Summary
Mindre arbeidere av maur arten Colobopsis explodens er dissekert for å isolere voks som innholdet lagres i deres forstørret mandibular kjertel reservoarer for påfølgende løsemiddel utvinning og analyse av gass kromatografi-massespektrometri. Merknader og identifikasjon av flyktige bestanddeler ved hjelp av åpen kildekode programvare MetaboliteDetector er også beskrevet.
Abstract
Målet med dette manuskriptet er å presentere en protokoll som beskriver metabolomic analyse av Bornean 'eksploderende maur' tilhører gruppen Colobopsis cylindrica (COCY). For dette formålet er modell arten C. explodens brukt. Maur tilhører mindre arbeidstaker kastesystemet har karakteristiske forstørret mandibular kjertler (MGs). I territoriale kamper bruker de tyktflytende innholdet deres forstørret mandibular kjertel reservoarer (MGRs) for å drepe rivaliserende leddyr i karakteristiske suicidale 'eksplosjoner' av frivillig ruptur av gastral integumentum (autothysis). Vi viser Disseksjon av arbeideren maur av denne arten for isolering av den gastral delen av voks-lignende MGR innholdet samt liste de nødvendige trinnene som kreves for løsemiddel-utvinning av disse inneholdt flyktige forbindelser med påfølgende gass kromatografi-massespektrometri (GC-MS) analyse og antatte identifikasjon av metabolitter i utdrag. Disseksjon prosedyren utføres under avkjølt forhold og uten bruk av noen disseksjon buffer løsning å minimere endringene i den kjemiske sammensetningen av MGR innholdet. Etter løsemiddelbaserte utvinning av flyktige metabolitter deri, presenteres de nødvendige skritt for å analysere prøvene via væske-injeksjon-GC-MULTIPLE Sclerosis. Til slutt, databehandling og antatte metabolitten identifikasjon med bruk av det åpen-kilde programvaren MetaboliteDetector vises. Med denne tilnærmingen, profilering og identifikasjon av flyktige metabolitter i MGRs av maur tilhører COCY gruppe via GC-MS og MetaboliteDetector programvaren blitt mulig.
Introduction
Det overordnede målet med arbeidsflyten presenteres her er generelt etterforskningen av kjemiske komposisjoner i sekret av insekter. Dette gjøres med av Klargjørende rolle utskillelsen som helhet, eller enkelt forbindelser derav. Videre er vi interessert i undersøker metabolske veier underliggende forbindelser finnes i respektive sekret. Spesielt kjertel innholdet fra maur (Hymenoptera, Formicidae) har fått økende interesse i de siste årene, fordi de gir kilder hittil uutforskede potensielt bioaktive forbindelser (lim, poesi aksent, etc.)1, 2. mindre arbeideren maur arter som tilhører COCY gruppe3,4 kan gi slike forbindelser i deres hypertrophied MGRs som strekker seg fra munndelene til og5,6. Når truet av antatte fiender, mindre arbeidere av C. explodens7 og tilhørende arter kan gjøre bruk av deres MGR innholdet på en uvanlig måte: de ofre seg av rupturing veggen deres gastral ut klissete innholdet i den MGRs eksplosivt på motstanderen, dø hvorpå antatte fienden er anholdt og kan selv5,6,8,9. Formålet med utvikling og bruk av metodene, presentert var å forbedre forståelsen av den kjemiske sammensetningen og natur foreløpig giftig bestanddeler av denne maur sekret.
Dette presenterer vi en protokoll for Disseksjon av C. explodens arbeideren maur å få den gastral delen av voks-lignende MGR innholdet med påfølgende løsemiddel utvinning og analyse av GC-MS.
GC-MS analyse er en av de veletablerte metodene for profilering og identifikasjon av flyktige metabolitter (volatilome) fra insekter. Typisk analytter interesse for maur inkluderer cuticular hydrokarboner10, semiochemicals11, og generelt forbindelser med biologiske aktivitet12. Prøver kan oppnås fra hele dyr eller kroppsdeler og væsker isolert via Disseksjon av insekt13,14. Eksempel forberedelser teknikker inkluderer utvinning av disse inneholdt metabolitter med bruk av løsemidler14 eller headspace-solid-fase-microextraction (HS-SPME)15.
For metabolomic studier er det viktig at prøvene er frosset raskt rett etter prøvetaking, for å minimere endringer i kjemisk sammensetning og antallet av forbindelser. Maurene brukes for denne studien ble drept av frysing på stedet i en kul pose fylt med deep-frozen kaldt, pakker. Prøvene ble deretter lagret i en 20 ° C fryser med generator-drevet elektrisitet, før de ble fraktet til laboratoriet på tørris. Disseksjon prosedyren presenteres her tilbyr muligheten til å isolere MGR innholdet uten å analysere hele maur eller og som helhet, som det har blitt gjort før forskjellige COCY arter16,17,18. Videre kan presentert protokollen også direkte tilgang og analyse av de omkringliggende kjertler og vev, som gift kjertel (VG)5,8, den Dufour kjertel (DG)8eller tarmen i andre biologiske studier eller Sjekk for mulig kryss-forurensing introdusert under håndtering eller Disseksjon av maur. For å minimere endringene i den kjemiske sammensetningen av MGR innholdet i disseksjon, enten ved tiner prøver eller kjemikalier, var disseksjon prosessen optimalisert for å utføres på en kald pakke (20 ° C), uten bruk av noen flere buffere, vaske løsninger eller løsemidler. Prøver innhentet via denne metoden passer for kvalitativ og kvantitativ spørsmål.
Dataanalyse for antatte metabolitten merknader og identifikasjon er gjort via det åpen-kilde programvaren MetaboliteDetector19, som ble utviklet for automatisk analyse av GC-baserte metabolomics data. Den oppdager enkelt ion toppene i chromatograms, utfører et deconvolution skritt, og trekker ut de deconvoluted masse spektra av kjemiske forbindelser i de analyserte prøvene. Antatte identifikasjon av forbindelser med MetaboliteDetector basert på bestemt oppbevaring indeksen (RI, Kovats RI kan beregnes automatisk av programvaren) og likheten mellom de deconvoluted masse spectra. RI og spectral kamp faktor kan kryss-sjekkes mot en eksisterende referansebiblioteker (som kan importeres, hvis de er i vanlig NIST format), eller et etablert bibliotek. Dette er i henhold til retningslinjene for (antatte) sammensatte identifikasjon foreslo, f.eksav den kjemiske analyser arbeider gruppe (CAWG) av Metabolomics standarder Initiative (MSI), der minst to uavhengige og ortogonale data i forhold til en autentisk sammensatte (her oppbevaring tid (RT) /RI og masse spektrum) analysert identiske eksperimentelle forhold foreslås som nødvendig å bekrefte ikke-romanen metabolitten identifikasjoner20.
Komplett eksperimentet utføres på MGR innholdet av COCY modellen arter C. explodens, men disseksjon trinnene kan også tilpasses til å isolere andre kjertler i maur og. Videre mens presenterer vi en protokoll for av volatilome av MGR innholdet, de mer generelle delene av arbeidsflyten som beskriver utvinning, kan GC-MS måling og data evaluering også brukes for analyse og (antatte) Identifikasjon av flyktige metabolitter generelt.
Siden eksperimenter beskrevet i dette manuskriptet utføres på insekter, kreves ingen etiske godkjenning. Feltarbeid, utvalg av maur, samt deres bruk for publikasjon er i henhold til veiledning regulere dette prosjektet gjennom Universiti Brunei Darussalam, Bruneis forskning og innovasjon sentrum og Bruneis skogbruk Department, Brunei Darussalam.
Protocol
1. innsamling av maur
- Samle mindre arbeideren maur med bruk av en aspirator (figur 1).
- Umiddelbart etter prøvetaking, fikse maurene ved frysing ved 20 ° C og lagre dem på dette eller lavere temperatur til analyse.
2. isolering av MGR innholdet og DG fra maur
- Før Disseksjon av maur, klargjør du følgende:
- Rengjør glasset Petriskål og disseksjon instrumenter med en metanol-vann blanding (MeOH/T2O, 1 + 1 v/v) og vev.
FORSIKTIG: MeOH er giftige for mennesker. Alltid ha riktige hansker, en labfrakk og briller, og utføre rengjøring under avtrekksvifte. - Fryse kaldt pakken og glass Petriskål til 20 ° C.
- Bestemme massene av 1,5 mL kort tråden ampuller inkludert skrulokk med silikon/polytetrafluoroethylene (PTFE) septa og holde dem på is rett ved siden av mikroskopet.
Merk: Valg av prøven ampullen er valgfritt. Her legges MGR innholdet direkte inn avkjølt 1,5 mL flasker laget av glass. Plast kan inneholde stoffer (f.eks ftalater) som kan forårsake gjenstander, som forstyrrer signaler om målet metabolitter. - Plass frosne kalde pakken i en boks av ekstruderte polystyren skum. Plasser Petri rett på toppen av kalde pakken og sette en frossen maur i retten. Montere boksen under stereo mikroskop. Justere forstørrelsen (20-40 X) og fokus til hele maur kan ses tydelig.
- Rengjør glasset Petriskål og disseksjon instrumenter med en metanol-vann blanding (MeOH/T2O, 1 + 1 v/v) og vev.
- Sjekk frosne maur for integriteten av sin gastral rom. For disseksjon, ta bare maur med en intakt og region (figur 2A, B). Ekskludere maur med flat gasters eller spor av herdet MGR-innhold på sine karosseriet fra videre analyse (figur 2C, D).
- Ta valgte maur med ett par tynn tang på propodeum (første abdominal segmentet) og andre par tang på petiole (andre abdominal segmentet). Koble regionen og forsiktig hentes fra resten av maur kroppen (figur 3A).
- Fikse nå atskilt maur og ved å holde med tynn tang på tergite 4. Med et par tynn tang Grip tergite 1 (ved siden av petiole) og fjern det av peeling det av (figur 3B). Gjenta dette også for skulpturert 2 og 3 (Figur 3 c, D) til den gastral delen av MGRs (gul farget i C. explodens arbeideren maur, men fargen på MG innholdet kan variere fra hvit over gul til rødt i andre arter) vises for de del.
Merk: Fjerner ytre skjelett, membran av MGR delvis fjernes også. - Ved bruk av en disseksjon nål, forsiktig fjerne voks som innholdet i de sammenkoblede MGRs ved å skrape dem ut av gastral batterirommet (figur 3E). Bare fjerne disse delene MGR innhold som kan isoleres uten rupturing andre kjertler i maur og. Hvis flere makt eller innsats må brukes for å få MGR innholdet som helhet, godta ufullstendig fjerning (Figur 4).
- Plukke opp MGR innholdet av forsiktig berørende seg med spissen av disseksjon nålen før de stikker på den. Deretter overføre MGR innholdet i avkjølt 1,5 kort tråden ampuller med kjent Tara masse.
- For å fjerne klebrige MGR innholdet fra spissen av disseksjon nålen, flytte pinne-spissen på veggen av prøven ampullen og smøre dem på veggen. Lukk ampullen og plassere den på is til neste MGR innholdet er isolert.
- Å senere sjekk for mulige krysskontaminering av MGR innhold utvalget av forbindelser stammer fra de tilstøtende DG (del 6), også samle DGs fra maur, de er intakt (Figur 4) og sette dem inn i separate HPLC ampuller.
- Rengjør alltid Petriskål og disseksjon instrumenter med MeOH/T2O (1 + 1 v/v), når du endrer fra kjertel til kjertel eller fra maur til ant.
- En analytisk prøve, kombinere reservoaret innholdet eller kjertler av flere maur.
Merk: Antall kjertler eller innholdet brukes for en analytisk prøven kan variere etter eksperiment design. Her var MGR innholdet eller DGs av fem maur samlet for å få en analytisk prøven.
3. løsemiddel-utvinning av isolerte kjertel innholdet
- Bestemme massene av analytiske prøvene (her, MGR innholdet eller tilstøtende kjertler samlet fra fem maur).
- Legge til iskald høy renhetsgrad ethyl acetate (EtOAc) i en konstant andel av 1:14 w/v og vortex prøvene i 5 min under avkjølt forhold; her, utført ved 7 ° C i et thermostated laboratorium.
- Sentrifuge prøvene i 10 min 3,820 x g ved 7 ° C og overføre supernatants (ca 55-75 µL for MGR innhold pakke hentes fra fem maur) inn i pre-avkjølt 1,5 mL kort tråden ampuller med 0,1 mL mikro-setter. Tett forsegle hetteglass med skrulokk inneholder hull og røde gummi/PTFE septa.
Merk: Hvis analyse ikke kan utføres umiddelbart, holde ekstrakt ved-80 ° C før analysen, men det anbefales å analysere prøver umiddelbart etter forberedelser for å minimere risikoen for kjemiske endringer under frysepunktet/tining syklus.
4. GC-MS
- For en fullstendig GC-MS måling rekkefølge, forberede følgende løsninger hver i 1,5 mL kort tråden ampuller:
- Forbered en RI calibrant blanding fortynne kommersielt tilgjengelig Alkan standard løsninger til en siste konsentrasjon av 8 mg/L per sammensatte bruker Heksan.
- Forberede en løsemiddel-tom bestående av ren EtOAc.
- Sted hetteglass som inneholder 1) løsemiddel-tom, 2) RI calibrant blanding, 3) MGR innhold ekstrakt og 4) DG innhold ekstrakt i avkjølt skuffen (10 ° C) av autosampler koblet til gasskromatograf (GC).
Merk: Det anbefales å minimere tidsrommet hvert hetteglass er holdt i autosampler før måling. For kritiske prøver, som MGR innhold prøven, kan ampullen plasseres i autosampler umiddelbart før analyse. - For hver prøve, injisere en 1 µL aliquot i GC-MS for brukt kromatografiske separasjon på en kolonne som er egnet for målet forbindelser (her: HP - 5MS UI kolonne).
- Angi de riktige GC parameterne, som kan se ut som følger:
- Bruke helium som bærer gass og angi en konstant kolonnen flyt av 1 mL/min. Sett en ovn temperatur rampen fra 40 ° C med tak i 2 minutter, etterfulgt av en rampe på 10 ° C/min opptil 330 ° C, med hold tid på 7 min. sett temperaturen til 270 ° C.
- Velg, og eventuelt justere delt forholdstallene for GC-MS injeksjon som tilstrekkelig peak figurer og intensiteter for forbindelser av interesse (figur 5).
Merk: I eksemplet presentert det var nødvendig å måle DG ekstrakt delt forholdet 2:1 og RI calibrant blandingen i splitless modus. MGR innhold ekstrakt ble analysert på delt forholdet 2:1 og en gang på 50:1. - Angi ekstra temperaturen til 350 ° C.
- Sette parametre for masse-spectrometer (MS) som følger: MS kilde temperatur 230 ° C, MS Quad temperatur 150 ° C, skanneområde lav masse 30 til høy masse 500, løsemiddel forsinkelsen 4.1 min (for løsemiddel tom og eksperimentelle prøver) eller 6.1 min (for RI calibrant blanding) , henholdsvis. Angi avsøkingshastigheten til ca 3 skanner/s.
Merk: MS parametrene, spesielt i MS skanne-, samplingsfrekvens, syklus kan påvirke peak plukking og spekteret deconvolution og må vurderes når du velger parameterinnstillingene for riktig data analyse med MetaboliteDetector programvaren.
- Angi de riktige GC parameterne, som kan se ut som følger:
- Når målet er ferdig, eksportere dataene. AIA prosjektfil (utføres her med bruk av data analyseprogramvare leveres med GC) på en bærbar datalagringsenhet.
- Velg fil | Eksportere data til AIA format..., sjekk Opprett ny mappe og klikk OK. Velg ønsket lagringsplasseringen (f.eks, USB flash-stasjon), og klikk Åpne. Velg filer som blir eksportert og treffer ---> ikonet. Bekreft med å klikke prosessen.
5. metabolitten gjenkjenning og identifikasjon med bruk av MetaboliteDetector programvare
- Før du starter analyse av datafilene, åpne MetaboliteDetector, velg verktøy | Innstillinger for, og angir de nødvendige parameterne som følger (enkeltark av MetaboliteDetector er angitt i fet skrift):
- I arket utseende, angi tidsskalaen til Min og aktivere akseetiketter.
- Angi parameterne for Peak innstillingene i arket Deconvolution,: Peak terskelen: 10 og Minimum topp høyde (støy enheter): 10. Fjern merket for aktivering av planlagt justering. Angi parametere for metabolitten gjenkjenning for å: hyller/skanne: 10 Deconvolution bredde (skanner): 5, nødvendige intensitet (% av base peak): 0, og antall topper: 10.
- I arket identifikasjon, angi biblioteket søk alternativet: sammensatte Lib: 'CalibrationLibrary_Alkanes' og NIST (et NIST sqlite bibliotek kan være inkludert i .lbr-format). Angi parameterne som følger: Max. RI forskjellen: 10, Cutoff score: 0,9, Pure/Impure sammensetning: 0,5, antall fragmenter: 2, Minimum antall identiske frag.: 1. Bruk skalert lib: haket; Likheten poengsum: Spec. likheten; Masse filter: m/z 207, 221, 281, 355 og 1147 (for kjente forurensninger som oppstår fra stasjonære fasen av GC-kolonnen).
- Arket kvantifisering satt parametrene til: antall kvantifisering ioner: 3, Minimal avstanden mellom etterfølgende ioner: 5 og Minimal nødvendig kvalitet indeks: 1. ekskludere kvantifisering ioner 207, 221, 281, 355 og 1147.
Merk: Ved høy oppløsning MS data i tillegg angi følgende parametere i arket Centroid til: Peak terskelen begynner: 10 topp terskelen slutten: 5, og maksimal planlagte avstand: 30, FWHM: 0,5.
- Importere filene i den. CDF-format i den genererte. AIA prosjektfilen. NetCDF i MetaboliteDetector programvaren ved å velge fil | Importer | NetCDF import. Velg ikonet mappe-formet, og velg deretter filene for eksempel kategoriene som importeres og behandlet: 1) løsemiddel tom, 2) RI calibrants, 3) MGR innhold ekstrakt og 4) DG innhold ekstrakt. Bekreft med OK for å starte databehandling. Etter bearbeiding, velger du Lukk i vinduet vises.
- RI kalibrering og besluttsomhet RI verdiene for forbindelser i MGR utdrag, velger fil | Åpne og velg filen som inneholder data i RI calibrants.
- Når RI calibrant filen åpnes, velger du forstørrelsesglassikonet . Bekreft vises vinduet med OK.
- For riktig RI kalibrering, kontrollere området med synlig alkanes i RI calibrant filen.
- Dette Velg trekanten vises under maksimal første toppen, som stammer fra den første Alkan (med lavest RT, figur 6) synlig ved å klikke én gang på den.
- Sjekk hit med høyeste spektrum likheten ('Spec. sim.', maks poeng = 1) sammenlignet med Alkan biblioteket oppføringene (figur 6).
- For å bekrefte identiteten til den foreslåtte Alkan sammensatt, kan du sammenligne sin masse spektrum til mass spekteret i litteratur, eksempelvis NIST kjemi WebBook22.
- Bestemme den siste Alkan i RI calibrant blandingen ved å telle til siste Alkan peak vises i chromatogram.
- Velg verktøy for RI kalibrering | RI-kalibrering for. Velg neste.
- Klikk på ikonet mappe-formet og velg filen som inneholder chromatogram av RI calibrant blandingen. Velg neste.
- Velg biblioteket som inneholder oppføringer for Alkan calibrants i vinduet dukket.
- Velge biblioteket alle alkanes synlig i RI calibrant filen og klikk på >> ikonet. Når du har valgt >>, velger du neste.
- Sjekk RTs oppført for hver synlig Alkan i tabellen vises. Dette sjekk RTs avbildet i hovedvinduet for hver Alkan ved å klikke på respektive trekanten (figur 7). Hvis nødvendig (Figur 8), løser RT i tabellen kalibrering manuelt ved å dobbeltklikke i feltet respektive, inn velge det miste-ned menyen og velge riktig foreslått RT. eventuelt RT ved hjelp av tastaturet ( Figur 9).
- Når RT for hver Alkan er riktig, velger du neste. Klikk neste i vinduet vises viser tabellen RI kalibrering.
- Velg grønn + symbolet i vises Chromatogram vinduet, Velg datafilen av løsemiddel-blank og av kjertel ekstrakter, og velg neste. Angitt parameterinnstillingene i vinduet vises slik: deaktivering av planlagte justering, Peak terskelen: 5, Minimal topp høyde: 5, hyller/skanne: 10 og Deconvolution bredde: 5. Trykk neste og deretter starte beregningen RI av forbindelsene i valgte eksempelfilene.
- Merknader og identifikasjon av de valgte metabolitter i MGR utdrag, åpne datafilen av målt MGR innhold ekstraktet, er beregnet på RIs som som beskrevet ovenfor (trinn 5.3.9), ved å velge fil | Åpne og velge ønsket datafilen.
- Velg verktøy | Innstillinger | Deconvolution og endre Peak terskelen samt Minimum peak høyden (støy enheter) både til 5. Velg forstørrelsesglassikonet og Bekreft vises advarselsvinduet igjen med OK.
- Klikk på en trekant vises under maksimum for en topp rundt og sammenligne sin masse spektrum med de lagret i NIST-biblioteket ved å velge ikonet NIST .
- Velg første resulterende rammet av NIST-søk (Figur 10).
- Hvis den resulterende spektrum likheten av sammensatt interesse er over valgte spektrum likheten score (her ≥ 0,9) sammenlignet med en NIST-oppføring (Figur 10), slå opp i RI (for lignende stasjonære fase av den GC, filmen tykkelse og diameter) gitt for denne forbindelsen i litteraturen (f.eks NIST kjemi WebBook22).
- Beregne den relative forskjellen mellom NIST referansen RI (eller de gjennomsnittlige RIs når flere RI verdier er gitt) og eksperimentelt avledede RI. Hvis forskjellen er lik eller mindre enn brukerdefinert tolerert maksimumsverdien (her, ≤ ±1%), angi sammensatt som merket"".
- Gjenta trinn 5.4.2–5.4.5 for alle forbindelser rundt i eksempelfilen MGR.
- For sammensatte identifikasjon, sammenligne RI og masse spektra av standard løsninger (f.eks 2-100 mg/L) målt under samme vilkår som beskrevet i del 4 de av kommenterte forbindelser.
- Analysere standard som forklart i Seksjon 4 og behandle resultatdataene som Alkan- og MGR innhold kjertel data i trinn 4.4 og 5.2.
- Kalibrere data ervervet fra standarden ved å velge verktøy | RI-kalibrering veiviseren | Neste og velge den samme RI calibrant filen som brukes før. Velg neste, så igjen neste og velg filen som inneholder data ervervet fra standard løsning ved å klikke grønn + symbolet. Traff neste og deretter begynne å beregne RI for standard sammensatte.
Merk: Hvis analysen av standarden ikke kan utføres umiddelbart etter eksempel analyse, anbefales å analysere RI calibrants igjen og utføre ny RI kalibrering og beregning for standard. - Åpne filen respektive standard og bekrefte sin identitet ved sammenligning av spekteret sin NIST-biblioteket som forklart i trinn 5.4.2.
- Etter bekreftelse på identiteten til standarden, legge til masse spektrum og RI av standard sammensatte i bibliotek. Dette Klikk på grønn + symbolet og angi ønsket navnet på oppføringen bibliotek. Bekreft med OK for å legge masse spekteret og RI av standard sammensatte til biblioteket. Hvis den nye oppføringen ikke kan sees i biblioteket, aktivere Oppdater for.
Merk: Hvis RI kalibreringen ble utført, RI bestemmes av MetaboliteDetector vises i den tilsvarende bibliotek-posten. Etter oppretter den bibliotek for standard, identifikasjon av denne metabolitten i MG utdrag basert på en kombinasjon av RI og spectra likheten er mulig. - Åpne filen MGR innhold igjen. Velg verktøy | Innstillinger | ID. Nå som RI av den standard sammensatt er beregnet og lagt til biblioteket posten, endre Likheten Score fra Spekteret likheten til Kombinert poeng.
- Klikk på forstørrelsesglasset ikon og velg trekanten under sammensatt som har blitt merket i trinn 5.4.5.
- Klikk på hit og kontrollere verdien gitt for 'total likhet poengsum' (OSS, forkortet av metabolitten detektor som 'Samlet simil.'), vurderer en kombinasjon av spekteret likhet og RI likheten score (Figur 11).
Merk: Hvis en hit ble funnet i huset biblioteket, vil det vises til høyre i vinduet. - Hvis OSS er over brukerdefinerte terskelen (her ≥ 0,9, også angis av den grønne fargen på trekanten), kan du angi sammensatt som "identifisert" (Figur 11).
6. Sjekk av MGR innhold ekstra for forurensing av DG innhold
- Åpne filen kalibrert på DG utvalget som RIs av forbindelsene har allerede er beregnet med MetaboliteDetector (trinn 5.3.9).
- For en overlapping av chromatogram oppnådd etter måling av MG innhold prøven og DG prøven, velger du verktøy | Chromatogram overlegg og velger de to respektive filene via ikonet grønn + . Bekreft med OK.
- Vise overlegg, velge vises Chromatogram overlegg arket på bunnen av vinduet.
- Sjekk for overlapping av forbindelser mellom MGR innholdet ekstra (Figur 12) og DG innholdet ekstra og ekskludere overlappende forbindelser fra videre MGR innholdsanalyse.
Representative Results
En skjematisk arbeidsflyt viser de eksperimentelle slik antatte metabolitten identifikasjon i kjertel sekret av C. explodens er vist i figur 13. Dessuten tilbys en skjematisk oversikt over de viktigste kroppsdeler av COCY arbeideren maur brukes for presentert eksperimentet som supplerende figur S1 A, B. De viktigste trinnene fra Disseksjon av maur til antatte metabolitten identifikasjon i MGR innholdet er illustrert i Supplerende figur S2.
For å isolere MGR innholdet egnet for volatilome analyse, ble nedkjølt tilstand opprettholdt gjennom transport, lagring, og også under disseksjon. Dette var maur frosset umiddelbart etter sin samling med bruk av et insekt aspirator (del 1 og figur 1) i situ. Etter lagring for 2 dager i 20 ° C fryser, ble maur prøvene fraktet på tørris til Østerrike, der de ble umiddelbart satt på-80 ° C til videre analyse. Maur egnet skal velges for isolering av MGR innholdet viser en og region som er rund og intakt (figur 2A) og i beste fall velfylt MGR innhold, som indikert av MGR vises mellom skulpturert (figur 2B). Gasters av maur som ikke egner seg for videre analyse er vist i figur 2C, D. De viktigste trinnene (trinn 2.3-2.6) involvert i isolasjon prosessen MGR innholdet fra COCY maur er illustrert i Figur 3. Isolert MGR innholdet (gul ved C. explodens, men fargene kan variere fra hvit til rød i andre arter som tilhører gruppen COCY) er vist i figur 14.
Når dissekere maurene for MGR innholdet, bør forsiktighet utvises ikke punkteres eller ruptur alle annet kjortelen eller tarmen (trinn 2.5). Figur 4 viser en dissekert maur og som fortsatt inneholder de to andre, intakt kjertlene (DG og VG) etter isolering av MGR innholdet. Et eksempel på synlig kontaminering av innholdet av maur tarmen er vist i Figur 15. Siden kryss-kontaminering med DG innholdet, ligger under MGR, ikke unngås helt, er en del av protokollen avbildet for å analysere disse kjertlene for sammenligning av resulterende signaler med signalene fra MGR innhold ekstrakt (del 6). Når disseksjon prosedyren utføres riktig, er det mulig å få omtrent 0,75-1.2 mg MGR innhold per maur. For protokollen beskrevet her, var MGR innholdet av fem maur samlet for å motta repeterende prøver av 3.9 5,9 mg hver.
Isolert kjertel reservoaret innholdet var utdraget med EtOAc (del 3) og analyseres av GC-MS (del 4). Måling av MG innhold ekstrakt av C. explodens arbeideren maur resulterer i en chromatogram bestående av topper og masse spectra for dusinvis av antatte MGR innhold forbindelser (figur 5). De to dominerende metabolitter 1-(2,4,6-trihydroxyphenyl)-ethanone (ID 4) og 5,7-dihydroxy-2-methylchromen-4-one (ID 5) i MG innhold utdrag forårsaket kolonnen overbelastning, derfor samme prøven ble analysert igjen deler høyere forholdet mellom 50:1 ( Figur 5, innfelt). Mulig kryssforurensning MGR innholdet av bestanddeler av DG for eksempel ville være synlig som ekstra toppene i GC-MS-chromatogram viser slutten RTs, fra minutt 29 (Figur 12). Unntak brukt kromatografiske topper og masse spektra av forbindelser også funnet i løsemiddel er tom, opprinnelige fra den stasjonære fasen av kolonnen GC, eller innholdet i DG i maur og og etterfølgende behandling med MetaboliteDetector programvare resulterte i ca 110 MGR innhold forbindelser med et signal til støy forhold ≥ 10. Senere metabolitten Merknad og identifikasjon med MetaboliteDetector programvare, chromatograms ble kalibrert og RI verdiene var bestemt for målte eksempelfilene (trinn 5.3 og undertrinn, figur 6, figur 7 , Figur 8 , Figur 9). Oppdaget antatte MGR innhold metabolitter ble kommentert basert på en kombinasjon av spekteret likhet NIST-biblioteket, som dannet en integrert del av MetaboliteDetector programvaren i eksemplet presentert (trinn 5.4 og undertrinn, Figur 10 ). Videre RI verdier funnet i litteraturen for den samme eller tilsvarende stasjonære fasen, filmen tykkelse og diameter i kolonnen GC ble ansett for sammensatte merknaden (trinn 5.4.4 og 5.4.5). Etter innstilling strenge samsvarende kriterier og bekreftelse av RIs og masse spektra ved bruk av standarder, som forklart i delen protokollen for én standard sammensatte (trinn 5.4.7-5.4.15 og Figur 11), var det mulig å bekrefte identiteten til ca 10 % av oppdaget metabolitter. Siden en detaljert rapport om volatilome for MGR C. explodens vil bli publisert andre steder, studien fokusert på de metabolitter som har allerede blitt beskrevet i tidligere publikasjoner av Jones et al. 17 (arter, som KB02-108, se også Cook et al. 23). tabell 1 gir en oversikt over disse identifiserte forbindelser.
Figur 1: skjematisk tegning av et insekt aspirator. I et lokk som sel en flaske eller beholder, er to hull laget, der to fleksible rør er satt gjennom. Åpningen av en tube (T1) som står overfor indre av ampullen er forseglet med et nett fint nok å blokkere insekter. I tillegg er hull laget inn i røret å lette utvekslingen av luft. Slutten av rør T2 er pekte tett mot insekter som er suget ampullen prøvetaking av aspirating gjennom T1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: intakt versus brutt og. (A) intakt og egnet for disseksjon. (B) intakt og nesten helt fylt med MGR innhold, også egnet for disseksjon. (C) og (D) brutt ant gasters med utløst og herdet MGR innhold (gul), muligens brutt under ruptur av og integumentum under prøvetaking. Disse maur utelates fra disseksjon, utvinning og videre analyse. T: tergite. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: store trinnene involvert i disseksjon prosessen. (A) separasjon og regionen fra resten av maur kroppen. (B) Peeling av ytre skjelett: tergite 1, tergite 2 (C) og tergite 3, etter som innholdet i de sammenkoblede gul farget MGRs er nesten helt synlige (D). (E) fjerne klebrige MGR innholdet ved hjelp av en disseksjon nål. T: tergite. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: maur og etter isolering av MGR innholdet. De to andre kjertlene presentere i og (VG: gift kjertel og DG: Dufours kjertel) kan sees. Etter fjerning av MGR innholdet (venstre overs etter isolasjon kan sees i gult), bør begge deler fortsatt være intakt. Disse kjertlene kan analyseres på samme måte som MGR innholdet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: representant totale ion gjeldende (TIC) chromatogram av MGR innhold ekstraktet. De to rikeste GC-MS toppene resulterte i mer symmetrisk formet brukt kromatografiske topper, da høyere delt innsats (50:1) ble valgt i stedet for det vanlige forholdet 2:1 (se innfelt). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: bestemmelse av første synlig Alkan i RI calibrant chromatogram. Trekanten under fjellpigg maksimal første Alkan toppen er valgt. Alkan elutes 6.31 minutter og viser høyeste spektrum likheten (her, 'Spec. sim.') til oppføringen bibliotek 'Alkane_C09'. Slik at Alkan identitet, sammenlignet masse spekteret med et bibliotek (f.eks NIST kjemi WebBook22). I eksemplet presentert er nonane identifisert av sin molekylære ion med 128 m/z-verdien. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: RI kalibrering med bruk av en n-Alkan standard blanding. RI-calibrant datafilen er åpnet og funksjonen 'RI-kalibrering-Wizard' valgt. Riktig tilpasse oppbevaringsperioden å RI i tabellen kalibrering bør sjekkes. RT 6.31 min for alkane_C09 (nonane) vises riktig i tabellen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: feil RTs vises i tabellen kalibrering. RTs ikke vises riktig (enten vises ved feil RT verdi eller en manglende RT verdi vises som -1). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9: manuell korrigering av feil RTs kalibrering tabell. Feil verdier kan korrigeres manuelt ved å sette inn riktig RT for de respektive Alkan, som vist her for Alkane_C39. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 10: sammenligning av masse spekter av valgte sammensatte NIST-bibliotek poster. Etter å ha valgt topp maksimal eluting 6.16 min (RI 891) og aktivering av funksjonen "NIST-søk" (røde sirkelen), vises en spektrum likhet i 0,99 for 2-heptanone. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 11: metabolitten identifikasjon i MGR innhold utdrag. Mass spekteret og RI fra den sammensatte eluting på RI 891 i chromatogram av prøven er sammenlignet bibliotek postene som inneholder RIs og spektra av målt standard forbindelser. Hvis 'total likhet Score"(OSS, forkortet i metabolitten detektor som 'Samlet simil.' implementere masse spectrum og RI) mellom et sammensatt i biblioteket og et sammensatt i utvalget arkiv er ≥ 0,9, sammensatte er angitt som"identifisert". Her er OSS mellom oppføringen bibliotek av 2-heptanone og sammensatte eluting på RI 891 0.96, som resulterer i identifikasjon av 2-heptanone i MGR innholdet pakke. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 12: overlegg av TIC chromatogram deler (min 29 til min 35) av DG innholdet ekstrakt (rød) og MGR innholdet pakke (blå). Topp er tilsvarer overlappende (antatte) forbindelser høyere i DG innhold extract enn MGR innholdet ekstrakt; disse forbindelser potensielt kommer fra DG og regnes derfor som (mindre) miljøgifter i MGR innholdet pakke. Ved C. explodens MGR innhold ekstrakt, brukt kromatografiske toppene fra en antatte DG forurensning kan finnes på ca min 29, og denne delen av chromatogram kan bli ekskludert fra videre analyse av MGR innholdet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 13: skjematisk arbeidsflyten fra maur prøver metabolitten merknader/identifikasjon i kjertel reservoaret innhold ut etter GC-MS analyse. Protokollen presenteres her forklarer alle eksperimentelle skritt fra isolering av MGR innholdet via Disseksjon av mauren og GC-MS analyse og data evaluering (angitt i svart). Som et alternativ, kan insekt utskillelsen også være generert og samlet i situ (angitt med grå farge). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 14: isolert voksaktig MGR innholdet før ekstraksjon. (A) innholdet i de to MGRs holde sammen, men (B) de kan også være atskilt etter isolasjon. I C. explodens, fargen på MGR innholdet er oransje-gulaktig, men kan variere fra hvit til rød i andre arter av gruppen COCY. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 15: illustrasjon av en isolert MGR sekresjon kryss-forurenset av bestanddeler av insekt tarmen (brun). Disse typer MGR isolerer utelates fra utvinning og videre analyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| ID | Metabolitt | Trivial navn | InCHI streng | Summer-formel | ||||||
| 1 | Heptan-2-en | InChI=1S/C7H14O/c1-3-4-5-6-7 (2) 8/ h3 - 6H 2, 1-2H 3 | C7H14O | |||||||
| 2 | n-Undecane | InChI=1S/C11H24/c1-3-5-7-9-11-10-8-6-4-2/h3-11H2,1-2H3 | C11H24 | |||||||
| 3 | n-Heptadecane | InChI=1S/C17H36/c1-3-5-7-9-11-13-15-17-16-14-12-10-8-6-4-2/h3-17H2,1-2H3 | C17H36 | |||||||
| 4 | 1-(2,4,6-Trihydroxyphenyl)-ethanone | Monoacetylphloroglucinol | InChI = 1/C8H8O4/c1-4 (9) 8-6 (11) 2-5 (10) 3 - 7 (8) 12/h2-3,10-12H, 1H 3 | C8H8O4 | ||||||
| 5 | 5,7-Dihydroxy-2-methylchromen-4-One | Noreugenin | InChI = 1/C10H8O4/c1-5-2-7 (12) 10-8 (13) 3-6 (11) 4-9 (10) 14-5/h2-4,11:, 13H, 1H 3 | C10H8O4 | ||||||
Tabell 1: metabolitter i EtOAc ekstrakt av MGR innholdet isolert fra C. explodens mindre arbeideren maur. Valgte metabolitter presenteres.
Supplerende figur S1. Oversikt over de viktigste kroppsdeler tilhører COCY maur (mindre arbeidere) presentert i dette manuskriptet. (A) The MGRs bli vist i gult. Deres gastral del brukes til volatilome analyse. (B) den gastral delen av MGRs ligger under skulpturert 1 til 3. T: tergite. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur S2. Skjematisk oversikt over presentert eksperimentet. De viktigste trinnene fra Disseksjon av maur til antatte identifikasjon av metabolitter i MGR innholdet er illustrert. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
I dette manuskriptet presenterer vi en komplett protokoll for å analysere volatilome for innhold finnes på de hypertrophied MGRs av C. explodens mindre arbeideren maur. Siden maurene brukes her kan "eksploderer" og kaste ut MGR innholdet i en ukontrollert måte når rørt med tang, anbefales det å bruke en "myke" teknikk som et insekt aspirator (figur 1). For enkelte maur arter inkludert COCY maur, kan det være nødvendig å begrense antall maur til fem personer per 50 mL medisinglass, siden ellers forgiftning av maur (f.eks av opphopning av maursyre i tanken) kan oppstå. For frysing maur i feltet, brukes en kul pose fylt med deep-frozen kaldt, pakker. Prøvene skal være raskt frosset og lagret under avkjølt forhold (f.eks 20 ° C, beste ved-80 ° C), men det anbefales ikke å drepe og lagre maur i flytende nitrogen, siden økt skade på deres kjertler er observert med denne metoden.
Presentert buffer - og løsemiddel-frie disseksjon metodikken er egnet for å få voks-lignende mandibular kjertel reservoaret innholdet samt andre kjertler i frosne arbeideren maur. Volatilome analyse av MGR innholdet i C. explodenser viktige aspekter vurderes under disseksjon kontinuerlig kjøling av maur (trinn 2.1.4) og minimere kryss-forurensing av MG prøvene med andre kjertel innholdet/væsker i maur og (trinn 2.5, Figur 4og Figur 15). En betydelig del av frosne maurene kan bli skadet, enten fordi maurene 'eksplodert' under prøvetaking eller ble skadet under transport på tørris fra webområdet prøvetaking til laboratoriet. Hvis regionen og er brutt, er disse maur ikke egnet for videre analyse (figur 2C, D). Hvis bare antenner og Ben er manglende eller brutt, kan disse maur fortsatt brukes for utvinning av MGR innholdet og videre analyse. Siden MGR innholdet avkjølt har C. explodens maur en voks konsistens er det rett fram å isolere dem med bruk av disseksjon nåler (trinn 2.5, figur 3Eog figur 14). Ytterligere omsorg må tas under behandling av den klebrige MGR innhold. Det kan holde seg til noe kommer i fysisk kontakt med det og vil ofte følge disseksjon tang, som øker risikoen for forurensing av andre prøver. Det er nødvendig å bare berøre MGR innholdet med disseksjon nålen og umiddelbart overføre den til hetteglass brukes for utvinning (trinn 2.5 og 2.6). Dessuten, det anbefales å rengjøre disseksjon utstyr med en MeOH/T2O blanding i bytte mellom maur eller kjertel-typer (trinn 2.8).
Kjertel innholdet i andre maur arter kan finnes i flytende form selv under nedkjøling med kaldt, pakker. I dette tilfellet være hele kjertel inkludert membranen kan først isolert og punctured etterpå for å få innholdet. Flytende sekret kan også oppnås ved hjelp av fine kapillær pipetter. Med en gjennomsnittlig kropp lengde på ca 4-5 mm (uten antenner) tilhører arbeidere av C. explodens den mindre arten av gruppen COCY. Deres ofte hovne og består av ca 2-2.5 mm i lengde og 1-1,5 mm i bredden. Arbeidere av så-langt største kjente arter av COCY kan nå en størrelse på ca 8 mm i kroppens lengde og størrelse på ca 3 mm i lengde og 2,5 mm i bredden. Siden protokollen er godt egnet for å analysere og undersøke personlige maur og gasters av denne størrelsen av ulike COCY arter, her brukte disseksjon instrumenter og mikroskopet må tilpasses gjelder for mindre maur eller mindre organer. Videre kan antall maur per analytisk prøve måtte økes også.
Mens dissekere maur for MGR innholdet, er det viktig ikke å skade noen andre kjertler eller tarmen - innholdet som kan kryss-smitte prøven (trinn 2.5, Figur 4 og Figur 15). I optimal saken, holdes etter utvinning av MGR innholdet, DG, samt VG synlig intakt (Figur 4). Forurensing med innholdet av DG, som ligger under MGRs, er vanskelig å unngå helt. Grunner til dette kan også omfatte delvis avbrudd integriteten kjertel under transport på tørris fra utvalg-området til laboratoriet. Det er også mulig at DGs bli skadet under prøvetaking eller i ferd med eksplosiv, som vi har lagt merke til MGR i en rekke undersøkte maur. Siden DG innholdet kan analyseres på samme måte som MGR innhold (avsnitt 3 og 4), kan resultatene sammenlignes resultatdataene etter analyse av MGR innhold prøvene (del 6). Ved MGR innhold ekstrakter fra C. explodens maur, begynner forbindelser også finnes i DG å elute sent i chromatogram (Figur 12). Å forhindre feil DG forbindelser for MGR bestanddeler, respektive metabolitter kan bli ekskludert fra videre analyse. Fra studier på andre maur arter er det kjent at DGs kan også inneholde (svært) flyktige forbindelser1,24, som vanligvis elute tidlig i GC-chromatogram.
I tidligere studier håndtere den kjemiske sammensetningen av MGR innholdet COCY maur, hele maur eller deres hele gasters var analysert16,17,18,23, mens her MGR innholdet selv ble innhentet via Disseksjon av maur.
Analysere dissekert MGR innholdet kan etterforskere til å utføre en rekke biokjemiske studier, inkludert identifikasjon av metabolitter deri. Siden utført studien fokusert på identifisering av flyktige bestanddeler i MGR av C. explodens, ble GC-MS valgt for sin analyse (del 4). For dette, bør ekstrakter ideelt målt umiddelbart etter forberedelse eller lagret ved-80 ° C før analysen. Det bør bemerkes at (utvidet) lagring kan føre til kjemiske endringer av ekstrakter (se merknader etter trinn 3.3 og 4.2). Siden konsentrasjonen av MGR innholdet kan dekke et utvalg av flere bestillinger av omfanget, kan det være nødvendig å analysere MGR ekstrakter på ulike GC delt prosenter. Siden de to viktigste forbindelsene i MGR innholdet ekstrakt av maur til eksemplifiserer protokollen forårsaket kolonnen overbelastning når delt forholdet 2:1 ble brukt, var dette eksemplet analysert en gang i høyere delt forholdet 50:1 (trinn 4.3.1.2and figur 5). GC-MS parameterinnstillingene presentert i Seksjon 4 er egnet for data generert med GC-MS-enhetene som er angitt i Tabellen for materiale. Ved RI calibrants (trinn 4.1.1), bør en løsemiddel-tom (trinn 4.1.2) også bli analysert for å gjenkjenne ikke-biologiske gjenstander og forurensninger under påfølgende dataanalyse. For metabolitten identifikasjon er det også viktig å måle autentisk standarder for kommenterte forbindelser GC-MS oppstiller som brukes for å analysere eksempel ekstrakter (trinn 5.4.7and følger). For å forbedre nøyaktigheten og påliteligheten av de endelige dataene, er det anbefalt å analysere alle eksempel kategorier (løsemiddel er tom, RI calibrants, prøve ekstrakter og standarder) i samme måling sekvens. Videre bør de autentiske standardene bli analysert i en konsentrasjon sammenlignes som observerte for eksempel ekstrakter. Dette bidrar til å forbedre nøyaktigheten av RI verdier og likheten mellom prøven og standard masse spectra, som vil til slutt føre til økt og mer meningsfylt metabolitten merknader/identifikasjon. Dette kan standarder gjentatte ganger måles ved hjelp av ulike delt faktorer.
For metabolitten identifikasjon, sofistikert programvare, brukes MetaboliteDetector for spectra deconvolution og RI og spectra sammenligning til en gjennomført NIST-biblioteket også som et etablert bibliotek (del 5). Det anbefales å kjøre MetaboliteDetector på en 64 bit LINUX-basert operativsystem (f.eks KUBUNTU) og kopiere den genererte *. CDF-datafiler (trinnet 4.4) fra bærbar datalagringsenhet på den lokale harddisken. MetaboliteDetector er i stand til å importere GC-MS rådata i centroid eller profil netCDF. Programvaren til de fleste GC-MS instrumenter skal kunne konvertere innspilte rådata til dette formatet19. Før du starter dataanalyse, er det sterkt anbefalt å lese litteraturen tilgjengelig for tidligere MetaboliteDetector programvareversjoner å bli kjent med funksjonene og grafisk bruker grenseflate19,25, 26.
RI kalibrering og påfølgende RI beregningen av sammensatte toppene i prøven ekstrakter brukes et bibliotek med RIs og spektra av RI calibrants (her, n-alkanes). Slik en bibliotek kan enten være selv etablerte, eller en eksisterende ("CalibrationLibrary_Alkanes") kan dataoverførte27. Følger standard calibrant biblioteket inneholder RIs og spectra for n-alkanes varierer fra C09 til C39 som har vært analysert som beskrevet i punkt 4. Det angitte biblioteket kan brukere arbeide med metabolitten detektor direkte starte med kalibreringsprosessen data. Om nødvendig kan dette biblioteket også utvides med flere oppføringer for ytterligere alkanes. Basert på likheten og eksperimentelt avledede RIs og masse spectra (se trinn 5.3 og undertrinn, figur 7, Figur 8, figur 9), merknad eller identifikasjon av forbindelser kan være utført (trinn 5.4 og undertrinn, Figur 11). Det er også avgjørende at etter automatisert databehandling med MetaboliteDetector brukeren vil kontrollere manuelt for riktige topp plukking og spectrum deconvolution ved inspeksjon masse spectra underliggende "trekanten" for hver mulige sammensatte interesse. Videre, avhengig av GC-MS instrumentering og parameterinnstillingene brukes for data generasjon, tilpasninger av presentert MetaboliteDetector innstillinger kan være nødvendig. MetaboliteDetector programvaren er i stand til å utføre mange flere nyttig operasjoner enn forklart i dette manuskriptet, f.eks visning av utdraget ion gjeldende (EIC) chromatograms, eksport av chromatograms som CSV, automatisk satsvis-kvantifisering av forbindelser, og mange flere.
Protokollen presentert i dette manuskriptet kan tjene som forslag til eksperimenter utført av andre forskere fokuserer på isolering av kjertler eller kjertel innholdet fra insekter, volatilome analyse, samt metabolitten identifikasjon.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Finansiering for denne studien ble oppnådd gjennom Wien vitenskap og teknologi Fund (WWTF) LS13-048 til ISD. Spesiell takk går til Diane W. Davidson (University of Utah, nå pensjonert) for å dele sin kunnskap om Bornean COCY maur med oss. Vi setter pris på administrasjoner Kuala Belalong feltet studier Center (KBFSC) og Universiti Brunei Darussalam (UBD) for prosjektet godkjenning samt Bruneis skogbruk Department og Bruneis forskning og innovasjon senter for tillatelse til å samle maur og godkjenning og utstedelse av eksporterer tillatelser. Spesiell takk går til UBD og KBFSC personale, spesielt Muhammad Salleh bin Abdullah Bat, bamse Chua Wee Li, Masnah Mirasan, Rafhiah Kahar, Roshanizah Rosli, Rodzay Wahab, Chan haken Mei og Kushan Tennakoon for å tilrettelegge vår forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tube 50 ml, 115 x 28 mm, flat/conical base PP | Sarstedt | 62,559,001 | see Figure 1 in manuscript |
| PVC Tubings | Rehau | 290 4489 | see Figure 1 in manuscript |
| Mesh, stainless steel, 0.63 mm mesh size | Antstore | 1000378 | see Figure 1 in manuscript |
| Freezer | Severin | KS 9890 | -20 °C or lower |
| polystyrene foam box, inner dimensions 155 mm x 100 mm x 45 mm | Thorsten Koch | 4260308590481 | |
| Petri dish, glass, 100 mm x 15 mm | Aldrich | BR455742 | |
| Cold pack 150 mm x 100 mm | Elite Bags | 1998 | freeze to -20 °C |
| Bucket with crushed ice | |||
| 1.5 mL Short Thread Vials, 32 x 11.6 mm, clear glass, 1st hydrolytic class, wide opening | La-Pha-Pack | 11090500 | |
| Screw caps for 1.5 mL Short Thread Vials, closed, Silicon white/PTFE red septum, 55° shore A, 1.0 mm | La-Pha-Pack | 9151799 | |
| Stereomicroscope | Bresser | 5806100 | |
| Forceps, Superfine Tip curved | Medizinische Instrumente May, Norman May | PI-0005B | |
| Forceps, Superfine Tip straight | blueINOX | BL-3408 | |
| Dissection needle 140 mm, pointed, straight | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1110301 | |
| Methanol, LC-MS CHROMASOLV, Honeywell Riedel-de Haën | fisher scientific | 15654740 | |
| Distilled water | |||
| Rotizell-Tissue-Tücher | Carl Roth GmbH + Co.KG | 0087.2 | |
| Acetic acid ethyl ester ROTISOLV ≥99,8 % | Carl Roth GmbH + Co.KG | 4442.1 | freeze to -20 °C |
| Vortex Genie 2 | neoLab | 7-0092 | |
| 0.1 mL micro-inserts for 1.5 mL Short Thread Vials, 31 x 6 mm, clear glass, 1st hydrolytic class, 15 mm tip | La-Pha-Pack | 06090357 | |
| Screw caps for 1.5 mL Short Thread Vials, with hole, RedRubber/PTFE septum, 45° shore A, 1.0 mm | La-Pha-Pack | 9151819 | |
| Alkane standard solution C8-C20 | Sigma-Aldrich | 04070 | |
| Alkane standard solution C21-C40 | Sigma-Aldrich | 04071 | |
| n-Hexane SupraSolv | Merck | 104371 | |
| GC-autosampler, e.g. MPS2XL-Twister | Gerstel | ||
| Agilent Gas chromatograph 6890 N | Agilent | ||
| Gooseneck splitless Liner | Restek | 22406 | |
| Helium (5.0 - F50) | Messer | 102532501 | |
| GC capillary column HP-5MS UI 30 m × 0.25 mm ×0.25 µm | Agilent | 19091S-433UI | |
| Agilent Mass Selective Detector 5975B | Agilent | ||
| MSD ChemStation Data Analysis Application software | Agilent | ||
| MetaboliteDetector software (3.1.Lisa20170127Ra-Linux) | Hiller K | download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 | |
| Calibration Library for MetaboliteDetector | Hiller K | download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 | |
| MD Conversion Tool for NIST-library | Hiller K | download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 |
References
- Morgan, E. D. Chemical sorcery for sociality: exocrine secretions of ants (Hymenoptera: Formicidae). Myrmecol News. 11, 79-90 (2008).
- Betz, O. Biological adhesive systems. , Springer. 111-152 (2010).
- Laciny, A., Zettel, H., Druzhinina, I. Workers, soldiers, and gynes-morphometric characterization and description of the female castes of Camponotus singularis (Smith, 1858)(Hymenoptera, Formicidae). Deutsche Entomologische Zeitschrift. 63, 183 (2016).
- Ward, P. S., Blaimer, B. B., Fisher, B. L. A revised phylogenetic classification of the ant subfamily Formicinae (Hymenoptera: Formicidae), with resurrection of the genera Colobopsis and Dinomyrmex. Zootaxa. 4072 (3), 343-357 (2016).
- Davidson, D. W., Salim, K. A., Billen, J. Histology of structures used in territorial combat by Borneo's 'exploding ants'. Acta Zoologica. 93 (4), 487-491 (2012).
- Davidson, D., et al. An experimental study of microbial nest associates of Borneo's exploding ants (Camponotus [Colobopsis] species). Journal of Hymenoptera Research. 18 (2), 341-360 (2009).
- Laciny, A., et al. Colobopsis explodens sp.n., model species for studies on "exploding ants" (Hymenoptera, Formicidae), with biological notes and first illustrations of males of the Colobopsis cylindrica group. ZooKeys. , (2018).
- Maschwitz, U., Maschwitz, E. Platzende Arbeiterinnen: eine neue Art der Feindabwehr bei sozialen Hautflüglern. Oecologia. 14 (3), 289-294 (1974).
- Davidson, D. W., Lessard, J. P., Bernau, C. R., Cook, S. C. The tropical ant mosaic in a primary Bornean rain forest. Biotropica. 39 (4), 468-475 (2007).
- Martin, S., Drijfhout, F. A review of ant cuticular hydrocarbons. Journal of chemical ecology. 35 (10), 1151 (2009).
- Pickett, J. Chromatography and isolation of insect hormones and pheromones. , Springer. 299-309 (1990).
- Tragust, S., et al. Ants disinfect fungus-exposed brood by oral uptake and spread of their poison. Current Biology. 23 (1), 76-82 (2013).
- Menzel, F., Blüthgen, N., Schmitt, T. Tropical parabiotic ants: highly unusual cuticular substances and low interspecific discrimination. Frontiers in Zoology. 5 (1), 16 (2008).
- Hogan, C. T., Jones, T. H., Zhukova, M., Sosa-Calvo, J., Adams, R. M. Novel mandibular gland volatiles from Apterostigma ants. Biochemical Systematics and Ecology. 72, 56-62 (2017).
- Augusto, F., Valente, A. L. P. Applications of solid-phase microextraction to chemical analysis of live biological samples. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 21 (6), 428-438 (2002).
- Davidson, D. W., et al. Nutrition of Borneo's 'exploding' ants (Hymenoptera: Formicidae: Colobopsis): a preliminary assessment. Biotropica. 48 (4), 518-527 (2016).
- Jones, T., et al. The chemistry of exploding ants, Camponotus spp.(cylindricus complex). Journal of chemical ecology. 30 (8), 1479-1492 (2004).
- Voegtle, H. L., Jones, T. H., Davidson, D. W., Snelling, R. R. E-2-ethylhexenal, E-2-ethyl-2-hexenol, mellein, and 4-hydroxymellein in Camponotus species from Brunei. Journal of chemical ecology. 34 (2), 215-219 (2008).
- Hiller, K., et al. MetaboliteDetector: comprehensive analysis tool for targeted and nontargeted GC/MS based metabolome analysis. Analytical chemistry. 81 (9), 3429-3439 (2009).
- Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis. Metabolomics. 3 (3), 211-221 (2007).
- Stein, S. Retention indices by NIST mass Spec data Center. NIST Chemistry Webbook, NIST Standard Reference Base. (69), (2010).
- NIST Chemistry WebBook. NIST Standard Reference Database Number 69. , Available from: http://webbook.nist.gov/chemistry/ (2018).
- Cook, S. C., Davidson, D. W. Nutritional and functional biology of exudate-feeding ants. Entomologia Experimentalis et Applicata. 118 (1), 1-10 (2006).
- Abdalla, F. C., Cruz-Landim, C. d Dufour glands in the hymenopterans (Apidae, Formicidae, Vespidae): a review. Revista Brasileira de Biologia. 61 (1), 95-106 (2001).
- Hiller, K. MetaboliteDetector. Documentation. , Available from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/wiki/index.php/Documentation (2010).
- Nieke, C. MetaboliteDetector - Development Version. , Available from: http://md.tu-bs.de/system/files/Downloads/MD-Development-Version-Documentation.pdf (2012).
- Hiller, K., Koschnitzki, N. MetaboliteDetector. Download. , Available from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 (2017).
