ghiandole mandibolari ipertrofici distintivi (MGs). In combattimento territoriale, usano il contenuto viscoso dei loro serbatoi di ingrossamento della ghiandola mandibolare (MGRs) per uccidere il rivale artropodi in caratteristici Suicide 'esplosioni' di rottura volontaria del integument tergiti (autothysis). Vi mostriamo la dissezione delle formiche operaie di questa specie per l'isolamento della parte sternita il contenuto MGR simile alla cera, nonché Inserzione i passaggi necessari richiesti per solvente-estrazione dei composti volatili ivi contenuti con successive gas analisi di spettrometria della cromatografia-massa (GC-MS) e presunta identificazione di metaboliti contenuti nell'estratto. La procedura di dissezione viene eseguita in condizioni raffreddate e senza l'uso di qualsiasi soluzione tampone di dissezione per ridurre al minimo le modifiche nella composizione chimica del contenuto MGR. Dopo l'estrazione del solvente di metaboliti volatili ivi contenute, vengono presentati i passaggi necessari per analizzare i campioni tramite liquido-iniezione-GC-MS. Infine, elaborazione dei dati e l'identificazione dei metaboliti presunti con l'uso del software open source è dimostrato MetaboliteDetector. Con questo approccio, la profilatura e l'identificazione dei metaboliti volatili in MGRs di formiche appartenendo alla COCY gruppo tramite GC-MS e il software di MetaboliteDetector diventano possibili.
Introduction
L'obiettivo generale del flusso di lavoro qui presentato è l'indagine generale di composizioni chimiche nelle secrezioni di insetti. Questo viene fatto con l'obiettivo di chiarire i ruoli ecologici della secrezione nel suo complesso o di singoli composti. Inoltre, siamo interessati a indagare le vie metaboliche sottostanti i composti trovati nelle rispettive secrezioni. Particolare contenuto di ghiandola da formiche (Imenotteri, Formicidae) hanno acquisito crescente interesse negli ultimi anni, perché forniscono fonti di composti potenzialmente bioattivi allora inesplorata (Colle, antimicrobici, ecc.)1, 2. formiche operaie minori di alcune specie appartenenti al gruppo3,COCY4 possono fornire tali composti contenuti in loro MGRs ipertrofico che si estendono dall'apparato boccale al gaster5,6. Quando minacciato da presunti nemici, minori lavoratori di explodens c.7 ed alcuni relativi specie può fare uso del loro MGR contenuti in un modo insolito: sacrificano se stessi di rottura loro parete sterniti per espellere il contenuto appiccicoso della MGRs esplosivo sull'avversario, dopo di che il presunto nemico è trattenuto e può anche morire5,6,8,9. Lo scopo dello sviluppo e l'utilizzo dei metodi qui presentati era di contribuire a migliorare la comprensione della composizione chimica e la natura dei costituenti provvisoriamente tossici di questa secrezione di formica.
A tal fine, vi presentiamo un protocollo per la dissezione delle formiche operaie explodens c. di ottenere la parte tergita del loro contenuto MGR ceroso con solvente-estrazione successiva e analisi mediante GC-MS.
Analisi GC-MS sono uno dei metodi consolidati per la profilatura e l'identificazione dei metaboliti volatili (volatilome) da insetti. Tipici analiti di interesse in formiche includono idrocarburi cuticolari10, semiochimici11e in generale, composti con attività biologica12. I campioni possono essere ottenuti da animali interi o da parti del corpo e fluidi isolati tramite dissezione del insetto13,14. Tecniche di preparazione del campione includono l'estrazione dei metaboliti ivi contenuti con l'uso di solventi14 o spazio di testa-solido-fase-microextraction (HS-SPME)15.
Per gli studi di metabolomica, è vitale che i campioni sono congelati rapidamente direttamente dopo il campionamento, al fine di minimizzare i cambiamenti nella composizione chimica e nella quantità dei composti. Le formiche utilizzate per questo studio sono stati uccisi mediante congelamento rapido in loco in un sacchetto freddo farcito con impacchi freddi surgelati. I campioni sono stati quindi conservati in un congelatore di-20 ° C usando l'elettricità generatore-guidato, prima di essere trasportati al laboratorio in ghiaccio secco. La procedura di dissezione qui presentata offre la possibilità di isolare contenuto MGR senza analizzare la formica intera o il gaster nel suo complesso, come è stato fatto prima per diversi COCY specie16,17,18. Inoltre, il protocollo presentato consente inoltre un accesso diretto e l'analisi delle ghiandole circostanti e tessuti, come il veleno ghiandola (VG)5,8, ghiandola (DG)8 di Dufouro gli intestini in altri studi biologici, o per controllare i possibili cross-contaminazioni introdotte durante la manipolazione o la dissezione delle formiche. Per ridurre al minimo le modifiche nella composizione chimica del contenuto MGR durante la dissezione, scongelamento campioni oppure utilizzando sostanze chimiche, il processo di dissezione è stato ottimizzato per essere effettuato su un impacco freddo (-20 ° C), senza l'uso di qualsiasi buffer aggiuntivi, soluzioni di lavaggio, o solventi. I campioni ottenuti tramite questo metodo sono adatti per rispondere alle domande qualitative e quantitative.
Analisi dei dati ai fini della annotazione metabolita presunto e l'identificazione avviene tramite il software open-source MetaboliteDetector19, che è stato sviluppato per l'analisi automatica dei dati basati su GC-MS metabolomica. Rileva singolo ione picchi presenti nei cromatogrammi, esegue un passaggio di deconvoluzione ed estrae i deconvoluted spettri di massa dei composti chimici contenuti nei campioni analizzati. Presunta identificazione di composti con MetaboliteDetector si basa sull'indice di ritenzione determinato (RI; il Kovats RI può essere calcolato automaticamente dal software) oltre a somiglianza degli spettri totali deconvoluted. RI e fattore di corrispondenza spettrale può essere verificati contro entrambi esistenti librerie di riferimento (che può essere importate, se essi sono nel formato comune NIST), o una biblioteca in loco stabilita. Questo è in accordo con le linee guida per il (presunto) composto identificazione suggerito, per esempio, dalla chimica analisi lavoro gruppo (CAWG) di metabolomica standard iniziativa (MSI), dove un minimo di due dati indipendenti e ortogonali relativo un autentico composto (qui conservazione tempo /RI (RT) e spettro di massa) analizzati sotto identiche condizioni sperimentali sono proposti come necessario confermare di non-romanzo metabolita identificazioni20.
L'esperimento completo è condotto sul contenuto MGR della specie modello COCY explodens c., ma i passaggi di dissezione possono anche essere adattati per isolare le altre ghiandole presenti nel gaster ant. Inoltre, mentre presentiamo un protocollo per l'analisi completa del volatilome del contenuto MGR, le parti più generiche del flusso di lavoro che descrive l'estrazione, GC-MS misura e valutazione dei dati utilizzabile anche per l'analisi e (presunto) identificazione dei metaboliti volatili in generale.
Poiché gli esperimenti descritti in questo manoscritto sono stati realizzati sugli insetti, non è necessaria alcuna approvazione etico. Lavoro sul campo, campionamento di formiche, come pure il loro utilizzo per la pubblicazione sono in conformità con le linee guida che regolano questo progetto attraverso il Universiti Brunei Darussalam, ricerca del Brunei e centro di innovazione e di Brunei Forestry Department, Brunei Darussalam.
