Summary
Mindre arbejdere af myre arter Colobopsis explodens er dissekeret for at isolere den voks-lignende indhold lagret i deres hypertrofisk mandibular kirtel reservoirer for efterfølgende opløsningsmidler-udvinding og analyse ved gaskromatografi-massespektrometri. Annotation og identifikation af flygtige bestanddele ved hjælp af open source software MetaboliteDetector er også beskrevet.
Abstract
Formålet med dette manuskript er at præsentere en protokol, der beskriver metabolomic analysen af Bornean 'eksploderende myrer' tilhører gruppen Colobopsis cylindrica (COCY). Til dette formål er model art C. explodens brugt. Myrer tilhører den mindre arbejdstager kaste besidder særprægede hypertrofisk mandibular kirtler (MGs). I territoriale kamp bruger de de tyktflydende indholdet af deres udvidede mandibular kirtel reservoirer (MGRs) til at dræbe rivaliserende leddyr i karakteristiske selvmorderisk 'eksplosioner' af frivillige Bristning af den gastral integument (autothysis). Vi viser dissektion af arbejdstager myrer af denne art til isolering af den gastral del af voks-lignende MGR indholdet samt liste over de nødvendige skridt, der kræves for opløsningsmidler-udvinding af de deri indeholdte flygtige forbindelser med efterfølgende gas kromatografi-massespektrometri (GC-MS) analyse og formodede identifikation af metabolitter indeholdt i uddrag. Dissektion procedure er udført under kølet betingelser og uden brug af enhver dissektion bufferopløsning til at minimere ændringerne i den kemiske sammensætning af MGR indholdet. Efter opløsningsmiddel-baseret udvinding af flygtige metabolitter deri, præsenteres de nødvendige skridt til at analysere prøver via væske-injektion-GC-MS. Endelig, databehandling og formodede metabolit identifikation med brugen af open source-software MetaboliteDetector er vist. Med denne tilgang, profilering og identifikation af flygtige metabolitter i MGRs af myrer tilhører COCY gruppe via GC-MS og MetaboliteDetector softwaren blive muligt.
Introduction
Det overordnede mål for arbejdsprocessen præsenteres her er den generelle undersøgelse af kemiske sammensætninger i sekreter af insekter. Dette gøres med det primære formål at belyse de økologiske roller af sekretion som helhed, eller enkelt forbindelser deraf. Derudover er vi interesseret i at undersøge de metabolske processer underliggende forbindelser findes i de respektive sekreter. Især kirtel indholdet fra myrer (Hymenoptera, Formicidae) har vundet stigende interesse i de seneste år, fordi de giver kilder hidtil uudforskede potentielt bioaktive stoffer (lim, antimikrobielle stoffer, osv.),1, 2. mindre arbejdstager myrer i nogle arter der hører til COCY gruppe3,4 kan fastsætte sådanne forbindelser, der findes i deres hypertrofisk MGRs, som strækker sig fra mouthparts at gaster5,6. Når truet af formodede fjender, mindre arbejdstagere af C. explodens7 og nogle relaterede arter kan gøre brug af deres MGR indhold på en usædvanlig måde: de ofrer sig af brud deres gastral mur hen til udsende det klistrede indholdet af den MGRs eksplosivt på modstanderen, dø hvorefter de formodede fjende er tilbageholdt og kan endda5,6,8,9. Formålet med udviklingen og anvendelsen af de heri præsenteres metoder var at hjælpe med at forbedre forståelsen af den kemiske sammensætning og art af forsøgsvis giftige bestanddele af denne myre sekretion.
Med henblik herpå præsenterer vi en protokol til dissektion af C. explodens arbejdstager myrer til at opnå den gastral del af deres voks-lignende MGR indholdet med efterfølgende opløsningsmidler-udvinding og analyse af GC-MS.
GC-MS analyse er en af de veletablerede metoder til profilering og identifikation af flygtige metabolitter (volatilome) fra insekter. Typiske analysander interesse for myrer omfatter cuticular kulbrinter10, semiochemicals11, og i almindelighed, forbindelser med biologisk aktivitet12. Prøver kan opnås fra hele dyr eller dele af kroppen og væsker isoleret via dissektion af insekt13,14. Prøven forberedelse teknikker omfatter udvinding af de deri indeholdte metabolitter med brugen af opløsningsmidler14 eller headspace-solid-fase-microextraction (HS-SPME)15.
Metabolomic undersøgelser er det afgørende, at prøverne er frosset hurtigt direkte efter prøvetagning, for at minimere ændringer i kemisk sammensætning og mængde af forbindelser. Myrerne anvendes til denne undersøgelse blev dræbt af Hurtig nedfrysning på stedet i en cool taske fyldt med frosset kolde pakninger. Prøverne blev derefter lagret i en-20 ° C fryser ved hjælp af generator-drevet elektricitet, før de transporteres til laboratoriet på tøris. Dissektion proceduren præsenteres her tilbyder muligheden for at isolere MGR indholdet uden at analysere hele Myren eller gaster som helhed, som det er sket inden for forskellige COCY arter16,17,18. Derudover muliggør præsenteres protokollen også direkte adgang og analyse af de omkringliggende kirtler og væv, som venom kirtel (VG)5,8, den Dufour kirtel (GD)8eller tarmene i andre biologiske undersøgelser, eller at kontrollere for eventuelle cross-forureninger indført under håndtering eller dissektion af myrer. For at minimere ændringerne i den kemiske sammensætning af MGR indholdet under dissektion, enten af optøningen prøver eller ved hjælp af kemikalier, var dissektion processen optimeret til at blive gennemført på en kold pack (-20 ° C), uden brug af enhver yderligere buffere, vask løsninger, eller opløsningsmidler. De prøver via denne metode er velegnet til besvarelse af kvalitative og kvantitative spørgsmål.
Dataanalyse formodede metabolit annotation og identifikation sker via open source-software MetaboliteDetector19, som blev udviklet til automatisk analyse af GC-MS-baseret metabolomics data. Det registrerer enkelt ion toppe i kromatogrammer, udfører et deconvolution skridt, og uddrag de deconvoluted massespektre af kemiske forbindelser, der findes i de analyserede prøver. Formodede identifikation af forbindelser med MetaboliteDetector er baseret på beslutsom fastholdelse indeks (RI; Kovats RI kan beregnes automatisk af softwaren) og ligheden mellem de deconvoluted massespektre. RI og spektral match faktor kan krydscheckes imod enten eksisterende reference-biblioteker, (der kan importeres, hvis de er i formatet fælles NIST), eller mod en etableret in-house bibliotek. Dette er i overensstemmelse med retningslinjerne for (formodede) sammensatte identifikation foreslog, fxaf den kemiske analyse arbejder gruppe (CAWG) af Metabolomics standarder initiativ (MSI), hvor mindst to uafhængige og ortogonale data i forhold til et autentisk stof (her fastholdelse tid (RT) /RI og masse spektrum) analyseret identiske forsøgsbetingelser er foreslået som nødvendigt at bekræfte ikke-roman metabolit identifikationer20.
Det komplette eksperiment er gennemført på MGR indholdet af COCY model art C. explodens, men trinene dissektion kan også tilpasses isolere andre kirtler i ant gaster. Desuden, mens vi præsentere en protokol for den omfattende analyse af volatilome af MGR indhold, de mere generisk dele af arbejdsprocessen beskriver udvinding, GC-MS måling og data evaluering kan også bruges til analyse og (formodede) identifikation af flygtige metabolitter i almindelighed.
Da de eksperimenter, der er beskrevet i dette håndskrift er udført på insekter, er ingen etiske godkendelse påkrævet. Feltarbejde, prøveudtagning af myrer, samt deres anvendelse til offentliggørelse er i overensstemmelse med de retningslinjer, der regulerer dette projekt gennem Universiti Brunei Darussalam, Bruneis forskning og Innovation Centre og Brunei Forestry Department, Brunei Darussalam.
Protocol
1. samling af myrer
- Indsamle mindre arbejdstager myrer med brug af en betjent sug (figur 1).
- Straks efter prøvetagning, fix myrerne ved hurtig nedfrysning ved-20 ° C og gemme dem på denne eller en lavere temperatur indtil analyse.
2. isolering af MGR indholdet og GD fra myrer
- Før dissektion af myrer, forberede følgende:
- Rene glas petriskål og dissektion instrumenter ved hjælp af en methanol-vand-blanding (MeOH/H2O; 1 + 1 v/v) og væv.
Forsigtig: MeOH er giftige for mennesker. Altid bære passende handsker, en lab coat og beskyttelsesbriller, og udføre rengøring under et stinkskab. - Fryse den kolde pack og glas petriskål til-20 ° C.
- Fastsættelse af 1,5 mL kort tråd hætteglas herunder skruelåg med silikone/polytetrafluorethylen (PTFE) septa masse og holde dem på is direkte ved siden af mikroskopet.
Bemærk: Valget af prøven hætteglasset er valgfri. Her, sættes MGR indholdet direkte i afkølede 1,5 mL hætteglas af glas. Plast kan indeholde stoffer (f.eks. phthalater), der kan forårsage artefakter, som forstyrrer signalerne fra target metabolitter. - Sted den frosne kolde pakkes i en kasse lavet af ekstruderet polystyrenskum. Placer petriskål ovenpå den kolde pack og sætte en frossen ant i skålen. Montere boksen under et stereo mikroskop. Justere forstørrelse (20 – 40 X) og fokus, indtil hele Myren kan ses tydeligt.
- Rene glas petriskål og dissektion instrumenter ved hjælp af en methanol-vand-blanding (MeOH/H2O; 1 + 1 v/v) og væv.
- Tjek den frosne ant for integriteten af sin gastral rum. Dissektion, tag kun myrer med en intakt gaster region (figur 2A, B). Udelukke myrer med flad gasters eller spor af hærdet MGR indhold på deres krop overflader fra yderligere analyse (figur 2 c, D).
- Grab den valgte ant med et par fine-tippet pincet på propodeum (første abdominal segment) og med de andre par pincet på stilk (andet abdominal segment). Frigør regionen gaster ved forsigtigt at trække det væk fra resten af ant krop (figur 3A).
- Fix nu adskilt ant gaster ved at holde det med bøde-tippet pincet på tergite 4. Med et andet par af fine spids pincet grab tergite 1 (beliggende ved siden af stilk) og forsigtigt fjerne det ved at skrælle det ud (figur 3B). Gentag dette også for tergites 2 og 3 (figur 3 c, D) indtil den gastral del af MGRs (gul farvet i C. explodens arbejdstager myrer, men farven på MG indhold kan variere fra hvid over gul til rød i andre arter) er synlige for mest del.
Bemærk: Ved at fjerne exoskeleton, membranen af MGR også delvis fjernes. - Ved brug af en dissektion nål forsigtigt fjerne voks-lignende indhold af de parrede MGRs ved at skrabe dem ud af den gastral rum (figur 3). Kun fjerne dele af MGR indhold, der kan isoleres uden brud andre kirtler i ant gaster. Hvis flere kraft eller indsats skal anvendes for at få MGR indhold som helhed, acceptere dens ufuldstændig fjernelse (figur 4).
- Afhente MGR indholdet ved forsigtigt at røre dem med spidsen af dissektion nålen indtil de holde på den. Derefter overføre MGR indholdet i et afkølet 1,5 kort tråd hætteglas med kendte Tara-massen.
- For at fjerne de klæbrige MGR indholdet fra spidsen af dissektion nålen, Flyt needle-tip til væg af prøven hætteglasset og smøre dem på væggen. Luk hætteglasset og placere den på is, indtil næste MGR indholdet er isoleret.
- Du kan senere kontrollere mulig krydskontaminering af MGR indhold prøven af forbindelser med oprindelse fra det tilstødende GD (afsnit 6), også indsamle generaldirektorater fra myrer, hvor de er stadig intakt (figur 4) og læg dem i et separat HPLC hætteglas.
- Rengør altid petriskål og dissektion instrumenter med MeOH/H2O (1 + 1 v/v), når du skifter fra kirtel til kirtel eller fra ant til ant.
- For en analyseprøve, kombinere reservoir indholdet eller kirtler af flere myrer.
Bemærk: Antallet af kirtler eller deres indhold til en analyseprøve kan variere afhængigt af eksperimentdesign. Her, var enten MGR indholdet eller generaldirektorater af fem myrer samlet for at opnå en analyseprøve.
3. opløsningsmidler-udvinding af isolerede kirtel indhold
- Bestemme massen af de analytiske prøver (her, MGR indholdet eller tilstødende kirtler samles fra fem myrer).
- Tilføje iskold høj renhed ethylacetat (EtOAc) i et konstant forhold på 1:14 w/v og vortex prøver for 5 min afkølede betingelser; her udføres ved 7 ° C i et laboratorium, der kan termostateres.
- Centrifugeres prøver i 10 min på 3,820 x g ved 7 ° C og overføre supernatanter (ca 55-75 µL til MGR indhold uddrag fra fem myrer) i pre afkølede 1,5 mL kort tråd hætteglas indeholdende 0,1 mL micro-skær. Stramt at forsegle hætteglassene med skruelåg indeholdende huller og røde gummi/PTFE septa.
Bemærk: Hvis analyse ikke kan gennemføres umiddelbart, holde ekstraktet ved-80 ° C indtil analyse, men det anbefales at analysere prøver straks efter forberedelse til at minimere risikoen for kemiske ændringer under frysning/optøning cyklus.
4. GC-MS
- For en komplet GC-MS måling sekvens, forberede de følgende løsninger, hver i en 1,5 mL kort tråd hætteglas:
- Forbered en RI-kalibratoren blanding ved at fortynde de kommercielt tilgængelige Alkan standard løsninger til en endelig koncentration på 8 mg/L per sammensatte med hexan.
- Forberede en opløsningsmiddel-Tom bestående af ren EtOAc.
- Sted hætteglas indeholdende 1) Solvent-blank, 2) RI-kalibratoren blanding, 3) MGR indhold ekstrakt, og 4) GD indhold ekstrakt i den afkølede bakke (10 ° C) af autosampler koblet til gaskromatograf (GC).
Bemærk: Det anbefales at minimere tidsrummet hvert hætteglas er holdt i autosampler før måling. Vigtige eksempler, ligesom eksemplet MGR indhold kan hætteglasset anbringes i autosampler umiddelbart før analyse. - For hver prøve, indsprøjtes en alikvot 1 µL i GC-MS kromatografiske adskillelse på en kolonne, der er egnet til target forbindelser (her: HP - 5MS UI kolonne).
- Angive de relevante parametre, GC, der kan se ud som følger:
- Bruge helium som bæregas og angive en konstant kolonne flow af 1 mL/min. Sæt en ovn temperatur rampe startende fra 40 ° C med et hold for 2 min, efterfulgt af en rampe på 10 ° C/min. op til 330 ° C, med et hold af 7 min. sæt indgangstemperatur holdes til 270 ° C.
- Vælge, og hvis det er nødvendigt, justere split nøgletal for GC-MS injektion, der resulterer i tilstrækkelig peak figurer og intensiteter for forbindelser af interesse (figur 5).
Bemærk: I eksemplet præsenteres det var nødvendigt at måle GD ekstrakt på en split forholdet 2:1 og RI-kalibratoren blandingen i splitless tilstand. MGR indhold ekstrakt blev analyseret på en split forholdet 2:1 og en anden gang på 50: 1. - Indstil hjælpeansatte temperaturen til 350 ° C.
- Angiv parametrene for masse-spectrometer (MS) som følger: MS source temperatur 230 ° C, MS Quad temperatur 150 ° C, scan spænder fra lav masse 30-højmesse 500, opløsningsmiddel forsinke 4.1 min (for opløsningsmiddel-blank og eksperimentelle prøver) eller 6.1 min (til RI-kalibratoren blanding) , henholdsvis. Indstille søgehastigheden til ca 3 scanninger/s.
Bemærk: MS parametre, specielt den MS scan-, samplingfrekvens, og cyklustid kan påvirke peak plukning og spektrum deconvolution og skal tages i betragtning ved valg af parameterindstillinger for ordentlig datavurdering med MetaboliteDetector software.
- Angive de relevante parametre, GC, der kan se ud som følger:
- Når målingen er afsluttet, skal du eksportere dataene som. AIA projekt fil (udføres her med brug af data analyse software leveres med GC) på en bærbar data opbevaring indretning.
- Vælg fil | Eksportere data til AIA format..., derefter kontrollere Opret ny mappe og klik på OK. Vælg den ønskede opbevaring placering (f.eks., USB-flashdrev) og klik på Åbn. Vælg filerne, der eksporteres, og tryk på ikonet ---> . Bekræfte med at klikke på processen.
5. metabolit påvisnings- og identifikationsmetode med anvendelse af MetaboliteDetector Software
- Før du starter en analyse af datafilerne, åbne MetaboliteDetector, Vælg værktøjer | Indstillinger for, og angive de nødvendige parametre som følger (enkelte plader af MetaboliteDetector er angivet med fed skrift):
- I arket udseende, indstille tidsskalaen til Min og aktivere indstillingen for akser etiketter.
- I arket Deconvolution, indstille parametre for Peak indstillinger til: Peak tærskel: 10 og Minimum tophøjde (støj enheder): 10. Uncheck aktivering af baseline justering. Angiv parametre for metabolitten påvisning at: placeringer/Scan: 10, Deconvolution bredde (scanninger): 5, krævede intensitet (% af basistoppen): 0, og krævede antal toppe: 10.
- I arket identifikation, angiver indstillingen bibliotek søgning: sammensatte Lib: 'CalibrationLibrary_Alkanes' og NIST (NIST sqlite bibliotek kan indgå i .lbr-format). Indstille parametre som følger: Max. RI forskel: 10, Cutoff score: 0,9, Pure/Impure sammensætning: 0,5, antal fragmenter: 2, Minimum antallet af identiske frag.: 1. Brug skaleret lib: kryds; Ligheden Score: Spec. lighed; Masse filter: m/z 207, 221, 281, 355 og 1147 (for kendte forurenende stoffer som følge af den stationære fase af GC-kolonne).
- I arket kvantificering indstille parametre: antallet af kvantificering ioner: 3, Minimal afstand mellem efterfølgende ioner: 5 og Minimal kræves kvalitetsindeks: 1. udelukke kvantificering ioner 207, 221, 281, 355 og 1147.
Bemærk: I tilfælde af høj opløsning MS data, desuden angive følgende parametre i arket barycentrum til: Peak tærskel begynde: 10, Peak tærskel ende: -5, og maksimal baseline afstand: 30, FWHM: 0,5.
- Importere filer i den. CDF-format i den genererede. AIA projektfilen som. NetCDF ind i MetaboliteDetector software ved at vælge fil | Import | NetCDF import. Vælg ikonet mappe-formet, og vælg derefter filer for eksempel kategorier der importeres og behandles: 1) Solvent-blank, 2) RI calibrants, 3) MGR indhold ekstrakt og 4) GD indhold ekstrakt. Bekræft med OK for at starte databehandling. Efter forarbejdning, vælge Luk i vinduet vises.
- For RI kalibrering og bestemmelse af RI værdier for forbindelser, der findes i MGR ekstrakt, Vælg fil | Åbn og vælg den fil, der indeholder data af RI calibrants.
- Efter at RI-kalibratoren filen er åbnet, Vælg ikonet for Forstørrelsesglas . Bekræfte vises vinduet med OK.
- For korrekt RI kalibrering, tjekke vifte af påviselige alkaner i RI-kalibratoren fil.
- Med henblik herpå, skal du vælge trekanten vises nedenunder det første bjerg, stammer fra den første Alkan (med den laveste RT, figur 6) kan påvises ved at klikke en gang på det maksimalt.
- Kontrollere hit med den højeste spektrum lighed ('Spec. sim.', max score = 1) i forhold til Alkan bibliotek poster (figur 6).
- For at verificere identiteten af den foreslåede Alkan sammensatte, sammenligne dets masse spektrum til masse spektrum i litteratur, fx NIST kemi WebBook22.
- Bestemme den sidste Alkan påvises i RI-kalibratoren blanding ved at tælle til sidste Alkan top i kromatogrammet.
- For RI kalibrering, Vælg værktøjer | RI-Calibration Wizard. Klik på næste.
- Klik på ikonet mappe-formet og vælg den fil, der indeholder kromatogrammet af RI-kalibratoren blanding. Klik på næste.
- Vælg det bibliotek, der indeholder poster for Alkan calibrants i vinduet syntes.
- Vælg bibliotek poster af alle alkaner påviselige i RI-kalibratoren fil og klik på den >> ikon. Når du har valgt >>, vælge næste.
- Kontrollere RTs anført for hver påviselige Alkan i tabellen vises. Med henblik herpå, kontrollere RTs afbildet i hovedvinduet for hver Alkan ved at klikke på de respektive trekant (figur 7). Hvis nødvendigt (figur 8), rette RT i tabellen kalibrering manuelt ved at dobbeltklikke i det respektive felt, skrive at vælge drop-down menuen, og vælge den korrekte foreslog RT. Alternativt, i RT ved hjælp af tastaturet ( Figur 9).
- Når RT for hver Alkan er korrekte, klik på næste. Klik på næste i vinduet vises viser tabellen RI kalibrering.
- Vælg green + symbol i vinduet vises Kromatogrammet udvalg , Vælg datafil, der bruges af opløsningsmiddel-blank og filer af kirtel ekstrakter, og vælg næste. Indstille parameterindstillingerne i vinduet vises som følger: deaktivering af baseline justering, Peak tærskel: 5, Minimal tophøjde: 5, placeringer/Scan: 10 og Deconvolution bredde: 5. ramte næste og derefter begynde at udføre RI beregning af de forbindelser, der findes i de valgte eksempelfiler.
- Annotation og identifikation af de valgte metabolitter i MGR ekstrakt, åbne datafilen af den målte MGR indhold ekstrakt, som RIs har været beregnet som beskrevet ovenfor (trin 5.3.9), ved at vælge fil | Åben og vælge den ønskede datafil.
- Vælg værktøjer | Indstillingerne | Deconvolution og ændre den maksimale tærskel samt Minimum peak højde (støj enheder) begge til 5. Vælg ikonet for Forstørrelsesglas og bekræfte advarselsvinduet vises igen med OK.
- Klik på en trekant, vises nedenunder maksimalt i et toppunkt på interesse og sammenligne dets masse spektrum med dem gemt i NIST-biblioteket ved at vælge ikonet NIST .
- Vælg den første resulterende hit af NIST-søgning (figur 10).
- Hvis den resulterende spektrum lighed i sammensat af interesse er over den valgte spektrum lighed score (her ≥ 0,9) sammenlignet med en NIST-entry (figur 10), slå op RI (for lignende stationære fase af GC-kolonne, filmtykkelse og kolonne diameter) givet for dette stof i litteratur (fx NIST kemi WebBook22).
- Beregne den relative forskel mellem NIST reference RI (eller de gennemsnit RIs når flere RI værdierne er angivet) og den eksperimentelt afledte RI. Hvis forskellen er lig eller mindre end den brugerangivne tolereret maksimumværdi (her, ≤ ± 1%), udpeger sammensat som annoteret «.»
- Gentag trin 5.4.2–5.4.5 for alle forbindelser af interesse i eksempelfilen MGR.
- For sammensatte identifikation, sammenligne RI og massespektre af standardopløsninger (f.eks. 2 – 100 mg/L) målt på samme betingelser som beskrevet i punkt 4 til dem af de kommenterede forbindelser.
- Analysere standarden, som forklaret i afsnit 4 og behandle de resulterende data som beskrevet for Alkan- og MGR indhold kirtel data i trin 4.4 og 5.2.
- Kalibrere de data, der er erhvervet fra standarden ved at vælge værktøjer | RI-calibration Wizard | Næste og vælge den samme RI-kalibratoren fil som brugt før. Klik på næste, derefter igen næste og vælg den fil, der indeholder dataene, der erhverves fra standardopløsningen ved at klikke på symbolet for green + . Ramte næste og derefter begynde at beregne RI for den standard sammensatte.
Bemærk: Hvis analysen af standarden ikke kan udføres straks efter prøven analyse, anbefales det at analysere RI calibrants igen og udføre nye RI kalibrering og beregning for standarden. - Åbne den respektive fil nemlig standarden og bekræfte sin identitet ved sammenligning af dets spektrum med NIST-bibliotek, som forklaret i trin 5.4.2.
- Efter bekræftelse af identiteten af standarden, tilføje masse spektrum og RI af standarden sammensatte til hotellets biblioteket. Til dette formål, klik på symbolet for green + og angive det foretrukne navn for posten bibliotek. Bekræft med OK for at tilføje masse spektret og RI af standarden sammensatte til biblioteket. Hvis den nye post ikke kan ses i biblioteket, skal du aktivere knappen Opdater .
Bemærk: Hvis RI kalibrering blev udført, RI bestemmes af MetaboliteDetector vil dukke op i de respektive bibliotek-post. Når du har oprettet posten bibliotek til standarden, identifikation af denne metabolit i MG ekstrakt baseret på en kombination af RI og spectra lighed er muligt. - Åbn filen MGR indhold data igen. Vælg værktøjer | Indstillingerne | Id. Nu, da RI af den standard sammensatte er beregnet og føjet til posten bibliotek, ændre Lighed Score fra Spektrum lighed til Kombineret Score.
- Klik på symbolet for forstørrelsesglasset og vælge trekant under det stof, der har været kommenteret i trin 5.4.5.
- Klik på hit og kontrollere værdien for den samlede lighed score (OSS, forkortet af metabolitten detektor som «Samlede lig. «»), i betragtning af en kombination af spektrum lighed og RI lighed score (Figur 11).
Bemærk: Hvis et hit blev fundet i hotellets biblioteket, vil det blive vist på højre side af hovedvinduet. - Hvis OSS er over den brugerdefinerede tærskel (her ≥ 0,9, også anført af den grønne farve af trekanten), udpege sammensat som «identificeret» (Figur 11).
6. check MGR indhold ekstrakt for forureninger af GD indhold
- Åbn filen kalibreret af GD prøven som RIs af forbindelser allerede er blevet beregnet med MetaboliteDetector (trin 5.3.9).
- For en overlejring af kromatogrammet fremstillet efter måling af MG indhold prøve og DG prøve, Vælg værktøjer | Kromatogrammet overlay og vælge de to respektive filer via ikonet green + . Bekræft med OK.
- For at se overlayet, Vælg arket vises Kromatogrammet Overlay på bunden af vinduet.
- Check for overlapning af forbindelser mellem MGR indhold ekstrakt (figur 12) og GD indhold uddrag og udelukke overlappende forbindelser fra yderligere MGR indholdsanalyse.
Representative Results
En skematisk arbejdsproces notering de eksperimenterende trin til formodede metabolit identifikation i kirtel sekreter af C. explodens er vist i Figur 13. Derudover tilbydes en skematisk oversigt over de vigtigste kropsdele af COCY arbejdstager myrer bruges til præsenteres eksperimentet som supplerende figur S1 A, B. De store skridt fra dissektion af myrerne indtil formodede metabolit identifikation i MGR indhold er illustreret i Supplerende figur S2.
For at isolere MGR indholdet egnet til volatilome analyse, blev en afkølet tilstand opretholdt i hele transport, opbevaring, og også under dissektion proces. Med henblik herpå, var myrer indfryses straks efter deres samling med brug af et insekt indsugningsventil (afsnit 1 og figur 1) på stedet. Efter lagring i 2 dage i en-20 ° C fryser, blev ant prøver transporteret på tøris til Østrig, hvor de straks blev sat på-80 ° C indtil videre analyse. Myrer egnet til at blive valgt til isolation af deres MGR indhold udviser en gaster region, som er rund og intakt (figur 2A) og i bedste fald velassorteret med MGR indhold, som angivet af MGR synlig mellem tergites (figur 2B). Gasters af myrer, som ikke er egnet til videre analyse er vist i figur 2 c, D. De vigtigste trin (trin 2,3-2,6) involveret i isolation processen MGR indholdet fra COCY myrer er illustreret i figur 3. Isolerede MGR indholdet (gul for C. explodens, men farverne kan variere fra hvid til rød i andre arter, der tilhører gruppen COCY) er vist i Figur 14.
Når dissekere myrer til deres MGR indhold, tages pleje til at ikke punktere eller ruptur nogen andre kirtler eller tarmene (trin 2.5). Figur 4 viser en dissekeret ant gaster, der stadig indeholder de to andre, intakt kirtler (GD og VG) efter isolering af MGR indhold. Et eksempel på synlig forurening af indholdet af ant tarmene er vist i Figur 15. Da krydskontaminering med GD indholdet, placeret under MGR, ikke kan undgås fuldstændigt, afbildet en del af protokollen for at analysere disse kirtler til sammenligning af de deraf følgende signaler med signaler fra MGR indhold ekstrakt (afsnit 6). Når dissektion procedure gøres ordentligt, er det muligt at få omkring 0,75-1,2 mg MGR indhold pr ant. Protokollen beskrevet her, var MGR indholdet af fem myrer samlet for at modtage gentagne prøver af 3,9-5.9 mg hver.
Isolerede kirtel reservoir indholdet blev udtrukket med EtOAc (afsnit 3) og analyseres ved GC-MS (afsnit 4). Måling af MG indhold uddraget af C. explodens arbejdstager myrer resulterer i et kromatogram bestående af toppe og massespektre for snesevis af formodede MGR indhold forbindelser (figur 5). De to dominerende metabolitter 1-(2,4,6-trihydroxyphenyl)-ethanone (ID 4) og 5,7-dihydroxy-2-methylchromen-4-one (ID 5) i den MG indhold ekstrakt forårsaget kolonne overbelastning, hvilket er grunden til den samme prøve blev analyseret igen split på et højere forholdet mellem 50: 1 ( Figur 5, inset). Mulig krydskontaminering af MGR indhold af bestanddele af Generaldirektoratet for eksempel ville være synlig som yderligere toppene i GC-MS kromatogrammet udstiller sent RTs, startende fra omkring minut 29 (figur 12). Eksklusive kromatografiske toppe og massespektre af forbindelser også fundet i opløsningsmiddel-blank, oprindelse fra den stationære fase af GC-kolonne, eller indholdet af GD i ant gaster, og efterfølgende behandling med MetaboliteDetector software resulterede i ca. 110 MGR indhold forbindelser med et signal til støj forhold ≥ 10. For senere metabolit annotation og identifikation med MetaboliteDetector software, kromatogrammer blev kalibreret og RI værdier blev bestemt for de målte eksempelfiler (trin 5.3 og underordnede trin, figur 6, figur 7 , Figur 8 , Figur 9). De fundne formodede MGR indhold metabolitter blev kommenteret, baseret på en kombination af spektrum lighed med NIST-bibliotek, som udgjorde en integrerende del af MetaboliteDetector software i eksemplet præsenteres (trin 5.4 og underordnede trin, figur 10 ). Derudover RI værdier fundet i litteraturen med de samme eller tilsvarende stationær fase, filmtykkelse og diameter på kolonnen GC blev anset for sammensatte annotation (trin 5.4.4 og 5.4.5). Efter indstilling strenge kriterier og bekræftelse af RIs og massespektre ved brug af standarder, som forklaret i afsnittet protokol for en standard sammensatte (trin 5.4.7-5.4.15 og Figur 11), var det muligt at bekræfte identiteten af omkring 10 % af de registrerede metabolitter. Da en detaljeret rapport om volatilome af MGR indholdet af C. explodens vil blive offentliggjort andetsteds, den nuværende undersøgelse fokuserer på disse metabolitter, som allerede er beskrevet i en tidligere publikation af Jones et al. 17 (arter heri udpeget som KB02-108; Se også Cook et al. 23). tabel 1 giver en oversigt over disse identificerede stoffer.
Figur 1: skematisk tegning af et insekt indsugningsventil. I et låg, der forsegler et hætteglas eller container, laves to huller, hvor to fleksible rør er sat. Åbningen af et rør (T1), der vender ud mod indre af hætteglasset er forseglet med en mesh fint nok til at blokere insekter. Derudover er huller lavet i røret til at fremme udveksling af luft. Slutningen af tube T2 peger tæt mod insekter, som er suget ind i prøvetagning hætteglas af sugning gennem T1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: intakt versus brudt gaster. (A) intakt gaster egnet til dissektion. (B) intakt gaster næsten helt fyldt med MGR indhold, også egnet til dissektion. (C) og (D) brudt ant gasters med skubbet og hærdet MGR indhold (gul), eventuelt brudt under ruptur af gaster integument under prøvetagningen. Disse myrer er udelukket fra dissektion, udvinding og yderligere analyse. T: tergite. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Major trin involveret i dissektion processen. (A) adskillelse af gaster region fra resten af kroppen, ant. (B) skrælning off exoskeleton: tergite 1, tergite 2 (C), og tergite 3, hvorefter indholdet af de parrede gul farvet MGRs er næsten helt synlige (D). (E) at fjerne den klæbrige MGR indhold ved hjælp af en dissektion nål. T: tergite. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Ant gaster efter isolering af MGR indhold. De to andre kirtler er til stede i gaster (VG: venom kirtel, og GD: Dufours kirtel) kan ses. Efter fjernelse af MGR indhold (venstre-overs, efter isolering kan ses i gult), bør begge rum stadig intakt. Disse kirtler kan analyseres på samme måde som feltet MGR. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: repræsentative samlede ion aktuelle (TIC) kromatogram af MGR indhold ekstrakt. De to mest udbredte GC-MS toppe resulterede i mere symmetrisk formet kromatografiske toppe, når en højere delingsforholdet (50: 1) blev valgt i stedet for den almindelige 2:1 ratio (Se indsatser). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: bestemmelse af første påviselige Alkan i RI-kalibratoren kromatogram. Trekanten under den første Alkan peak peak maksimalt er valgt. Alkan eluerer 6,31 min. og viser den højeste spektrum lighed (her, 'Spec. sim.') til posten bibliotek 'Alkane_C09'. For at bekræfte Alkan identitet, er den masse spektret i forhold til et bibliotek (f.eks. NIST kemi WebBook22). I eksemplet præsenteres identificeres nonan ved dens molekylarionen 128 m/z værdi. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: RI kalibrering ved hjælp af en standard blanding, n-Alkan. RI-kalibratoren datafil er blevet åbnet og funktionen 'RI-kalibrering-guiden' valgt. Den korrekte matchende for retentionstid for RI afbildet i tabellen kalibreringen bør kontrolleres. RT af 6,31 min til alkane_C09 (nonan) vises korrekt i tabellen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: forkert RTs vises i tabellen kalibrering. RTs vises ikke korrekt (enten vist i en forkert RT værdi eller en manglende RT værdi vises som -1). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: manuel korrektion af forkerte RTs i kalibrering tabel. De forkerte værdier kan rettes manuelt ved at indsætte den korrekte RT for de respektive Alkan, som vist her for Alkane_C39. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10: sammenligning af masse spektrum af valgte sammensatte til NIST-bibliotek poster. Efter valg af peak maksimale eluerer på 6.16 min (RI 891) og aktivering af funktionen 'NIST-Søg' (rød cirkel), vises en spektrum lighed på 0,99 for 2-heptanone. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 11: metabolit identifikation i MGR indhold ekstrakt. Den masse spektrum og RI med oprindelse fra den sammensatte eluerer på RI 891 i kromatogrammet af prøven er i forhold til hotellets biblioteket poster indeholdende RIs og spektre af målte standard forbindelser. Hvis 'Samlede lighed Score' (OSS, forkortet i metabolit detektor 'samlede lig."gennemføre masse spektrum og RI) mellem et stof i hotellets biblioteket og et stof i prøven fil er ≥ 0,9, sammensat er udpeget som"identificeret". Her er OSS mellem posten in-house bibliotek af 2-heptanone og de sammensatte eluerer på RI 891 0,96, hvilket resulterer i identifikation af 2-heptanone i MGR indhold uddrag. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 12: overlejring af TIC kromatogrammet sektioner (min 29 til min 35) af GD indhold ekstrakt (rød) og MGR indhold ekstrakt (blå). Peak områder svarende til overlappende (formodede) forbindelser er højere i GD indhold, ekstrakt end indholdsmæssigt MGR ekstrakt; disse forbindelser potentielt stammer fra GD og betragtes derfor som (mindre) forureninger i MGR indhold uddrag. Ved C. explodens MGR indhold ekstrakt, de kromatografiske toppe med oprindelse fra en formodet GD kontaminering kan findes på ca. min. 29, og denne del af kromatogrammet kan udelukkes fra yderligere analyse af MGR indhold. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 13: skematisk workflow fra ant prøver at metabolit anmærkning/identifikation i kirtel reservoir indhold uddrag efter GC-MS analyse. Protokollen præsenteres her forklarer alle eksperimenterende trin starter fra isolation af MGR indholdet via dissektion af ant og GC-MS analyse samt data evaluering (angivet i sort). Som et alternativ kan insekt udskillelsen også genereres og indsamlet i situ (angivet i grå). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 14: isoleret voksagtig MGR indholdet før udvinding. (A) indholdet af de to MGRs holde sammen, men (B) kan også være adskilt efter isolation. I C. explodens, farven på MGR indhold er orange-gullig, men kan variere fra hvid til rød i andre arter af gruppen COCY. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 15: Illustration af en isoleret MGR sekretion cross-forurenet af bestanddele af insekt tarmene (brown). Disse typer af MGR isolater er udelukket fra udvinding og yderligere analyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| ID | Metabolit | Trivielle navn | InCHI streng | Sumformlen | ||||||
| 1 | Heptan-2-one | InChI=1S/C7H14O/c1-3-4-5-6-7 (2) 8/ h3 - 6H 2, 1-2H 3 | C7H14O | |||||||
| 2 | n-Undecane | InChI=1S/C11H24/c1-3-5-7-9-11-10-8-6-4-2/h3-11H2,1-2H3 | C11H24 | |||||||
| 3 | n-Heptadecane | InChI=1S/C17H36/c1-3-5-7-9-11-13-15-17-16-14-12-10-8-6-4-2/h3-17H2,1-2H3 | C17H36 | |||||||
| 4 | 1-(2,4,6-Trihydroxyphenyl)-ethanone | Monoacetylphloroglucinol | InChI = 1S/C8H8O4/c1-4 (9) 8-6 (11) 2-5 (10) 3 - 7 (8) 12/h2-3,10-12H, 1H 3 | C8H8O4 | ||||||
| 5 | 5,7-dihydroxy-2-methylchromen-4-One | Noreugenin | InChI = 1S/C10H8O4/c1-5-2-7 (12) 10-8 (13) 3-6 (11) 4-9 (10) 14-5/h2-4,11, 13H, 1H 3 | C10H8O4 | ||||||
Tabel 1: metabolitter identificeret i EtOAc uddrag af MGR indholdet isoleret fra C. explodens mindre arbejdstager myrer. Udvalgte metabolitter er præsenteret.
Supplerende figur S1. Oversigt over de vigtigste dele af kroppen tilhører COCY myrer (mindre arbejdstagere) præsenteret i dette håndskrift. (A) den MGRs er vist i gul. Deres gastral del bruges til volatilome analyse. (B) den gastral del af MGRs er placeret under tergites 1 til 3. T: tergite. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S2. Skematisk oversigt over præsenteres eksperimentet. De store skridt fra dissektion af Myren indtil formodede identifikation af metabolitter til stede i MGR indhold er illustreret. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Discussion
I dette manuskript præsenterer vi en fuldstændig protokol til at analysere volatilome af det indhold, der findes i de hypertrofisk MGRs af C. explodens mindre arbejdstager myrer. Da myrerne bruges her kan 'eksplodere' og skubbe deres MGR indholdet i en ukontrolleret måde ved berøring med pincet, anbefales det at bruge en 'blød' samling teknik som fastsat af et insekt indsugningsventil (figur 1). For nogle myre arter herunder COCY myrer, kan det være nødvendigt at begrænse det maksimale antal myrer til fem personer pr. 50 mL hætteglas, da ellers selv forgiftning af myrerne (f.eks. ved ophobning af myresyre i headspace) kan forekomme. Til frysning myrer i feltet, kan en cool taske fyldt med frosset kolde pakninger anvendes. Prøverne bør være hurtigt frosset og opbevares i kølet betingelser (fx, -20 ° C, bedst ved-80 ° C), men det anbefales ikke at dræbe og gemme myrer i flydende kvælstof, da øget beskadigelse af deres kirtler er blevet observeret med denne metode.
Metoden præsenteres buffer og opløsningsmiddelfri dissektion er velegnede til at opnå voks-lignende mandibular kirtel reservoir indholdet samt andre kirtler i frosne arbejdstager myrer. Volatilome analyse af MGR indholdet af C. explodenser vigtige aspekter skal betragtes under dissektion kontinuerlig køling af ant (trin 2.1.4) og minimere cross-forureninger af MG prøver med andre kirtel indhold/væsker i ant gaster (trin 2,5, fig. 4og Figur 15). En betydelig brøkdel af de frosne myrer kan være beskadiget, enten fordi myrerne 'eksploderede' ved udtagning eller blev beskadiget under transport på tøris fra prøvetagningsstedet til laboratoriet. Hvis regionen gaster er brudt, er disse myrer ikke egnet til videre analyse (figur 2 c, D). Hvis kun antenner og ben er mangler eller er brudt, kan disse myrer stadig anvendes til udvinding af MGR indholdet og yderligere analyse. Da MGR indholdet af afkølet har C. explodens myrer en voks-lignende konsistens det er ligetil at isolere dem med brug af dissektion nåle (trin 2.5, figur 3og Figur 14). Ekstra pleje skal tages mens håndtering af den klæbrige MGR indhold. Det kan holde til noget, der kommer i fysisk kontakt med det og vil ofte også overholde dissektion pincet, hvilket øger risikoen for kontaminering af andre prøver. Det er nødvendigt at kun røre MGR indhold med dissektion nålen og straks overføre det ind i hætteglas anvendes til ekstraktion (trin 2.5 og 2.6). Endvidere, det anbefales at rengøre dissektion udstyr med en MeOH/H2O blanding, når du skifter mellem myrer eller kirtel-typer (trin 2.8).
Kirtel indholdet af andre myre arter kan være til stede i en flydende tilstand selv under afkøling med kolde pakninger. I dette tilfælde være hele kirtlen herunder membranen kan først isoleret og punkteret bagefter for at hente indholdet. Flydende sekret kan også opnås ved hjælp af fine kapillær pipetter. Med en gennemsnitlig kropslængde på omkring 4-5 mm (uden antenne) hører arbejdstagere af C. explodens til de mindre arter af gruppen COCY. Deres ofte hævede gaster består af ca. 2-2,5 mm i længden og 1-1,5 mm i bredden. Arbejdere i den så langt største kendte arter af gruppen COCY kan nå en størrelse på ca 8 mm i længde med en gaster størrelse på omkring 3 mm i længden og 2,5 mm i bredden. Da protokollen er velegnet til at dissekere og undersøge individuelle myrer og gasters af denne størrelse af forskellige COCY arter, her anvendte dissektion instrumenter og mikroskop eventuelt skal tilpasses for at være gældende for mindre myrer eller mindre organer. Desuden skal antallet af myrer pr. analyseprøve muligvis øges samt.
Mens dissekere ant for MGR indhold, er det vigtigt ikke at beskadige nogen andre kirtler eller tarmene - hvis indhold kan cross-forurene prøve (trin 2.5, figur 4 og Figur 15). I optimal fald holdes efter udvinding af MGR indholdet, DG, samt VG synligt intakt (figur 4). Forureninger med indholdet af det generaldirektorat, som er placeret under MGRs, er svære at undgå helt. Årsager til dette kan også omfatte den delvise afbrydelse af kirtel integritet under transport på tøris fra prøvetagningsstedet til laboratoriet. Det er også muligt at GD'erne blive beskadiget under prøvetagningen eller er ved at eksplodere, som vi har bemærket for MGR i et antal undersøgte myrer. Da GD indholdet kan analyseres på samme måde som MGR indhold (afsnit 3 og 4), kan resultaterne sammenlignes med de resulterende data efter analyse af MGR indhold prøver (afsnit 6). For MGR indhold ekstrakter fremstillet af C. explodens myrer, begynder de forbindelser, der også findes i Generaldirektoratet at eluere sent i kromatogrammet (figur 12). At undgå fejl af GD forbindelser til MGR vælgere, de respektive metabolitter kan udelukkes fra yderligere analyse. Fra undersøgelser på andre myre arter er det kendt, at GD'er kan også indeholde (meget) flygtige forbindelser1,24, som typisk elueres tidligt i GC-kromatogram.
I tidligere undersøgelser beskæftiger sig med den kemiske sammensætning af MGR indholdet af COCY myrer, hele myrer eller deres hele gasters blev analyseret16,17,18,23, mens her MGR indhold selv blev indhentet via dissektion af myrer.
Analysere dissekeret MGR indholdet giver efterforskerne til at udføre en lang række biokemiske undersøgelser, herunder identifikation af metabolitter deri. Da den udførte undersøgelse her fokuseret på identifikation af de flygtige bestanddele i MGR af C. explodens, blev GC-MS valgt for sin analyse (afsnit 4). For dette, bør ekstrakterne ideelt målt umiddelbart efter tilberedning eller opbevares ved-80 ° C indtil analyse. Det skal bemærkes, at (udvidede) opbevaring kan forårsage kemiske ændringer af uddrag (Se noter efter trin 3.3 og 4.2). Da koncentrationen af MGR indholdet kan dække en række flere størrelsesordener, kan det være nødvendigt at analysere MGR uddrag på forskellige GC split nøgletal. Da de to primære forbindelser i MGR indhold uddrag af myrer at eksemplificere protokollen forårsaget kolonne overbelastning når split forholdet 2:1 blev brugt, var denne prøve analyseres en anden gang på et højere delingsforholdet af 50: 1 (trin 4.3.1.2and figur 5). GC-MS parameterindstillingerne præsenteret i afsnit 4 er velegnet til data genereret med GC-MS enheder angivet i Tabel af materialer. Ved siden af RI calibrants (trin 4.1.1), bør en opløsningsmiddel-tom (trin 4.1.2) også analyseres for at anerkende ikke-biologiske artefakter og forurenende stoffer under efterfølgende dataanalyser. For metabolitten identifikation er det også vigtigt at måle autentiske standarder af kommenteret forbindelser de samme GC-MS betingelser som bruges til at analysere prøveekstrakter (trin 5.4.7and følgende). For at forbedre nøjagtigheden og pålideligheden af de endelige data, anbefales det at analysere alle prøve kategorier (opløsningsmiddel-blank, RI calibrants, prøveekstrakter og standarder) inden for den samme måling sekvens. De autentiske standarder bør desuden analyseres ved en koncentration svarende til at der er konstateret for prøveekstrakter. Dette medvirker til at forbedre nøjagtigheden af RI værdier og lighed mellem prøve og standard massespektre, der endelig vil føre til øget og mere meningsfuld metabolit anmærkning/identifikation. Med henblik herpå, kan standarderne gentagne gange måles ved hjælp af forskellige split faktorer.
For metabolitten identifikation, den sofistikerede software, bruges MetaboliteDetector til spektre deconvolution og RI og spectra sammenligning med en implementeret NIST-bibliotek samt om et etableret biblioteket (afsnit 5). Det anbefales at køre MetaboliteDetector på en 64-bit LINUX-baseret operativsystem (fx KUBUNTU) og kopiere den genererede *. CDF-datafiler (trin 4.4) fra den bærbare datalagerenhed på den lokale harddisk. MetaboliteDetector er i stand til at importere GC-MS rådata i barycentrum eller profil netCDF format. Softwaren til de fleste GC-MS instrumenter bør være stand til at konvertere de registrerede rå data til dette format19. Før du starter dataanalyse, er det stærkt anbefales at læse litteratur tilgængelig for tidligere MetaboliteDetector softwareversioner at blive fortrolig med funktionerne og anskuelighed brugergrænseflade19,25, 26.
RI kalibrering og efterfølgende RI værdiberegning af de sammensatte toppe i prøveekstrakter bruges et bibliotek som indeholder RIs og spektre af RI calibrants (her, n-alkaner). Sådan et bibliotek kan enten være selvstændig etableret, eller en allerede eksisterende ('CalibrationLibrary_Alkanes') kan være hentet27. Det angivne standard-kalibratoren bibliotek indeholder RIs og spektre for n-alkaner spænder fra C09 til C39, som er blevet analyseret som beskrevet i afsnit 4. Det angivne bibliotek gør det muligt for brugere, der arbejder med metabolit detektor til direkte start med kalibreringen af deres data. Hvis det er nødvendigt, kan dette bibliotek også udvides med supplerende angivelser for yderligere alkaner. Baseret på lighed og eksperimentelt afledte RIs og massespektre (Se trin 5.3 og underordnede trin, figur 7, figur 8, fig. 9), kommentering eller identifikation af forbindelser kan være udført (trin 5.4 og underordnede trin, Figur 11). Det er også afgørende, at efter edb med MetaboliteDetector, brugeren vil manuelt kontrollere for korrekte peak plukning og spektrum deconvolution ved inspektion massespektre underliggende 'trekant' for hver formodede sammensatte af interesse. Desuden, afhængigt af GC-MS instrumentering og parameterindstillingerne bruges til data generation, tilpasninger af de præsenterede MetaboliteDetector indstillinger kan være nødvendigt. MetaboliteDetector software er i stand til at udføre mange flere nyttige handlinger end forklaret i dette manuskript, f.eks. visning af uddraget ion aktuelle (EIC) kromatogrammer, eksport af kromatogrammer som .csv, automatiske batch-kvantificering af forbindelser, og mange flere.
Protokollen præsenteret i dette håndskrift kan tjene som forslag til forsøg udført af andre forskere, at fokusere på isolering af kirtler eller kirtel indholdet fra insekter samt volatilome analyse og metabolitten identifikation.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Finansiering af denne undersøgelse blev opnået gennem Wien videnskab og teknologi Fund (WWTF) LS13-048 til ISD. Særlig tak til Diane W. Davidson (University of Utah, nu pensioneret) for at dele sin viden om Bornean COCY myrer med os. Vi sætter pris på forvaltninger af Kuala Belalong Field Studies Center (KBFSC) og Universiti Brunei Darussalam (UBD) for projektgodkendelse samt Brunei Forestry Department Bruneis forskning- og innovationscenter om tilladelse til at indsamle myrer og godkendelse og udstedelse af eksporttilladelser. Særlig tak til UBD og KBFSC personale, især Muhammad Salleh bin Abdullah Bat, Teddy Chua Wee Li, Masnah Mirasan, Rafhiah Kahar, Roshanizah Rosli, Rodzay Wahab, Chan hage Mei, og Kushan Tennakoon for at lette vores forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tube 50 ml, 115 x 28 mm, flat/conical base PP | Sarstedt | 62,559,001 | see Figure 1 in manuscript |
| PVC Tubings | Rehau | 290 4489 | see Figure 1 in manuscript |
| Mesh, stainless steel, 0.63 mm mesh size | Antstore | 1000378 | see Figure 1 in manuscript |
| Freezer | Severin | KS 9890 | -20 °C or lower |
| polystyrene foam box, inner dimensions 155 mm x 100 mm x 45 mm | Thorsten Koch | 4260308590481 | |
| Petri dish, glass, 100 mm x 15 mm | Aldrich | BR455742 | |
| Cold pack 150 mm x 100 mm | Elite Bags | 1998 | freeze to -20 °C |
| Bucket with crushed ice | |||
| 1.5 mL Short Thread Vials, 32 x 11.6 mm, clear glass, 1st hydrolytic class, wide opening | La-Pha-Pack | 11090500 | |
| Screw caps for 1.5 mL Short Thread Vials, closed, Silicon white/PTFE red septum, 55° shore A, 1.0 mm | La-Pha-Pack | 9151799 | |
| Stereomicroscope | Bresser | 5806100 | |
| Forceps, Superfine Tip curved | Medizinische Instrumente May, Norman May | PI-0005B | |
| Forceps, Superfine Tip straight | blueINOX | BL-3408 | |
| Dissection needle 140 mm, pointed, straight | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1110301 | |
| Methanol, LC-MS CHROMASOLV, Honeywell Riedel-de Haën | fisher scientific | 15654740 | |
| Distilled water | |||
| Rotizell-Tissue-Tücher | Carl Roth GmbH + Co.KG | 0087.2 | |
| Acetic acid ethyl ester ROTISOLV ≥99,8 % | Carl Roth GmbH + Co.KG | 4442.1 | freeze to -20 °C |
| Vortex Genie 2 | neoLab | 7-0092 | |
| 0.1 mL micro-inserts for 1.5 mL Short Thread Vials, 31 x 6 mm, clear glass, 1st hydrolytic class, 15 mm tip | La-Pha-Pack | 06090357 | |
| Screw caps for 1.5 mL Short Thread Vials, with hole, RedRubber/PTFE septum, 45° shore A, 1.0 mm | La-Pha-Pack | 9151819 | |
| Alkane standard solution C8-C20 | Sigma-Aldrich | 04070 | |
| Alkane standard solution C21-C40 | Sigma-Aldrich | 04071 | |
| n-Hexane SupraSolv | Merck | 104371 | |
| GC-autosampler, e.g. MPS2XL-Twister | Gerstel | ||
| Agilent Gas chromatograph 6890 N | Agilent | ||
| Gooseneck splitless Liner | Restek | 22406 | |
| Helium (5.0 - F50) | Messer | 102532501 | |
| GC capillary column HP-5MS UI 30 m × 0.25 mm ×0.25 µm | Agilent | 19091S-433UI | |
| Agilent Mass Selective Detector 5975B | Agilent | ||
| MSD ChemStation Data Analysis Application software | Agilent | ||
| MetaboliteDetector software (3.1.Lisa20170127Ra-Linux) | Hiller K | download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 | |
| Calibration Library for MetaboliteDetector | Hiller K | download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 | |
| MD Conversion Tool for NIST-library | Hiller K | download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 |
References
- Morgan, E. D. Chemical sorcery for sociality: exocrine secretions of ants (Hymenoptera: Formicidae). Myrmecol News. 11, 79-90 (2008).
- Betz, O. Biological adhesive systems. , Springer. 111-152 (2010).
- Laciny, A., Zettel, H., Druzhinina, I. Workers, soldiers, and gynes-morphometric characterization and description of the female castes of Camponotus singularis (Smith, 1858)(Hymenoptera, Formicidae). Deutsche Entomologische Zeitschrift. 63, 183 (2016).
- Ward, P. S., Blaimer, B. B., Fisher, B. L. A revised phylogenetic classification of the ant subfamily Formicinae (Hymenoptera: Formicidae), with resurrection of the genera Colobopsis and Dinomyrmex. Zootaxa. 4072 (3), 343-357 (2016).
- Davidson, D. W., Salim, K. A., Billen, J. Histology of structures used in territorial combat by Borneo's 'exploding ants'. Acta Zoologica. 93 (4), 487-491 (2012).
- Davidson, D., et al. An experimental study of microbial nest associates of Borneo's exploding ants (Camponotus [Colobopsis] species). Journal of Hymenoptera Research. 18 (2), 341-360 (2009).
- Laciny, A., et al. Colobopsis explodens sp.n., model species for studies on "exploding ants" (Hymenoptera, Formicidae), with biological notes and first illustrations of males of the Colobopsis cylindrica group. ZooKeys. , (2018).
- Maschwitz, U., Maschwitz, E. Platzende Arbeiterinnen: eine neue Art der Feindabwehr bei sozialen Hautflüglern. Oecologia. 14 (3), 289-294 (1974).
- Davidson, D. W., Lessard, J. P., Bernau, C. R., Cook, S. C. The tropical ant mosaic in a primary Bornean rain forest. Biotropica. 39 (4), 468-475 (2007).
- Martin, S., Drijfhout, F. A review of ant cuticular hydrocarbons. Journal of chemical ecology. 35 (10), 1151 (2009).
- Pickett, J. Chromatography and isolation of insect hormones and pheromones. , Springer. 299-309 (1990).
- Tragust, S., et al. Ants disinfect fungus-exposed brood by oral uptake and spread of their poison. Current Biology. 23 (1), 76-82 (2013).
- Menzel, F., Blüthgen, N., Schmitt, T. Tropical parabiotic ants: highly unusual cuticular substances and low interspecific discrimination. Frontiers in Zoology. 5 (1), 16 (2008).
- Hogan, C. T., Jones, T. H., Zhukova, M., Sosa-Calvo, J., Adams, R. M. Novel mandibular gland volatiles from Apterostigma ants. Biochemical Systematics and Ecology. 72, 56-62 (2017).
- Augusto, F., Valente, A. L. P. Applications of solid-phase microextraction to chemical analysis of live biological samples. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 21 (6), 428-438 (2002).
- Davidson, D. W., et al. Nutrition of Borneo's 'exploding' ants (Hymenoptera: Formicidae: Colobopsis): a preliminary assessment. Biotropica. 48 (4), 518-527 (2016).
- Jones, T., et al. The chemistry of exploding ants, Camponotus spp.(cylindricus complex). Journal of chemical ecology. 30 (8), 1479-1492 (2004).
- Voegtle, H. L., Jones, T. H., Davidson, D. W., Snelling, R. R. E-2-ethylhexenal, E-2-ethyl-2-hexenol, mellein, and 4-hydroxymellein in Camponotus species from Brunei. Journal of chemical ecology. 34 (2), 215-219 (2008).
- Hiller, K., et al. MetaboliteDetector: comprehensive analysis tool for targeted and nontargeted GC/MS based metabolome analysis. Analytical chemistry. 81 (9), 3429-3439 (2009).
- Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis. Metabolomics. 3 (3), 211-221 (2007).
- Stein, S. Retention indices by NIST mass Spec data Center. NIST Chemistry Webbook, NIST Standard Reference Base. (69), (2010).
- NIST Chemistry WebBook. NIST Standard Reference Database Number 69. , Available from: http://webbook.nist.gov/chemistry/ (2018).
- Cook, S. C., Davidson, D. W. Nutritional and functional biology of exudate-feeding ants. Entomologia Experimentalis et Applicata. 118 (1), 1-10 (2006).
- Abdalla, F. C., Cruz-Landim, C. d Dufour glands in the hymenopterans (Apidae, Formicidae, Vespidae): a review. Revista Brasileira de Biologia. 61 (1), 95-106 (2001).
- Hiller, K. MetaboliteDetector. Documentation. , Available from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/wiki/index.php/Documentation (2010).
- Nieke, C. MetaboliteDetector - Development Version. , Available from: http://md.tu-bs.de/system/files/Downloads/MD-Development-Version-Documentation.pdf (2012).
- Hiller, K., Koschnitzki, N. MetaboliteDetector. Download. , Available from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 (2017).
