Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Изготовление градиента Nanopattern тепловой Nanoimprinting техникой и проверка реакции человека эндотелиальные клетки, образуя колонии

Published: July 1, 2018 doi: 10.3791/57661
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 2, 2, 1
1School of Biomedical Engineering, Korea University, 2Department of Cardiology, Korea University Anam Hospital
* These authors contributed equally

Summary

Здесь мы представляем протокол для изготовления пластин градиента nanopattern через тепловые nanoimprinting и метод скрининга ответы клеток человека эндотелиальной прародитель наноструктур. С помощью описанных технологий, можно производить эшафот, что можно управлять поведение клеток, физические раздражители.

Abstract

Нанотопографии могут быть найдены в различных внеклеточной матрицы (ECMs) вокруг тела и как известно, имеют важные регламентационных на клеточных реакций. Однако трудно определить связь между размером наноструктур и реакции клеток из-за отсутствия надлежащей проверки инструментов. Здесь мы покажем развития воспроизводимых и экономически градиента nanopattern пластин для манипуляции клеточных реакций. Использование анодного оксида алюминия (ААО) в качестве главной формы, градиент nanopattern плиты с nanopillars хребтов увеличения диаметра [120-200 Нм (GP 120/200), 200-280 Нм (GP 200/280) и 280-360 Нм (GP 280/360)] были сфабрикованы тепловой импринтинга технику. Эти пластины градиента nanopattern были разработаны для имитации различных размеров нанотопографии в ECM и были использованы для экран ответов человека эндотелиальных образуя колонии клеток (hECFCs). В этом протоколе опишем шаг за шагом процедура изготовления градиента nanopattern пластины для ячейки, инженерия, технологии выращивания hECFCs из периферической крови человека и культивирования hECFCs на nanopattern пластины.

Introduction

Недавно реакция клеток по физической стимуляции топографии поверхности была освещена в поле ячейки инженерных1,2,3,4. Таким образом больше внимания было уделено трехмерной наноструктур на поверхности клеток вложений5. Сообщается, что Интегрин, который является устройством поверхности признание ячейки, передает физический раздражитель, управляемый микро нано составами ECM-механо трансдукция6. Это механическая стимуляция регулирует поведение клеток через контакт руководство7 и индуцирует цитоскелета реорганизации менять форму, помимо координационных спаек и жесткость8клеток.

Человека эндотелиальной прародитель клеток (hEPCs) в организме тесно взаимодействуют с микроокружения окружающих ECM9. Это означает, что физическое состояние ECM действует как важный параметр для конкретных ячеек матрица адгезии комплекс формирования как касательное напряжение, полученных из крови поток10. Сообщается, что поверхности нанотопографии повышает в vitro создание сетей обширной капиллярной трубки hEPCs11 и растворимых факторов ECM/био комбинированная система позволяет hEPCs признать неблагополучных субстратов и способствует ранение исцеления12,13. Тем не менее отношения между ECM и hEPCs не четко понимать.

Хотя многие исследователи пытались прояснить взаимосвязь между клеток ответов и физические сигналы от различных субстратов14,,1516, эти исследования используются только фиксированный размер наноструктурированных или nanopatterns с неправомерных механизмов, которые имеют ограничение для прояснения взаимосвязи между размер поведения наноструктур и клеток. Проблема здесь является отсутствие подходящих инструментов для скрининга клеточных реакций, которые могут заменить существующие утомительной и итеративный подходы к найти оптимальный размер наноструктур. Таким образом простой метод не требуется для скрининга реакциях на физической стимуляции без повторения.

Здесь мы описываем метод, используемый в наших предыдущих докладов17,18,19 производить градиента nanopattern, в котором постепенно увеличивается диаметр аранжированное nanopillars. Кроме того мы также описал, как обрабатывать и анализировать поведение hECFCs на градиент nanopattern пластины для определения влияния физических раздражителей на клетки. Мягкий анодирование, постепенно травления и против прилипания слой покрытия методом были использованы для изготовления градиента ААО плесень. Приняв тепловой импринтинга технике литографии, идентичные полистирола градиента nanopatterns были произведены в экономически эффективным и легким способом. Использование градиента nanopatterns, представляется возможным определить, какой размер наноструктурированных имеет большое влияние на поведение ячейки в одном наборе эксперимента. Мы ожидаем, что этот градиент nanopattern будет полезным для понимания механизмов взаимодействия между крови производные hECFC или другие клетки и различных размеров наноструктур.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Это исследование был одобрен Советом по рассмотрению институциональных больнице Анам университета Кореи (IRB № ED170495). Все процедуры были проведены в соответствии с Хельсинкской декларации и последующих поправок к нему.

1. подготовка субстрата алюминия (Al), электрополировка

Осторожностью: Электрополировка решение коррозионные и токсичных. Носите личного защитного оборудования, включая нитриловые перчатки, защитные очки и халате. Выполните этот шаг в зонта.