Protocol
1. raccolta delle formiche
- Raccogliere formiche operaie minori con l'uso di un aspiratore (Figura 1).
- Immediatamente dopo il campionamento, fissare le formiche mediante congelamento rapido a-20 ° C e depositarli presso questo o una temperatura più bassa fino all'analisi.
2. isolamento della DG da formiche e contenuto MGR
- Prima la dissezione delle formiche, preparare il seguente:
- Pulire il piatto di Petri di vetro e gli strumenti di dissezione utilizzando una miscela di metanolo-acqua (MeOH/H2O; 1 + 1 v/v) e dei tessuti.
Attenzione: MeOH è tossico per gli esseri umani. Sempre indossare appositi guanti, camice da laboratorio e occhiali di protezione ed eseguire la pulizia sotto cappa aspirante. - Congelare l'impacco freddo e il vetro di Petri a-20 ° C.
- Determinare le masse di 1,5 mL fiale di filetto corto tra cui coperchi a vite con setti in silicone/politetrafluoroetilene (PTFE) e tenerli sul ghiaccio direttamente accanto al microscopio.
Nota: La scelta della fiala del campione è facoltativa. Qui, il contenuto MGR vengono inserito direttamente nella raffreddato 1,5 mL fiale di vetro. Plastica può contenere composti (ad es., ftalati) che possono causare artefatti, che interferiscano con i segnali dei metaboliti destinazione. - Inserire l'impacco freddo ghiacciato in una scatola di polistirene espanso estruso. Posizionare la piastra di Petri in cima al mazzo di freddo e mettere una formica congelata nel piatto. Montare la scatola sotto un microscopio stereo. Regolare l'ingrandimento (20 – 40 X) e la messa a fuoco fino a quando la formica intera può essere visto chiaramente.
- Pulire il piatto di Petri di vetro e gli strumenti di dissezione utilizzando una miscela di metanolo-acqua (MeOH/H2O; 1 + 1 v/v) e dei tessuti.
- Verifica la formica congelata per l'integrità dei suoi compartimenti tergiti. Per dissezione, prendere solo le formiche con una regione di gaster intatto (Figura 2A, B). Escludere le formiche con piatto gasters o tracce di contenuto MGR indurito sulla loro superficie del corpo da un'ulteriore analisi (Figura 2, D).
- Afferrare la formica selezionata con una coppia di pinze a punta fine presso il propodeo (primo segmento addominale) e con l'altra coppia di pinze presso il picciolo (segmento secondo addominale). Staccare la regione di gaster tirandolo delicatamente lontano dal resto del corpo della formica (Figura 3A).
- Difficoltà il gaster ora separati formica tenendolo con una pinza appuntita alle tergite 4. Con un'altra coppia di pinze a punta fine afferrare tergite 1 (situato accanto il picciolo) e rimuoverlo delicatamente dalla scrostata (Figura 3B). Ripetere questa procedura anche per tergiti 2 e 3 (Figura 3, D) fino alla parte sternita del MGRs (di colore giallo in formiche operaie explodens c. , ma il colore del contenuto MG può variare da bianco sopra colore giallo a colore rosso in altre specie) è visibile per la maggior parte parte.
Nota: Rimuovendo l'esoscheletro, la membrana del MGR verrà anche parzialmente rimosso. - Mediante l'uso di un ago di dissezione, rimuovere delicatamente il contenuto simile alla cera del MGRs accoppiati graffiando li fuori del vano tergito (Figura 3E). Rimuovere solo quelle parti del contenuto MGR che possono essere isolate senza rompersi altre ghiandole presenti nel gaster ant. Se più forza o sforzi devono essere applicati per ottenere il contenuto MGR nel suo complesso, accettare la rimozione incompleta (Figura 4).
- Raccogliere i contenuti MGR toccandole delicatamente con la punta dell'ago dissezione fino a quando non si attaccano su di esso. Poi trasferire il contenuto MGR in una fiala di 1,5 filetto corto raffreddato con noto massa a vuoto.
- Per rimuovere il contenuto MGR appiccicoso dalla punta dell'ago dissezione, spostare la punta dell'ago alla parete del flaconcino campione e loro striscio sulla parete. Chiudere il flacone e posizionarlo sul ghiaccio, fino a quando il prossimo contenuto MGR è isolato.
- Per controllare più tardi possibile contaminazione del campione contenuto MGR dai composti originari della DG adiacente (sezione 6), anche raccogliere DGs da formiche, in cui sono ancora intatti (Figura 4) e metterli in un flaconcino HPLC separato.
- Pulire sempre la piastra di Petri e strumenti per la dissezione con MeOH/H2O (1 + 1 v/v), quando si cambia da una ghiandola alla ghiandola o formica della formica.
- Per un campione da analizzare, combinare il contenuto di serbatoio o ghiandole di più formiche.
Nota: Il numero delle ghiandole e dei loro contenuti utilizzati per un campione analitico può variare a seconda della progettazione dell'esperimento. Qui, o contenuto MGR o DGs di cinque formiche sono stati riuniti per ottenere un campione da analizzare.
3. solvente-estrazione della ghiandola isolato contenuto
- Determinare le masse dei campioni analitici (qui, contenuto MGR o ghiandole adiacenti in pool da cinque formiche).
- Aggiungere ghiacciata ad alta purezza di acetato di etile (EtOAc) in un rapporto costante di 01:14 w/v e vortice i campioni per 5 min in condizioni di raffreddamento; qui, eseguito a 7 ° C in un laboratorio termostatato.
- Centrifugare i campioni per 10 min a 3.820 x g e a 7 ° C e trasferire i surnatanti (circa 55 – 75 µ l per estratto contenuto MGR ottenuto da cinque formiche) in pre-raffreddata mL 1,5 filetto corto fiale contenenti 0,1 mL micro-inserti. Sigillare ermeticamente le fiale con tappo a vite contenente fori e setti in gomma rossa/PTFE.
Nota: Se l'analisi non possono essere effettuato immediatamente, mantenere l'estratto a-80 ° C fino a quando l'analisi, ma si raccomanda di analizzare i campioni immediatamente dopo la preparazione per minimizzare il rischio di alterazioni chimiche durante il ciclo di congelamento/scongelamento.
4. GC-MS
- Per una sequenza di misurazione completa di GC-MS, preparare le seguenti soluzioni, ciascuno in una fiala di 1,5 mL filetto corto:
- Preparare una miscela di calibratore RI diluendo soluzioni standard disponibile in commercio alcano a una concentrazione finale di 8 mg/L del composto utilizzando esano.
- Preparare un solvente-vuoto composto da puro EtOAc.
- Posto le fiale contenenti 1) solvente-bianche, miscela di Calibratore 2) RI, contenuto 3) MGR estrarre e 4) DG contenuto estratto nel vassoio raffreddato (10 ° C) di autocampionatore accoppiato al gascromatografo (GC).
Nota: Si consiglia di ridurre al minimo l'intervallo di tempo, che ogni flaconcino è tenuto nell'autocampionatore prima della misura. Per campioni critici, come l'esempio di MGR di contenuto, il flaconcino può essere messo nell'autocampionatore immediatamente prima dell'analisi. - Per ogni campione, iniettare un'aliquota 1 µ l in GC-MS per la separazione cromatografica su una colonna adatta per i composti target (qui: colonna HP - 5MS UI).
- Impostare i parametri appropriati di GC, che possono apparire come segue:
- Utilizzare l'elio come gas vettore e impostare un flusso costante colonna di 1 mL/min impostare una rampa di temperatura del forno a partire da 40 ° C con una tenuta per 2 min, seguita da una rampa di 10 ° C/min fino a 330 ° C, con un tempo di attesa di 7 minuti impostare la temperatura dell'ingresso a 270 ° C.
- Scegliere e se necessario, regolare i rapporti di Spalato per iniezione di GC-MS che si traducono in forme adeguate di picco e intensità per composti di interesse (Figura 5).
Nota: Nell'esempio presentato era necessario misurare l'Estratto DG a un rapporto di divisione di 2:1 e la miscela di calibratore RI in modalità splitless. L'estratto contenuto MGR è stato analizzato in un rapporto di divisione di 2:1 e una seconda volta di 50: 1. - Impostare la temperatura ausiliaria a 350 ° C.
- Impostare i parametri di spettrometro di massa (MS) come segue: temperatura 230 ° C sorgente MS, MS Quad temperatura 150 ° C, intervallo di scansione da 30 bassa massa a massa elevata 500, solvente fa ritardare 4,1 min (per campioni solvente-blank e sperimentali) o 6,1 min (per la miscela di calibratore RI) , rispettivamente. Impostare la velocità di scansione di circa 3 scansioni/s.
Nota: I parametri MS, soprattutto la MS scansione-, frequenza di campionamento e tempo di ciclo possono influenzare picco picking e deconvoluzione spettro e deve essere considerati quando si selezionano le impostazioni dei parametri per la valutazione corretta dei dati con il software MetaboliteDetector.
- Impostare i parametri appropriati di GC, che possono apparire come segue:
- Quando la misurazione è completata, è possibile esportare i dati come. AIA file (qui effettuato con l'ausilio del software di analisi dati consegnato con il GC) del progetto su un dispositivo di archiviazione dati portatile.
- Selezionare il File di | Esportare dati in formato AIA..., quindi selezionare Crea una nuova directory e cliccare OK. Selezionare il percorso di archiviazione desiderato (ad esempio, unità memoria flash USB) e fare clic su Apri. Selezionare i file da esportare e colpire l'icona ---> . Confermare con un clic il processo.
5. metabolita rilevamento e l'identificazione con l'uso del Software MetaboliteDetector
- Prima di iniziare l'analisi dei file di dati, aprire MetaboliteDetector, scelta degli strumenti | Impostazionie impostare i parametri necessari come indicato di seguito (i singoli fogli di MetaboliteDetector sono indicati in grassetto):
- Nella scheda aspetto, è necessario impostare la scala di tempo di Min e attivare l'opzione di etichette degli assi.
- Nel foglio di deconvoluzione, impostare i parametri per le impostazioni di picco: soglia di picco: 10 e l'altezza di picco minimo (unità di rumore): 10. Deselezionare abilitazione della regolazione della linea di base. Impostare i parametri per il rilevamento metabolita: bidoni/Scan: 10, larghezza di deconvoluzione (scansioni): 5, intensità richiesta (% del picco base): 0 e il numero necessario di vette: 10.
- Nella scheda Identificazione, impostata l'opzione di ricerca biblioteca: Compound Lib: 'CalibrationLibrary_Alkanes' e NIST (una libreria sqlite NIST può essere incluso nel formato. LBR). Impostare i parametri come segue: Max. Differenza di RI: 10, Punteggio di cut-off: 0,9, Pure/impuri Composizione: 0,5, numero di frammenti: 2, numero minimo di identici frag.: 1. uso scalati lib: barrata; Punteggio di somiglianza: Somiglianza spec.; Filtro di massa: m/z 207, 221, 281, 355 e 1147 (per agenti inquinanti conosciuti derivanti dalla fase stazionaria della colonna GC).
- Nel foglio di quantificazione impostare i parametri: numero di ioni di quantificazione: 3, distanza minima tra ioni successive: 5 e l'indice di qualità minima richiesta: 1. escludere gli ioni di quantificazione, 207, 221, 281, 355 e 1147.
Nota: In caso di alta risoluzione dei dati MS, inoltre impostare i seguenti parametri nella finestra delle centroide di: iniziare la soglia di picco: 10, fine di soglia di picco: -5 e la distanza massima della linea di base: 30, FWHM: 0,5.
- Importare i file nella. Formato CDF contenuta nel sorgente. File di progetto AIA come. NetCDF nel software selezionando File MetaboliteDetector | Importazione | NetCDF importazione. Scegliere l'icona a forma di cartella e quindi selezionare i file per le categorie di campione ad essere importati e lavorati: 1) solvente-vuoto, 2) RI calibranti, 3) MGR contenuto estratto e 4) DG contenuto estratto. Confermare con OK per avviare l'elaborazione dei dati. Dopo l'elaborazione, selezionare Chiudi nella finestra visualizzata.
- Per la calibrazione di RI e determinazione dei valori di RI per composti contenuti nell'estratto del MGR, selezionare File | Aperto e scegliete il file contenente i dati dei calibranti RI.
- Dopo il calibratore RI file è aperto, selezionare l'icona lente d'ingrandimento . Confermare la finestra che appare con OK.
- Per la corretta calibrazione del RI, controllare l'intervallo degli alcani rilevabili nel file calibratore RI.
- A tal fine, selezionare il triangolo che appare sotto il massimo del primo picco, provenienti dall'alcano prima (con il RT più basso, Figura 6) rilevabile facendo clic una volta su di esso.
- Controllare il colpo con la massima somiglianza di spettro ('Spec. sim.', Punteggio massimo = 1) rispetto alle voci della libreria dell'alcano (Figura 6).
- Per verificare l'identità dell'alcano suggerito composto, confrontare il suo spettro di massa per lo spettro di massa previste nella documentazione, ad esempio, NIST chimica WebBook22.
- Determinare l'ultimo alcano rilevabile nella miscela calibratore RI contando fino all'ultimo picco alcano che appaiono nel cromatogramma.
- Per la calibrazione del RI, selezionare strumenti di | RI-taratura guidata. Selezionare Avanti.
- Fare clic sull'icona a forma di cartella e selezionare il file contenente il cromatogramma della miscela calibratore RI. Selezionare Avanti.
- Selezionare la libreria che contiene le voci per l'alcano calibranti nella finestra che appare.
- Selezionare le voci di libreria di tutti gli alcani rilevabile nel RI calibratore file e fare clic sulla >> icona. Dopo aver selezionato >>, fare clic su successivo.
- Verifica il RTs elencato per ogni rilevabile alcano nella tabella che appare. A tal fine, controllare il RTs raffigurato nella finestra principale per ciascun alcano cliccando sul rispettivo triangolo (Figura 7). Se necessario (Figura 8), correggere la RT della tabella di calibrazione manualmente facendo doppio clic nel campo rispettivo, selezionando il menu a discesa e scegliere che la corretta suggerito RT. in alternativa, digitare in RT con l'aiuto della tastiera ( Figura 9).
- Quando il RT per ciascun alcano è corretta, selezionare Avanti. Fare clic su Next nella finestra visualizzata mostrando la tabella di calibrazione di RI.
- Selezionare il simbolo verde + nella finestra di Selezione del cromatogramma , scegliere il file di dati del solvente-grezzo e i file della ghiandola estratti e selezionare Avanti. Impostare le impostazioni dei parametri nella finestra che appare come segue: disattivazione di regolazione basale, picco soglia: 5, altezza del picco minimo: 5, bidoni/Scan: 10 e la larghezza di deconvoluzione: 5. Hit Avanti , quindi Avvia per eseguire il calcolo di RI di i composti contenuti nei file campione selezionato.
- Per annotazione e l'identificazione dei metaboliti selezionati nell'estratto del MGR, aprire il file di dati dell'estratto contenuto MGR misurato, per cui il RIs è stato calcolato come descritto in precedenza (punto 5.3.9), selezionando File | Aperto e scegliendo il file di dati desiderato.
- Selezionare strumenti di | Impostazioni | Deconvoluzione e modificare la soglia di picco, nonché l'altezza minima di picco (unità di rumore) entrambi a 5. Selezionare l'icona lente d'ingrandimento e confermare la finestra di avviso che appare ancora con OK.
- Fare clic su un triangolo che appare sotto il massimo di un picco di interesse e confrontare il suo spettro di massa con quelli memorizzati nella libreria di NIST selezionando l'icona NIST .
- Selezionare il primo colpo risultante del NIST-ricerca (Figura 10).
- Se la somiglianza di spettro risultante del composto di interesse è sopra il Punteggio di somiglianza di spettro selezionate (qui ≥ 0,9) rispetto a una NIST-voce (Figura 10), cercare la RI (per simile fase stazionaria della colonna GC, spessore del film e colonna diametro) dato per questo composto nella letteratura (ad es., NIST chimica WebBook22).
- Calcolare la differenza relativa tra il riferimento NIST RI (o la media RIs quando più valori di RI sono date) e il RI sperimentalmente derivata. Se la differenza è uguale o minore del valore specificato dall'utente massimo tollerato (qui, ≤ ± 1%), designare il composto come 'annotato'.
- Ripetere i passaggi 5.4.2–5.4.5 per tutti i composti di interesse contenute nel file di esempio MGR.
- Per l'identificazione di composto, confrontare il RI e spettri di massa delle soluzioni standard (ad es., 2 – 100 mg/L) misurata nelle stesse condizioni, come descritto nella sezione 4 a quelle dei composti con annotazioni.
- Analizzare lo standard come spiegato nella sezione 4 ed elaborare i dati risultanti come descritto per l'alcano - e dati di contenuto della ghiandola MGR nei passaggi 4.4 e 5.2.
- Calibrare i dati acquisiti dallo standard selezionando strumenti | RI-taratura guidata | Prossimo e scegliendo lo stesso file di calibratore RI come usato prima. Selezionare Avanti, poi di nuovo Next e selezionare il file contenente i dati acquisiti dalla soluzione standard cliccando sul simbolo verde + . Premere Avanti , quindi iniziare a calcolare il RI per la mescola standard.
Nota: Se l'analisi dello standard non possono essere eseguito subito dopo analisi del campione, si consiglia di analizzare nuovamente RI calibranti ed effettuare nuova calibrazione del RI e calcolo per lo standard. - Aprire il file corrispondente per lo standard e confermare la sua identità tramite il confronto del suo spettro con la libreria NIST come spiegato al punto 5.4.2.
- Dopo la conferma dell'identità dello standard, aggiungere lo spettro di massa e RI dello standard composto per la biblioteca in loco. A tal fine, fare clic sul simbolo verde + e immettere il nome preferito della voce della libreria. Confermare con OK per aggiungere lo spettro di massa e il RI dello standard composto alla libreria. Se la nuova voce non può essere visto nella libreria, è possibile attivare il pulsante Aggiorna .
Nota: Se la calibrazione RI è stata eseguita con successo, il RI determinato dal MetaboliteDetector apparirà nella rispettiva libreria-voce. Dopo aver creato la voce di libreria per lo standard, l'identificazione di questo metabolita nell'estratto MG basata su una combinazione di RI e spettri somiglianza è possibile. - Aprire nuovamente il file di dati di contenuto di MGR. Selezionare strumenti di | Impostazioni | Identificazione. Ora, come la RI del composto standard è calcolato e aggiunto alla voce della libreria, modificare il Punteggio di somiglianza da Spettro somiglianza al Punteggio combinato.
- Fare clic sull'icona lente di ingrandimento e selezionare il triangolo sotto il composto che è stato annotato nel passaggio 5.4.5.
- Fare clic sul colpo e controllare il valore dato per il 'Punteggio di somiglianza complessiva' (OSS, abbreviato dal metabolita rivelatore come 'Nel complesso simil.'), considerando una combinazione di spettro somiglianza e RI somiglianza Punteggio ottenuto (Figura 11).
Nota: Se un colpo è stato trovato nella libreria interna, esso verrà visualizzato sul lato destro della finestra principale. - Se l'OSS è superiore alla soglia definita dall'utente (qui ≥ 0.9, indicata anche dal colore verde del triangolo), designare il composto come 'identificati' (Figura 11).
6. controllo di MGR contenuto estratto per contaminazioni da DG contenuto
- Aprire il file calibrato del campione DG per il quale il RIs dei composti già è stato calcolato con MetaboliteDetector (passo 5.3.9).
- Per una sovrapposizione del cromatogramma ottenuto dopo la misurazione del campione contenuto MG e il campione DG, selezionare strumenti di | Cromatogramma sovrapposizione e scegliere i due rispettivi file tramite l'icona verde + . Confermare con OK.
- Per visualizzare la sovrapposizione, selezionare il foglio di Sovrapposizione di cromatogramma che appare sulla parte inferiore della finestra.
- Controllo della sovrapposizione dei composti tra il contenuto MGR estrarre (Figura 12) ed il contenuto DG estrarre ed escludere sovrapposti composti da ulteriori analisi di contenuto MGR.
Representative Results
Un flusso di lavoro schematico inserzione la procedura sperimentale per l'identificazione dei metaboliti presunti nelle secrezioni della ghiandola di c. explodens è illustrato nella Figura 13. Inoltre, è fornita una descrizione schematica delle parti del corpo più importanti delle formiche operaie COCY utilizzate per l'esperimento presentato come complementare figura S1 A, B. I passaggi principali da dissezione delle formiche fino alla identificazione di presunti metaboliti nel contenuto MGR sono illustrati nel Complementare figura S2.
Per isolare il contenuto MGR adatto per analisi di volatilome, uno stato raffreddato è stato mantenuto durante il trasporto, la conservazione e anche durante il processo di dissezione. A tal fine, le formiche sono state congelate immediatamente dopo la loro raccolta con l'uso di un aspiratore dell'insetto (sezione 1 Figura 1) e in situ. Dopo immagazzinaggio per 2 giorni in un congelatore a-20 ° C, i campioni di formica sono stati trasportati su ghiaccio secco in Austria, dove sono stati immediatamente messi a-80 ° C fino a ulteriori analisi. Adatte ad essere scelto per l'isolamento del loro contenuto MGR formiche esibiscono una regione gaster è rotonda e intatta (Figura 2A) e nel migliore dei casi ben fornito con contenuto MGR, come indicato dal Mons visibile tra i tergiti (Figura 2B). Gasters di formiche che non sono adatte per un'ulteriore analisi sono mostrati in Figura 2, D. I principali passaggi (2.3-2.6) coinvolti nel processo di isolamento del contenuto MGR dalle formiche COCY sono illustrati nella Figura 3. Il contenuto MGR isolato (giallo nel caso di c. explodens, ma colori può variare dal bianco al rosso in altre specie appartenenti al gruppo COCY) è mostrato nella Figura 14.
Quando le formiche per il loro contenuto MGR di dissezione, si dovrebbe prestare attenzione a non forare o rottura di qualsiasi altre ghiandole o dell'intestino (punto 2.5). La figura 4 Mostra un gaster dissecata formica che contiene ancora due altre, intatte ghiandole (DG e VG) dopo l'isolamento del contenuto MGR. Un esempio di contaminazione visibile dal contenuto degli intestini formica è illustrato nella Figura 15. Poiché la contaminazione incrociata con DG contenuto, situato sotto il Mons, non può essere evitata completamente, una parte del protocollo è raffigurata per analizzare queste ghiandole per il confronto dei segnali risultanti con i segnali dall'estratto contenuto MGR (sezione 6). Quando la procedura di dissezione è fatto correttamente, è possibile ottenere circa 0,75-1,2 mg di contenuto di MGR per ant. Per il protocollo qui descritto, contenuto MGR di cinque formiche sono stati riuniti per ricevere campioni ripetitivi di 3.9-5.9 mg ciascuna.
Il contenuto del serbatoio isolato ghiandola sono state estratte con EtOAc (sezione 3) e analizzato mediante GC-MS (sezione 4). La misurazione dell'estratto contenuto MG di c. explodens formiche operaie si traduce in un cromatogramma con picchi e spettri di massa per decine di presunti composti contenuti di MGR (Figura 5). I due metaboliti dominante 1-(2,4,6-trihydroxyphenyl)-ethanone (ID 4) e 5,7-dihydroxy-2-methylchromen-4-one (ID 5) nell'estratto contenuto di MG causato colonna sovraccarico, motivo per cui lo stesso campione è stato analizzato nuovamente a un più alto rapporto di 50: 1 ( divisi Figura 5, inserto). Possibili contaminazioni del contenuto MGR dai costituenti della DG per esempio, sarebbe visibile come ulteriori picchi nel cromatogramma GC-MS che esibiscono RTs tardi, a partire da circa minuto 29 (Figura 12). Esclusi i picchi cromatografici e spettri di massa dei composti anche trovate il solvente-vuoto, originario dalla fase stazionaria della colonna GC, o dal contenuto della DG presenti nel gaster formica ed il conseguente trattamento con il MetaboliteDetector software ha provocato circa 110 composti contenuti MGR con un segnale/disturbo ratio ≥ 10. Per la successiva annotazione metabolita e identificazione con il software MetaboliteDetector, i cromatogrammi sono stati calibrati e i valori di RI sono stati determinati per i file di esempio misurato (punto 5.3 e passaggi secondari, Figura 6, Figura 7 , Figura 8 , Figura 9). I rilevati metaboliti presunti di MGR contenuti sono stati annotati basato su una combinazione di somiglianza di spettro per la libreria di NIST, che forma parte integrante del software MetaboliteDetector nell'esempio presentato (punto 5.4 e passaggi secondari, Figura 10 ). Inoltre, RI valori trovati in letteratura per la fase stazionaria stessa o comparabile, spessore del film e il diametro della colonna GC sono stati considerati per l'annotazione di composto (passaggi 5.4.4 e 5.4.5). Dopo aver impostato i rigorosi criteri di corrispondenza e conferma di RIs e spettri di massa mediante l'uso di standard, come spiegato nella sezione protocollo per uno standard composto (passaggi 5.4.7-5.4.15 e Figura 11), è stato possibile confermare l'identità di circa 10 % dei metaboliti rilevati. Poiché una relazione dettagliata sul volatilome del contenuto MGR di c. explodens sarà pubblicata altrove, il presente studio focalizzato su quei metaboliti che sono già stati descritti in una precedente pubblicazione di Jones et al. 17 (specie qui designato come KB02-108; Vedi anche Cook et al. 23). la tabella 1 fornisce una panoramica di questi composti identificati.
Figura 1: disegno di un aspiratore dell'insetto schematico. In un coperchio che sigilla un flaconcino o contenitore, vengono fatti due buchi, dove i due tubi flessibili sono messi. L'apertura di un tubetto (T1) che si affaccia all'interno del flaconcino è sigillata con una mesh bene abbastanza per bloccare gli insetti. Inoltre, fori sono fatti nel tubo per facilitare lo scambio d'aria. L'estremità del tubo T2 è strettamente orientato sugli insetti che vengono risucchiati nella fiala di campionatura aspirando attraverso T1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: intatto contro rotto gaster. (A) adatto per dissezione gaster intatto. (B) intatto gaster quasi completamente riempito di contenuti MGR, adatto anche per la dissezione. (C) e (D) rotto gasters formica con contenuto MGR espulso e indurito (giallo), possibilmente rotto durante la rottura del integument gaster durante il campionamento. Queste formiche sono esclusi dalla dissezione, estrazione e un'ulteriore analisi. T: tergite. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: principali passaggi necessari per il processo di dissezione. (A) separazione della regione gaster dal resto del corpo della formica. (B) staccando l'esoscheletro: tergite 1, tergite 2 (C) e il tergite 3, dopo il quale il contenuto del MGRs colorato giallo abbinato è quasi completamente visibile (D). (E) rimuovendo il contenuto MGR appiccicoso con l'aiuto di un ago di dissezione. T: tergite. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: gaster Ant dopo l'isolamento del contenuto MGR. Le altre due ghiandole presentano nel gaster (VG: ghiandola velenifera e DG: ghiandola di Dufour) può essere visto. Dopo la rimozione del contenuto MGR (avanzi dopo isolamento può essere visto in giallo), entrambi i compartimenti dovrebbero essere ancora intatti. Queste ghiandole possono essere analizzate nello stesso modo come il contenuto MGR. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: cromatogramma di (TIC) corrente ionica totale rappresentativo dell'estratto contenuto MGR. Le due cime più abbondante di GC-MS ha provocato più simmetricamente a forma di picchi cromatografici, quando un più alto rapporto di divisione (50: 1) è stato scelto invece il normale rapporto di 2:1 (Vedi riquadro). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: determinazione dell'alcano primo rilevabile nel cromatogramma calibratore RI. Il triangolo sotto massimo del picco del primo picco alcano è selezionato. L'alcano eluisce a 6,31 min e Mostra la massima somiglianza di spettro (qui, 'Spec. sim.') per la voce di libreria 'Alkane_C09'. Per confermare l'identità dell'alcano, lo spettro di massa viene confrontato con una libreria (ad es., NIST chimica WebBook22). Nell'esempio presentato, nonano identificato dalla sua ione molecolare con un valore di m/z di 128. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: calibrazione del RI con l'uso di una miscela standard di alcano. Il calibratore di RI è stato aperto il file di dati e la funzione di 'RI-calibrazione-Wizard' scelta. Il corretto abbinamento del tempo di ritenzione al RI raffigurato nella tabella di calibrazione deve essere controllato. La RT di 6,31 min per alkane_C09 (nonano) viene visualizzato correttamente nella tabella. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: sbagliato RTs vengono visualizzati nella tabella di calibrazione. La RTs non vengono visualizzati correttamente (sia indicato da un valore errato di RT o di un valore di RT mancante visualizzato come -1). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: correzione manuale della RTs sbagliato nella tabella di calibrazione. Valori errati possono essere corretti manualmente inserendo il corretto RT per il rispettivo alcano, come mostrato qui per Alkane_C39. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 10: confronto di spettro di massa di composto selezionata voci NIST-libreria. Dopo aver selezionato il picco massimo medicati al 6,16 min (RI 891) e l'attivazione della funzione "NIST-ricerche" (cerchio rosso), viene visualizzata una somiglianza di spettro di 0,99 per 2-eptanone. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 11: identificazione dei metaboliti nell'estratto contenuto MGR. Lo spettro di massa e il RI provenienti dall'eluizione composto al RI 891 nel cromatogramma del campione vengono confrontati con le voci di biblioteca interna contenente RIs e spettri di mescole standard misurati. Se il 'Punteggio complessivo di somiglianza' (OSS, abbreviato in metabolita rivelatore come 'Nel complesso simil.' implementazione di spettro di massa e RI) tra un composto in biblioteca in loco e un composto nell'esempio file è ≥ 0.9, il composto viene designato come 'identificato'. Qui, l'OSS tra la voce di libreria in-House di 2-eptanone e l'eluizione composto al RI 891 è 0,96, che si traduce nell'identificazione di 2-eptanone nel contenuto MGR estrarre. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 12: sovrapposizione di sezioni di cromatogramma TIC (min 29 a min 35) del contenuto DG estrarre (rosso) ed estrarre il contenuto MGR (blu). Aree dei picchi corrispondenti ai (presunti) composti di sovrapposizione sono più alti della DG contenuto estratto rispetto al contenuto di MGR Estratto; questi composti potenzialmente provengono da DG e sono quindi considerati come contaminanti (minore) del contenuto di MGR estrarre. Nel caso l'estratto contenuto c. explodens MGR, i picchi cromatografici derivanti da una presunta impurità DG si trova a circa min 29, e questa parte del cromatogramma si possa escludere ulteriori analisi del contenuto MGR. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 13: schematica del flusso di lavoro da campioni di formica per l'annotazione/identificazione dei metaboliti nel contenuto serbatoio ghiandola estratti dopo analisi GC-MS. Il protocollo presentato qui spiega tutto sperimentale passaggi a partire dall'isolamento del contenuto MGR tramite dissezione della formica e analisi GC-MS e valutazione dei dati (indicata in nero). In alternativa, la secrezione dell'insetto può anche essere generato e raccolti in situ (indicata in grigio). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 14: isolato ceroso contenuto MGR prima dell'estrazione. (A) il contenuto del due MGRs stare insieme, ma (B) possono anche essere separati dopo l'isolamento. In explodens c., il colore del contenuto MGR è arancio-giallastro, ma può variare dal bianco al rosso in altre specie del gruppo COCY. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 15: illustrazione di una secrezione di MGR isolata contaminata incrociata di costituenti dell'intestino dell'insetto (marrone). Questi tipi di MGR isolati sono esclusi dall'estrazione e un'ulteriore analisi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| ID | Metabolita | Nome insignificante | InCHI stringa | Formula di somma | ||||||
| 1 | Heptan-2-one | InChI=1S/C7H14O/c1-3-4-5-6-7 (2) 8/ h3 - 6H 2, 1-2H 3 | C7H14O | |||||||
| 2 | n-Undecane | InChI=1S/C11H24/c1-3-5-7-9-11-10-8-6-4-2/h3-11H2,1-2H3 | C11H24 | |||||||
| 3 | n-Heptadecane | InChI=1S/C17H36/c1-3-5-7-9-11-13-15-17-16-14-12-10-8-6-4-2/h3-17H2,1-2H3 | C17H36 | |||||||
| 4 | 1-(2,4,6-Trihydroxyphenyl)-ethanone | Monoacetylphloroglucinol | InChI = 1S/C8H8O4/c1-4 (9) 8-6 (11) 2-5 (10) 3-8 12/h2-3,10-12 H, 1 H 3 | C8H8O4 | ||||||
| 5 | 5,7-dihydroxy-2-methylchromen-4-One | Noreugenin | InChI = 1S/C10H8O4/c1-5-2-7 (12) 10-8 (13) 3-6 (11) 4-9 (10) 14-5/h2-4,11, 13h, 1h 3 | C10H8O4 | ||||||
Tabella 1: metaboliti identificati nella EtOAc estrarre il contenuto di MGR isolato dalle formiche lavoratore minore c. explodens . Metaboliti selezionati sono presentati.
Complementare figura S1. Panoramica delle parti del corpo più importanti appartenendo a formiche COCY (minori lavoratori) presentati in questo manoscritto. (A) The MGRs sono mostrati in giallo. La loro parte sterniti viene utilizzato per l'analisi di volatilome. (B) la parte tergita della MGRs sorge sotto tergiti 1 a 3. T: tergite. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
Complementare figura S2. Descrizione schematica dell'esperimento presentato. Sono illustrati i passaggi principali da dissezione della formica fino alla presunta identificazione dei metaboliti presenti nel contenuto del MGR. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
Discussion
In questo manoscritto, presentiamo un protocollo completo per l'analisi volatilome del contenuto trovato nel MGRs ipertrofico di formiche lavoratore minore c. explodens . Poiché le formiche qui utilizzate possono 'esplodere' ed espellere il loro contenuto MGR in modo incontrollato, quando ha toccato con il forcipe, si consiglia di utilizzare una tecnica di raccolta 'soft' come previsto da un aspiratore dell'insetto (Figura 1). Per alcune specie di formiche tra cui formiche COCY, può essere necessario limitare il numero massimo di formiche a cinque persone per flaconcino da 50 mL, poiché in caso contrario auto-avvelenamento delle formiche (ad es., da accumulo di acido formico in spazio di testa) può accadere. Per congelare le formiche nel campo, un sacchetto freddo farcito con impacchi freddi surgelati può essere utilizzato. I campioni dovrebbero essere congelati e conservati (ad es., da-20 ° C, migliori a-80 ° C) in condizioni raffreddato rapidamente, ma non è consigliabile per uccidere e memorizzare le formiche in azoto liquido, poiché danno maggiore delle loro ghiandole è stato osservato con questo metodo.
La metodologia di dissezione presentato buffer - e privo di solventi è adatta per ottenere il contenuto del serbatoio ceroso mandibular della ghiandola, nonché altre ghiandole presenti in formiche operaie congelati. Per volatilome l'analisi del contenuto MGR di explodens c., gli aspetti principali da considerare durante la dissezione sono raffreddamento continuo della formica (passo 2.1.4) e minimizzando cross-contaminazioni dei campioni MG con altri presenti nella ghiandola contenuto/fluidi il gaster formica (passo 2.5, Figura 4e Figura 15). Una parte considerevole delle formiche congelate potrebbe essere danneggiata, perché le formiche 'esplose' durante il campionamento o sono state danneggiate durante il trasporto il ghiaccio secco dal sito di campionamento al laboratorio. Se la regione di gaster è rotta, queste formiche non sono adatte per ulteriori analisi (Figura 2, D). Se solo antenne e le gambe sono mancanti o rotti, queste formiche possono ancora essere utilizzate per l'estrazione del contenuto MGR e un'ulteriore analisi. Poiché il contenuto MGR di raffreddato explodens c. formiche hanno una consistenza simile alla cera è straight-forward per isolarli con l'uso di aghi di dissezione (passo 2.5, Figura 3Ee Figura 14). Maggiore cura deve essere presa mentre si maneggia il Mons appiccicoso contenuto. Si può attaccare a nulla entrano in contatto fisico con esso e anche spesso aderirà al forcipe di dissezione, che aumenta il rischio di contaminazione di altri campioni. È necessario toccare solo il contenuto MGR con l'ago di dissezione e trasferire immediatamente in fiale di vetro utilizzate per l'estrazione (punti 2.5 e 2.6). Inoltre, si raccomanda di pulire l'apparecchiatura di dissezione con una miscela di2O di MeOH/H quando si passa tra le formiche o ghiandola-tipi (punto 2.8).
Contenuto della ghiandola di altre specie di formica può essere presente allo stato liquido anche durante il raffreddamento con impacchi freddi. In questo caso, la ghiandola intera, compreso la membrana può in primo luogo essere isolata e perforata in seguito per ottenere il contenuto. Secrezioni liquide possono essere ottenute anche con l'aiuto di pipette capillari bene. Con una lunghezza di corpo medio di circa 4-5 mm (senza antenna), lavoratori di c. explodens appartengono alla specie più piccola del gruppo COCY. Loro spesso gonfie gaster comprende circa 2-2.5 mm di lunghezza e 1-1,5 mm di larghezza. Lavoratori delle specie conosciute finora più grande del gruppo di COCY possono raggiungere una dimensione di circa 8 mm di lunghezza del corpo con una dimensione di gaster di circa 3 mm di lunghezza e 2,5 mm in larghezza. Poiché il protocollo è adatto per sezionare e indagare singole formiche e gasters di quelle dimensioni di diverse specie COCY, qui utilizzato strumenti per la dissezione e microscopio può avere essere adattati per essere applicabile per piccole formiche o più piccoli organi. Inoltre, il numero di formiche per campione analitico potrebbe essere necessario essere aumentato pure.
Mentre la formica per il contenuto MGR di dissezione, è fondamentale per non danneggiare qualsiasi altre ghiandole o dell'intestino - il cui contenuto può traversa-contaminare il campione (punto 2.5, Figura 4 e Figura 15). Nel caso ottima, dopo l'estrazione del contenuto MGR, DG, così come il VG sono visibilmente mantenuto intatto (Figura 4). Contaminazioni con il contenuto della DG, che si trova sotto il MGRs, sono difficili da evitare completamente. Le ragioni possono includere anche la rottura parziale dell'integrità della ghiandola durante il trasporto il ghiaccio secco dal sito di campionamento al laboratorio. È anche possibile che le DG danneggiate durante il campionamento o in procinto di esplodere, come abbiamo notato per il Mons in un certo numero di formiche indagate. Poiché il contenuto DG può essere analizzato allo stesso modo come il Mons Sommario (sezioni 3 e 4), i risultati possono essere confrontati ai dati risultanti dopo l'analisi dei campioni contenuti MGR (sezione 6). Nel caso di estratti contenuti MGR ottenuti dalle formiche explodens c. , i composti contenuti anche nella DG cominciano a eluire tardi nel cromatogramma (Figura 12). Per evitare di confondere DG composti per i costituenti MGR, i rispettivi metaboliti possono essere escluso da ulteriori analisi. Da studi su altre specie di formica è noto che DGs può anche contenere composti volatili (altamente)1,24, che in genere eluire presto nel GC-cromatogramma.
Negli studi precedenti a che fare con la composizione chimica del contenuto MGR di COCY formiche, formiche tutta o loro gasters intero sono stati analizzati16,17,18,23, considerando che contenuto qui il MGR essi stessi sono stati ottenuti tramite la dissezione delle formiche.
Analisi dissecata MGR contenuti permette ai ricercatori di effettuare una vasta gamma di studi biochimici, compresa l'identificazione dei metaboliti in esso contenute. Dal momento che lo studio effettuato qui focalizzata sull'identificazione dei costituenti volatili contenute nel MGR di c. explodens, GC-MS è stato scelto per la sua analisi (sezione 4). Per questo, gli estratti dovrebbero idealmente essere misurati immediatamente dopo la preparazione o conservati a-80 ° C fino all'analisi. Si noti che il magazzinaggio (estesa) possono provocare alterazioni chimiche degli estratti (Vedi note dopo passi 3.3 e 4.2). Poiché la concentrazione del contenuto MGR può coprire una gamma di diversi ordini di grandezza, può essere necessario analizzare gli estratti MGR presso diversi GC dividere rapporti. Poiché i due composti principali nel contenuto MGR estrarre delle formiche prese per esemplificare il protocollo causato colonna sovraccarico quando è stato utilizzato un rapporto di divisione di 2:1, questo campione è stato analizzato una seconda volta a un più alto rapporto di divisione di 50: 1 (passo 4.3.1.2and Figura 5). Le impostazioni del parametro di GC-MS presentate nella sezione 4 sono adatte per i dati generati con i dispositivi di GC-MS specificati nella Tabella materiali. Accanto il RI calibranti (punto 4.1.1), un solvente-vuoto (punto 4.1.2) dovrebbe essere analizzato anche per riconoscere gli artefatti non-biologici e contaminanti durante l'analisi di dati successivi. Per l'identificazione dei metaboliti, è anche importante misurare gli standard autentici di composti con annotazioni sotto le stesse condizioni di GC-MS usato per analizzare gli estratti di campione (dopo 5.4.7and di passaggi). Per migliorare la precisione e affidabilità dei dati finali, è consigliabile analizzare tutte le categorie di campione (solvente-blank, calibranti RI, estratti del campione e standard) all'interno della stessa sequenza di misurazione. Inoltre, l'autentico standard dovrebbero essere analizzati ad una concentrazione paragonabile a quella osservata per gli estratti di campione. Questo aiuta a migliorare la precisione dei valori di RI e somiglianza tra campione e standard spettri di massa, che portano infine alla annotazione/identificazione dei metaboliti di maggiore e più significativo. A tal fine, le norme possono essere misurate ripetutamente utilizzando split diversi fattori.
Per l'identificazione dei metaboliti, il sofisticato software, MetaboliteDetector è utilizzato per il confronto di deconvoluzione e RI e spettri spettri ad un implementato NIST-biblioteca anche per quanto riguarda una biblioteca in loco stabilita (sezione 5). Si raccomanda di eseguire MetaboliteDetector su un 64bit LINUX-sistema operativo (ad es., KUBUNTU) e copiare il generato *. File di dati CDF (punto 4.4) dalla periferica di archiviazione dati portatile sul disco rigido locale. MetaboliteDetector è in grado di importare dati grezzi di GC-MS in formato netCDF centroide o profilo. Il software della maggior parte degli strumenti di GC-MS dovrebbe essere in grado di convertire i dati raw registrati in questo formato19. Prima di iniziare l'analisi dei dati, si consiglia vivamente di leggere la letteratura disponibile per versioni precedenti del software MetaboliteDetector acquisire familiarità con le funzionalità e interfaccia utente grafica19,25, 26.
Per la calibrazione di RI e successivo calcolo del valore di RI delle cime composte presenti negli estratti del campione, viene utilizzata una libreria contenente RIs e spettri di RI calibranti (qui, n-alcani). Una libreria di questo tipo può essere auto-affermato, o una preesistenza ('CalibrationLibrary_Alkanes') può essere scaricato27. La biblioteca di calibratore predefinito fornito contiene RIs e spettri per n-alcani che vanno da C09 a C39 che sono stati analizzati come descritto nella sezione 4. La libreria fornita consente gli utenti che lavorano con rilevatore di metabolita per avviare direttamente con il processo di calibrazione dei propri dati. Se necessario, questa libreria può anche essere esteso con voci aggiuntive per ulteriori alcani. Basandosi sulla somiglianza di riferimento e sperimentalmente derivata RIs e spettri di massa (Vedi punto 5.3 e passaggi secondari, Figura 7, Figura 8, Figura 9), annotazione o identificazione dei composti può essere eseguita (punto 5.4 e passaggi secondari, Figura 11). Inoltre è fondamentale che dopo trattamento automatizzato di dati con MetaboliteDetector, l'utente verificherà manualmente per deconvoluzione di picking e spettro di picco corretto controllando spettri di massa sottostante il 'triangolo' per ciascun putativo composto di interesse. Inoltre, a seconda della strumentazione GC-MS e le impostazioni dei parametri utilizzate per la generazione di dati, gli adattamenti delle impostazioni MetaboliteDetector presentate possono essere necessari. Il software MetaboliteDetector è in grado di eseguire molte operazioni più utile di quanto spiegato in questo manoscritto, ad esempio, visualizzazione di cromatogrammi (EIC) corrente di ioni estratti, esportazione di cromatogrammi come CSV, automatica batch-quantificazione del composti e molti altri.
Il protocollo presentato in questo manoscritto può servire come suggerimento per esperimenti effettuati da altri ricercatori concentrandosi sull'isolamento delle ghiandole o contenuto della ghiandola da insetti, analisi volatilome, nonché l'identificazione dei metaboliti.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Finanziamenti per questo studio è stato ottenuto attraverso la Vienna Science e Technology Fund (WWTF) LS13-048 per DSi. Speciali ringraziamenti vanno a Diane W. Davidson (University of Utah; ora ritirato) per condividere la sua conoscenza circa le formiche di Bornean COCY con noi. Apprezziamo le amministrazioni dei Kuala Belalong Field Studies Center (KBFSC) e Universiti Brunei Darussalam (UBD) per l'approvazione del progetto, nonché del Brunei Dipartimento foreste e del Brunei ricerca e centro di innovazione per l'autorizzazione a raccogliere le formiche e approvazione e rilascio dei permessi di esportazione. Speciali ringraziamenti vanno a UBD e KBFSC personale, soprattutto speranza Muhammad bin Abdullah Bat, Teddy Chua Wee Li, Masnah Mirasan, Rafhiah Kahar, Roshanizah Rosli, Rodzay Wahab, Mei Chin Chan e Kushan Tennakoon per facilitare le nostre ricerche.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tube 50 ml, 115 x 28 mm, flat/conical base PP | Sarstedt | 62,559,001 | see Figure 1 in manuscript |
| PVC Tubings | Rehau | 290 4489 | see Figure 1 in manuscript |
| Mesh, stainless steel, 0.63 mm mesh size | Antstore | 1000378 | see Figure 1 in manuscript |
| Freezer | Severin | KS 9890 | -20 °C or lower |
| polystyrene foam box, inner dimensions 155 mm x 100 mm x 45 mm | Thorsten Koch | 4260308590481 | |
| Petri dish, glass, 100 mm x 15 mm | Aldrich | BR455742 | |
| Cold pack 150 mm x 100 mm | Elite Bags | 1998 | freeze to -20 °C |
| Bucket with crushed ice | |||
| 1.5 mL Short Thread Vials, 32 x 11.6 mm, clear glass, 1st hydrolytic class, wide opening | La-Pha-Pack | 11090500 | |
| Screw caps for 1.5 mL Short Thread Vials, closed, Silicon white/PTFE red septum, 55° shore A, 1.0 mm | La-Pha-Pack | 9151799 | |
| Stereomicroscope | Bresser | 5806100 | |
| Forceps, Superfine Tip curved | Medizinische Instrumente May, Norman May | PI-0005B | |
| Forceps, Superfine Tip straight | blueINOX | BL-3408 | |
| Dissection needle 140 mm, pointed, straight | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1110301 | |
| Methanol, LC-MS CHROMASOLV, Honeywell Riedel-de Haën | fisher scientific | 15654740 | |
| Distilled water | |||
| Rotizell-Tissue-Tücher | Carl Roth GmbH + Co.KG | 0087.2 | |
| Acetic acid ethyl ester ROTISOLV ≥99,8 % | Carl Roth GmbH + Co.KG | 4442.1 | freeze to -20 °C |
| Vortex Genie 2 | neoLab | 7-0092 | |
| 0.1 mL micro-inserts for 1.5 mL Short Thread Vials, 31 x 6 mm, clear glass, 1st hydrolytic class, 15 mm tip | La-Pha-Pack | 06090357 | |
| Screw caps for 1.5 mL Short Thread Vials, with hole, RedRubber/PTFE septum, 45° shore A, 1.0 mm | La-Pha-Pack | 9151819 | |
| Alkane standard solution C8-C20 | Sigma-Aldrich | 04070 | |
| Alkane standard solution C21-C40 | Sigma-Aldrich | 04071 | |
| n-Hexane SupraSolv | Merck | 104371 | |
| GC-autosampler, e.g. MPS2XL-Twister | Gerstel | ||
| Agilent Gas chromatograph 6890 N | Agilent | ||
| Gooseneck splitless Liner | Restek | 22406 | |
| Helium (5.0 - F50) | Messer | 102532501 | |
| GC capillary column HP-5MS UI 30 m × 0.25 mm ×0.25 µm | Agilent | 19091S-433UI | |
| Agilent Mass Selective Detector 5975B | Agilent | ||
| MSD ChemStation Data Analysis Application software | Agilent | ||
| MetaboliteDetector software (3.1.Lisa20170127Ra-Linux) | Hiller K | download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 | |
| Calibration Library for MetaboliteDetector | Hiller K | download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 | |
| MD Conversion Tool for NIST-library | Hiller K | download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 |
References
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