Summary
Minorarbeiterinnen Ameisenarten Colobopsis Explodens werden indiziert, um den Wachs-wie Inhalt gespeichert in ihre hypertrophierten Unterkiefer Drüse Lagerstätten für nachfolgende Lösungsmittel-Extraktion und Analyse von Gaschromatographie-Massenspektrometrie zu isolieren. Die Beschriftung und Kennzeichnung an flüchtigen Bestandteilen, die mit der Open-Source-Software MetaboliteDetector ist ebenfalls beschrieben.
Abstract
Dieses Manuskript soll ein Protokoll beschreiben Metabolomic Analyse von Bornean "explodierende Ameisen" Colobopsis Cylindrica (COCY) Gruppe zu präsentieren. Zu diesem Zweck ist die Modell-Arten C. Explodens gebrauchte. Ameisen gehören zur Kaste kleine Arbeiter besitzen charakteristische hypertrophierten mandibulares Drüsen (MGs). Im territorialen Kampf verwenden sie den viskosen Inhalt ihrer vergrößerten Unterkiefer Drüse Stauseen (MGRs) rivalisierende Arthropoden in charakteristischen selbstmörderisch "Explosionen" durch freiwillige Ruptur der gastral Integument (Protozoen) zu töten. Wir zeigen das Sezieren von ArbeiterInnen dieser Art für die Isolierung des gastral Teils wachsähnliche MGR Inhalt sowie auflisten die notwendigen Schritte für Lösungsmittel-Extraktion der darin enthaltenen flüchtigen Verbindungen mit nachfolgenden Gas erforderlich Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) Analyse und vermeintliche Identifizierung von Metaboliten im Extrakt enthalten. Die Dissektion Prozedur erfolgt unter gekühlten Bedingungen und ohne den Einsatz von jedem Dissektion Pufferlösung, die Änderungen in der chemischen Zusammensetzung die MGR-Inhalte zu minimieren. Nach Lösungsmittel Extraktion der flüchtige Stoffwechselprodukte, die darin enthaltenen werden die notwendigen Schritte für die Analyse der Proben über Flüssigkeit-Injektion-GC-MS präsentiert. Zu guter Letzt zeigt Datenverarbeitung und vermeintliche Metabolit Identifikation mit dem Einsatz von Open-Source-Software MetaboliteDetector. Mit diesem Ansatz die Profilerstellung und Identifizierung von flüchtigen Metaboliten in MGRs Ameisen gehören zu den COCY Gruppe über GC-MS und die MetaboliteDetector-Software möglich.
Introduction
Das übergeordnete Ziel des hier vorgestellten Workflows ist die allgemeine Untersuchung der chemischen Zusammensetzungen in Ausscheidungen von Insekten. Dies geschieht mit dem vorrangigen Ziel der Aufklärung die ökologische Rolle der Sekretion als Ganzes oder einzelne Verbindungen davon. Darüber hinaus sind wir bei der Untersuchung der Stoffwechselwege zugrunde liegen die Verbindungen in die jeweiligen Sekrete interessiert. Vor allem Drüse Inhalt von Ameisen (Hymenoptera, Ameisen) haben steigende Zinsen in den letzten Jahren gewonnen, da diese Quellen bisher unerforschten potentiell bioaktiven Substanzen (Klebstoffe, Antibiotika, etc.)1, bieten 2. kleinere Arbeiterameisen einiger Arten gehören zu den COCY Gruppe3,4 können solche Verbindungen in ihre hypertrophierten MGRs, die von der Mundwerkzeuge, die Gaster5,6verlängern. Wenn von vermeintlichen Feinden bedroht, kleinere Arbeiter von C. Explodens7 und einige verwandte Arten machen Verwendung von ihrer MGR Inhalt auf ungewöhnliche Weise: sie opfern sich durch Brechung ihre gastral Wand zum Auswerfen des klebrigen Inhalts der MGRs explosionsartig auf den Gegner, sterben worauf der vermeintliche Feind festgehalten wird und kann sogar5,6,8,9. Der Zweck der Entwicklung und den Einsatz der hier vorgestellten Methoden war, um das Verständnis der chemischen Zusammensetzung und der Art der vorläufig toxische Bestandteile dieser Ameise Sekretion zu verbessern.
Zu diesem Zweck präsentieren wir ein Protokoll für die Zerlegung des C. Explodens Arbeiterameisen gastral Portion inhaltlich wachsähnliche MGR mit nachfolgenden Lösungsmittel-Extraktion und Analyse von GC-MS zu erhalten.
GC-MS-Analyse gehört zu den etablierten Methoden für die Profilerstellung und Identifizierung von flüchtigen Metaboliten (Volatilome) von Insekten. Typische Analyten von Interesse an Ameisen gehören kutikulären Kohlenwasserstoffe10, Botenstoffe11, und im Allgemeinen mit biologischer Aktivität12Verbindungen. Muster erhalten ganze Tiere oder Körperteile und Flüssigkeiten isoliert über Dissektion der Insekten13,14. Probe Präparationstechniken gehören Extraktion der darin enthaltenen Metaboliten mit dem Einsatz von Lösungsmitteln14 oder Headspace-Solid-Phase-Microextraction (HS-SPME)15.
Metabolomic Studien ist es wichtig, dass die Proben unmittelbar nach der Probenahme, schnell eingefroren werden, um Veränderungen in der chemischen Zusammensetzung und Menge der Verbindungen zu minimieren. Die Ameisen, die für diese Studie verwendet wurden durch schnelles Gefrieren vor Ort in eine coole Tasche gefüllt mit tiefgefrorene Kühlakkus getötet. Die Proben wurden anschließend in einem-20 ° C-Gefrierschrank elektrisch Generator angetrieben, bevor sie in das Labor auf Trockeneis transportiert wurden gespeichert. Hier vorgestellten Dissektion-Verfahren bietet die Möglichkeit, MGR Inhalt ohne Analyse der gesamten Ameise oder die Gaster als Ganzes, zu isolieren, da es verschiedene COCY Arten16,17,18zuvor getan hat. Darüber hinaus ermöglicht der vorgestellte Protokoll auch direkten Zugang und Analyse der umgebenden Drüsen und Gewebe, wie die Venom Drüse (VG)5,8, die Dufour Drüse (DG)8oder den Darm in anderen biologischen Studien oder zu Suchen Sie nach möglichen Kreuz-Kontaminationen während der Handhabung oder Dissektion der Ameisen eingeführt. Um die Änderungen in der chemischen Zusammensetzung die MGR Inhalte während der Dissektion, Auftauen Proben oder durch den Einsatz von Chemikalien zu minimieren, wurde die Dissektion Prozess optimiert, um auf einem Kühlakku (-20 ° C), ohne die Verwendung von jeder zusätzlichen Puffern durchgeführt werden, Spüllösungen oder Lösungsmittel. Die Proben über diese Methode eignen sich für qualitative und quantitative Fragen zu beantworten.
Analyse der Daten zum Zwecke der vermeintlichen Metabolit Annotation und Identifikation erfolgt über Open-Source-Software MetaboliteDetector19, das für die automatische Analyse der Metabolomik GC-MS-basierte Daten entwickelt wurde. Es erkennt einzelne Ionen-Gipfeln im Chromatogramme, führt einen Dekonvolution Schritt und Extrakte der deconvoluted Massenspektren von chemischen Verbindungen, die in den analysierten Proben enthalten. Vermeintliche Identifizierung von Verbindungen mit MetaboliteDetector basiert auf den ermittelten Retention-Index (RI; der Kovats RI kann automatisch von der Software berechnet werden) sowie Ähnlichkeit der deconvoluted Massenspektren. RI und spektrale Match-Faktor kann gegengeprüft gegen entweder bestehende Präsenzbibliotheken (, die importiert werden können wenn sie in der gemeinsamen NIST-Format sind,), oder eine etablierte Hausbibliothek. Dies ist in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die (vermeintlich) zusammengesetzte Identifizierung vorgeschlagen, z. B.durch die chemische Analyse arbeiten Gruppe (CAWG) der Metabolomik Standards Initiative (MSI), wo ein Minimum von zwei unabhängigen und orthogonal Daten bezogen auf eine authentische Verbindung (hier Retention time (RT) /RI und Massenspektrum) analysiert unter identische Versuchsbedingungen werden nach Bedarf zu bestätigen-Roman Metabolit Identifikationen20vorgeschlagen.