  1. Приготовляют раствор электрополирование, смешивая этилового спирта (C2H5OH, 99,9%) и хлорной кислоты (HClO4, 60%) в стакан емкостью 1 Л Двухместный пиджак (OH:HClO4 C2H5= 4:1).
  2. Подключите к термостат двойной куртка стакан и установите температуру на 7 ° C. Поставьте стакан Двухместный пиджак на магнитной мешалкой. Оставьте раствор под перемешивание для по крайней мере 30 минут до тех пор, пока температура падает до 7 ° C.
  3. Погружать пластину сверхчистого Аль (99,999%, 20 × 50 × 1 мм3) и углерода счетчика электрода в раствор электрополировка с использованием зажимы крокодил и медной проволоки. Отрегулируйте положение пластины Аль и электрода счетчика углерода противостоять друг другу.
    Примечание: Это необходимо тщательно установить клипы чтобы не коснуться решения. При контакте с решения, примесей, выливается из клипов может загрязнить Аль пластины.
  4. Подключите Аль пластины к плюсовому и углерода счетчика электрода на негативные терминал, питания постоянного тока (DC).
  5. Выключить магнитную мешалку и применить напряжения 20 V. поддерживать это состояние на 4 мин.
  6. Включите Магнитная мешалка и позволяют ток потока для еще 6 мин.
    Примечание: Статическое состояние удаляет большую часть примесей и шероховатости от Аль пластины, и динамическое состояние улучшает конечное качество Электролитическая полировка.
  7. Выключите электропитание и вручную отделить Аль пластина из клипа. Тщательно вымойте Аль пластины с дейонизированной водой, чтобы удалить все остальные решения.
  8. Сухие Аль пластины с азотом и магазин в атмосфере инертного газа. Проводить этот процесс сушки в конце всех экспериментов на шаге 1 и 2.
    Примечание: При внутривенном введении сжатого воздуха, сделайте поток воздуха из полированной части на противоположной стороне. В противном случае примесей может побег из не полированные части и загрязнять Аль пластины.

2. Изготовление градиента ААО плесень с фосфорной кислоты электролит

Осторожностью: Глазной токсичных метилового спирта и его паров. Непрерывное воздействие хрома может привести к серьезным хрома отравления. Выполните этот шаг в зонта.

  1. Основная анодирование
    1. Для приготовления 1 Л электролита фосфорной кислоты, загрузите 590 мл обессоленной воды в стеклянной бутылке.
    2. Добавить 400 мл метилового спирта (CH3OH, 99%) и 10 mL фосфорной кислоты (H3PO4, 85%), в стеклянной бутылке. Mix решение хорошо встряхнув вручную или с магнитной перемешивания.
    3. Налейте в стакан емкостью 1 Л Двухместный пиджак 500 мл электролита. Погружайте полированной Аль пластины и углерода счетчика электрода в раствор с зубчатые зажимы и медной проволоки.
    4. Влить дополнительные электролита найти границы электрополировка 2-3 мм над поверхностью раствора.
      Примечание: Если анодирование осуществляется с границей электрополирование, касаясь решения, Аль пластины, как правило, сжигать в течение анодирование.
    5. Установка вертикального вала на пьедестал U-образной формы. Приложите накладных мешалкой и крыльчатка с помощью металлических хомутов. Расположите лопасти крыльчатки в нижнем конце обоих электродов. Задайте скорость вращения мешалки накладных между 200 и 300 об/мин.
    6. Подключите к термостат двойной куртка стакан и установите температуру от-10 ° c. Оставьте систему для по крайней мере 1 ч при перемешивании до тех пор, пока температура падает до-10 ° C.
      Примечание: Не использовать воду в качестве охлаждающей жидкости. Потому что вода замерзает при низких температурах, тираж не будет нормально работать. Рекомендуется использовать смесь воды и спирта этилового в соотношении 1:1 в качестве охлаждающей жидкости.
    7. Примените напряжения 195 V под перемешивания на 16 h.
      Примечание: Если текущий поднимается более чем 50 мА в течение 2 или 3 ч после применения напряжения, вероятность возникновения горения очень высока. Немедленно остановить процесс и замените новую пластину Аль. Если эта проблема возникнет повторно, убедитесь, что нет никаких аномалий в регулятор температуры термостата. Если есть без аномалий, измените электролита.
    8. Остановить питания и вручную отделить Аль пластина из клипа. Вымойте пластину из анодированного Аль деионизованной водой, чтобы удалить все остальные решения.
  2. Травление алюминия
    1. Подготовьте метахромовой кислоты травления решение путем растворения 9.0 g оксида хрома (3CrO) и 20,3 mL фосфорной кислоты (H3PO4, 85%), в 500 мл деионизованной воды.
    2. Залейте раствор травления в двойной куртка стакан емкостью 1 Л. Установите температуру на 65 ° C.
    3. Погружайте пластину из анодированного Аль в решении травления для по крайней мере 10 ч при помешивании. Печать верхней части стакан с алюминиевой фольгой.
    4. Промойте травления пластины Аль несколько раз с дейонизированной водой.
  3. Вторичные анодирование
    1. Установка же экспериментальных условиях как шаг 2.1.1 для 2.1.7.
    2. Загрузить травления пластины Аль к аноду системы и применить напряжения 195 V 6 ч. Затем выключите электропитание и вручную отделить Аль пластина из клипа. Немедленно промойте пластину из анодированного Аль деионизированной водой.
      Примечание: Когда время стирки задерживается, размер пор ААО увеличивает непреднамеренно вследствие остатков фосфорной кислоты.
  4. Расширение градиента поры
    1. Приготовляют раствор расширяющее поры путем растворения 5.765 g фосфорной кислоты в 500 мл деионизованной воды. Залейте раствор в стакан емкостью 1 Л Двухместный пиджак.
    2. Подключите к термостат двойной куртка стакан и установите температуру 30 ° c. Место линейной стадии движущихся вертикально рядом с стакан. Прикрепите кронштейн с движущейся частью линейной стадии.
    3. Установите подвижную часть линейной стадии в исходное положение. Прикрепить зажим к кронштейну и загрузить пластину анодированная Al.
    4. Манипулировать положение пластины Аль вручную, таким образом, чтобы пластины Аль придет прямо над поверхностью раствора.
      Примечание: В этом шаге Аль плита не должна касаться решения. Пора расширять процесс начинается, как только пластину Аль достигает решение.
    5. Постепенно погрузиться пластину Аль раствора со скоростью 4.86 мкм/s для 120 мин сделать ААО плесень 35 мм с размером от 120 Нм до 200 Нм (GP 120/200). Запустите секундомер на данный момент пластину Аль касается поверхности раствора.
    6. Чтобы сделать GP 200/280 и GP 280/360 прессформы, погрузите всю область формы GP 120/200 в поры, расширение решение для 2 или 4 h, соответственно.
    7. Промойте пластину градиента Аль несколько раз с дейонизированной водой.

3. осаждение против прилипания слоя на градиент ААО плесень с собственн-собранные монослоя

Примечание: Выполните шаги 3.2.1 для 3.3.3 в перчаточном ящике. Подключение вакуумного насоса и инжектора газа сухим азотом в бардачок. Поместите все образцы, реагентов и аппараты в перчаточном ящике до процесса осушения. Повторите цикл впрыска газа эвакуации и азота более чем в три раза для надлежащего удаления влаги из вещевого ящика. Пусть сухой азота поток через эксперимент.

  1. Модификация гидроксила ААО плесени с лечением Пиранья
    1. Налить 140 мл серной кислоты (H2т4, 95%) в стакан из политетрафторэтилена (ПТФЭ). Добавьте 60 мл прикапывают пероксида водорода (H2O2, 30%). Оставьте на 30 мин, до тех пор, пока решение остынет.
      Осторожностью: Будьте осторожны при принятии решения Пиранья. С момента добавления перекиси водорода решение энергично кипит и генерирует высоких температур. Выполнение эксперимента в зонта.
    2. Погружать ААО плесень в решении для 30 сек с использованием неметаллических пинцет.
    3. Смыть плесень ААО несколько раз с дейонизированной водой. Замочите плесень в дейонизированной воде на 30 минут и положить его в метилового спирта для еще 30 мин.
      Осторожностью: Когда отбрасывая используемое решение пираньи, разбавьте раствор с большим количеством водопроводной воды.
    4. Полностью высушите ААО плесень под вакуумом для 3 h.
  2. Подготовка 20 × HDFS Стоковый раствор
    Примечание: HDFS это аббревиатура (гептадекафтор-1,1,2,2, - tetrahydrodecyl) dimethylchloro силан
    1. Заполните одну треть бутылка 1 Л н гексан молекулярного сита. Печать бутылки с парафином фильм и хранить его под сухим азотом за 24 ч.
    2. Фильтр по 200 мл-гексана, используя шприц стекла и 0,2 мкм PTFE фильтр шприц.
    3. Налейте 80 мл отфильтрованных н гексан стеклянная бутылка 100 мл. Добавьте 2 мл HDFS.
  3. Собственн-собранные монослоя осаждения
    1. Загрузите 57 мл отфильтрованных н гексан в 100 мл стакан. Погрузите ААО плесень в растворитель.
    2. Добавьте 3 мл раствора HDFS штока-гексана сделать решение HDFS 2,9 мм. Подождите 10 минут для реакции для продолжения.
    3. Литформы AAO чтобы свежие-гексана. Закройте и запечатать все бутылки реагента. Закройте клапан азота, а затем вытащить образцы из вещевого ящика.
      Примечание: HDFS чрезвычайно чувствителен к влаге. Храните все реагенты, которые содержат HDFS в эксикатор.
    4. Замочите ААО плесень в 60 мл methoxynonafluorobutane (C10H6F18O2, 99%). Ультразвуковой очистки плесень AAO в стакан для 10 s в один раз, чтобы удалить физически адсорбированных молекул HDFS. Повторите процедуру очистки 10 раз.
      Примечание: Разоблачение ААО плесень ультразвуковой долгое время без интервалов может повредить слой оксида.
    5. Полностью высушите ААО плесень под вакуумом для 24 h.
      Примечание: Успешно наплавленного слоя против прилипания супер водоотталкивающего и стабильных месяцев при хранении в эксикатор. Протокол может быть приостановлена здесь.

4. Изготовление градиента Nanopattern пластин тепловой импринтинг

Примечание: Выполните шаги 4,2 до 4,7 в чистой комнате.

  1. Вырежьте лист пенополистирола толщиной 1.1 мм размер 2.9 мм 3,7 мм длиной, с помощью фрезы печатной платы (PCB).
  2. Вырежьте ААО плесень 35 мм от дна используя щипцы. Марк образец имени и даты изготовления на спине.
  3. Очистите 8.0" вафельные с небольшой дозы этилового спирта. Положите листы из полистирола на пластины, а затем смонтировать ААО плесень.
  4. Положите нижней пленки в ящик тепловой надпечатки. Прикрепите Топ фильм для прокладки.
  5. Поместите пластины на нижней пленки. Поместите прокладку на пластины. Убедитесь, что есть нет пыли на пластины.
  6. Закройте ящик тепловой надпечатки. Применить 165 ° C тепла и 620.52 кПа давление 100 s.
  7. Прохладный образца до комнатной температуры. Аккуратно поверните лист полистирола выпустить ААО плесень.

5. стерилизация и гидрофильные изменения градиента Nanopattern плит

  1. Поместите пластины для nanopattern на квадратный блюдо. Залить 100 мл 70% спирта этилового и подвергать ультрафиолетового света за 30 мин.
  2. Сухой nanopattern плиты с азотом. Передача nanopattern пластины на плазменный генератор кислорода.
  3. Эвакуировать камеры, пока он не достигнет 1.33 ПА. Затем, придать кислорода в размере 30 см3/мин применяются радио частоты мощностью 60 W. поддерживать кислорода плазмы 90 s.
    Примечание: Рекомендуется использовать плазмы лечение nanopattern пластины в течение 14 дней.
  4. Прикрепите пластину nanopattern в нижней части клетки культуры блюдо с помощью капли толуола.
  5. Печать образцов в чехле и стерилизовать с низкотемпературный плазменный стерилизатор.

6. выращивание hECFCs

Примечание: Проведение всех процедур центрифугирования при температуре 4 ° C, если не указано иное.

  1. Прежде чем изолировать периферической крови мононуклеаров (получения), инкубировать коллаген покрытием 12-ну культуры блюдо при 37 ° C в течение 1 ч.
  2. Вымойте 12-ну культуры блюдо, используя 1 × стерильные фосфатный буфер (PBS).
  3. Соберите 50 мл крови человека с помощью трубки ингибитор гепарина.
  4. Положите 6 мл раствора полисахарид гидрофильной в 15 мл и добавить 8 мл крови в гидрофильной полисахарид решение.
    Примечание: Медленно Пипетка крови в гидрофильной полисахарид раствор.
  5. Центрифуга трубку 1020 x g за 20 мин до Пелле клетки.
  6. Урожай слоя непрозрачные клеток и передачи новой трубки 15 мл.
  7. Добавить 10% плода бычьим сывороточным (ФБС)-содержится PBS и центрифуги трубку 1020 x g за 10 мин до Пелле клетки.
  8. Удалить супернатант и добавить буфера lysis клеток красной крови. Держите на льду на 5 мин.
  9. Добавить 10% содержащихся FBS PBS и центрифуги трубку 1020 x g за 5 мин до Пелле клетки.
  10. Удалить супернатант и добавить 10% содержащихся FBS PBS. Центрифуга трубку 1020 x g за 5 мин до Пелле клетки.
  11. Удалить супернатант и добавьте 1 mL эндотелиальных клеток расширения среды в дополнение с 10% FBS. Семя 8.0 × 106 клеток на хорошо для каждого блюдо коллаген покрытием.
  12. Изменение культуры среднего каждый день в течение 1 недели. Затем измените питательной среды каждые 2 дня.
    Примечание: hECFCs можно найти после культуры день 10-14. hECFCs Показать типичные булыжник как морфология и формируют колонии, которую можно наблюдать в фазово-контрастной микроскопии. Иммунофлюоресценции окрашивание сосудистого эндотелия Кадгерины (CD144) и фактор Виллебранда (vWF) может также проводиться для характеризации hECFCs после дальнейшего расширения клеток.
  13. Чтобы культивировать hECFCs, используйте эндотелиальных клеток расширения среднего дополнена 5% FBS и пенициллин/стрептавидина при 37 ° C в атмосфере увлажненные, содержащих 5% CO2. Замените носитель один раз в день.
  14. После индукции hECFC растут клетки проход 7 для дальнейших экспериментов.

7. Мобильный посева и культура на градиент Nanopattern пластины

Примечание: Шаг 7 описывает культуры hECFCs на плите градиента nanopattern, но также могут использоваться другие источники клеток.

  1. Слой градиента nanopattern плиты с 1 мл 0,1% раствора белка покрытие в PBS 10 мин при комнатной температуре.
    Примечание: 0,1% белка покрытие не распространяется на nanopillar функции.
  2. Сделайте hECFCs подвеска от культуры блюдо, стандартный метод расщепления ячейки с помощью трипсина.
  3. Разбавления суспензии клеток для достижения желаемого слияния. Семена hECFCs на градиент nanopattern пластины и плоские управления (например, 1.0 × 104 клетки/см2).
    Примечание: Когда hECFCs посеян на 1.0 × 104 клетки/см2 на градиент nanopattern пластины, confluency клетки обычно достигает 70-80% после 2 дней.
  4. Культура клетки на плоской или градиент nanopattern пластины на 2 дня в инкубаторе.

8. наблюдение и анализ

  1. Сканирующий электронный микроскоп (SEM) изображений
    1. Исправьте hECFCs, культивируемых на плоской или градиент nanopattern пластины с глютаральдегид 2,5% при температуре 4 ° C для ночлега.
    2. Лечить 1% осмия тетраоксид за 1 ч при комнатной температуре. Стирайте образцы с PBS.
    3. Обезвоживает образцы с этилового спирта от низкой к высокой концентрации (50%, 70%, 80%, 90% и 100%), за 10 мин на каждом шагу.
    4. Лечить Гексаметилдисилазан (ГМДО) для 15 мин при комнатной температуре. После этого стирать образцы с свежим HMDS и оставить образцы под зонт по крайней мере за 1 день до остаточного HMDS испаряется полностью.
    5. С покрытия образцы платины распыления нанесения покрытий на 5 мин и изучить образцы с SEM.
  2. Передачи изображения микроскопа (ТЕА)
    1. Исправьте hECFCs, культивируемых на плоской или градиент nanopattern пластины с 2% параформальдегида и 2,5% глютаральдегид смеси в PBS на 4 ° C для ночлега.
    2. Выполнять после фиксации с использованием 1% осмия тетраоксид и обезвоживания проб с помощью метода в 8.1.3.
    3. Внедрите образцы в эпоксидной смолы. Сделать 60 Нм толщиной разделы из блоков и поместите на сетке ТЕА.
    4. Пятно раздел со смесью уранила ацетат 10 мг в 100 мл метилового спирта и 0,1 мг цитрата свинца в 100 мл дистиллированной воды. Получите изображения с ТЕА.
  3. Флуоресценции пятнать
    1. Исправьте hECFCs, культивируемых на плоской или градиент nanopattern пластины с параформальдегида 4% при комнатной температуре в течение 15 мин.
    2. Разрушения и блокировать образцы с 5% козьего сыворотки и 0,1% octylphenol ethoxylate в PBS (PBST) при комнатной температуре за 30 мин.
    3. Проинкубируйте образцы с антинародным vinculin основное антитело (1: 500 в PBST) при комнатной температуре 2 h. полоскания образцов три раза с PBST.
    4. Проинкубируйте образцы с флуоресцентным конъюгированных Фаллоидин (1:1, 000 в PBST), конъюгированных флуоресценции вторичное антитело (1:1, 000 в PBST) при комнатной температуре 2 h. полоскания образцов три раза с PBST.
    5. Проинкубируйте образцы с 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1:1,000 в PBST) при комнатной температуре в течение 5 мин.
    6. Падение 10 мкл среднего монтажа на поверхности градиента nanopattern. Место coverslip на носителе монтажа.
    7. Переверните образца на сцене образец и получить изображения с помощью микроскопа конфокальный флуоресценции.
  4. Анализ изображений
    1. Передавать захваченных изображений hECFCs системы анализа изображений.
    2. Выберите случайное поле Фаллоидин окрашивание изображения. Отрегулировать порог и создайте двоичный образ, в котором клетки отличаются от фона.
    3. Нарисуйте контуры вокруг клетки, чтобы измерить ячейку площади и периметра и вручную пересчитать filopodia в клетку.
    4. Выберите случайное поле vinculin окрашивание изображения. Отрегулировать порог и создайте двоичный образ областей фокуса адгезии.
      Примечание: Настройка порога изображения надлежащим образом избежать искусственных над - или под - filling областей фокуса адгезии.
    5. Подсчитать количество координационных адгезии каждой ячейки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results


Рисунок 1 показывает SEM изображения изготовлены формы градиента ААО согласно их тип и расположение. Рисунок 2 показывает изображения SEM градиента nanopattern плит с регулярными округлые nanopillars, и на рисунке 3 приведена количественная оценка данных nanopillar диаметра. В таблице 1 перечислены характеристики сфабрикованных nanopillars.

На рисунке 4A показана схема культивирования крови производные hECFCs. Рисунок 4B шоу фаза контраст изображение thecultivated hECFCs. Рисунок 4 c показывает, что hECFC маркеры витражи с CD144 (зеленый), vWF (красный) и ядра (синий). Рисунок 5A показывает представитель изображения SEM hECFCs после 2 дней культуры на квартиру, GP 120/200, GP 200/280 и GP 280/360 пластины. Рисунок 5B и C изображают количественные данные о ячейке площади и периметра по сравнению с плоской. Количественная оценка данных показали, что клетки, выращенных на nanopillar поверхностях меньшего размера показали сокращение клеток площади и периметра. Рисунок 5 d является представитель SEM образы hECFCs, которые показывают морфология существующих filopodia. 5E рисунок изображает количественные данные о количестве filopodia по сравнению с квартиры. Значительные filopodial нарост было отмечено в клетках, культивируемых на GP 120/200, в то время как в GP200/280 или GP280/360 было отмечено никаких существенных изменений по сравнению с квартиры. 5F рисунок показывает представитель ТЕА изображения hECFCs после 2 дней культуры на плоской и градиент nanopattern пластины.

Figure 1
Рисунок 1. Градиент ААО плесень. SEM изображения градиента ААО формы для GP 120/200, GP 200/280 и GP 280/360 пластин в зависимости от положения формы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 . Градиент пластины nanopattern. SEM изображения столба тип градиента nanopattern плит для GP 120/200, GP 200/280 и GP 280/360 пластины согласно позиции плит. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 . Градиент размер диаметра nanopillar. Количественная оценка данных показаны градиент nanopillar диаметров для GP 120/200, GP 200/280 и GP 280/360 пластины, соответственно. Бары представляют стандартная ошибка. Эта цифра была изменена от [Acta Biomaterialia] 20. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Модуль Юнга (ГПД) Nanopillar диаметр (Нм) Nanopillar поле (Нм) Чтобы центр расстояние (nm) Nanopillar высота (Нм) Nanopillar жесткость (N/m)
Квартира 2.43±0.19 – – – – –
GP 120/200 1.74±0.11 120 – 200 320-240 440 276.9±21.9 9.35
GP 200/280 2.01±0.05 200-280 240 – 160 440 268.1±25.9 55.78
GP 280/360 2.1±0.13 280-360 160-80 440 293.6±23.6 134.15

Таблицы 1. Характеристики сфабрикованных nanopillars. Количественные данные, показывающие Юнга, диаметр, шаг, в центр расстояние, высоту и жесткость сфабрикованных nanopillars. Эта таблица была изменена от [Acta Biomaterialia] 20.

Figure 4
Рисунок 4 . Характеристика hECFCs. (A) схема показаны график hECFCs производным от взрослых периферической крови. (B) этап контраст изображения hECFC колонии, производный от взрослых периферической крови на 14 день. (C) Immunofluorescent изображения показаны CD144 (зеленый), vWF (красный) и ядро клетки окрашивали DAPI (синий). Эта цифра была изменена от [Acta Biomaterialia] 20. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5 . hECFCs, культивируемых на плиты плоские и градиент nanopattern за 2 дня. (A) представитель SEM образ hECFCs, культивируемых на квартиру, GP 120/200, GP 200/280 и GP 280/360 пластины. (B и C) Количественная оценка данных о площади и периметра hECFCs (n = 50). * p <.05 по сравнению с квартиры. (D) представитель SEM изображения переднего края hECFCs на плоской и градиент nanopattern пластины. (E) данные количественной оценки числа filopodia в одну hECFC (n = 20). * p <.05 по сравнению с квартиры. (F) представитель ТЕА образ hECFC культивировали на квартиру и градиента nanopattern пластины. Белые стрелки указывают точки взаимодействия между hECFCs и подложке поверхность. Эта цифра была изменена от [Acta Biomaterialia] 20. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительные Рисунок 1. Углом контакта воды нетронутой ААО и HDFS лечение ААО. Контактный угол измерения показаны гидрофобные свойства файловой системы HDFS самостоятельно собрал монослоя (A) перед и, (B) после лечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот показатель.

Дополнительный рисунок 2. Изображения SEM сфабрикованные градиента nanopattern плит с же ААО плесень. Сравнительные SEM изображения наборы для проверки прочности ААО плесени. (A) градиент nanopattern пластины производится с свежезаваренным сделал прессформы. (B) градиент nanopattern пластины производится с плесенью ААО после импринтинга 15 раз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот показатель.

Дополнительная цифра 3. Влияние белка оболочки. SEM изображения hECFCs, которые были культивированный на GP 120/200, GP 200/280 или GP 280/360 градиента nanopattern плиты (A) без или (B) с покрытием белка. Эта цифра была изменена от [Acta Biomaterialia] 20 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот показатель.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Изготовление AAO часто страдает от такие дефекты, как трещины, неправильной формы поры, и горения. Основная причина этих дефектов называется электролитической пробоя, которая сильно зависит от характера металлические субстраты анодированный и сопротивление электролита21. Поскольку сопротивление электролита варьируется в зависимости от его температуры, устраняя тепла непрерывно с электродами является критической точки для поддержания местоположением температуры электролита стабильным в таком состоянии анодирование высокого напряжения. В этом протоколе мы сфабрикованы ААО формы, изменяя Масуда двухступенчатый анодирование22,23. Замена почти половина электролита с метилового спирта не только предотвращает блокирование при низких температурах электролита, но также лишает электрод тепла испарением в нижней части порового24. Причина использования накладных мешалкой и крыльчатка вместо магнитной мешалкой является обеспечение контроля температуры. Типичный Магнитная мешалка имеет высокую вероятность холостого хода вследствие случайного смещения магнитный бар во время длительной эксплуатации. Эта проблема побуждает ненадлежащего обращения электролита, повышение температуры и ведущих к горения.

Чтобы придать размер градиента ААО плесень, мы постепенно погружается AAO в фосфорной кислоты, травления решения. Поры расширяется пропорционально времени, которое ААО остается в растворе травления, как показано на рисунке 1. При этом условии средняя поры расширение составляет 0,67 Нм/мин манипулирования погружения скорость и время будет изменить наклон размер поры градиента и максимальный диаметр ААО. Максимально возможной поры диаметр – 400 Нм. Когда диаметр пор превышает 400 Нм, стены расстояние между поры становится настолько тонкие, что он не может терпеть давление во время тепловой процесс импринтинга.

Чтобы иметь возможность добавить гидрофобные свойства материала поверхности25известен HDFS собственн-собранные монослоя. Молекула HDFS делает сильную ковалентную связь с группами гидроксила на поверхности ААО, представленный Пиранья лечение26. Таким образом, как показано в дополнительный рисунок 1, твердых собственн-собранные монослоя может быть сформирован, когда большое количество гидроксильных групп присутствуют на поверхности субстрата. Для оптимального качества с HDFS собственн-собранные монослоя мы предлагаем проведение реакции в атмосфере осушенный. Когда HDFS подвергается воздействию влаги, побочные реакции с водой образует димеры, тримеры и даже олигомеров молекулы силана и уменьшает общее качество собственн-собранные монослоя.

При использовании ААО плесень с градиентом размер в тепловой nanoimprinting, пластины культуры клеток с градиентом nanopillars были получены Рисунок 2 и на рисунке 3. Тепловые nanoimprinting метод имеет преимущество в том, что он может производить большое количество идентичных nanopattern плит с помощью одной ААО главной формы. Дополнительные рисунок 2 показывает, что нет никакой разницы в качестве nanopattern производства, даже после пятнадцать импринтинг процессов, по сравнению с nanopattern, производства новой формы AAO. Для выбора полистирола как материал для передачи nanopattern причина что полистирола имеет соответствующие температуры стеклования (100 ° C) для тепловой импринтинг, и он широко используется в коммерческих клетки культуры блюда из-за его прозрачный и нетоксичных свойства.

Изготовления наноструктур с высоким соотношением сторон с использованием метода теплового nanoimprinting трудно. Потому что, когда условия процесса, такие как увеличение давления и времени, плесень становится глубоко укоренилось в полимерные субстраты, что делает его трудно отделить плесень от субстрата. Таким образом это очень сложно производить nanopatterns с соотношением сторон 1:3 или более с помощью нашей техники nanoimprinting. Однако согласно ТЕА изображения мы наблюдали Рисунок 5 c, мы нашли интересный факт что мембраны клеток на nanopatterns не был в контакте с нижней части nanopattern. Другими словами все физические раздражители, которые могут манипулировать ответ клеток были возникла из верхней части nanopattern. Таким образом в этом исследовании, мы не рассмотреть пропорции в изучении реакции клеток к nanopattern. Как показано в дополнительный Рисунок 3, 0,1% раствор белка покрытие было никакого влияния на вложение hECFCs на nanopillar поверхностях. Кроме того эти наноразмерных раздражители из градиента nanopattern плит сократились ячейки площадь и периметр hECFCs и увеличение filopodial нарост на рисунке 5.

Таким образом мы установили градиента nanopattern пластины, манипулируя ответ hECFCs в пробирке. Чтобы знать точно какой размер наноструктур, сильно страдают клетки, будущей работы требуется дизайн nanopillar клетки конкретного размера, регулируя наклон размер градиента и минимальная максимальная диаметр nanopillars. Мы ожидаем этот градиент nanopattern быть увлекательный инструмент взаимодействия между клетками и наноструктур с экрана, а также обеспечивают передовые клетки ниши, в которых наноструктур могут свободно настраиваться в размер.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана базовой программы исследований науки через национальных исследований фонда из Кореи (NRF) финансируется министерством образования, науки и технологии (MEST) [СР 2015R1D1A1A01060397] и био и медицинской технологии развития Программа финансируется министерством науки, ИКТ и будущего планирования [СР 2017M3A9C6029563] СР НАТО.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Perchloric acid 60% Daejung Chemicals & Metals 6512-4100
Ethyl alcohol, absolute 99.9% Daejung Chemicals & Metals 4118-4100
Phosphoric acid 85% Daejung Chemicals & Metals 6532-4400
Methyl alcohol 99.5% Daejung Chemicals & Metals 5558-4400
Chromium(VI) oxide Daejung Chemicals & Metals 2558-4400
Sulfuric acid 95% Daejung Chemicals & Metals 7781-4100
Hydrogen peroxide 30% Daejung Chemicals & Metals 4104-4400
n-hexane 95% Daejung Chemicals & Metals 4081-4400
Toluene 99.5% Daejung Chemicals & Metals 8541-4400
(heptadecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrodecyl)dimethylchlorosilane Gelest SIH5840.4 Moisture sensitive
Methoxynonafluorobutane 99% Sigma aldrich 464309
Collagen solution Stemcell #4902
Gelatin Sigma aldrich G1890 Protein coating solution
Ficoll-Paque GE Heathcare 17-1440-03 Hydrophilic polysaccharide solution
EGM-2MV Lonza CC-3202 Endothelial cell expansion medium
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
Phosphate buffered saline Gibco 10010031
Fetal bovine serum Gibco 12483-020
Paraformaldehyde Sigma aldrich P6148
Glutaraldehyde Sigma aldrich G5882-100ML
Osmium tetroxide Sigma aldrich 201030-1G
Hexamethyldisilazane Sigma aldrich 440191
Triton X-100 Sigma aldrich X100-100ML Octylphenol ethoxylate 
Goat serum Gibco 26050-088
anti-human vinculin primary antibody  Sigma aldrich V9131
F-actin probe Molecular Probes A12379 Fluorescence-conjugated phalloidin
Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody Molecular Probes A11001 Fluorescence-conjugated secondary antibody 
4',6-diamidino-2-phenylindole  Sigma aldrich D9542
Mounting medium DAKO S3023
Anti-human vWF primary antibody  DAKO A0082
Anti-human CD144 primary antibody  BD Biosciences #555661
Eponate 12™ Embedding Kit, with BDMA Ted Pella 18012 Epoxy resin
Uranyl Acetate, 25g Ted Pella 19481
Lead Citrate, Trihydrate, 10g Ted Pella 19312
Ultra pure aluminum plate Goodfellow 26050-088
Polystyrene sheet Goodfellow ST313120
8.0" silicon wafer Siltron 29-01024-03 Single side polished, 725 µm thick
Vacuum desiccator, 4.4 L Kartell KA.230
Vacuum pump Vacuumer V3.VOP100
Power supply Unicorntech UDP-3003
Magnetic stirrer Daihan scientific SL.SMS03022
Overhead stirrer Daihan scientific HT120DX
Circulator Daihan scientific WCR-P12
Linear moving stage Zaber A-LSQ300A-E01-KT07
Angle bracket, 90 degrees Zaber AB90M Accessory of the linear moving stage
PMP forcep, 145 mm Vitlab 67995 Nonmetallic tweezer
PTFE beaker, 250 mL Cowie CW007.25
Ultrasonic cleaner Branson B2510MTH
PCB cutter Hozan Tool Industrial K-110
Nanoimprint device Nanonex NX-2000
Oxygen plasma generator Femto Science CUTE
Low temperature sterilizer Lowtem Crystal 50
CO2 Incubator Panasonic MCO-18AC
Confoal laser scanning microscope Carl Zeiss LSM700
Scanning electron microscope JEOL JSM6701
Transmission electron microscope Hitachi H-7500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nature materials. 13 (6), 558-569 (2014).
  2. Qian, W., Gong, L., Cui, X., Zhang, Z., Bajpai, A., Liu, C., Castillo, A., Teo, J. C., Chen, W. Nanotopographic Regulation of Human Mesenchymal Stem Cell Osteogenesis. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (48), 41794-41806 (2017).
  3. Naganuma, T. The relationship between cell adhesion force activation on nano/micro-topographical surfaces and temporal dependence of cell morphology. Nanoscale. 9 (35), 13171-13186 (2017).
  4. Han, J., Lin, K. H., Chew, L. Y. Study on the regulation of focal adesions and cortical actin by matrix nanotopography in 3D environment. Journal of Physics: Condensed Matter. 29 (45), 455101 (2017).
  5. Liu, X., Wang, S. Three-dimensional nano-biointerface as a new platform for guiding cell fate. Chemical Society Reviews. 43 (8), 2385-2401 (2014).
  6. Turner, L. A., Dalby, M. J. Nanotopography-potential relevance in the stem cell niche. Biomaterials science. 2 (11), 1574-1594 (2014).
  7. Driscoll, M. K., Sun, X., Guven, C., Fourkas, J. T., Losert, W. Cellular contact guidance through dynamic sensing of nanotopography. ACS nano. 8 (4), 3546-3555 (2014).
  8. Yim, E. K., Darling, E. M., Kulangara, K., Guilak, F., Leong, K. W. Nanotopography-induced changes in focal adhesions, cytoskeletal organization, and mechanical properties of human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 31 (6), 1299-1306 (2010).
  9. Davis, G. E., Senger, D. R. Endothelial extracellular matrix. Circulation research. 97 (11), 1093-1107 (2005).
  10. Nakayama, K. H., Surya, V. N., Gole, M., Walker, T. W., Yang, W., Lai, E. S., Ostrowski, M. A., Fuller, G. G., Dunn, A. R., Huang, N. F. Nanoscale patterning of extracellular matrix alters endothelial function under shear stress. Nano letters. 16 (1), 410-419 (2015).
  11. Bettinger, C. J., Zhang, Z., Gerecht, S., Borenstein, J. T., Langer, R. Enhancement of in vitro capillary tube formation by substrate nanotopography. Advanced materials. 20 (1), 99-103 (2008).
  12. Katz, B. Z., Zamir, E., Bershadsky, A., Kam, Z., Yamada, K. M., Geiger, B. Physical state of the extracellular matrix regulates the structure and molecular composition of cell-matrix adhesions. Molecular biology of the cell. 11 (3), 1047-1060 (2000).
  13. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
  14. Tajima, S., Chu, J., Li, S., Komvopoulos, K. Differential regulation of endothelial cell adhesion, spreading, and cytoskeleton on low-density polyethylene by nanotopography and surface chemistry modification induced by argon plasma treatment. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 84 (3), 828-836 (2008).
  15. Mohiuddin, M., Pan, H. A., Hung, Y. C., Huang, G. S. Control of growth and inflammatory response of macrophages and foam cells with nanotopography. Nanoscale research letters. 7 (1), 394 (2012).
  16. Kyle, D. J., Oikonomou, A., Hill, E., Bayat, A. Development and functional evaluation of biomimetic silicone surfaces with hierarchical micro/nano-topographical features demonstrates favourable in vitro foreign body response of breast-derived fibroblasts. Biomaterials. 52, 88-102 (2015).
  17. Seo, H. R., Joo, H. J., Kim, D. H., Cui, L. H., Choi, S. C., Kim, J. H., Cho, S. W., Lee, K. B., Lim, D. S. Nanopillar Surface Topology Promotes Cardiomyocyte Differentiation through Cofilin-Mediated Cytoskeleton Rearrangement. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (20), 16803-16812 (2017).
  18. Hwang, J. H., Lee, D. H., Byun, M. R., Kim, A. R., Kim, K. M., Park, J. I., Oh, H. T., Hwang, E. S., Lee, K. B., Hong, J. H. Nanotopological plate stimulates osteogenic differentiation through TAZ activation. Scientific Reports. 7 (1), 3632 (2017).
  19. Bae, D., Moon, S. H., Park, B. G., Park, S. J., Jung, T., Kim, J. S., Lee, K. B., Chung, H. M. Nanotopographical control for maintaining undifferentiated human embryonic stem cell colonies in feeder free conditions. Biomaterials. 35 (3), 916-928 (2014).
  20. Cui, L. H., Joo, H. J., Kim, D. H., Seo, H. R., Kim, J. S., Choi, S. C., Huang, L. H., Na, J. E., Lim, I. R., Kim, J. H. Manipulation of the response of human endothelial colony-forming cells by focal adhesion assembly using gradient nanopattern plates. Acta biomaterialia. 65, 272-282 (2017).
  21. Lee, W., Park, S. J. Porous anodic aluminum oxide: anodization and templated synthesis of functional nanostructures. Chemical reviews. 114 (15), 7487-7556 (2014).
  22. Masuda, H., Fukuda, K. Ordered metal nanohole arrays made by a two-step replication of honeycomb structures of anodic alumina. science. 268 (5216), 1466 (1995).
  23. Masuda, H., Satoh, M. Fabrication of gold nanodot array using anodic porous alumina as an evaporation mask. Japanese Journal of Applied Physics. 35 (1B), L126 (1996).
  24. Zaraska, L., Sulka, G. D., Jaskuła, M. The effect of n-alcohols on porous anodic alumina formed by self-organized two-step anodizing of aluminum in phosphoric acid. Surface and Coatings Technology. 204 (11), 1729-1737 (2010).
  25. Yang, K. Y., Kim, J. W., Byeon, K. J., Lee, H. Selective deposition of the silver nano-particles using patterned the hydrophobic self-assembled monolayer patterns and zero-residual nano-imprint lithography. Microelectronic engineering. 84 (5), 1552-1555 (2007).
  26. Park, B. G., Lee, W., Kim, J. S., Lee, K. B. Superhydrophobic fabrication of anodic aluminum oxide with durable and pitch-controlled nanostructure. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 370 (1), 15-19 (2010).

Tags

Биоинженерия выпуск 137 анодного оксида алюминия nanoimprint литография градиент nanopattern пластины внеклеточная матрица физической стимуляции человека эндотелиальные клетки образуя колонии
Изготовление градиента Nanopattern тепловой Nanoimprinting техникой и проверка реакции человека эндотелиальные клетки, образуя колонии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, D. H., Cui, L. H., Seo, H. R.,… More

Kim, D. H., Cui, L. H., Seo, H. R., Joo, H. J., Choi, S. C., Lim, D. S., Lee, K. B. Fabrication of Gradient Nanopattern by Thermal Nanoimprinting Technique and Screening of the Response of Human Endothelial Colony-forming Cells. J. Vis. Exp. (137), e57661, doi:10.3791/57661 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter