Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Isolatie van de mandibulaire klier Reservoir inhoud van Borneose ' exploderende mieren (Formicidae) voor Volatilome analyse door GC-MS en MetaboliteDetector

Published: August 26, 2018 doi: 10.3791/57652
Automatic Translation
1, 2, 1, 3,4, 5, 5, 6, 7, 2, 1
1Center for Analytical Chemistry, Department of Agrobiotechnology (IFA-Tulln), University of Natural Resources and Life Sciences Vienna (BOKU), Austria, 2Institute of Chemical, Environmental and Biological Engineering, TU Vienna, Austria, 3Department of Computational Biology of Infection Research, Helmholtz Centre for Infection Research, Germany, 4Institute for Biochemistry, Biotechnology and Bioinformatics, University of Technology (TU) Braunschweig, Germany, 52nd Zoological Department, Natural History Museum Vienna, Austria, 6Chemical Sciences, Universiti Brunei Darussalam, Brunei, 7Environmental and Life Sciences, Universiti Brunei Darussalam, Brunei

Summary

Minderjarige werknemers van de mier soorten Colobopsis explodens worden ontleed om te isoleren van de inhoud van de wasachtige opgeslagen in hun hypertrophied mandibulaire klier reservoirs voor latere oplosmiddel-extractie en analyse met gaschromatografie-massaspectrometrie. De aantekening en de identificatie van vluchtige bestanddelen met behulp van de open-source software MetaboliteDetector wordt ook beschreven.

Abstract

Het doel van dit manuscript is te presenteren een protocol met een beschrijving van de metabolomic analyse van de Borneose 'exploderende mieren' behoren tot de groep Colobopsis bloedgras (COCY). Voor dit doel is het model soorten C. explodens gebruikt. Mieren, die behoren tot de kaste van de minderjarige werknemer bezitten onderscheidend hypertrophied mandibulaire klieren (MGs). In het gevecht van de territoriale gebruiken ze de viskeuze inhoud van hun uitgebreide mandibulaire klier reservoirs (MGRs) te doden van rivaliserende geleedpotigen in karakteristiek suïcidale 'explosies' door vrijwillige breuk van het gastral integument (autothysis). Wij tonen de dissectie van werkmieren van deze soort voor de isolatie van het gastral gedeelte van de wasachtige MGR inhoud, alsmede de vermelding van de nodige stappen die nodig zijn voor oplosmiddel-extractie van de daarin staande vluchtige stoffen met latere gas chromatografie-massaspectrometrie (GC-MS) analyse en vermeende identificatie van metabolieten die zijn opgenomen in het extract. De dissectie-procedure is uitgevoerd in gekoelde omstandigheden en zonder het gebruik van een bufferoplossing dissectie om te minimaliseren van de veranderingen in de chemische samenstelling van de inhoud van de MGR. Na een extractie van vluchtige metabolieten die erin zijn opgenomen, op basis van oplosmiddelen, worden de nodige maatregelen voor het analyseren van de monsters via vloeistof-injectie-GC-MS gepresenteerd. Tot slot, gegevensverwerking en vermeende metaboliet identificatie met het gebruik van de open-source software MetaboliteDetector wordt weergegeven. Met deze aanpak, de profilering en identificatie van vluchtige metabolieten in MGRs van mieren, die behoren tot de COCY group via GC-MS en de software van de MetaboliteDetector mogelijk.

Introduction

Het algemene doel van de workflow die hier gepresenteerd is het algemene onderzoek van chemische samenstelling in secreties van insecten. Dit wordt gedaan met het primaire doel van het ophelderen van de ecologische functies van de afscheiding als geheel, of van interne verbindingen daarvan. Bovendien zijn we geïnteresseerd in onderzoek naar de metabole routes die ten grondslag liggen aan de verbindingen die zijn gevonden in de respectieve afscheidingen. Vooral klier inhoud van mieren (Hymenoptera (Vliesvleugeligen), Formicidae) hebben stijgende belangstelling in de afgelopen jaren opgedaan, omdat zij bronnen van tot nog toe onontgonnen potentieel bioactieve stoffen (lijm, antimicrobiële middelen, enz.)1, 2. kleine werkmieren van sommige soorten die behoren tot de COCY groep3,4 kunnen dergelijke verbindingen opgenomen in hun hypertrophied MGRs die uit te van de monddelen aan de gaster5,6 breiden. Wanneer bedreigd door vermeende vijanden, minderjarige werknemers van C. explodens7 en enkele verwante soorten kunnen maken gebruik van hun MGR inhoud op een ongebruikelijke manier: ze offeren zich door het bezwijken van hun gastral muur om uit te werpen de kleverige inhoud van de MGRs explosief op de tegenstander, sterven waarna de vermeende vijand wordt vastgehouden en kan zelfs5,6,8,9. Het doel van de ontwikkeling en het gebruik van de hierin gepresenteerde methoden moest helpen bij het verbeteren van het inzicht in de chemische samenstelling en de aard van voorlopig giftige bestanddelen van deze mier-secretie.

Te dien einde presenteren we een protocol voor de dissectie van C. explodens Arbeider mieren te verkrijgen van het gastral gedeelte van de inhoud ervan van wasachtige, MGR met latere oplosmiddel-extractie en analyse door GC-MS.

GC-MS-analyse is een van de gevestigde methoden voor de profilering en identificatie van vluchtige metabolieten (volatilome) van insecten. Typische analyten belangstelling voor mieren omvatten cuticular koolwaterstoffen10, semiochemicals11, en in het algemeen, verbindingen met biologische activiteit12. Monsters kunnen worden verkregen van hele dieren of van lichaamsdelen en vloeistoffen geïsoleerd via dissectie van de insecten13,14. Monster voorbereiding technieken omvatten extractie van de daarin staande metabolieten met het gebruik van oplosmiddelen14 of15(HS-SPME) headspace-solid-fase-microextraction.

Voor metabolomic studies is het essentieel dat de monsters direct na de monsterneming, snel zijn bevroren om te minimaliseren van veranderingen in de chemische samenstelling en de hoeveelheid van de stoffen. De mieren gebruikt voor deze studie werden gedood door snelle bevriezen ter plaatse in een koel zak gevuld met diepgevroren cold packs. De monsters werden vervolgens opgeslagen in een vriezer van-20 ° C met behulp van de generator-aangedreven elektriciteit, voordat ze werden vervoerd naar het laboratorium op droog ijs. De hier gepresenteerde dissectie-procedure biedt de mogelijkheid om het isoleren van MGR inhoud zonder het analyseren van de hele mier of de gaster als geheel, als het is al eerder gedaan voor verschillende COCY soorten16,17,18. Bovendien, het voorgestelde protocol kunt ook directe toegang en analyse van de omliggende klieren en weefsels, zoals de venom klier (VG)5,8, van de Dufour klier (DG)8of de darmen in andere biologische studies of naar controleren op mogelijke Kruis-besmettingen geïntroduceerd tijdens de behandeling of dissectie van de mieren. Om de veranderingen in de chemische samenstelling van de MGR-inhoud tijdens dissectie, ontdooien monsters of door het gebruik van chemische stoffen, is de dissectie-proces geoptimaliseerd om te worden uitgevoerd op een coldpack (-20 ° C), zonder het gebruik van eventuele extra buffers, wassen oplossingen, of oplosmiddelen. De monsters die zijn verkregen via deze methode zijn geschikt voor het beantwoorden van vragen van kwalitatieve en kwantitatieve.

Analyse van de gegevens met het oog op de vermeende metaboliet annotatie en identificatie gebeurt via de open-source software MetaboliteDetector19, die werd ontwikkeld voor de automatische analyse van GC-MS-gebaseerde metabolomica gegevens. Het detecteert enkele ion pieken aanwezig in chromatogrammen, voert een deconvolutie stap, en extracten van de deconvoluted massaspectra van chemische stoffen die zijn opgenomen in de geanalyseerde monsters. Vermeende identificatie van verbindingen met MetaboliteDetector is gebaseerd op de index van de vastberaden retentie (RI; de Kováts RI kan automatisch door de software worden berekend) alsmede de gelijkenis van de deconvoluted massaspectra. RI en spectrale matchfactor kunnen kruiscontrole tegen beide bestaande naslagbibliotheken (dat kan worden geïmporteerd, als ze in het gemeenschappelijke formaat van NIST), of tegen een vastgestelde interne bibliotheek. Dit is in overeenstemming met de richtsnoeren voor de (vermeende) samengestelde identificatie voorgesteld, bijvoorbeelddoor de chemische analyse Working Group (CAWG) van de metabolomica normen initiatief (MSI), waar een minimum van twee onafhankelijke en orthogonale gegevens ten opzichte van een authentiek compound (hier retentie tijd (RT) /RI en massaspectrum) geanalyseerd onder dezelfde proefomstandigheden worden voorgesteld als nodig is om niet-roman metaboliet identificaties20bevestigen.

Het volledige experiment is uitgevoerd op de inhoud van de MGR soorten model COCY C. explodens, maar de stappen van de dissectie kunnen ook worden aangepast aan het isoleren van de andere klieren aanwezig in de ant-gaster. Bovendien, terwijl presenteren we een protocol voor een totale analyse van de volatilome van de MGR-inhoud, de meer algemene onderdelen van de workflow met een beschrijving van extractie, GC-MS meting en evaluatie van de gegevens kan ook worden gebruikt voor analyse en (vermeende) identificatie van vluchtige metabolieten in het algemeen.

Aangezien de beschreven in dit manuscript experimenten worden uitgevoerd op insecten, is geen ethische goedkeuring vereist. Veldwerk, bemonstering van de mieren, evenals hun gebruik voor publicatie zijn in overeenstemming met de richtsnoeren voor het reguleren van dit project door de Universiti Brunei Darussalam, Brunei van onderzoek en innovatiecentrum en Brunei van Forestry Department, Brunei Darussalam.

Protocol

1. verzameling van mieren

  1. Verzamelen van kleine werkmieren met het gebruik van een aspirator (Figuur 1).
  2. Onmiddellijk na de monsterneming, de mieren oplossen door snelle bevriezing bij-20 ° C en sla deze op dit of een lagere temperatuur tot analyse.

2. isolatie van de MGR inhoud en DG van mieren

  1. Voordat hij de dissectie van mieren, stelt het volgende:
    1. Reinig de petrischaal glas en de dissectie-instrumenten met een mengsel van methanol / water (MeOH/H2O; 1 + 1 v/v) en weefsels.
      Let op: MeOH is giftig voor de mens. Altijd Draag geschikte handschoenen en een laboratoriumjas bril, en voeren de reiniging in een zuurkast.
    2. Bevriezen van de coldpack en de glazen petrischaaltje tot-20 ° C.
    3. Bepalen van de massa's van 1,5 mL korte draad flesjes met inbegrip van schroefdoppen met siliconen/polytetrafluorethyleen (PTFE) septa en houd ze op het ijs direct naast de Microscoop.
      Opmerking: De keuze van de steekproef flacon is optioneel. Hier komen de MGR-inhoud rechtstreeks in gekoelde 1,5 mL flesjes gemaakt van glas. Kunststoffen kunnen bevatten verbindingen (bijvoorbeeld ftalaten) die kunnen leiden tot artefacten, die met de signalen van de metabolieten van de doelgroep interfereren.
    4. Plaats de bevroren coldpack in een box gemaakt van geëxtrudeerd polystyreenschuim. Plaats de petrischaal op de top van de coldpack en een bevroren mier gestoken in de schotel. Monteer het vak onder een stereomicroscoop. Pas de vergroting (20-40 X) en de focus totdat de hele mier duidelijk kan worden gezien.
  2. Controleer de bevroren mier voor de integriteit van haar gastral compartimenten. Voor dissectie, nemen alleen mieren met een intact gaster regio (figuur 2A, B). Uitsluiten mieren met vlakke gasters of sporen van geharde MGR inhoud op hun lichaam oppervlakken uit verdere analyse (figuur 2C, D).
  3. Pak de geselecteerde mier met een paar van boete-tipped verlostang op het propodeum (eerste abdominale segment) en met de andere paar pincet in de bast (tweede abdominale segment). Loskoppelen van de regio gaster door zachtjes te trekken uit de buurt van de rest van het lichaam van de mier (figuur 3A).
  4. Oplossen de gaster nu gescheiden mier door het bedrijf met een boete-tipped Tang op tergite 4. Met een ander paar van boete-tipped verlostang grijp tergite 1 (gelegen naast de bloemknop) en zachtjes verwijderen door het peeling uit (figuur 3B). Herhaal dit ook voor tergites 2 en 3 (Figuur 3 c, D) tot het gastral gedeelte van de MGRs (geel gekleurde in C. explodens Arbeider mieren, maar de kleur van de MG-inhoud kan variëren van wit via geel naar rood bij andere diersoorten) is zichtbaar voor de meest deel.
    Opmerking: Door het verwijderen van het exoskelet, het membraan van de MGR wordt ook gedeeltelijk verwijderd.
  5. Door het gebruik van een dissectie naald, zachtjes verwijderen de wasachtige inhoud van de gekoppelde MGRs krassen hen uit het gastral compartiment (figuur 3E). Alleen die delen van de MGR-inhoud die geïsoleerd worden kan zonder het bezwijken van andere klieren aanwezig in de mier gaster te verwijderen. Als meer kracht of inspanningen worden toegepast op de MGR inhoud als geheel verkrijgen moeten, aanvaarden de onvolledige verwijdering (Figuur 4).
  6. Oprapen de MGR-inhoud door zachtjes ze aan te raken met het topje van de dissectie naald totdat ze aan het vasthouden. Breng de MGR-inhoud in een gekoelde 1.5 korte draad flacon met bekende tarra massa.
    1. De kleverige MGR inhoud om uit te verwijderen het puntje van de dissectie-naald, de naald tip naar de muur van de monster-flacon en smeren ze op de muur. Sluit de flacon en plaats deze op ijs totdat de volgende MGR inhoud geïsoleerd worden.
  7. Als u wilt later controleren voor mogelijke kruisbesmetting van het MGR inhoud monster verbindingen afkomstig uit de aangrenzende DG (afdeling 6), ook directoraten-generaal van mieren, waarin ze zijn nog steeds intact (Figuur 4) en zet ze in een aparte HPLC-flacon te verzamelen.
  8. Altijd schoon de petrischaal en de dissectie instrumenten met MeOH/H2O (1 + 1 v/v), bij het wisselen van klier aan klier of van mier aan ant.
  9. Voor één analytische monster, door de inhoud van het reservoir of klieren van meerdere mieren te combineren.
    Opmerking: Het aantal van klieren of van hun inhoud gebruikt voor een analysemonster kan variëren afhankelijk van het ontwerp van het experiment. Hier, waren MGR inhoud of DG's van de vijf mieren gebundeld om één analytische monster te verkrijgen.

3. oplosmiddel-extractie van geïsoleerde klier inhoud

  1. Het bepalen van de massa's van de analytische monsters (hier, MGR inhoud of aangrenzende klieren gebundeld van vijf mieren).
  2. Ijskoude Zuiver ethylacetaat (EtOAc) toevoegen in een constante verhouding van 1:14 w/v en vortex de monsters gedurende 5 minuten in gekoelde omstandigheden; hier, uitgevoerd bij 7 ° C in een waterbaden laboratorium.
  3. Centrifugeer de monsters gedurende 10 minuten bij 3,820 x g bij 7 ° C en breng het supernatant (over 55 / 75 µL voor inhoud MGR-extract verkrijgbaar bij vijf mieren) in vooraf gekoelde 1,5 mL korte draad flesjes met 0,1 mL micro-inserts. Strak zegel de flesjes met schroefdoppen met gaten en rode rubber/PTFE septa.
    Opmerking: Indien de analyse niet onmiddellijk worden uitgevoerd, houden het extract bij-80 ° C tot analyse, maar het wordt aanbevolen om het analyseren van monsters onmiddellijk na de voorbereiding om te minimaliseren van het risico van chemische veranderingen tijdens de cyclus invriezen/ontdooien.