Das komplette Experiment ist auf dem MGR-Inhalt der Gattung COCY Modell C. Explodensdurchgeführt, aber die Dissektion Schritte auch an die anderen Drüsen vorhanden in der Ameise Gaster isolieren angepasst werden können. Darüber hinaus während präsentieren wir ein Protokoll für die umfassende Analyse der Volatilome des MGR Inhalts, die generische Teile des Workflows beschreiben, Extraktion, GC-MS Messung und Auswertung der Daten auch für die Analyse und (vermeintlich) einsetzbar Kennung der flüchtige Stoffwechselprodukte im Allgemeinen.
Da die Experimente in diesem Manuskript beschrieben auf Insekten durchgeführt werden, ist keine ethische Genehmigung erforderlich. Feldarbeit, Probenahme von den Ameisen, sowie ihre Verwendung zur Veröffentlichung sind gemäß den Richtlinien zur Regelung dieses Projekts durch die Universiti Brunei Darussalam, Forschung und Innovation Centre und Brunei Forstamt, Brunei Brunei Darussalam.
Protocol
1. Sammlung von Ameisen
- Sammeln Sie kleine ArbeiterInnen mit dem Einsatz von eine Absauganlage (Abbildung 1).
- Unmittelbar nach der Probenahme, beheben Sie die Ameisen durch schnelles Gefrieren bei-20 ° C zu, und speichern Sie diese dies oder eine niedrigere Temperatur bis zur Analyse.
2. Isolierung der GD von Ameisen und MGR Inhalt
- Bereiten Sie vor das Sezieren von Ameisen die folgenden:
- Reinigen Sie die Petrischale Glas und die Dissektion Instrumente mit einem Methanol-Wasser-Gemisch (MeOH/H2O; 1 + 1 V/V) und Gewebe.
Achtung: MeOH ist giftig für den Menschen. Immer tragen Sie geeignete Handschuhe, einen Kittel und Schutzbrillen zu, und führen Sie die Reinigung unter einem Abzug. - Einfrieren der Cold-Pack und das Glas Petrischale bis-20 ° C.
- Bestimmen Sie die Massen von 1,5 mL kurzen Faden Fläschchen einschließlich Schraubkappen mit Silikon/Polytetrafluorethylen (PTFE) Septen und halten sie auf dem Eis direkt neben dem Mikroskop.
Hinweis: Die Wahl der Probenfläschchen ist optional. Hier werden die MGR-Inhalte direkt in gekühlten 1,5 mL Fläschchen aus Glas gemacht gesetzt. Kunststoffe können Verbindungen (z. B. Phthalate) enthalten, die Artefakte, die die Signale von der Ziel-Metaboliten stören verursachen können. - Legen Sie die gefrorenen Kühlakku in eine Box aus extrudiertem Polystyrol-Hartschaum. Die Petrischale auf das Kühlkissen legen Sie und eine gefrorene Ameise in die Schüssel. Montieren Sie das Feld unter dem Stereo-Mikroskop. Passen Sie die Vergrößerung (20 – 40 X) und den Fokus, bis die ganze Ameise deutlich zu erkennen.
- Reinigen Sie die Petrischale Glas und die Dissektion Instrumente mit einem Methanol-Wasser-Gemisch (MeOH/H2O; 1 + 1 V/V) und Gewebe.
- Überprüfen Sie die gefrorenen Ameise für die Integrität seiner gastral Fächer. Dissektion dauern Sie nur Ameisen mit einer intakten Gaster Region (Abb. 2A, B). Schließen Sie Ameisen mit flachen dabei oder Spuren von gehärteten MGR Inhalte auf ihre Körperoberfläche von der weiteren Analyse (Abbildung 2, D).
- Schnappen Sie sich die ausgewählten Ameise mit ein paar feine Spitzen Pinzette auf das Propodeum (erste abdominalsegment) und mit dem anderen paar der Zange am Blattstiel (zweite abdominalsegment). Lösen der Region Gaster durch leichtes ziehen es weg vom Rest des Körpers Ameise (Abb. 3A).
- Beheben Sie die nun getrennten Ameise Gaster durch hielt es mit feinen Spitzen Pinzette bei Tergit 4. Greifen Sie mit einem anderen paar feine Spitzen Pinzette Tergit 1 (direkt neben den Blattstiel) und entfernen Sie es vorsichtig durch Abziehen (Abb. 3 b). Wiederholen Sie dies auch für Tergites 2 und 3 (Abbildung 3, D) bis der gastral Teil von der MGRs (gelb gefärbt in C. Explodens Arbeiterameisen, aber die Farbe MG Inhalte reichen von weiß über gelb bis rot in anderen Arten) ist für die meisten sichtbar Teil.
Hinweis: Entfernen Sie das Exoskelett, wird die Membran der MGR auch teilweise entfernt werden. - Entfernen Sie durch die Verwendung einer Dissektion Nadel vorsichtig den Wachs-wie Inhalt der gekoppelten MGRs durch Kratzen sie aus das gastral Fach (Abbildung 3E). Entfernen Sie nur die Teile des Inhalts MGR, die isoliert werden können, ohne anderen Drüsen vorhanden in der Ameise Gaster bersten. Wenn mehr Kraft oder Bemühungen werden, um den MGR-Inhalt als Ganzes zu erhalten angewandt müssen, akzeptieren Sie den unvollständigen Entfernung (Abbildung 4).
- Abholen der MGR-Inhalt durch sanft berühren mit der Dissektion Nadelspitze bis sie drauf kleben. Übertragen Sie dann die MGR-Inhalte in ein gekühltes 1,5 kurzen Faden Fläschchen mit bekannter Masse zu tarieren.
- Um den klebrigen MGR-Inhalt von der Spitze der Dissektion Nadel entfernen, verschieben Sie die Nadelspitze an der Wand das Probenfläschchen und an die Wand zu schmieren. Schließen Sie das Fläschchen und legen Sie ihn auf Eis, bis der nächste MGR Inhalt isoliert sind.
- Um später mögliche Kontamination der MGR Content Probe von Verbindungen mit Ursprung aus der angrenzenden DG (Kap. 6) überprüfen, erfassen Sie auch DGs von Ameisen, in denen sie sind noch intakt (Abbildung 4) und setzen Sie sie in einem separaten HPLC-Fläschchen.
- Reinigen Sie die Petrischale und Dissektion Instrumente mit MeOH/H2O (1 + 1 V/V), beim Wechsel von Drüse, Drüse oder von Ameise zu Ameise.
- Kombinieren Sie für eine analytische Probe das Reservoir Inhalt oder Drüsen mehrere Ameisen.
Hinweis: Die Anzahl der Drüsen oder deren Inhalt für eine analytische Probe verwendet variieren je nach Experiment Design. Hier wurden entweder MGR Inhalt oder Generaldirektionen der fünf Ameisen zusammengefasst, um eine analytische Probe zu erhalten.
(3) Lösungsmittel-Extraktion von isolierten Drüse Inhalt
- Bestimmen Sie die Massen der analytischen Proben (hier, MGR Inhalte oder angrenzenden Drüsen gebündelt aus fünf Ameisen).
- Fügen Sie eiskalte hochreinen Ethylacetat (EtOAc) in ein konstantes Verhältnis von 01:14 w/V und Wirbel die Proben 5 min unter gekühlten Bedingungen; hier, durchgeführt bei 7 ° C in einem thermostatisierten Labor.
- Zentrifugieren Sie Proben für 10 min bei 3.820 x g bei 7 ° C und die Überstände zu übertragen (ca. 55 – 75 µL für MGR Content Extrakt aus fünf Ameisen) in vorgekühlte 1,5 mL Fläschchen kurzen Faden mit 0,1 mL Mikro-Einsätze. Dicht verschließen der Flaschen mit Schraubverschlüssen mit Löchern und roten Gummi-/PTFE Septen.
Hinweis: Wenn Analyse sofort durchgeführt werden kann, halten des Extrakts bei-80 ° C bis Analyse, aber es wird empfohlen, unmittelbar nach der Herstellung zur Minimierung des Risikos von chemischen Veränderungen während des Zyklus Einfrieren/Auftauen Proben.
4. GC-MS
- Bereiten Sie eine komplette GC-MS-Messreihe die folgenden Lösungen, jeweils in einem kurzen Faden Fläschchen 1,5 mL:
- Bereiten Sie eine RI Kalibrator Mischung durch Verdünnung der handelsüblichen Alkan-standard-Lösungen, eine Endkonzentration von 8 mg/L pro Verbindung mit Hexan.
- Bereiten Sie ein Lösungsmittel-Rohling bestehend aus reinen EtOAc.
- Ort der Ampullen mit 1) Lösungsmittel-leer, 2) RI Kalibrator Mischung, 3) MGR Inhalt zu extrahieren, und (4) DG Inhalte extrahieren in das abgekühlte Fach (10 ° C) von den Autosampler mit Gaschromatographen (GC) gekoppelt.
Hinweis: Es wird empfohlen, die Zeitspanne zu minimieren, die jedes Fläschchen in den Autosampler vor Messung gehalten wird. Für kritische Proben, wie die MGR Content Probe kann das Fläschchen in den Autosampler sofort vor der Analyse platziert werden. - Für jede Probe eine Aliquote 1 µL injizieren in die GC-MS für die chromatographische Trennung für eine Spalte für die Ziel-Verbindungen geeignet (hier: HP - 5ms UI-Spalte).
- Legen Sie die entsprechenden GC-Parameter, die wie folgt aussehen können:
- Verwenden Sie Helium als Trägergas und legen Sie eine Konstante Spalte Durchfluss von 1 mL/min Set ein Backofen temperaturrampe ab 40 ° C einen Halt für 2 min, gefolgt von einer Rampe von 10 ° C/min bis zu 330 ° C mit einer Haltezeit von 7 min. die Vorlauftemperatur auf 270 ° eingestellt C.
- Wählen Sie, und wenn nötig, passen Sie die Split-Verhältnisse für die GC-MS-Injektion, die angemessene Spitze Formen führen und Intensitäten für Verbindungen des Interesses (Abbildung 5).
Hinweis: Im dargestellten Beispiel war es notwendig, die DG-Extrakt bei einem Split-Verhältnis von 2:1 und die RI-Kalibrator-Mischung in splitless Modus messen. Der MGR-Inhalt-Extrakt wurde auf einer Split-Verhältnis von 2:1 und ein zweites Mal bei 50: 1 analysiert. - Stellen Sie die aux Temperatur bis 350 ° C.
- Legen Sie die Parameter der Massenspektrometer (MS) wie folgt: MS Quelle Temperatur von 230 ° C, MS Quad Temperatur 150 ° C, Scan-Bereich von niedrigen Masse 30 bis Hochamt 500, Lösungsmittel zu verzögern, 4.1 min (für Lösemittel-Blank und experimentellen Proben) oder 6,1 min (für RI Kalibrator Mischung) , beziehungsweise. Legen Sie die Abtastrate auf ca. 3 Scans/s.
Hinweis: Die MS-Parameter, insbesondere die MS-Scan-, Abtastrate, Zykluszeit beeinträchtigen Peak Picking und Spektrum Dekonvolution und berücksichtigen bei der Auswahl der Parameter-Einstellungen für angemessene Datenauswertung mit der MetaboliteDetector Software.
- Legen Sie die entsprechenden GC-Parameter, die wie folgt aussehen können:
- Wenn die Messung abgeschlossen ist, exportieren Sie die Daten als. AIA Projektdatei (hier mit der Verwendung der Daten-Analyse-Software im Lieferumfang der GC durchgeführt) auf ein tragbares Speichermedium.
- Wählen Sie -Datei | Exportieren Sie Daten nach AIA Format..., dann überprüfen Sie erstellen neue Verzeichnis und klicken Sie auf "OK". Wählen Sie den gewünschten Speicherort (z.B. USB-Flash-Laufwerk), und klicken Sie auf Öffnen. Wählen Sie die Dateien exportiert werden und das ---> Symbol drücken. Bestätigen Sie mit einem Klick Prozess.
(5) Metabolit Detektion und Identifizierung mit dem Einsatz von MetaboliteDetector Software
- Vor Beginn der Analyse der Datendateien, öffnen Sie MetaboliteDetector, wählen Sie -Tools | Einstellungen, und legen Sie die erforderlichen Parameter wie folgt (einzelne Blätter des MetaboliteDetector sind in Fettdruck angegeben):
- In das Blatt aussehendie Zeitskala auf Min und aktivieren Sie die Option Achsenbeschriftungen.
- In dem Blatt Dekonvolution, legen Sie die Parameter für die Peak-Einstellungen: Peak-Schwelle: 10 und Minimum Peakhöhe (Lärm Einheiten): 10. Deaktivieren Sie die Option Basislinie Anpassung ermöglichen. Legen Sie die Parameter für Metabolit Detection: Lagerplätze/Scan: 10, Dekonvolution Breite (Scans): 5, erforderliche Intensität (% der Basis Peak): 0 und erforderliche Anzahl von Gipfeln: 10.
- In dem Blatt Identifikation, legen die Library Search Option auf: Compound Lib: "CalibrationLibrary_Alkanes" und auf NIST (NIST Sqlite Bibliothek in das .lbr-Format aufgenommen werden kann). Legen Sie die Parameter wie folgt: Max. RI-Unterschied: 10, Cutoff Score: 0,9, Pure/Impure Zusammensetzung: 0,5, Anzahl der Fragmente: 2, minimale Anzahl von identischen Frag.: 1. Nutzung skaliert Lib: angekreuzt; Ähnlichkeitsergebnis: Spec Ähnlichkeit; Massenfilter: m/Z 207, 221, 281, 355 und 1147 (für bekannte Verunreinigungen aus der stationären Phase der GC-Säule).
- In dem Blatt Quantifizierung legen die Parameter zu: Anzahl der Quantifizierung Ionen: 3, Mindestabstand zwischen nachfolgenden Ionen: 5 und minimale erforderliche Qualitätsindex: 1. ausschließen die Quantifizierung Ionen 207, 221, 281, 355 und 1147.
Hinweis: Bei hoher Auflösung MS Daten, setzen zusätzlich folgende Parameter in das Blatt Zentroid zu: Peak Schwelle beginnen: 10, Peak Schwelle Ende:-5 und maximalen Basislinie Entfernung: 30, FWHM: 0,5.
- Importieren Sie die Dateien in das. CDF-Format in der generierten enthalten. AIA-Projektdatei als. NetCDF in die MetaboliteDetector-Software, indem Sie die Datei auswählen | Import | NetCDF Import. Wählen Sie die Ordner-Symbol, und wählen Sie dann die Dateien für die Beispiel-Kategorien nicht importiert und verarbeitet werden: (1) Lösungsmittel-leer, 2) RI Kalibrierstandards, MGR (3) Inhalte extrahieren, und (4) DG Inhalte extrahieren. Bestätigen Sie mit "OK" um die Datenverarbeitung zu starten. Wählen Sie nach der Verarbeitung im erscheinenden Fenster Schließen .
- Wählen Sie für RI Kalibrierung und Bestimmung der RI Werte für Verbindungen in dem MGR-Extrakt enthaltene Datei | Offene und wählen Sie die Datei mit den Daten des RI-Kalibrierstandards.
- Nachdem die RI-Kalibrator-Datei geöffnet wird, wählen Sie das Lupen -Symbol. Im erscheinende Fenster mit "OK"bestätigen.
- Überprüfen Sie für eine korrekte Kalibrierung der RI die Reichweite von nachweisbaren Alkanen in der RI-Kalibrator-Datei.
- Wählen Sie zu diesem Zweck das Dreieck erscheint unter das Maximum des ersten Peaks, aus der ersten Alkan (mit der niedrigsten RT, Abbildung 6) nachweisbar mit einem Klick drauf.
- Überprüfen Sie die Treffer mit der höchsten Bandbreite Ähnlichkeit ('spec Sim., max Punktzahl = 1) im Vergleich zum Alkan Bibliothekseinträge (Abbildung 6).
- Um die Identität des die vorgeschlagenen Alkans zusammengesetzte vergleichen Sie seine Massenspektrum, gegeben in der Literatur, z. B. NIST Chemie WebBook22Massenspektrum.
- Bestimmen Sie die letzten Alkans nachweisbar in der RI-Kalibrator-Mischung durch zählen bis zum letzten Alkan-Spitze, die in das Chromatogramm.
- Wählen Sie für RI Kalibrierung, Tools | RI-Kalibrierungsassistent. Wählen Sie nächste.
- Klicken Sie auf das Ordner-Symbol und wählen Sie die Datei mit das Chromatogramm der RI Kalibrator Mischung. Wählen Sie nächste.
- Wählen Sie die Bibliothek mit den Einträgen für die Alkan-Kalibrierstandards im erscheinenden Fenster.
- Wählen Sie die Bibliothekseinträge von allen Alkanen nachweisbar in der RI-Kalibrator-Datei und klicken Sie auf die >> Symbol. Nach der Auswahl >>, wählen Sie nächste.
- Überprüfen Sie die RTs für jede nachweisbare Alkan in der erscheinenden Tabelle aufgeführt. Überprüfen Sie zu diesem Zweck die RTs dargestellt im Hauptfenster für jedes Alkans durch Anklicken des jeweiligen Dreiecks (Abbildung 7). Wenn notwendig (Abbildung 8), die RT in der kalibriertabelle manuell per Doppelklick in das jeweilige Feld, geben Sie die Drop-Down-Menü auswählen, und die Wahl die richtige RT. Alternativ vorgeschlagen RT mit Hilfe der Tastatur ( ( Abbildung 9).
- Wenn der RT für jedes Alkans korrekt ist, wählen Sie nächste. Klicken Sie auf nächste in das erscheinende Fenster zeigt die RI kalibriertabelle.
- Wählen Sie das Symbol grün + im Chromatogramm erscheinenden Auswahlfenster, wählen Sie die Datendatei des Lösungsmittel-Rohlings und die Dateien der Drüse Extrakte und nächsten. Legen Sie die Parameter-Einstellungen in dem erscheinenden Fenster wie folgt: Deaktivieren der Grundlinie Anpassung Peak-Schwelle: 5, minimaler Peakhöhe: 5, Lagerplätze/Scan: 10 und Deconvolution Breite: 5. nächste und dann beginnen die RI-Berechnung der auszuführenden die Verbindungen in den ausgewählten Beispieldateien enthalten.
- Für Beschriftung und Identifizierung der gewählten Metaboliten in der MGR-Extrakt, öffnen Sie die Datendatei der gemessenen MGR Content-Extrakt, wofür sind die RIs berechnet worden, wie beschrieben (Schritt 5.3.9), indem Sie die Datei auswählen | Offene und wählen Sie die gewünschte Datei.
- Wählen Sie -Tools | Einstellungen | Dekonvolution und ändern Sie die Peak-Schwelle sowie die Minimum Peakhöhe (Lärm Einheiten) beide in 5. Wählen Sie das Lupen -Icon und bestätigen Sie die erscheinende Warnungsfenster wieder mit "OK".
- Klicken Sie auf ein Dreieck erscheinen unter den bis zu einem Spitzenwert von Interesse und vergleichen Sie seine Massenspektrum zu, mit denen, die durch Auswahl des NIST -Symbols in der NIST-Bibliothek gespeichert.
- Wählen Sie den ersten resultierenden Treffer der NIST-Suche (Abbildung 10).
- Wenn die resultierende Spektrum Ähnlichkeit der Verbindung von Interesse über das gewählte Spektrum Ähnlichkeitsergebnis liegt (hier ≥ 0,9) im Vergleich zu einem NIST-Eintrag (Abbildung 10), suchen sich die RI (ähnlich wie stationären Phase der GC-Säule, Schichtdicke und Spalte Durchmesser) für diese Verbindung in der Literatur (z. B. NIST Chemie WebBook22) gegeben.
- Berechnen Sie die relative Differenz zwischen der NIST Hinweis RI (oder die gemittelten RIs wenn mehrere RI Werte gegeben sind) und die experimentell abgeleitete RI. Wenn die Differenz gleich ist oder kleiner als die benutzerspezifischen tolerierten Maximalwert (hier: ≤ ±1 %), Festlegen der Verbindung als kommentiert"".
- Wiederholen Sie die Schritte 5.4.2–5.4.5 für alle Verbindungen des Interesses in der MGR-Beispieldatei enthalten.
- Für zusammengesetzte Identifikation, vergleichen Sie die RI und Massenspektren von standard-Lösungen (z. B. 2 – 100 mg/L) gemessen unter den gleichen Bedingungen wie denen der kommentierten Verbindungen in Abschnitt 4 beschrieben.
- Analysieren Sie den Standard zu, wie in Kapitel 4 erläutert und verarbeiten Sie die daraus resultierenden Daten zu, wie für die Alkan und MGR Content Drüse Daten in 4,4 und 5,2 Schritten beschrieben.
- Kalibrieren Sie die Daten aus dem Standard Werkzeuge auswählen | RI-Kalibrierungsassistent | Nächste und Wahl der RI Kalibrator Datei vor. Wählen Sie nächste, dann wieder weiter und wählen Sie die Datei mit den Daten erworben von der standard-Lösung durch Anklicken des Symbols grün + . Schlagen Sie nächste und dann beginnen die RI für die standard Verbindung berechnen.
Hinweis: Wenn die Analyse des Standards umgehend nach Analyse von Proben durchgeführt werden kann, empfiehlt es um RI Kalibrierstandards erneut analysieren und neue RI Kalibrierung und Berechnung für den Standard durchzuführen. - Öffnen Sie die jeweilige Datei für die Standard und bestätigen Sie seine Identität durch einen Vergleich des Spektrums mit der NIST-Bibliothek zu, wie in Schritt 5.4.2 erläutert.
- Nach der Bestätigung der Identität des Standards Massenspektrum und RI der Norm zusammengesetzte hinzufügen der hauseigenen Bibliothek. Klicken Sie zu diesem Zweck auf das grüne + -Symbol und geben Sie den bevorzugten Namen des Eintrags Bibliothek. Bestätigen Sie mit "OK" , um das Massenspektrum hinzufügen und der RI den Standard Verbindung zur Bibliothek. Wenn der neue Eintrag in der Bibliothek nicht sehen kann, aktivieren Sie die Schaltfläche " Aktualisieren ".
Hinweis: Wenn die RI-Kalibrierung erfolgreich durchgeführt wurde, die RI bestimmt durch MetaboliteDetector in der jeweiligen Bibliothek-Eintrag erscheint. Nach dem Erstellen des Bibliothek-Eintrags für den Standard, die Identifizierung dieser Metaboliten in der MG Extrakt basiert auf einer Kombination von RI und Spektren Ähnlichkeit ist möglich. - Öffnen Sie die MGR Inhaltsdaten Datei erneut. Wählen Sie -Tools | Einstellungen | Identifikation. Jetzt, da die RI der standard Verbindung berechnet und, um die Bibliothek Eintrag hinzugefügt, Ähnlichkeitsergebnis Spektrum Ähnlichkeit zu wechseln Kombiniert Score
- Klicken Sie auf das Lupensymbol und wählen Sie das Dreieck unterhalb der Verbindung, die kommentiert wurde in Schritt 5.4.5.
- Klicken Sie auf den Treffer und überprüfen Sie den Wert für die "Gesamtnote Ähnlichkeit" gegeben (OSS, Metabolit Detektor als "Insgesamt Simil." abgekürzt), wenn man eine Kombination von Spektrum Ähnlichkeit und RI Ähnlichkeit Punkten (Abbildung 11).
Hinweis: Wenn ein Hit in der hauseigenen Bibliothek gefunden wurde, wird es auf der rechten Seite des Hauptfensters angezeigt. - Wenn das OSS über den benutzerdefinierten Grenzwert (hier ≥ 0,9, auch durch die grüne Farbe des Dreiecks bezeichnet) ist, legen Sie die Verbindung als "identifizierte" (Abbildung 11).
6. Überprüfung der MGR Inhalt Extrakt für Verunreinigungen durch DG Inhalt
- Öffnen Sie die kalibrierte Datei der DG-Probe für die RIs der Verbindungen bereits berechnet wurden, mit MetaboliteDetector (Schritt 5.3.9).
- Wählen Sie für eine Überlagerung der das Chromatogramm nach Messung der MG Inhalt Probe und die DG-Probe erhalten, -Tools | Chromatogramm Overlay und wählen Sie die beiden jeweiligen Dateien über das grüne + -Icon. Bestätigen Sie mit "OK".
- Die Überlagerung anzuzeigen, wählen Sie das erscheinende Chromatogramm Overlay -Blatt auf den unteren Rand des Fensters.
- Prüfung auf Überschneidung von Verbindungen zwischen dem MGR-Inhalt zu extrahieren (Abbildung 12) und die DG-Inhalte extrahieren und weitere MGR Inhaltsanalyse überlappenden Verbindungen ausschließen.
Representative Results
Ein schematische Workflow auflisten die experimentellen Schritte zum vermeintlichen Metabolit Identifikation in der Drüse Absonderungen von C. Explodens ist in Abbildung 13dargestellt. Darüber hinaus ist eine schematische Übersicht über die wichtigsten Körperteile von COCY ArbeiterInnen für die vorgestellten Experiment verwendet als ergänzende Abbildung S1 A, Bvorgesehen. Die wichtigsten Schritte vom Dissektion der Ameisen bis zum vermeintlichen Metabolit Identifikation im MGR Inhalt sind in den Ergänzenden Abbildung S2illustriert.
Um MGR Inhalt geeignet für die Volatilome Analyse zu isolieren, hielt ein gekühlten Zustand während Transport, Lagerung, und auch während der Präparation. Zu diesem Zweck wurden die Ameisen sofort nach ihrer Sammlung mit dem Einsatz von einem Insekt Absauganlage (Abschnitt 1 und Abb. 1) in Situeingefroren. Nach der Lagerung für 2 Tage in einem Gefrierschrank-20 ° C wurden die Ameise Proben auf Trockeneis nach Österreich, transportiert wo sie sofort bei-80 ° C bis zur weiteren Analyse gestellt wurden. Ameisen geeignet zur Isolierung der inhaltlich MGR gewählt werden ausstellen eine Gaster-Region, die rund ist und intakt (Abbildung 2A) und im besten Fall gut sortierten mit MGR Inhalt, wie durch die MGR sichtbar zwischen den Tergites (Abb. 2 b). Dabei der Ameisen sind nicht geeignet für die weitere Analyse sind in Abbildung 2, Ddargestellt. Die wichtigsten Schritte (Schritte 2,3-2,6) beteiligt die Isolierung der MGR Inhalte von COCY Ameisen sind in Abbildung 3dargestellt. Die isolierten MGR-Inhalte (gelb bei C. Explodens, aber Farben reichen von weiß bis rot in anderen Arten aus der Gruppe COCY) sind in Abbildung 14gezeigt.
Wenn die Ameisen inhaltlich MGR sezieren, sollte darauf geachtet werden, nicht durchstechen oder Bruch anderen Drüsen oder den Darm (Schritt 2.5). Abbildung 4 zeigt ein seziert Ameise Gaster, die noch die zwei anderen, intakten Drüsen (DG und VG) enthält nach Isolierung der MGR Inhalte. Ein Beispiel von sichtbaren Verunreinigungen durch Inhalt des Darms Ameise ist in Abbildung 15dargestellt. Seit der Kreuzkontamination mit DG Inhalt, unterhalb der MGR vollständig vermieden werden kann, ist ein Teil des Protokolls dargestellt, um diese Drüsen zum Vergleich der resultierenden Signale mit den Signalen aus dem MGR-Inhalt-Extrakt (Kap. 6) zu analysieren. Wenn die Dissektion Verfahren richtig getan wird, es ist möglich, etwa 0,75 bis 1,2 mg MGR-Inhalt pro Ameise. Für die hier beschriebenen Protokoll wurden MGR Inhalt der fünf Ameisen zusammengefasst, um sich wiederholende Muster von 3,9-5,9 mg erhalten.
Die isolierten Drüse Reservoir Inhalte wurden mit EtOAc (Abschnitt 3) extrahiert und analysiert durch GC-MS (Abschnitt 4). Der MG Inhalt Extrakt von C. Explodens Arbeiterameisen Messergebnisse in einem Chromatogramm bestehend aus Spitzen und Massenspektren für Dutzende von vermeintlichen MGR Content Verbindungen (Abbildung 5). Die beiden dominierenden Metaboliten 1-(2,4,6-trihydroxyphenyl)-Ethanone (ID-4) und 5,7-dihydroxy-2-methylchromen-4-one (ID 5) im MG Inhalt Extrakt verursacht Spalte Überlastung, weshalb die gleiche Probe analysiert wurde split wieder auf ein höheres Verhältnis von 50: 1 ( Abbildung 5, eingerückt). Möglich Cross-Kontamination der MGR Inhalte durch Bestandteile der GD wäre zum Beispiel sichtbar als zusätzliche Peaks in der GC-MS-Chromatogramm ausstellenden späten RTs, ab ca. Minute 29 (Abbildung 12). Ohne chromatographische Peaks und Massenspektren von Verbindungen fanden auch in der Lösungsmittel-Blank, stammen aus der stationären Phase des GC-Säulen oder Inhalt der GD in der Ameise Gaster vorhanden, und die anschließende Bearbeitung mit der MetaboliteDetector Software ergab ca. 110 MGR Content Verbindungen mit einem Signal-Rausch Verhältnis ≥ 10. Für spätere Metabolit Annotation und Identifikation mit der MetaboliteDetector-Software die Chromatogramme wurden kalibriert und die RI-Werte wurden ermittelt, für die gemessenen Beispieldateien (Schritt 5.3 und Teilschritte, Abbildung 6, Abbildung 7 , Abbildung 8 , ( Abbildung 9). Die erkannten vermeintlichen MGR Content Metaboliten wurden kommentiert, basierend auf einer Kombination von Spektrum Ähnlichkeit mit der NIST-Bibliothek, die integralen Bestandteil der MetaboliteDetector-Software im dargestellten Beispiel (Schritt 5.4 und Teilschritte, Abbildung 10 gebildet ). Darüber hinaus RI Werte gefunden in der Literatur für die gleiche oder vergleichbare stationäre Phase, Schichtdicke und Durchmesser von GC-Säulen für zusammengesetzte Annotation (Schritte 5.4.4 und 5.4.5) galten. Nach der Einstellung strenge Übereinstimmungskriterien und Bestätigung von RIs und Massenspektren durch den Einsatz von Standards, konnte wie beschrieben im Abschnitt "Protokoll" für eine Norm zusammengesetzte (Schritte 5.4.7-5.4.15 und Abbildung 11), Bestätigung der Identität des etwa 10 % der detektierten Metaboliten. Da ein ausführlichen Bericht über die Volatilome der MGR Inhalte von C. Explodens an anderer Stelle veröffentlicht werden, konzentrierte sich die vorliegende Studie auf diese Metaboliten, die bereits in einer früheren Publikation von Jones Et Al. beschrieben 17 (Arten hierin bezeichnet als KB02-108; siehe auch Koch Et Al. 23). Tabelle 1 gibt einen Überblick über diese identifizierten Verbindungen.
Abbildung 1: Schematische Zeichnung von einem Insekt Absauger. In einen Deckel, der eine Flasche oder Behälter versiegelt, sind zwei Löcher gemacht, wo zwei flexible Schläuchen durchgestellt werden. Die Öffnung einer Röhre (T1), die das Innere des Fläschchens Gesichter ist mit einem Netz fein genug, um die Insekten zu blockieren verschlossen. Darüber hinaus werden Löcher in das Rohr hergestellt, Luftaustausch zu erleichtern. Rohrende T2 ist eng auf die Insekten hingewiesen, das in das Sampling-Fläschchen gesaugt werden durch Absaugen durch T1. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: intakte versus gebrochene Gaster. (A) intakt Gaster geeignet für Dissektion. (B) intakt Gaster fast vollständig mit MGR Inhalt, auch geeignet für Dissektion gefüllt. (C) und (D) gebrochen Ameise dabei inhaltlich ausgeworfene und gehärteten MGR (gelb), möglicherweise während der Probenahme während Bruch der Gaster Integument gebrochen. Diese Ameisen sind aus Dissektion, Extraktion und weiteren Analyse ausgeschlossen. T: Tergit. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: wichtige Schritte der Dissektion. (A) Trennung der Gaster Region vom Rest des Körpers Ameise. (B) abziehen das Exoskelett: Tergit 1 Tergit 2 (C) und Tergit 3, wonach der Inhalt der gekoppelten gelb gefärbten MGRs fast vollständig sichtbar (D ist). (E) die klebrige MGR Inhalte mit Hilfe von einer Dissektion Nadel entfernen. T: Tergit. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Ant Gaster nach Isolierung Inhaltsverzeichnis MGR. Die zwei anderen Drüsen präsentieren in der Gaster (VG: Venom Drüse und DG: Dufours Drüse) zu sehen. Nach Entfernung des MGR Contents (Reste nach Isolierung in gelb gesehen werden kann) sollten beide Fächer noch intakt sein. Diese Drüsen können genauso wie die MGR Inhalte analysiert werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Repräsentative total Ion aktuelle (TIC) Chromatogramm der MGR Content Extrakt. Die zwei am häufigsten vorkommenden GC-MS-Gipfel führte zu mehr symmetrisch geformt chromatographische Peaks, wenn ein höheres Split-Verhältnis (50: 1) statt der regulären 2:1-Verhältnis gewählt wurde (siehe Kasten). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: Ermittlung der ersten nachweisbaren Alkan in RI Kalibrator Chromatogramm. Das Dreieck unter den Peak Maximum des ersten Alkan Peaks wird ausgewählt. Die Alkan 6,31 min elutes und zeigt die höchste Spektrum Ähnlichkeit (hier:'spec Sim.) mit der Bibliothek-Eintrag "Alkane_C09". Um die Alkan-Identität zu bestätigen, das Massenspektrum im Vergleich zu einer Bibliothek (z. B. NIST Chemie WebBook22). Im dargestellten Beispiel wird Nonan durch seine molekulare Ionen mit einem m/Z-Wert von 128 identifiziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7: RI Kalibrierung mit dem Einsatz von einem n-Alkan-Standardmischung. Die RI-Kalibrator, die Datendatei geöffnet wurde und die 'RI-Kalibrierung-Assistent'-Funktion gewählt. Die richtige Abstimmung der Verweilzeit der RI in der kalibriertabelle dargestellt sollte überprüft werden. RT von 6,31 min für alkane_C09 (Nonan) wird in der Tabelle korrekt angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 8: falsche RTs werden angezeigt in der kalibriertabelle. Die RTs nicht korrekt angezeigt (entweder gezeigt durch einen falschen RT-Wert oder eine fehlende RT Wert als-1 angezeigt). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 9: manuelle Korrektur der falschen RTs in kalibriertabelle. Falsche Werte können manuell durch das Einfügen der richtigen RT für die jeweiligen Alkans korrigiert werden, wie hier für Alkane_C39 gezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 10: Vergleich der Massenspektrum der gewählten Verbindung zu NIST-Bibliothekseinträge. Nach der Auswahl der Spitze maximale eluierenden 6,16 min (RI 891) und Aktivierung von "NIST-Suche"-Funktion (roter Kreis), wird eine Spektrum Ähnlichkeit von 0,99 für 2-Heptanone angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 11: Metabolit Identifikation im MGR Content Extrakt. Das Massenspektrum und der RI aus den zusammengesetzten eluierenden an RI 891 in das Chromatogramm der Probe werden mit der hauseigenen Bibliothekseinträge mit RIs und Spektren von gemessenen Standardverbindungen verglichen. Wenn die "Ähnlichkeit Gesamtnote" (OSS, abgekürzt in Metabolit Detektor 'insgesamt Simil. Umsetzung Massenspektrum und RI) zwischen einer Verbindung in der hauseigenen Bibliothek und eine Verbindung in der Probe-Datei ist ≥ 0,9, die Verbindung bezeichnet man als "identifiziert". Hier ist das OSS zwischen der Hausbibliothek Eintrag des 2-Heptanone und der zusammengesetzten eluierenden an RI 891 0,96, welche Ergebnisse bei der Identifizierung von 2-Heptanone in der MGR-Inhalt zu extrahieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 12: Überlagerung von TIC Chromatogramm Abschnitte (min 29 bis 35 min) von der DG-Inhalt zu extrahieren (rot) und den MGR-Inhalt zu extrahieren (blau). Peakflächen entsprechend überlappen (vermeintliche) Verbindungen sind höher in der DG Content-Extrakt als in dem MGR-Inhalt zu extrahieren; Diese Verbindungen möglicherweise stammen aus der DG und gelten daher als (kleine) Verunreinigungen im MGR Inhalt zu extrahieren. Im Falle der C. Explodens MGR-Inhalt-Extrakt die chromatographische Peaks aus einer vermeintlichen DG Kontamination finden Sie bei ca. 29 min, und dieser Teil das Chromatogramm von der weiteren Analyse der MGR Inhalte ausgeschlossen werden kann. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 13: Schematische Workflow von Ameise Proben Metabolit Annotation/Identifizierung Drüse Reservoir Inhalt extrahiert nach GC-MS-Analyse. Die hier vorgestellten Protokoll erklärt alle experimentellen Schritte ab Isolierung der MGR Inhalte über Dissektion der Ameise und GC-MS-Analyse und Auswertung der Daten (angegeben in schwarz). Als Alternative kann auch die Insekten Sekretion erzeugt und gesammelt in Situ (grau dargestellt) sein. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 14: wachsartige MGR Inhalt vor der Extraktion isoliert. (A) die Inhalte der beiden MGRs zusammenkleben, (B) sie können jedoch auch getrennt nach Isolierung. In C. Explodensdie Farbe des Inhalts MGR ist Orange-gelblich, aber können reichen von weiß bis rot in anderen Arten des Arbeitskreises COCY. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 15: Beispiel für eine isolierte MGR Sekret Kreuz verunreinigt durch Bestandteile der Darm des Insekts (braun). Diese Arten von MGR Isolate sind von Extraktion und weiteren Analyse ausgeschlossen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| ID | Metabolit | Trivial-Namen | InCHI Zeichenfolge | Summenformel | ||||||
| 1 | Heptan-2-1 | InChI=1S/C7H14O/c1-3-4-5-6-7 (2) 8/ h3 - 6H 2, 1-2H 3 | C7H14O | |||||||
| 2 | n-Undecane | InChI=1S/C11H24/c1-3-5-7-9-11-10-8-6-4-2/h3-11H2,1-2H3 | C11H24 | |||||||
| 3 | n-Heptadecane | InChI=1S/C17H36/c1-3-5-7-9-11-13-15-17-16-14-12-10-8-6-4-2/h3-17H2,1-2H3 | C17H36 | |||||||
| 4 | 1-(2,4,6-Trihydroxyphenyl)-ethanone | Monoacetylphloroglucinol | InChI = 1 s/C8H8O4/c1-4 (9) 8-6 (11) 2-5 (10) 3-8 12/h2-3,10-12 H, 1 H 3 | C8H8O4 | ||||||
| 5 | 5,7-Dihydroxy-2-methylchromen-4-One | Noreugenin | InChI = 1 s/C10H8O4/c1-5-2-7 (12) 10-8 (13) 3-6 (11) 4-9 (10) 14-5/h2-4,11, 13H, 1H 3 | C10H8O4 | ||||||
Tabelle 1: Metaboliten identifiziert in der EtOAc Auszug Inhaltsverzeichnis isoliert von C. Explodens kleinere Arbeiterameisen MGR. Ausgewählte Metaboliten werden vorgestellt.
Ergänzende Abbildung S1. Überblick über die wichtigsten Körperteile, die Zugehörigkeit zu COCY Ameisen (minorarbeiterinnen) präsentiert in dieser Handschrift. (A) die MGRs sind in gelber Schrift angezeigt. Ihre gastral Teil wird für die Volatilome Analyse verwendet. (B) der gastral Teil der MGRs befindet sich unter Tergites 1 bis 3. T: Tergit. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
Ergänzende Abbildung S2. Schematische Übersicht über die vorgestellten Experiment. Die wichtigsten Schritte vom Dissektion der Ameise bis zum vermeintlichen Identifikation von Metaboliten in der MGR Inhalt vorhanden sind dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
Discussion
In diesem Manuskript präsentieren wir Ihnen ein komplettes Protokoll für die Analyse der Volatilome des Inhalts in der hypertrophierten MGRs C. Explodens kleinere Arbeiterameisen gefunden. Da die Ameisen verwendet, hier können "explodieren" und inhaltlich MGR unkontrolliert Auswerfen bei Berührung mit der Pinzette, empfiehlt es sich, eine "weiche" Sammlung Technik durch ein Insekt Absauganlage (Abbildung 1) zu verwenden. Für einige Ameisenarten, darunter COCY Ameisen ist es möglicherweise erforderlich, die maximale Anzahl der Ameisen zu fünf Personen pro 50 mL Fläschchen zu begrenzen, da ansonsten Selbstvergiftung der Ameisen (z. B. durch Anhäufung von Ameisensäure in den Gasraum) auftreten kann. Für das Einfrieren der Ameisen im Feld, kann eine coole Tasche gefüllt mit tiefgefrorene Kühlakkus verwendet werden. Die Proben schnell eingefroren und unter gekühlten Bedingungen (z. B. -20 ° C, am besten bei-80 ° C) gelagert werden sollten, aber es wird nicht empfohlen, um zu töten und die Ameisen in flüssigem Stickstoff zu speichern, da erhöhten Schaden ihre Drüsen mit dieser Methode beobachtet wurde.
Die vorgestellten Puffer und lösungsmittelfreie Dissektion Methodik eignet sich für den Erhalt der Wachs-wie Unterkiefer Drüse Reservoir Inhalt sowie anderen Drüsen im gefrorenen Arbeiterameisen. Für die Volatilome Analyse des Inhalts der C. ExplodensMGR sind wichtige Aspekte bei der Dissektion berücksichtigt werden kontinuierliche Kühlung von d Ameise (Schritt 2.1.4) und Minimierung der Kreuz-Kontaminationen der MG Proben mit anderen Drüse Inhalt/Flüssigkeiten im die Ameise Gaster (Schritt 2.5, Abbildung 4und Abbildung 15). Ein beträchtlicher Bruchteil der gefrorenen Ameisen beschädigt werden, da die Ameisen "", während der Probenahme explodiert oder während des Transports auf Trockeneis von der Probenahme-Website ins Labor beschädigt wurden. Wenn die Region Gaster gebrochen ist, eignen sich diese Ameisen nicht für die weitere Analyse (Abbildung 2, D). Wenn nur Antennen und Beine fehlen oder kaputt sind, können diese Ameisen noch für die Extraktion der MGR Inhalte und weitere Analysen verwendet werden. Da die MGR Inhalt abgekühlt haben C. Explodens Ameisen eine wachsähnliche Konsistenz ist geradlinig, mit dem Einsatz der Dissektion Nadeln (Schritt 2.5, Abbildung 3Eund Abbildung 14) zu isolieren. Zusätzliche Pflege muss werden beim Umgang mit der klebrigen MGR Inhalte. Es kann zu nichts kommen in körperlichen Kontakt mit ihm halten und haften auch oft an die Dissektion Zange, die erhöht das Risiko einer Kontamination von anderen Proben. Es ist notwendig, berühren nur die MGR-Inhalte mit der Dissektion Nadel und übertragen Sie es sofort in die Glasfläschchen für die Extraktion (Schritt 2.5 und 2.6) verwendet. Darüber hinaus empfiehlt es sich, die Dissektion mit einer MeOH/H2O Mischung reinigen beim Umschalten zwischen den Ameisen oder Drüse-Typen (Schritt 2,8).
Drüse-Inhalte von anderen Ameisenarten können in einem flüssigen Zustand auch bei Kühlung mit kältepackungen vorhanden sein. In diesem Fall werden die ganze Drüse einschließlich der Membran kann zunächst isoliert und anschließend punktiert, um den Inhalt zu erhalten. Flüssige Absonderungen können auch mit Hilfe von feinen Kapillare Pipetten erhalten werden. Mit einer durchschnittlichen Körperlänge von etwa 4-5 mm (ohne Antennen) gehören Arbeiter von C. Explodens , die kleineren Arten des Arbeitskreises COCY. Ihre oft geschwollen Gaster umfasst ca. 2-2,5 mm in der Länge und Breite von 1-1,5 mm. Arbeiter der bisher größten bekannten Arten der Gruppe COCY erreichen eine Größe von ca. 8 mm Körperlänge mit einer Gaster Größe von ca. 3 mm in der Länge und Breite von 2,5 mm. Da das Protokoll gut geeignet ist, um zu sezieren und untersuchen einzelne Ameisen und dabei die Größe der verschiedenen COCY Arten, die hier verwendeten Dissektion Instrumente und Mikroskop möglicherweise angepasst werden, um für kleinere Ameisen oder kleinere Organe gelten. Darüber hinaus kann die Anzahl der Ameisen pro Analyseprobe müssen erhöht werden.
Beim sezieren der Ameise für den MGR Inhalt, ist es wichtig, nicht zu beschädigen, anderen Drüsen oder den Darm - deren, die, die, die Inhalt Kreuz-die Probe (Schritt 2.5, Abbildung 4 und Abbildung 15) verunreinigen können. Im optimalen Fall sind nach dem Extrahieren des Inhalts MGR, DG, sowie das VG sichtlich intakt (Abbildung 4) gehalten. Kontaminationen mit dem Inhalt der DG, die unter die MGRs befindet, sind nur schwer vollständig zu vermeiden. Gründe dafür können auch die partielle Unterbrechung der Drüse Integrität während des Transports auf Trockeneis von der Probenahme-Website ins Labor. Es ist auch möglich, dass der DGs bei der Probenahme oder bei der Explosion, beschädigt, wie wir für die MGR in einer Reihe von untersuchten Ameisen bemerkt haben. Da der DG-Inhalt die gleiche Weise analysiert werden können wie die MGR (Abschnitte 3 und 4) Inhalt, können die Ergebnisse, die daraus resultierenden Daten nach Analyse der MGR zufriedene Beispiele (Kap. 6) verglichen werden. Im Falle von MGR Inhalt Extrakte von C. Explodens Ameisen erhalten beginnen auch in der DG enthaltenen Verbindungen zu spät in das Chromatogramm (Abbildung 12) eluieren. Um zu verhindern, DG zu verkennen Verbindungen für MGR Bestandteile, die jeweiligen Metaboliten von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden können. Aus Studien zu anderen Ameisenarten ist bekannt, dass DGs auch (hoch) flüchtige Verbindungen1,24, enthalten können, die in der Regel früh in der GC-Chromatogramm eluieren.
In früheren Studien, die der Umgang mit der chemischen Zusammensetzung die MGR-Inhalte von COCY Ameisen, ganze Ameisen oder ihre ganze dabei waren analysierten16,17,18,23, während hier die MGR-Inhalt selbst stammen über Dissektion der Ameisen.
Analyse seziert MGR Inhalte ermöglicht Ermittler zahlreiche biochemische Untersuchungen, einschließlich Ermittlung der Metaboliten, die darin enthaltenen durchführen. Da hier die durchgeführte Studie zur Identifizierung von die flüchtigen Bestandteile in die MGR C. Explodensenthaltenen konzentriert, wurde GC-MS für die Analyse (Abschnitt 4) gewählt. Hierzu sollten die Extrakte idealerweise gemessen unmittelbar nach der Herstellung oder bis zur Analyse bei-80 ° C gelagert werden. Es sei darauf hingewiesen, dass (erweiterter) Lagerung chemische Veränderungen der Extrakte verursachen (siehe Hinweise nach Schritten 3.3 und 4.2). Da die Konzentration der MGR Inhalte verschiedener Größenordnungen abdecken kann, es möglicherweise notwendig, die MGR-Extrakte bei verschiedenen GC aufgeteilt Verhältnisse zu analysieren. Da die beiden wichtigsten Verbindungen in den MGR Inhalt der Ameisen ergriffen extrahieren, um veranschaulichen das Protokoll verursacht Spalte Überlastung bei einem Split-Verhältnis von 2:1 verwendet wurde, wurde in diesem Beispiel ein zweites Mal auf ein höheres Split-Verhältnis von 50: 1 (Schritt 4.3.1.2and Abbildung 5) analysiert. Die GC-MS-Parameter-Einstellungen im Abschnitt 4 präsentiert eignen sich für Daten generiert mit GC-MS-Geräte, die in der Tabelle der Materialienangegeben. Neben der RI Kalibrierstandards (Schritt 4.1.1) sollte ein Lösungsmittel-Rohling (Schritt 4.1.2) auch analysiert werden, um nicht-biologische Artefakte und Verunreinigungen während der nachfolgenden Datenanalyse zu erkennen. Für die Identifizierung der Metabolit ist es auch wichtig, authentische Standards der kommentierten Verbindungen unter den gleichen Bedingungen der GC-MS wie verwendet für die Analyse der Probe-Extrakte (5.4.7and folgende Schritte) zu messen. Um die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der endgültigen Daten zu verbessern, empfiehlt es sich, alle Beispiel-Kategorien (Lösungsmittel-Blank, RI Kalibrierstandards, Probe-Extrakte und Standards) innerhalb der gleichen Messablauf zu analysieren. Darüber hinaus sollten die authentische Standards in einer Konzentration vergleichbar, die für die Probe-Extrakte beobachtet analysiert werden. Dadurch verbessern die Genauigkeit der RI Werte und Ähnlichkeit zwischen Probe und standard Massenspektren, die schließlich zu erhöhten und bedeutungsvoller Metabolit Annotation/Identifikation führen wird. Zu diesem Zweck können die Standards immer wieder mit verschiedenen Split Faktoren gemessen werden.
Metabolit Identifikation, die anspruchsvolle Software dient MetaboliteDetector Spektren Entfaltung und RI und Spektren Vergleich zu einer implementierten NIST-Bibliothek sowie über eine etablierte Hausbibliothek (Abschnitt 5). Es wird empfohlen, MetaboliteDetector auf einem 64-Bit LINUX-basierten Betriebssystem (z. B. KUBUNTU) laufen und das erzeugte kopieren *. CDF-Daten-Dateien (Schritt 4.4) aus dem portablen Datenträgers auf der lokalen Festplatte. MetaboliteDetector ist in der Lage, GC-MS-Rohdaten im Schwerpunkt oder Profil NetCDF-Format zu importieren. Die Software der meisten GC-MS-Instrumente sollten die aufgenommenen raw-Daten in diesem Format19umwandeln können. Vor Beginn der Analyse der Daten, ist es dringend empfohlen, die Literatur zur vorherigen MetaboliteDetector-Software-Versionen vertraut mit den Funktionen und der grafischen Schnittstelle19,25, zu lesen 26.
Für RI Kalibrierung und anschließender RI Wertberechnung der zusammengesetzten Gipfel in die Probe Extrakte vorhanden wird eine Bibliothek mit RIs und Spektren von RI Kalibrierstandards (hier: n-Alkanen) verwendet. Solch eine Bibliothek kann entweder selbst hergestellt werden oder eine bereits vorhandene ("CalibrationLibrary_Alkanes") können heruntergeladene27sein. Die zur Verfügung gestellten Kalibrator Standardbibliothek enthält RIs und Spektren für n-Alkane von C09 bis hin zu C39, die analysiert wurden, wie in Abschnitt 4 beschrieben. Die mitgelieferte Bibliothek ermöglicht Benutzern das Arbeiten mit Metabolit Detektor direkt mit der Kalibrierung ihrer Daten beginnen. Bei Bedarf kann diese Bibliothek auch mit zusätzlichen Einträge für weitere Alkane erweitert werden. Aufgrund der Ähnlichkeit der Referenz und experimentell abgeleitete RIs und Massenspektren (siehe Schritt 5.3 und Teilschritte, Abbildung 7, Bild 8, Bild 9), Beschriftung oder Kennzeichnung der Verbindungen kann sein durchgeführt (Schritt 5.4 und Teilschritte, ( Abbildung 11). Es ist auch wichtig, dass nach der automatisierten Datenverarbeitung mit MetaboliteDetector, der Benutzer manuell für richtige Peak Picking und Spektrum Dekonvolution prüft der Inspektion Massenspektren zugrunde liegt das "Dreieck" für jeden vermeintlichen Verbindung von Interesse. Darüber hinaus können abhängig von der GC-MS-Instrumentierung und die Parameter-Einstellungen, die für die Datengenerierung, Anpassungen der vorgestellten MetaboliteDetector Einstellungen erforderlich sein. Die MetaboliteDetector-Software ist in der Lage, viele weitere nützliche Operationen als in diesem Manuskript, z. B. Anzeige der extrahierten Ion aktuelle (EIC) Chromatogramme, Export der Chromatogramme als CSV, automatische Batch-Quantifizierung der erklärt Verbindungen und vieles mehr.
Das Protokoll präsentiert in dieser Handschrift kann als Anregung für Experimente, die von anderen Forschern mit Schwerpunkt auf Isolation von Drüsen oder Drüse Inhalt von Insekten sowie Volatilome Analyse und Metabolit Identifikation dienen.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Finanzierung für diese Studie wurde durch die Wiener Wissenschafts-, Forschungs- und Technologiefonds (WWTF) LS13-048 zu ISD erhalten. Besonderer Dank geht an Diane W. Davidson (University of Utah, jetzt im Ruhestand) teilen ihr Wissen über die Bornean COCY Ameisen mit uns. Wir freuen uns über Verwaltungen der Kuala Apoi Field Studies Center (KBFSC) und Universiti Brunei Darussalam (UBD) für die Genehmigung des Projekts sowie Brunei Forstamt und Brunei Forschungs- und Innovationszentrum für die Erlaubnis, Ameisen sammeln und Zulassung und Erteilung von Ausfuhrgenehmigungen. Besonderer Dank geht an UBD und KBFSC Personal, vor allem Salleh bin Abdullah Muhammad Bat, Teddy Chua Wee Li, Masnah Mirasan, Rafhiah Kahar, Roshanizah Rösli, Rodzay Wahab, Chan Chin Mei und Kushan Tennakoon für unsere Forschung zu erleichtern.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tube 50 ml, 115 x 28 mm, flat/conical base PP | Sarstedt | 62,559,001 | see Figure 1 in manuscript |
| PVC Tubings | Rehau | 290 4489 | see Figure 1 in manuscript |
| Mesh, stainless steel, 0.63 mm mesh size | Antstore | 1000378 | see Figure 1 in manuscript |
| Freezer | Severin | KS 9890 | -20 °C or lower |
| polystyrene foam box, inner dimensions 155 mm x 100 mm x 45 mm | Thorsten Koch | 4260308590481 | |
| Petri dish, glass, 100 mm x 15 mm | Aldrich | BR455742 | |
| Cold pack 150 mm x 100 mm | Elite Bags | 1998 | freeze to -20 °C |
| Bucket with crushed ice | |||
| 1.5 mL Short Thread Vials, 32 x 11.6 mm, clear glass, 1st hydrolytic class, wide opening | La-Pha-Pack | 11090500 | |
| Screw caps for 1.5 mL Short Thread Vials, closed, Silicon white/PTFE red septum, 55° shore A, 1.0 mm | La-Pha-Pack | 9151799 | |
| Stereomicroscope | Bresser | 5806100 | |
| Forceps, Superfine Tip curved | Medizinische Instrumente May, Norman May | PI-0005B | |
| Forceps, Superfine Tip straight | blueINOX | BL-3408 | |
| Dissection needle 140 mm, pointed, straight | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1110301 | |
| Methanol, LC-MS CHROMASOLV, Honeywell Riedel-de Haën | fisher scientific | 15654740 | |
| Distilled water | |||
| Rotizell-Tissue-Tücher | Carl Roth GmbH + Co.KG | 0087.2 | |
| Acetic acid ethyl ester ROTISOLV ≥99,8 % | Carl Roth GmbH + Co.KG | 4442.1 | freeze to -20 °C |
| Vortex Genie 2 | neoLab | 7-0092 | |
| 0.1 mL micro-inserts for 1.5 mL Short Thread Vials, 31 x 6 mm, clear glass, 1st hydrolytic class, 15 mm tip | La-Pha-Pack | 06090357 | |
| Screw caps for 1.5 mL Short Thread Vials, with hole, RedRubber/PTFE septum, 45° shore A, 1.0 mm | La-Pha-Pack | 9151819 | |
| Alkane standard solution C8-C20 | Sigma-Aldrich | 04070 | |
| Alkane standard solution C21-C40 | Sigma-Aldrich | 04071 | |
| n-Hexane SupraSolv | Merck | 104371 | |
| GC-autosampler, e.g. MPS2XL-Twister | Gerstel | ||
| Agilent Gas chromatograph 6890 N | Agilent | ||
| Gooseneck splitless Liner | Restek | 22406 | |
| Helium (5.0 - F50) | Messer | 102532501 | |
| GC capillary column HP-5MS UI 30 m × 0.25 mm ×0.25 µm | Agilent | 19091S-433UI | |
| Agilent Mass Selective Detector 5975B | Agilent | ||
| MSD ChemStation Data Analysis Application software | Agilent | ||
| MetaboliteDetector software (3.1.Lisa20170127Ra-Linux) | Hiller K | download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 | |
| Calibration Library for MetaboliteDetector | Hiller K | download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 | |
| MD Conversion Tool for NIST-library | Hiller K | download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 |
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