4. GC-MS

  1. Voor een volledige reeks van GC-MS meting, voorbereiding van de volgende oplossingen, elk in een flesje van de korte draad 1,5 mL:
    1. Een RI kalibrant mengsel bereid door verdunning van de standaardoplossingen verkrijgbare alkane om een eindconcentratie van 8 mg/L per verbinding met behulp van hexaan.
    2. Bereiden van een oplosmiddel-lege bestaande uit pure EtOAc.
  2. Plaats de flesjes met 1) oplosmiddel-lege, 2) RI kalibrant mengsel, 3) MGR inhoud uitpakken, en 4) DG inhoud uitpakken in de afgekoelde lade (10 ° C) van de autosampler gekoppeld aan de gaschromatograaf (GC).
    Opmerking: Het wordt aanbevolen om te minimaliseren van de tijd-span die elke flacon wordt bewaard in de autosampler voorafgaand aan de meting. Voor kritische monsters, zoals MGR inhoud, kan de flacon in de autosampler onmiddellijk vóór de analyse worden geplaatst.
  3. Voor elk monster, een aliquoot 1 µL te injecteren in de GC-MS voor chromatografische scheiding op een kolom die geschikt is voor de doelgroep verbindingen (hier: HP - 5MS UI kolom).
    1. Stel de juiste GC parameters, die er als volgt kunnen uitzien:
      1. Helium gebruikt als draaggas en stelt u een kolom van de constante stroom van 1 mL/min. Set een oven temperatuur helling vanaf 40 ° C met een houden gedurende 2 minuten, gevolgd door een helling van 10 ° C/min. tot 330 ° C, met een tijd van de greep van 7 min. Set de inlaattemperatuur tot 270 ° C.
      2. Kies en wijzig indien nodig de verhoudingen van de split van GC-MS injectie die leiden tot een adequate piek vormen en intensiteiten voor verbindingen van belang (Figuur 5).
        Opmerking: In het gepresenteerde voorbeeld bleek het noodzakelijk om te meten de DG-extract bij een split-ratio van 2:1 en het RI kalibrant mengsel in splitless modus. Het MGR inhoud extract werd geanalyseerd op een split-ratio van 2:1 en een tweede keer op 50: 1.
      3. De ondersteunende temperatuur instellen tot 350 ° C.
    2. De parameters van de massa-spectrometer (MS) als volgt ingesteld: MS bron temperatuur van 230 ° C, MS Quad temperatuur: 150 ° C, scanbereik van lage massa 30 naar hoogmis 500, oplosmiddel vertraging 4.1 min (voor oplosmiddel-lege en experimentele monsters) of 6.1 min (voor RI kalibrant mengsel) , respectievelijk. Stel de scan rate tot ongeveer 3 scans/s.
      Opmerking: De MS-parameters, met name de MS scan-, Samplingsnelheid, cyclustijd piek plukken en spectrum deconvolutie kan beïnvloeden en moet worden beschouwd bij de keuze van de parameterinstellingen voor evaluatie van de juiste gegevens met de MetaboliteDetector software.
  4. Wanneer de meting is voltooid, moet u de gegevens als exporteren. AIA projectbestand (hier uitgevoerd met het gebruik van de data-analysesoftware geleverd met de GC) op een draagbaar apparaat voor gegevensopslag.
    1. Selecteer bestand | Gegevens exporteren naar AIA bestandsindeling..., vervolgens controleren op nieuwe map maken en klik op OK. Selecteer de gewenste opslaglocatie (b.v., USB-flashstation) en klik op openen. Selecteer de bestanden worden geëxporteerd en druk op de ---> pictogram. Bevestig met het procesop te klikken.

5. metaboliet detectie en identificatie met het gebruik van MetaboliteDetector Software

  1. Voordat u begint de analyse van de gegevensbestanden, open MetaboliteDetector, kies Tools | Instellingen, en stel de gewenste parameters als volgt (individuele vellen MetaboliteDetector zijn vetgedrukt):
    1. In de weergaveResourceblad de tijdschaal ingesteld op Min en inschakelen van de optie van de etiketten van de assen.
    2. In het blad deconvolutie, stel de parameters voor de piek instellingen: Peak drempel: 10 en Minimum piekhoogte (lawaai eenheden): 10. Vink inschakelen van aanpassing van de basislijn. De parameters voor de metaboliet detectie: opslaglocaties/scannen: 10, deconvolutie breedte (scans): 5, vereiste intensiteit (% van hoofdpiek): 0, en vereiste aantal pieken: 10.
    3. In het blad identificatie, stel de Library Search-optie op: samengestelde Lib: 'CalibrationLibrary_Alkanes' en NIST (een NIST sqlite library kan worden opgenomen in de .lbr-formaat). De parameters als volgt instellen: Max. RI verschil: 10, Cutoff score: 0.9, Pure/Impure samenstelling: 0.5, aantal fragmenten: 2, Minimum aantal identieke frag.: 1. gebruik geschaald lib: aangevinkt; Gelijkenis Score: Spec. gelijkenis; Massa filter: m/z 207, 221, 281, 355 en 1147 (voor bekende verontreinigingen die voortvloeien uit de stationaire fase van de GC-kolom).
    4. In het blad kwantificering de parameters ingesteld op: aantal kwantificering ionen: 3, de minimale afstand tussen de latere ionen: 5 en minimale vereiste kwaliteitsindex: 1. uitsluiten van de kwantificering ionen 207, 221, 281, 355 en 1147.
      Opmerking: In geval van hoge resolutie MS gegevens, daarnaast de volgende parameters instellen in het blad Centroid aan: de drempel van de piek beginnen: 10, piek drempel einde: -5 en maximale basislijn afstand: 30, FWHM: 0,5.
  2. Importeren van de bestanden in de. CDF-indeling opgenomen in de gegenereerde. AIA-projectbestand als alleen. NetCDF in de software van de MetaboliteDetector door het bestand selecteren | Import | NetCDF import. Kies de map-vormige-pictogram en selecteer vervolgens de bestanden voor de categorieën van de steekproef worden geïmporteerd en verwerkt: 1) oplosmiddel-lege, RI 2) kalibranten 3) MGR inhoud uittreksel en 4) DG inhoud uittreksel. Bevestig met OK om te beginnen van gegevensverwerking. Na verwerking, selecteer sluiten in het opkomende venster.
  3. Selecteer voor RI kalibratie en vastberadenheid van de RI-waarden voor stoffen die zijn opgenomen in het MGR-extract, bestand | Open en kies het bestand met de gegevens van de RI-kalibranten.
    1. Nadat de RI kalibrant bestand wordt geopend, selecteert u het vergrootglaspictogram . Het opkomende venster met OKbevestigen.
    2. Voor goede RI kalibratie, check het scala detecteerbare alkanen in het RI kalibrant bestand.
      1. Te dien einde, selecteer het driehoekje verschijnen onder het maximum van de eerste piek, die afkomstig zijn uit de eerste alkane (met de laagste RT, Figuur 6) aantoonbaar door op het eens te klikken.
      2. Controleer de hit met de hoogste spectrum gelijkenis ('Spec. sim.', Max. score = 1) vergeleken met de vermeldingen bibliotheek alkane (Figuur 6).
      3. Vergelijken om te controleren de identiteit van de voorgestelde alkane samengestelde, haar massaspectrum op de massaspectrum gegeven in de literatuur, bijvoorbeeld NIST chemie WebBook22.
      4. De laatste alkane aantoonbaar in het RI kalibrant mengsel bepalen door te tellen naar de laatste alkane piek in het chromatogram verschijnen.
    3. Selecteer voor RI kalibratie, Tools | RI-kalibratie Wizard. Selecteer volgende.
    4. Klik op het pictogram map-vormige en selecteer het bestand met het chromatogram van het RI kalibrant mengsel. Selecteer volgende.
    5. Selecteer de bibliotheek met de vermeldingen voor de kalibranten alkane in het verschenen venster.
    6. Selecteer de bibliotheek-items van alle alkanen aantoonbaar in het RI kalibrant bestand en klik op de >> pictogram. Na het selecteren van >>, kies volgende.
    7. Controleer de RTs vermeld voor elke detecteerbare alkane in de weergegeven tabel. Controleer de RTs afgebeeld in het hoofdvenster voor elke alkane door te klikken op de respectieve driehoek (afbeelding 7) te dien einde. Als noodzakelijk (Figuur 8), wordt de RT in de tabel van de kalibratie handmatig corrigeren door erop te dubbelklikken in het desbetreffende veld, typt selecteren van het drop-down menu, en kiezen van dat de juiste voorgesteld RT. alternatief, u in de RT met behulp van het toetsenbord ( Figuur 9).
    8. Wanneer de RT voor elke alkane juist is, selecteert u volgende. Klik op volgende in het opkomende venster tonen de RI kalibratie tabel.
    9. Selecteer het groene + -symbool in het opkomende Chromatogram selectie venster, kies het gegevensbestand van de oplosmiddel-blanco en de bestanden van de klier extracten en op volgendeklikt. Stel de parameterinstellingen in het opkomende venster als volgt: uitschakelen van basislijn aanpassing, piek drempel: 5, minimale piekhoogte: 5, opslaglocaties/scannen: 10 en deconvolutie breedte: 5. Druk op volgende en vervolgens Start naar uitvoeren van de RI-berekening van de de verbindingen die in de geselecteerde voorbeeldbestanden zijn opgenomen.
  4. Voor aantekening en identificatie van de gekozen metabolieten in het MGR-extract, opent het gegevensbestand van de gemeten MGR inhoud uittreksel, waarvoor de RIs zijn berekend zoals beschreven hierboven (stap 5.3.9), door het selecteren van bestand | Open en het gewenste gegevensbestand te kiezen.
    1. Selecteer gereedschappen | Instellingen | Deconvolutie en wijzig de piek drempel, alsmede de Minimum piekhoogte (lawaai eenheden) beide in 5. Selecteer het Vergrootglas pictogram en het weergegeven waarschuwingsvenster weer met OKbevestigen.
    2. Klik op een driehoekje verschijnen onder het maximum van een piek van belang en haar massaspectrum te vergelijken met degene die zijn opgeslagen in de NIST-bibliotheek door de NIST -pictogram te selecteren.
    3. Selecteer de eerste resulterende hit van het NIST-onderzoek (Figuur 10).
    4. Als de resulterende spectrum gelijkenis van de stof van belang boven de gekozen spectrum gelijkenis score is (hier ≥ 0.9) vergeleken met een NIST-ingang (Figuur 10), de RI (voor soortgelijke stationaire fase van de GC kolom laagdikte en kolom opzoeken diameter) gegeven voor deze verbinding in de literatuur (bijvoorbeeld NIST chemie WebBook22).
    5. Bereken het relatieve verschil tussen de NIST verwijzing RI (of de gemiddelde RIs wanneer meerdere RI waarden krijgen) en het experimenteel afgeleide RI. Als het verschil gelijk is of lager dan de gebruiker opgegeven maximale toegestane waarde (hier, van niet meer dan ±1%), wijst de verbinding als aantekeningen' '.
    6. Herhaal de stappen 5.4.2–5.4.5 voor alle verbindingen van belang opgenomen in het voorbeeldbestand MGR.
    7. Vergelijk de RI en massaspectra van standaardoplossingen voor samengestelde identificatie, (bijvoorbeeld 2 – 100 mg/L) gemeten onder dezelfde voorwaarden zoals is beschreven in punt 4 aan die van de geannoteerde verbindingen.
    8. Analyseren van de standaard zoals beschreven in punt 4 en de resulterende gegevens te verwerken zoals beschreven voor de alkane- en MGR inhoud klier gegevens in stap 4.4 en 5.2.
    9. Kalibreren van de van de standaard door te selecteren Hulpmiddelen van de verkregen gegevens | RI-kalibratie Wizard | Volgende en hetzelfde RI kalibrant bestand zoals gebruikt alvorens te kiezen. Selecteer volgende, dan weer volgende en selecteer het bestand met de gegevens verkregen uit de standaard oplossing door te klikken op het symbool van de groene + . Druk op volgende en vervolgens Start voor het berekenen van de RI voor de standaard compound.
      Opmerking: Als de analyse van de standaard kan niet worden uitgevoerd onmiddellijk na analyse van het monster, het wordt aanbevolen om te analyseren RI kalibranten weer en voor het uitvoeren van nieuwe RI kalibratie en berekening van de standaard.
    10. Open het respectieve dossier voor de standaard en zijn identiteit te bevestigen door vergelijking van het spectrum met de NIST-bibliotheek, zoals uitgelegd in stap 5.4.2.
    11. Na bevestiging van de identiteit van de standaard, de massaspectrum en RI van de samengestelde norm toevoegen aan de eigen bibliotheek. Te dien einde, klik op het symbool van de groene + en voer de gewenste naam van de vermelding van de bibliotheek. Bevestig met OK om toe te voegen de massaspectrum en de RI van de standaard samengestelde aan de bibliotheek. Als de nieuwe vermelding niet kan worden gezien in de bibliotheek, activeren de knop vernieuwen .
      Opmerking: Als de RI-kalibratie werd met succes uitgevoerd, de RI bepaald door MetaboliteDetector zal verschijnen in de respectieve bibliotheek-post. Na het maken van de bibliotheek-vermelding voor de standaard, de identificatie van deze metaboliet in het MG extract gebaseerd op een combinatie van RI en spectra gelijkenis is mogelijk.
    12. Het MGR inhoudsgegevens bestand opnieuw opent. Selecteer gereedschappen | Instellingen | Identificatie. Nu, als de RI van de standaard verbinding wordt berekend en toegevoegd aan de vermelding van de bibliotheek, omzetten in de Gelijkenis Score van Spectrum gelijkenis Gecombineerde Score.
    13. Klik op het vergrootglaspictogram en selecteer de driehoek onder de stof die heeft zijn aantekeningen in stap 5.4.5.
    14. Klik op de hit en controleer de waarde van de 'totale gelijkenis score' (OSS, afgekort door metaboliet Detector als 'Overall simil.'), rekening houdend met een combinatie van spectrum gelijkenis en RI gelijkenis score (Figuur 11).
      Opmerking: Als een hit werd gevonden in de in-house bibliotheek, het wordt getoond aan de rechterkant van het hoofdvenster.
    15. Als de OSS hoger is dan de door de gebruiker gedefinieerde drempel (hier ≥ 0.9, ook aangegeven door de groene kleur van de driehoek), wijst u de compound als 'geïdentificeerde' (Figuur 11).

6. check voor MGR inhoud Extract voor verontreinigingen door DG inhoud

  1. Open het geijkte bestand van het monster van de DG waarvoor reeds de RIs van de verbindingen zijn berekend met MetaboliteDetector (stap 5.3.9).
  2. Selecteer voor een deken van het chromatogram verkregen na meting van het MG inhoud monster en het DG monster, Tools | Chromatografische overlay en kies de twee respectieve bestanden via het pictogram groen + . Bevestig met OK.
  3. Selecteer het verschijnen Chromatogram Overlay blad aan de onderkant van het venster om de overlay.
  4. Controleren op overlapping van verbindingen tussen de MGR inhoud uittreksel (Figuur 12) en de inhoud van de DG uitpakken en overlappende verbindingen uitsluiten van verdere MGR inhoudsanalyse.

Representative Results

Een schematische werkstroom de experimentele stappen naar vermeende metaboliet identificatie in de klier afscheidingen van C. explodens is afgebeeld in Figuur 13. Bovendien is een schematisch overzicht van de belangrijkste onderdelen van het lichaam van COCY werkmieren gebruikt voor het gepresenteerde experiment wordt geleverd als aanvullende figuur S1 A, B. De grote stappen van de dissectie van de mieren tot vermeende metaboliet identificatie in de MGR-inhoud worden geïllustreerd in de Aanvullende figuur S2.

Om te isoleren MGR inhoud geschikt voor analyse van de volatilome, werd een gekoelde staat gehandhaafd gedurende het vervoer, opslag, en ook tijdens het proces van de dissectie. Te dien einde, waren de mieren bevroren onmiddellijk na hun collectie met het gebruik van een insect aspirator (sectie 1 en Figuur 1) in situ. Na opslag voor 2 dagen in een diepvriezer van-20 ° C, werden de mier monsters vervoerd op droog ijs naar Oostenrijk, waar ze onmiddellijk bij-80 ° C tot verdere analyse zetten werden. Mieren geschikt om te worden gekozen voor het isoleren van de inhoud van hun MGR vertonen een gaster-regio die rond is en intact (figuur 2A) en in het beste geval goed gevulde met MGR inhoud, zoals aangegeven door de MGR zichtbaar tussen de tergites (figuur 2B). Gasters van mieren die niet geschikt zijn voor verdere analyse staan in figuur 2C, D. De belangrijkste stappen (stappen 2.3-2.6) betrokken in het proces van de isolatie van de MGR-inhoud van COCY mieren worden geïllustreerd in Figuur 3. De geïsoleerde MGR inhoud (geel in het geval van C. explodens, maar kleuren kan variëren van wit tot rood in andere soorten die behoren tot de groep van de COCY) worden weergegeven in Figuur 14.

Wanneer de ontrafeling van de mieren voor hun inhoud MGR, moet oppassen niet perforaties of scheuren van elke andere klieren of de darmen (stap 2.5). Figuur 4 geeft een ontleed ant-gaster waarin nog steeds de twee andere, intact klieren (DG en VG) na isolatie van de MGR-inhoud. Een voorbeeld van zichtbare verontreiniging door de inhoud van de darmen ant is weergegeven in Figuur 15. Aangezien de kruisbesmetting met DG inhoud, gelegen onder de MGR, kan niet volledig worden vermeden, is een onderdeel van het protocol voor het analyseren van deze klieren voor vergelijking van de resulterende signalen met de signalen van het MGR inhoud extract (afdeling 6) afgebeeld. Wanneer de procedure van de dissectie is goed gedaan, het is mogelijk om ongeveer 0,75-1.2 mg MGR inhoud per mier. Voor het protocol beschreven hier, werden MGR inhoud van vijf mieren gebundeld om te ontvangen van repetitieve monsters van 3,9-5,9 mg elke.

De geïsoleerde klier reservoir inhoud werden geëxtraheerd met EtOAc (sectie 3) en geanalyseerd door GC-MS (afdeling 4). De meting van de MG inhoud uittreksel van C. explodens werkmieren resulteert in een chromatogram bestaande uit pieken en massaspectra voor tientallen putatief MGR inhoud verbindingen (Figuur 5). De twee dominante metabolieten 1-(2,4,6-trihydroxyphenyl)-ethanone (ID 4) en 5,7-dihydroxy-2-methylchromen-4-one (ID 5) in de inhoud extract MG veroorzaakt kolom overbelasten, en daarom hetzelfde monster werd geanalyseerd opnieuw op een hoger opgesplitst ratio van 50: 1 ( Figuur 5, inzet). Mogelijke kruisbesmetting van de MGR-inhoud door de bestanddelen van de DG zou bijvoorbeeld zichtbaar als extra pieken in het chromatogram van de GC-MS exposeren laat RTs, vanaf ongeveer minuut 29 (Figuur 12). Met uitzondering van chromatografische pieken en massaspectra van verbindingen ook gevonden in de oplosmiddel-lege van oorsprong vanuit de stationaire fase van de GC-kolom of vanuit de inhoud van het DG in de mier gaster aanwezig en latere verwerking met de MetaboliteDetector software resulteerde in ongeveer 110 MGR inhoud verbindingen met een signaal ruis verhouding ≥ 10. Voor latere metaboliet aantekening en identificatie met de software van de MetaboliteDetector, de chromatogrammen waren gekalibreerd en de RI-waarden werden bepaald voor de bestanden van het te meten monster (stap 5.3 en substappen, Figuur 6, , Figuur 7 , Figuur 8 , Figuur 9). De gedetecteerde putatief MGR inhoud metabolieten waren geannoteerde gebaseerd op een combinatie van spectrum gelijkenis met de NIST-bibliotheek, die een integraal onderdeel van de software van de MetaboliteDetector in het gepresenteerde voorbeeld (stap 5.4 en substappen, Figuur 10 opgericht ). Bovendien, RI waarden gevonden in de literatuur voor de dezelfde of vergelijkbare stationaire fase, laagdikte en diameter van de GC-kolom werden beschouwd als voor samengestelde aantekening (stappen 5.4.4 en 5.4.5). Na het instellen van strikte procesfilteringscriteria en bevestiging van RIs en massaspectra door het gebruik van normen, zoals uitgelegd in de sectie protocol voor één standaard samengestelde (stappen 5.4.7-5.4.15 en Figuur 11), was het mogelijk om de identiteit bevestigen van ongeveer 10 % van de gedetecteerde metabolieten. Aangezien een gedetailleerd verslag over de volatilome van de inhoud van de MGR van C. explodens elders zal worden gepubliceerd, de huidige studie concentreerde zich op die metabolieten die al in een eerdere publicatie zijn beschreven door Jones et al. 17 (soorten hierin uitgeroepen tot KB02-108; Zie ook Cook et al. 23). tabel 1 geeft een overzicht van deze geïdentificeerde verbindingen.

Figure 1
Figuur 1: schematische tekening van een insect aspirator. In een deksel dat de zeehonden van een ampul of container, zijn twee gaten gemaakt, waar twee flexibele buizen worden gebracht door middel. De opening van een buis (T1), die wordt geconfronteerd met het interieur van de flacon is verzegeld met een fijn genoeg om het blokkeren van de insecten gaas. Daarnaast zijn gaten gemaakt in de buis te vergemakkelijken van de uitwisseling van lucht. Het einde van de buis T2 is nauw wees vooruit naar de insecten die zijn meegezogen in de flacon bemonstering door zuigen door T1. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Intact versus gebroken gaster. (A) Intact gaster geschikt voor dissectie. (B) Intact gaster bijna helemaal gevuld met MGR inhoud, ook geschikt voor dissectie. (C) en (D) gebroken gasters van de mier met uitgeworpen en gehard MGR inhoud (geel), eventueel gebroken tijdens breuk van de omhulling gaster gedurende de bemonstering. Deze mieren zijn uitgesloten van de dissectie, extractie en verdere analyse. T: tergite. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: grote stappen betrokken bij het proces van de dissectie. (A) scheiding van gaster regio uit de rest van het lichaam van de mier. (B) Peeling off exoskeleton: tergite 1, tergite 2 (C), en de tergite 3, waarna de inhoud van de gekoppelde geel gekleurde MGRs bijna volledig zichtbaar (D is). (E) de kleverige MGR inhoud verwijderen door de hulp van een dissectie naald. T: tergite. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Ant gaster na isolatie van MGR inhoud. De twee andere klieren aanwezig in de gaster (VG: venom klier, en DG: Dufour de klier) kan worden gezien. Na verwijdering van de MGR-inhoud (left-overs na isolatie kan worden gezien in het geel), moeten beide compartimenten wel intact. Deze klieren kunnen op dezelfde manier als de MGR-inhoud worden geanalyseerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: vertegenwoordiger totale ion huidige (TIC) chromatogram van de inhoud uittreksel van MGR. De twee meest voorkomende GC-MS bergtoppen resulteerde in meer symmetrisch gevormde chromatografische pieken, wanneer een hogere splitsingsverhouding (50: 1) werd gekozen in plaats van de reguliere 2:1 ratio (Zie inzet). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: bepaling van de eerste detecteerbare alkane in RI kalibrant chromatogram. Het driehoekje onder het maximum van de piek van de eerste alkane piek is geselecteerd. De alkane GC op 6.31 min en toont de hoogste spectrum gelijkenis (hier, 'Spec. sim.') met de vermelding van de bibliotheek 'Alkane_C09'. De alkane om identiteit te bevestigen, wordt de massaspectrum vergeleken met een bibliotheek (bijvoorbeeld NIST chemie WebBook22). In het gepresenteerde voorbeeld wordt nonane geïdentificeerd door het molecuulion met een m/z-waarde 128. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7: RI kalibratie met het gebruik van een standaard mengsel van n-alkane. De RI-kalibrant gegevensbestand is geopend en de functie van de 'RI-kalibratie-Wizard' gekozen. De juiste afstemming van de retentietijd aan de RI afgebeeld in de kalibratie-tabel moet worden gecontroleerd. De RT van 6.31 min voor alkane_C09 (nonane) wordt correct weergegeven in de tabel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 8
Figuur 8: verkeerde RTs worden weergegeven in de tabel kalibratie. De RTs niet correct worden weergegeven (of komt te staan door een verkeerde RT-waarde of door een ontbrekende RT waarde weergegeven als -1). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 9
Figuur 9: handmatige correctie van verkeerde RTs kalibratie intabel. De verkeerde waarden kunnen handmatig worden gecorrigeerd door het invoegen van de juiste RT voor de respectieve alkane, zoals hier wordt weergegeven voor Alkane_C39. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 10
Figuur 10: vergelijking van massaspectrum van gekozen samengestelde NIST-bibliotheek posten. Na het selecteren van de piek maximale eluerende 6.16 min (RI 891) en activering van de 'NIST-zoeken' functie (rode cirkel), wordt de gelijkenis van een spectrum van 0.99 voor 2-heptanone weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 11
Figuur 11: metaboliet identificatie in de inhoud uittreksel van MGR. De massaspectrum en de RI die afkomstig zijn van de samengestelde eluerende op RI 891 in het chromatogram van het monster worden vergeleken met de vermeldingen van de eigen bibliotheek met RIs en spectra van gemeten standaard stoffen. Als de 'totale gelijkenis Score' (OSS, afgekort in metaboliet Detector 'Overall simil.' uitvoering van massaspectrum en RI) tussen een stof in de in-house bibliotheek en een compound in de steekproef is bestand ≥ 0.9, de compound is aangewezen als 'identified'. Hier is de OSS tussen de toetreding van de eigen bibliotheek van 2-heptanone en de samengestelde eluerende op RI 891 0.96, wat resulteert in de identificatie van 2-heptanone in de MGR inhoud uitpakken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 12
Figuur 12: Overlay van TIC chromatografische secties (29 min aan min 35) van de inhoud van de DG pak (rood) en de inhoud van de MGR (blauw). Piek gebieden overeenkomt met overlappende (vermeende) verbindingen zijn hoger in het DG inhoud uittreksel dan in de MGR inhoud uitpakken; deze verbindingen mogelijk zijn afkomstig uit de DG en worden daarom beschouwd als (kleine) verontreinigingen in de MGR inhoud uitpakken. In het geval van de inhoud uittreksel van C. explodens MGR, de chromatografische toppen die afkomstig zijn van een vermeende besmetting van DG kunnen gevonden worden op ongeveer 29 min, en dit deel van het chromatogram uit verdere analyse van de MGR-inhoud kan worden uitgesloten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 13
Figuur 13: schematische workflow van ant monsters tot metaboliet aantekening/identificatie in klier reservoir inhoud extracten na analyse van de GC-MS. Het hier gepresenteerde protocol legt alle experimentele stappen vanaf van de isolatie van de MGR-inhoud via dissectie van de mier en de GC-MS-analyse en evaluatie van de gegevens (aangegeven in het zwart). Als alternatief, kan de insecten secretie ook worden gegenereerd en verzamelde in situ (aangeduid in grijs). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 14
Figuur 14: geïsoleerd wasachtige MGR inhoud voorafgaand aan winning. (A) de inhoud van de twee MGRs plakken aan elkaar, maar (B) ze kunnen ook gescheiden na isolatie. In C. explodens, de kleur van de MGR-inhoud is oranje-geel, maar kan variëren van wit naar rood in andere soorten van de COCY groep. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 15
Figuur 15: illustratie van een geïsoleerde MGR secretie door de bestanddelen van het insect darmen (bruin) cross-besmette. Deze soorten MGR isolaten zijn van extractie en verdere analyse uitgesloten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

ID Metaboliet Triviale naam InCHI tekenreeks Som-formule
1 Heptan-2-one InChI=1S/C7H14O/c1-3-4-5-6-7 (2) 8/ h3 - 6H 2, 1-2H 3 C7H14O
2 n-Undecane InChI=1S/C11H24/c1-3-5-7-9-11-10-8-6-4-2/h3-11H2,1-2H3 C11H24
3 n-heptadecaan InChI=1S/C17H36/c1-3-5-7-9-11-13-15-17-16-14-12-10-8-6-4-2/h3-17H2,1-2H3 C17H36
4 1-(2,4,6-Trihydroxyphenyl)-ethanone Monoacetylphloroglucinol InChI = 1S/C8H8O4/c1-4 (9) (11) 8-6 2-5 (10) 3 - 7 (8) 12/h2-3,10-12H, 1H 3 C8H8O4
5 5,7-dihydroxy-2-methylchromen-4-One Noreugenin InChI = 1S/C10H8O4/c1-5-2-7 (12) 10-8 (13) (11) 3-6 4-9 (10) 14-5/h2-4,11, 13H, 1H 3 C10H8O4

Tabel 1: metabolieten geïdentificeerd in de EtOAc extract van de inhoud van de MGR geïsoleerd van C. explodens kleine werkmieren. Geselecteerde metabolieten worden gepresenteerd.

Aanvullende figuur S1. Overzicht van de belangrijkste lichaamsdelen die behoren tot de COCY mieren (minderjarige werknemers) gepresenteerd in dit manuscript. (A) de MGRs staan in geel. Hun gastral gedeelte wordt gebruikt voor volatilome analyse. (B) het gastral gedeelte van de MGRs is gelegen onder de tergites 1 tot en met 3. T: tergite. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S2. Schematisch overzicht van de gepresenteerde experiment. De grote stappen van de dissectie van de mier tot vermeende identificatie van metabolieten aanwezig zijn in de MGR-inhoud worden geïllustreerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

In dit manuscript presenteren wij een volledige protocol voor het analyseren van de volatilome van de inhoud gevonden in het hypertrophied MGRs van C. explodens kleine werkmieren. Aangezien de mieren die hier gebruikt kunnen 'ontploffen' en hun MGR inhoud op een ongecontroleerde wijze bij aanraking met een tang uit te werpen, is het aanbevolen om het gebruik van een 'zachte' collectie techniek zoals geboden door een insect aspirator (Figuur 1). Voor sommige soorten van mier met inbegrip van COCY mieren, wellicht te beperken van het maximale aantal mieren aan vijf personen per 50 mL flacon, aangezien anders zelf vergiftiging van de mieren (bijvoorbeeld door de accumulatie van mierenzuur in de headspace) kan optreden. Voor de bevriezing van de mieren in het veld, kan een koel zak gevuld met diepgevroren cold packs worden gebruikt. De monsters moeten snel worden ingevroren en opgeslagen in gekoelde omstandigheden (bijvoorbeeld -20 ° C, beste bij-80 ° C), maar het wordt niet aanbevolen om te doden en de mieren slaan in vloeibare stikstof, aangezien grotere schade van hun klieren geconstateerd met deze methode.

De gepresenteerde buffer - en oplosmiddelvrije dissectie methodologie is geschikt voor het verkrijgen van de wasachtige mandibulaire klier reservoir inhoud, evenals andere klieren in bevroren werkmieren aanwezig. Voor volatilome analyse van de inhoud van de MGR van C. explodenszijn belangrijke aspecten moet worden beschouwd tijdens dissectie continue koeling van de mier (stap 2.1.4) en het minimaliseren van de Kruis-verontreinigingen van de MG monsters met andere klier inhoud/vloeistoffen aanwezig in de mier gaster (stap 2.5, Figuur 4en Figuur 15). Een aanzienlijk deel van de bevroren mieren kan worden beschadigd, hetzij omdat de mieren '' gedurende de bemonstering ontplofte of werden beschadigd tijdens het transport op droog ijs van de bemonstering-site naar het laboratorium. Als de regio gaster gebroken is, zijn deze mieren niet geschikt voor verdere analyse (figuur 2C, D). Indien slechts antennes en poten ontbreekt of gebroken zijn, kunnen deze mieren nog steeds worden gebruikt voor de extractie van de MGR inhoud en verdere analyse. Omdat de inhoud van de MGR van afgekoeld hebben C. explodens mieren een wax-achtige consistentie is rechttoe-rechtaan te isoleren hen met het gebruik van naalden van de dissectie (stap 2.5 figuur 3Een Figuur 14). Extra zorg moet worden genomen tijdens het verwerken van de kleverige MGR inhoud. Het kan vasthouden aan iets fysiek contact met het binnenkomt en ook vaak zal houden aan de verlostang dissectie, dat het risico van besmetting van andere monsters verhoogt. Er moet alleen het aanraken van de MGR-inhoud met de naald van de dissectie en onmiddellijk breng dit in de glazen flesjes gebruikt voor extractie (stappen 2.5 en 2.6). Bovendien, wordt het aanbevolen om het reinigen van de dissectie-apparatuur met een MeOH/H2O mengsel bij het schakelen tussen mieren of klier-types (stap 2.8).

Klier inhoud van andere soorten van de mier mag in een vloeibare staat zelfs tijdens het koelen met cold packs. In dit geval worden de hele klier met inbegrip van het membraan misschien eerst geïsoleerd en doorboord daarna om te verkrijgen van de inhoud. Vloeibare afscheidingen mogen ook worden verkregen met behulp van fijn capillaire pipetten. Met een gemiddelde lichaamslengte van ongeveer 4-5 mm (zonder antennes) behoren werknemers van C. explodens tot de kleinere soorten van de COCY groep. Hun vaak gezwollen gaster bestaat uit ongeveer 2-2,5 mm in lengte en 1-1,5 mm in de breedte. Werknemers van de zo ver grootste bekende soort van de COCY groep kunnen bereiken een grootte van ongeveer 8 mm in lengte met een gaster grootte van ongeveer 3 mm lang en 2,5 mm in de breedte. Aangezien het protocol is geschikt om te ontleden en het onderzoeken van individuele mieren en gasters van die grootte van verschillende COCY soorten, de hier gebruikte dissectie instrumenten en Microscoop wellicht worden aangepast gelden voor kleinere mieren of kleinere orgels. Bovendien is het aantal mieren per analysemonster wellicht ook worden verhoogd.

Terwijl de ontrafeling van de mier voor de MGR-inhoud, is het van cruciaal belang om niet te beschadigen van elke andere klieren of de darmen - waarvan de inhoud kunnen het monster (stap 2.5, Figuur 4 en Figuur 15) kruis-besmetten. In het optimale geval, na de extractie van de MGR-inhoud, het DG, evenals de VG zichtbaar blijven intact (Figuur 4). Besmettingen met de inhoud van het directoraat-generaal, die zich onder de MGRs bevindt, zijn moeilijk te vermijden volledig. Redenen hiervoor kunnen ook de gedeeltelijke ontwrichting van de integriteit van de klier tijdens het vervoer op droog ijs van de bemonstering-site naar het laboratorium. Het is ook mogelijk dat de directoraten-generaal beschadigd gedurende de bemonstering of in het proces van exploderen, zoals we hebben gemerkt voor de MGR in een aantal onderzochte mieren. Aangezien de inhoud van de DG kunnen dezelfde manier worden geanalyseerd als de MGR inhoud (afdelingen 3 en 4), kunnen de resultaten worden vergeleken met de resulterende gegevens na analyse van de MGR inhoud monsters (afdeling 6). In het geval van MGR inhoud plantenextracten verkregen van C. explodens mieren, beginnen de verbindingen ook opgenomen in het DG te elueren laat in het chromatogram (Figuur 12). Om te voorkomen dat DG verwarren verbindingen voor MGR bestanddelen, de respectieve metabolieten kunnen worden uitgesloten van verdere analyse. Uit studies over andere ant-soorten is bekend dat DG's ook (zeer) vluchtige stoffen1,24 bevatten kunnen, die meestal vroeg in het GC-chromatogram Elueer.

In eerdere studies omgaan met de chemische samenstelling van de inhoud van de MGR van COCY mieren, hele mieren of hun hele gasters werden geanalyseerd16,17,18,23, overwegende dat hier de MGR inhoud zelf werden verkregen via dissectie van de mieren.

Ontleed MGR inhoud analyseren kan onderzoekers voor het uitvoeren van een breed scala aan biochemische studies, met inbegrip van de identificatie van metabolieten die erin zijn opgenomen. Aangezien de uitgevoerde studie hier op de identificatie van de vluchtige bestanddelen opgenomen in de MGR van C. explodens gericht, werd GC-MS gekozen voor haar analyse (afdeling 4). Hiervoor moeten de extracten idealiter worden gemeten onmiddellijk na bereiding of opgeslagen bij-80 ° C tot analyse. Opgemerkt moet worden dat de (uitgebreide) opslag chemische veranderingen van de extracten (zie opmerkingen na stap 3.3 en 4.2) kan veroorzaken. Aangezien de concentratie van de MGR-inhoud betrekking op een scala aan verschillende ordes van grootte hebben kan, wellicht voor het analyseren van de MGR-extracten op verschillende GC splitsen van ratio's. Omdat de twee belangrijkste verbindingen in de MGR inhoud uittreksel van de mieren genomen om te illustreren het protocol veroorzaakt kolom overbelasting toen een splitsingsverhouding van 2:1 werd gebruikt, was in dit voorbeeld een tweede keer op een hogere split-ratio van 50: 1 (stap 4.3.1.2and Figuur 5) geanalyseerd. De GC-MS parameterinstellingen gepresenteerd in hoofdstuk 4 zijn geschikt voor gegevens die zijn gegenereerd met de GC-MS apparaten opgegeven in de Tabel van materialen. Naast de RI kalibranten (stap 4.1.1), moet ook een oplosmiddel-leeg (stap 4.1.2) worden geanalyseerd om te herkennen van niet-biologische artefacten en verontreinigende stoffen tijdens latere data-analyse. Voor de identificatie van de metaboliet is het ook belangrijk voor het meten van authentieke normen van geannoteerde stoffen dezelfde voorwaarden GC-MS zoals gebruikt voor het analyseren van de steekproef extracten (volgende stappen 5.4.7and). Ter verbetering van de nauwkeurigheid en de betrouwbaarheid van de definitieve gegevens, is het aanbevolen om het analyseren van alle monster categorieën (oplosmiddel-lege, RI kalibranten, monster extracten en normen) binnen de dezelfde volgorde van de meting. Bovendien, de authentieke normen moeten worden geanalyseerd met een concentratie die vergelijkbaar is met die waargenomen voor de monster-extracten. Dit helpt bij het verbeteren van de nauwkeurigheid van RI waarden en gelijkenis tussen monster en de standaard massaspectra, die uiteindelijk tot meer en meer zinvolle metaboliet aantekening/identificatie leiden zal. Te dien einde kunnen de normen worden herhaaldelijk gemeten met behulp van verschillende split factoren.

Voor de metaboliet identificatie, de geavanceerde software, wordt MetaboliteDetector gebruikt voor vergelijking van spectra deconvolutie en RI en spectra aan een geïmplementeerde NIST-bibliotheek ook over een gevestigde in-house bibliotheek (sectie 5). Het wordt aanbevolen voor het uitvoeren van MetaboliteDetector op een 64-bits LINUX-gebaseerd werkend systeem (bijvoorbeeld KUBUNTU) en kopieer de gegenereerde *. CDF gegevensbestanden (stap 4.4) van het draagbare apparaat voor gegevensopslag op de lokale vaste schijf. MetaboliteDetector is geschikt voor de ruwe gegevens van de GC-MS in centroid of profiel netCDF-indeling importeren. De software van de meeste GC-MS instrumenten moet zitten kundig voor de opgenomen raw gegevens omzetten in dit formaat19. Voordat u begint de data-analyse, is het sterk aanbevolen om te lezen van de literatuur beschikbaar voor eerdere versies van de software van de MetaboliteDetector vertrouwd te raken met de functies en de grafische user interface19,25, 26.

Voor het kalibreren van de RI en RI waarde nacalculatie van de samengestelde pieken aanwezig in het monster extracten, wordt een bibliotheek met RIs en spectra van RI-kalibranten (hier, n-alkanen) gebruikt. Een dergelijke bibliotheek kan zelf gevestigde, of een bestaande ('CalibrationLibrary_Alkanes') kunnen gedownloade27. De meegeleverde standaard kalibrant bibliotheek bevat RIs en spectra voor n-alkanen variërend van C09 tot C39 die hebben geanalyseerd zoals beschreven in sectie 4. De meegeleverde bibliotheek kan gebruikers werken met metaboliet Detector om direct te starten met het kalibratieproces van hun gegevens. Indien nodig, kan deze bibliotheek ook worden uitgebreid met extra posten voor verdere alkanen. Gebaseerd op de gelijkenis van de verwijzing en experimenteel afgeleide RIs en massaspectra (zie stap 5.3 en substappen, Figuur 7, Figuur 8, Figuur 9), annotatie of identificatie van de stoffen kan worden uitgevoerd (stap 5.4 en substappen, Figuur 11). Het is ook cruciaal dat na geautomatiseerde verwerking van gegevens met MetaboliteDetector, de gebruiker handmatig voor juiste piek picking en spectrum deconvolutie controleren zal door inspectie van massaspectra ten grondslag liggen aan de "driehoek" voor elke vermeende verbinding van belang. Bovendien, afhankelijk van de GC-MS-instrumentatie en de parameterinstellingen gebruikt voor gegevens generatie, aanpassingen van de gepresenteerde MetaboliteDetector instellingen kunnen noodzakelijk zijn. De MetaboliteDetector-software is in staat bewerkingen veel nuttiger dan uitgelegd in dit manuscript, bijvoorbeeld de weergave van uitgepakte ion huidige (EIC) chromatogrammen, export van chromatogrammen als .csv, automatische batch-kwantificering van verbindingen, en nog veel meer.

Het protocol gepresenteerd in dit manuscript kan dienen als suggestie voor experimenten uitgevoerd door andere onderzoekers zich te concentreren op isolatie van klieren of klier inhoud van insecten, volatilome analyse, evenals metaboliet identificatie.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Financiering voor deze studie werd verkregen door de Wenen wetenschap en technologie Fonds (WWTF) LS13-048 bij RBD. Speciale dank gaat naar Diane W. Davidson (Universiteit van Utah; nu gepensioneerd) voor haar kennis over de Bornean COCY mieren met ons te delen. Wij waarderen de administraties van de Kuala Belalong veld Studies Center (KBFSC) en Universiti Brunei Darussalam (UBD) voor goedkeuring van projecten evenals van Brunei Forestry Department en Brunei van onderzoek en innovatiecentrum om toestemming voor het verzamelen van mieren en goedkeuring en uitvoervergunningen. Speciale dank gaat naar UBD en KBFSC personeel, met name Muhammad Salleh bin Abdullah Bat, Teddy Chua Wee Li, Masnah Mirasan, Rafhiah Kahar, Roshanizah Rosli, Rodzay Wahab, Chan Kin Mei en Kushan Tennakoon voor het vergemakkelijken van ons onderzoek.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tube 50 ml, 115 x 28 mm, flat/conical base PP Sarstedt 62,559,001 see Figure 1 in manuscript
PVC Tubings Rehau 290 4489 see Figure 1 in manuscript
Mesh, stainless steel, 0.63 mm mesh size Antstore 1000378 see Figure 1 in manuscript
Freezer Severin KS 9890  -20 °C or lower
polystyrene foam box, inner dimensions 155 mm x 100 mm x 45 mm Thorsten Koch 4260308590481
Petri dish, glass, 100 mm x 15 mm Aldrich BR455742
Cold pack 150 mm x 100 mm Elite Bags 1998 freeze to -20 °C
Bucket with crushed ice
1.5 mL Short Thread Vials, 32 x 11.6 mm, clear glass, 1st hydrolytic class, wide opening La-Pha-Pack 11090500
Screw caps for 1.5 mL Short Thread Vials, closed, Silicon white/PTFE red septum, 55° shore A, 1.0 mm La-Pha-Pack 9151799
Stereomicroscope Bresser 5806100
Forceps, Superfine Tip curved Medizinische Instrumente May, Norman May PI-0005B
Forceps, Superfine Tip straight blueINOX BL-3408
Dissection needle 140 mm, pointed, straight Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH 1110301
Methanol, LC-MS CHROMASOLV, Honeywell Riedel-de Haën fisher scientific 15654740
Distilled water
Rotizell-Tissue-Tücher Carl Roth GmbH + Co.KG 0087.2
Acetic acid ethyl ester ROTISOLV ≥99,8 % Carl Roth GmbH + Co.KG 4442.1 freeze to -20 °C
Vortex Genie 2 neoLab 7-0092
0.1 mL micro-inserts for 1.5 mL Short Thread Vials, 31 x 6 mm, clear glass, 1st hydrolytic class, 15 mm tip  La-Pha-Pack 06090357
Screw caps for 1.5 mL Short Thread Vials, with hole, RedRubber/PTFE septum,  45° shore A, 1.0 mm La-Pha-Pack 9151819
Alkane standard solution C8-C20 Sigma-Aldrich  04070
Alkane standard solution C21-C40 Sigma-Aldrich  04071
n-Hexane SupraSolv Merck 104371
GC-autosampler, e.g. MPS2XL-Twister Gerstel
Agilent Gas chromatograph 6890 N Agilent
Gooseneck splitless Liner Restek 22406
Helium (5.0 - F50) Messer 102532501
GC capillary column HP-5MS UI 30 m × 0.25 mm ×0.25 µm Agilent 19091S-433UI
Agilent Mass Selective Detector 5975B Agilent
MSD ChemStation Data Analysis Application software  Agilent
MetaboliteDetector software (3.1.Lisa20170127Ra-Linux) Hiller K download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10
Calibration Library for MetaboliteDetector Hiller K download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10
MD Conversion Tool for NIST-library Hiller K download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Morgan, E. D. Chemical sorcery for sociality: exocrine secretions of ants (Hymenoptera: Formicidae). Myrmecol News. 11, 79-90 (2008).
  2. Betz, O. Biological adhesive systems. , Springer. 111-152 (2010).
  3. Laciny, A., Zettel, H., Druzhinina, I. Workers, soldiers, and gynes-morphometric characterization and description of the female castes of Camponotus singularis (Smith, 1858)(Hymenoptera, Formicidae). Deutsche Entomologische Zeitschrift. 63, 183 (2016).
  4. Ward, P. S., Blaimer, B. B., Fisher, B. L. A revised phylogenetic classification of the ant subfamily Formicinae (Hymenoptera: Formicidae), with resurrection of the genera Colobopsis and Dinomyrmex. Zootaxa. 4072 (3), 343-357 (2016).
  5. Davidson, D. W., Salim, K. A., Billen, J. Histology of structures used in territorial combat by Borneo's 'exploding ants'. Acta Zoologica. 93 (4), 487-491 (2012).
  6. Davidson, D., et al. An experimental study of microbial nest associates of Borneo's exploding ants (Camponotus [Colobopsis] species). Journal of Hymenoptera Research. 18 (2), 341-360 (2009).
  7. Laciny, A., et al. Colobopsis explodens sp.n., model species for studies on "exploding ants" (Hymenoptera, Formicidae), with biological notes and first illustrations of males of the Colobopsis cylindrica group. ZooKeys. , (2018).
  8. Maschwitz, U., Maschwitz, E. Platzende Arbeiterinnen: eine neue Art der Feindabwehr bei sozialen Hautflüglern. Oecologia. 14 (3), 289-294 (1974).
  9. Davidson, D. W., Lessard, J. P., Bernau, C. R., Cook, S. C. The tropical ant mosaic in a primary Bornean rain forest. Biotropica. 39 (4), 468-475 (2007).
  10. Martin, S., Drijfhout, F. A review of ant cuticular hydrocarbons. Journal of chemical ecology. 35 (10), 1151 (2009).
  11. Pickett, J. Chromatography and isolation of insect hormones and pheromones. , Springer. 299-309 (1990).
  12. Tragust, S., et al. Ants disinfect fungus-exposed brood by oral uptake and spread of their poison. Current Biology. 23 (1), 76-82 (2013).
  13. Menzel, F., Blüthgen, N., Schmitt, T. Tropical parabiotic ants: highly unusual cuticular substances and low interspecific discrimination. Frontiers in Zoology. 5 (1), 16 (2008).
  14. Hogan, C. T., Jones, T. H., Zhukova, M., Sosa-Calvo, J., Adams, R. M. Novel mandibular gland volatiles from Apterostigma ants. Biochemical Systematics and Ecology. 72, 56-62 (2017).
  15. Augusto, F., Valente, A. L. P. Applications of solid-phase microextraction to chemical analysis of live biological samples. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 21 (6), 428-438 (2002).
  16. Davidson, D. W., et al. Nutrition of Borneo's 'exploding' ants (Hymenoptera: Formicidae: Colobopsis): a preliminary assessment. Biotropica. 48 (4), 518-527 (2016).
  17. Jones, T., et al. The chemistry of exploding ants, Camponotus spp.(cylindricus complex). Journal of chemical ecology. 30 (8), 1479-1492 (2004).
  18. Voegtle, H. L., Jones, T. H., Davidson, D. W., Snelling, R. R. E-2-ethylhexenal, E-2-ethyl-2-hexenol, mellein, and 4-hydroxymellein in Camponotus species from Brunei. Journal of chemical ecology. 34 (2), 215-219 (2008).
  19. Hiller, K., et al. MetaboliteDetector: comprehensive analysis tool for targeted and nontargeted GC/MS based metabolome analysis. Analytical chemistry. 81 (9), 3429-3439 (2009).
  20. Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis. Metabolomics. 3 (3), 211-221 (2007).
  21. Stein, S. Retention indices by NIST mass Spec data Center. NIST Chemistry Webbook, NIST Standard Reference Base. (69), (2010).
  22. NIST Chemistry WebBook. NIST Standard Reference Database Number 69. , Available from: http://webbook.nist.gov/chemistry/ (2018).
  23. Cook, S. C., Davidson, D. W. Nutritional and functional biology of exudate-feeding ants. Entomologia Experimentalis et Applicata. 118 (1), 1-10 (2006).
  24. Abdalla, F. C., Cruz-Landim, C. d Dufour glands in the hymenopterans (Apidae, Formicidae, Vespidae): a review. Revista Brasileira de Biologia. 61 (1), 95-106 (2001).
  25. Hiller, K. MetaboliteDetector. Documentation. , Available from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/wiki/index.php/Documentation (2010).
  26. Nieke, C. MetaboliteDetector - Development Version. , Available from: http://md.tu-bs.de/system/files/Downloads/MD-Development-Version-Documentation.pdf (2012).
  27. Hiller, K., Koschnitzki, N. MetaboliteDetector. Download. , Available from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 (2017).

Tags

Milieuwetenschappen kwestie 138 tropische mieren Colobopsis bloedgras groep Colobopsis explodens mandibulaire klier dissectie extractie gaschromatografie-massaspectrometrie metabolomica volatilome MetaboliteDetector
Isolatie van de mandibulaire klier Reservoir inhoud van Borneose ' exploderende mieren (<em>Formicidae</em>) voor Volatilome analyse door GC-MS en MetaboliteDetector
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hoenigsberger, M., Kopchinskiy, A.… More

Hoenigsberger, M., Kopchinskiy, A. G., Parich, A., Hiller, K., Laciny, A., Zettel, H., Lim, L. B. L., Salim, K. A., Druzhinina, I. S., Schuhmacher, R. Isolation of Mandibular Gland Reservoir Contents from Bornean 'Exploding Ants' (Formicidae) for Volatilome Analysis by GC-MS and MetaboliteDetector. J. Vis. Exp. (138), e57652, doi:10.3791/57652 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter