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Bioengineering

Fabrication de nanostructures Gradient thermique dispositifs Technique et dépistage de la réponse des cellules formatrices endothéliales humaines

Published: July 1, 2018 doi: 10.3791/57661
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 2, 2, 1
1School of Biomedical Engineering, Korea University, 2Department of Cardiology, Korea University Anam Hospital
* These authors contributed equally

Summary

Nous présentons ici un protocole pour la fabrication de plaques de nanostructures dégradé par l’intermédiaire de dispositifs thermiques et la méthode de dépistage des réponses des cellules progénitrices endothéliales humaines pour les nanostructures. En utilisant la technique décrite, il est possible de produire un échafaudage qui peut manipuler le comportement de la cellule par des stimuli physiques.

Abstract

Nanotopography se trouvent dans diverses matrices extracellulaires (ECMs) autour du corps et est connu pour avoir des mesures de réglementation importants sur les réactions cellulaires. Toutefois, il est difficile de déterminer la relation entre la taille d’une nanostructure et les réponses des cellules en raison du manque d’outils de dépistage approprié. Ici, nous montrons l’évolution des plaques de nanostructures gradient reproductible et rentable pour la manipulation des réponses cellulaires. À l’aide d’oxyde d’aluminium anodique (AAO) comme un maître moule, plaques de nanostructures dégradé avec nanopillars de diamètre croissant s’étend [120-200 nm (GP 120/200), 200-280 nm (GP 200/280) et 280-360 nm (GP 280/360)] ont été fabriquées par un thermique, technique d’impression. Ces plaques de nanostructures gradient ont été conçus pour imiter les différentes tailles de nanotopography dans l’ECM et ont été utilisés pour dépister les réponses des cellules endothéliales humaines formatrices (hECFCs). Dans ce protocole, nous décrivons la procédure étape par étape de fabrication de nanostructures gradient plaques pour cellule ingénierie, techniques de culture hECFCs de sang périphérique humain et culture hECFCs sur des plaques de nanostructures.

Introduction

Récemment, la réponse des cellules par la stimulation physique de topographie de surface a été mis en lumière dans le domaine de l’ingénierie cellulaire1,2,3,4. Par conséquent, plus d’attention s’est concentrée sur des nanostructures en trois dimensions à la surface d’accessoires cellule5. Il a été signalé que l’intégrine, qui est le dispositif de reconnaissance de surface de la cellule, transmet le stimulus physique entraîné par les structures micro-nano d’ECM par mécanotransduction6. Cette stimulation mécanique réglemente le comportement cellulaire par le biais de conseils contact7 et induit la réorganisation du cytosquelette à changer de forme, en plus des adhésions focales et de rigidité des cellules8.

Cellules progénitrices endothéliales humaines (hEPCs) dans le corps interagissent étroitement avec le microenvironnement des ECM environnantes9. Cela indique que l’état physique de l’ECM agit comme un paramètre important pour la formation d’un complexe adhérence cellule-matrice spécifique autant que la contrainte de cisaillement dérivés de sang flux10. Il est rapporté que nanotopography surface favorise la formation in vitro des réseaux vastes tube capillaire de hEPCs11 et qu’un facteur soluble ECM/bio système combiné permet aux hEPCs de reconnaître des substrats dysfonctionnels et favorise plaie de guérison12,13. Néanmoins, la relation entre ECM et hEPCs n’est pas clairement comprise.

Bien que de nombreux chercheurs a tenté de clarifier la relation entre les réponses des cellules et des repères physiques à partir de différents substrats14,15,16, ces études utilisé uniquement la taille fixe d’une nanostructure ou nanopatterns avec des dispositions irrégulières qui ont une limitation pour élucider la relation entre la taille du comportement nanostructure et cellule. Le problème, c’est un manque d’outils adaptés pour le dépistage des réponses cellulaires qui peuvent remplacer les méthodes existantes de fastidieux et itératives pour trouver la taille optimale de la nanostructure. Par conséquent, une technique simple est nécessaire pour le dépistage des réactions cellulaires sur les stimulations physiques sans répétition.

Nous décrivons ici une méthode utilisée dans nos précédents rapports17,18,19 pour produire un gradient nanostructures dans lequel le diamètre de la nanopillars arrangé augmente progressivement. En outre, nous avons également décrit comment cultiver et analyser le comportement des hECFCs sur des plaques de nanostructures dégradé pour déterminer l’effet de stimuli physiques sur les cellules. Un douce anodisation, gravure progressive et méthode de revêtement anti-collage couche ont été utilisées pour fabriquer moule AAO dégradé. En adoptant la technique de la lithographie d’impression thermique, nanopatterns gradients polystyrène identiques ont été produites de manière rentable et facile. À l’aide de nanopatterns dégradé, il est possible de déterminer quelle taille de nanostructure a une grande influence sur le comportement de la cellule dans un ensemble d’expérience. Nous prévoyons que ce gradient nanostructures sera utile pour comprendre les mécanismes d’interaction entre hECFC dérivés du sang ou autres cellules et des nanostructures de différentes tailles.

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Protocol

Cette étude a été approuvée par l’Institutional Review Board à Korea University Hospital Anam (IRB no ED170495). Toutes les procédures ont été effectués conformément à la déclaration d’Helsinki et ses amendements ultérieurs.

1. préparation du substrat d’aluminium (Al) par polissage électrolytique

Mise en garde : Solution de polissage électrolytique est corrosif et toxique. Porter des équipements de protection individuelle, y compris les gants en nitrile, lunettes et blouse de laboratoire. Effectuez cette étape sous une hotte.

  1. Préparer la solution de polissage électrolytique en mélangeant éthyl alcool (C2H5OH, 99,9 %) et l’acide perchlorique (HClO4, 60 %) dans un bécher de 1 L double enveloppe (C2H5OH:HClO4 = 4:1).
  2. Connectez le gobelet double enveloppe à un circulateur et régler la température à 7 ° C. Placer le bécher de gaine double sur un agitateur magnétique. Laissez la solution sous agitation pendant au moins 30 min jusqu'à ce que la température descend à 7 ° C.
  3. Plonger la plaque Al ultrapure (99,999 %, 20 × 50 × 1 mm3) et carbone contre-électrode dans la solution de polissage électrolytique à l’aide de pinces crocodile et fil de cuivre. Ajustez la position de la plaque de Al et la contre-électrode carbone pour faire face à l’autre.
    Remarque : Il est nécessaire d’installer les clips avec précaution pour ne pas toucher la solution. Au contact de la solution, impuretés écoule des clips peuvent contaminer la plaque de l’Al.
  4. Brancher la plaque de Al à la borne positive et la contre-électrode carbone à la borne négative, alimentation de courant continu (DC).
  5. Désactiver l’agitateur magnétique et appliquer une tension de 20 c. de maintenir cet État pendant 4 min.
  6. Mettre sur l’agitateur magnétique et attendre le courant de circuler pendant 6 min.
    Remarque : La condition statique supprime la plupart des impuretés et rugosité de la plaque d’Al, et la condition dynamique améliore la qualité finale de l’électropolissage.
  7. Coupez l’alimentation électrique et séparer manuellement la plaque Al du clip. Rigoureusement laver la plaque de Al à eau déionisée pour éliminer tous les reste de la solution.
  8. Sécher la plaque Al d’azote et de stocker sous gaz inerte. Conduite de ce processus de séchage à la fin de toutes les expériences à l’étape 1 et 2.
    Remarque : Lors de l’injection d’air comprimé, se débit d’air de la partie polie vers le côté opposé. Dans le cas contraire, impuretés peuvent échapper à la partie non poli et contaminer la plaque de l’Al.

2. fabrication de moule AAO dégradé avec électrolyte acide phosphorique

Mise en garde : Alcool méthylique et ses vapeurs sont toxiques oculaire. Peut entraîner une exposition continue au chrome chrome grave empoisonnement. Effectuez cette étape sous une hotte.

  1. Anodisation primaire
    1. Pour préparer 1 L de l’électrolyte acide phosphorique, charger 590 mL d’eau désionisée dans une bouteille en verre.
    2. Ajouter 400 mL d’alcool méthylique (CH3OH, 99 %) et 10 mL d’acide phosphorique (H3PO4, 85 %) dans la bouteille en verre. Mélanger la solution bien en secouant manuellement ou avec agitateur magnétique.
    3. Versez 500 mL de l’électrolyte dans un bécher de 1 L double enveloppe. Plongez le poli Al plaque et carbone contre-électrode dans la solution avec pinces crocodiles et fil de cuivre.
    4. Versez les électrolytes supplémentaires pour rechercher la limite d’électropolissage 2 à 3 mm au-dessus de la surface de la solution.
      Remarque : Si anodisation est effectuée avec la limite de l’électropolissage touchant la solution, la plaque de Al a tendance à brûler au cours de l’anodisation.
    5. Installer un puits vertical sur un piédestal en u. Joignez un agitateur généraux et rotor en utilisant des pinces métalliques. Placez l’hélice de la roue près de l’extrémité inférieure des deux électrodes. Régler la vitesse de rotation de l’agitateur généraux entre 200 et 300 tr/min.
    6. Connectez le gobelet double enveloppe à un circulateur et régler la température à-10 ° C. Laisser le système pendant au moins 1 h en remuant jusqu'à ce que la température descend à-10 ° C.
      Remarque : Ne pas utiliser l’eau comme liquide de refroidissement. Parce que l’eau gèle à basse température, la circulation ne fonctionnera pas normalement. Il est recommandé d’utiliser un mélange d’eau et d’alcool éthylique à un ratio de 1:1 comme liquide de refroidissement.
    7. Appliquer une tension de 195 V sous agitation pendant 16 h.
      Remarque : Si le courant s’élève à plus de 50 mA au sein de 2 ou 3 h après l’application de la tension, la probabilité que brûlant se produise est très élevée. Immédiatement arrêter le processus et remplacer la plaque Al par une Neuve. Si ce problème se produit à plusieurs reprises, vérifiez qu’il n’y a aucune anomalie dans le contrôle de la température du circulateur. S’il n’y a aucune anomalie, changer l’électrolyte.
    8. Arrêter l’alimentation électrique et séparer manuellement la plaque Al du clip. Laver la plaque Al anodisée avec de l’eau déionisée pour enlever tous les reste de la solution.
  2. Gravure d’alumine
    1. Préparer l’acide chromique solution de gravure en dissolvant 9,0 g d’oxyde de chrome (CrO3) et 20,3 mL d’acide phosphorique (H3PO4, 85 %) dans 500 mL d’eau désionisée.
    2. Verser la solution de décapage dans le bécher de gaine double 1 L. Réglez la température à 65 ° C.
    3. Plonger la plaque Al anodisée dans la solution de décapage pendant au moins 10 h sous agitation. Sceller la partie supérieure du gobelet avec du papier aluminium.
    4. Rincez la plaque Al gravée plusieurs fois avec de l’eau désionisée.
  3. Anodisation secondaire
    1. Définissez les mêmes conditions expérimentales comme étape 2.1.1 à 2.1.7.
    2. Charger la plaque Al gravée à l’anode du système et d’appliquer une tension de 195 V pendant 6 h. Ensuite, coupez l’alimentation électrique et séparer manuellement la plaque Al du clip. Laver immédiatement la plaque Al anodisée avec de l’eau désionisée.
      Remarque : Lorsque le temps de lavage est retardé, la taille des pores de l’AAO augmente involontairement en raison de l’acide phosphorique résiduelle.
  4. Élargissement des pores dégradé
    1. Préparer une solution étendue de pore en dissolvant 5,765 g d’acide phosphorique dans 500 mL d’eau désionisée. Versez la solution dans un bécher de 1 L double enveloppe.
    2. Connectez le gobelet double enveloppe pour le circulateur et régler la température à 30 ° C. Placez une phase de mouvement linéaire verticalement à côté le bécher. Fixer un support à la partie mobile de l’étape linéaire.
    3. Définir la partie mobile de la phase linéaire à la position d’origine. Fixez le clip sur le support puis charger la plaque Al anodisée.
    4. Manipuler manuellement la position de la plaque de Al afin que la plaque Al viendra juste au-dessus de la surface de la solution.
      Remarque : Dans cette étape, la plaque Al ne doit pas toucher la solution. Le pore élargissant le processus commence dès que la plaque de Al est la solution.
    5. Plongez progressivement la plaque Al dans la solution à une vitesse de 4,86 µm/s pendant 120 min faire un moule AAO de 35 mm avec une taille de gradient de 120 nm à 200 nm (GP 120/200). Déclencher un chronomètre pour le moment que la plaque Al touche la surface de la solution.
    6. Pour faire des moules GP 200/280 et GP 280/360, immerger la zone entière du moule de la GP 120/200 dans le pore élargissement solution pour 2 ou 4 h, respectivement.
    7. Rincez la plaque Al dégradée plusieurs fois avec de l’eau désionisée.

3. dépôt de couche anti-collage sur moule AAO dégradé avec des monocouches auto-assemblées

Remarque : Effectuez les étapes 3.2.1 à 3.3.3 dans une boîte à gants. Connecter une pompe à vide et un injecteur de gaz azote sec à la boîte à gants. Placer tous les échantillons, réactifs et appareils dans la boîte à gants avant le processus de déshumidification. Répétez le cycle d’injection de gaz d’évacuation et de l’azote plus de trois fois pour bien enlever l’humidité de la boîte à gants. Laissez l’azote sec débit à travers l’expérience.

  1. Modification d’hydroxyle du moule AAO avec traitement Piranha
    1. 140 ml d’acide sulfurique (H2SO4, 95 %) dans un bécher de polytétrafluoroéthylène (PTFE). Ajouter 60 mL de goutte à goutte de peroxyde d’hydrogène (H2O2, 30 %). Laissez-le pendant 30 min jusqu'à ce que la solution refroidie.
      Mise en garde : Être extrêmement prudent lors de la solution de Piranha. Partir du moment de l’ajout de peroxyde d’hydrogène, la solution vigoureusement bouille et génère des températures élevées. Réaliser l’expérience sous une hotte.
    2. Immerger le moule de l’AAO dans la solution pendant 30 s à l’aide d’une pince métallique.
    3. Rincer le moule de l’AAO plusieurs fois avec de l’eau désionisée. Faire tremper le moule dans l’eau désionisée pendant 30 min et le mettre dans l’alcool méthylique pour un autre 30 min.
      Mise en garde : Lorsqu’il se défait de la solution utilisée de Piranha, diluer la solution avec une grande quantité d’eau du robinet.
    4. Sécher complètement le moule de l’AAO sous vide pendant 3 h.
  2. Préparation de solution-mère HDFS × 20
    Remarque : HDFS est l’abréviation de (heptadécafluorooctanesulfonamide-1,1,2,2-tétrachloroéthane, - tetrahydrodecyl) dimethylchloro-silane
    1. Remplir un tiers d’une bouteille de n-hexane 1 L avec des tamis moléculaires. Sceller la bouteille avec le film de paraffine et stocker sous azote sec pendant 24 h.
    2. Filtrer les 200 mL de n-hexane à l’aide d’une seringue en verre et filtre seringue en PTFE 0,2 µm.
    3. Verser le 80 mL de n-hexane filtré dans un flacon de verre de 100 mL. Ajouter 2 mL de HDFS.
  3. Dépôts de monocouches auto-assemblées
    1. Charger 57 mL de n-hexane filtrée dans un bécher de 100 mL. Plongez le moule de l’AAO dans le solvant.
    2. Ajouter 3 mL de solution mère HDFS pour le n-hexane pour rendre la solution HDFS 2,9 mM. Attendre 10 min pour la réaction de procéder.
    3. Transférer le moule de l’AAO au frais n-hexane. Fermez et scellez tous les flacons de réactifs. Fermer le robinet d’azote, puis tirez sur des échantillons de la boîte à gants.
      Remarque : HDFS est extrêmement sensible à l’humidité. Conserver tous les réactifs qui contiennent HDFS dans un dessicateur.
    4. Faire tremper le moule de l’AAO dans 60 mL de methoxynonafluorobutane (C10H6F18O2, 99 %). Nettoyage ultrasons le moule de l’AAO dans un bécher pour 10 s par un temps d’enlever physiquement adsorbée molécules HDFS. Répéter la procédure de nettoyage 10 fois.
      Remarque : Exposant le moule de l’AAO à ultrasons pendant un long moment sans intervalles risquent d’endommager la couche d’oxyde.
    5. Sécher complètement le moule de l’AAO sous vide pendant 24 h.
      Remarque : Une couche anti-collage avec succès déposée est super hydrofuge et stable pendant des mois, lorsqu’il est stocké dans un dessicateur. Le protocole peut être suspendu ici.

4. fabrication des plaques de nanostructures dégradé par impression thermique

Remarque : Effectuez les étapes de 4,2 à 4,7 dans une salle blanche.

  1. Couper une feuille de polystyrène épaisseur 1,1 mm pour une taille de 2,9 mm de largeur de 3,7 mm de long à l’aide d’un coupeur de carte de circuit imprimé.
  2. Couper le moule de l’AAO 35 mm du fond à l’aide d’une pince. Marquer le nom de l’échantillon et la date de fabrication sur le dos.
  3. Nettoyer une plaquette de 8.0" avec une petite dose d’alcool éthylique. Mettre les feuilles de polystyrène sur la plaquette, puis fixer le moule de l’AAO.
  4. Mettre le film inférieur dans le tiroir d’une imprimante thermique. Fixez la pellicule sur le joint.
  5. Mettre la plaquette sur le film inférieur. Placer le joint sur la plaquette. Assurez-vous qu’il n’y a pas de poussière sur la plaquette.
  6. Fermer le tiroir de l’imprimante thermique. S’appliquent à 165 ° C, de la chaleur et 620.52 kPa de pression pour 100 s.
  7. Refroidir l’échantillon à la température ambiante. Tourner doucement la feuille de polystyrène pour libérer le moule de l’AAO.

5. stérilisation et hydrophile Modification des plaques de nanostructures dégradé

  1. Placer les plaques de nanostructures sur une assiette carrée. Verser 100 mL d’alcool éthylique à 70 % et l’exposer aux rayons ultraviolets pendant 30 min.
  2. Sécher les plaques de nanostructures à l’azote. Les plaques de nanostructures de transfert à un générateur de plasma d’oxygène.
  3. Évacuer la chambre jusqu'à ce qu’il atteigne 1,33 PA. Ensuite, injecter de l’oxygène à un taux de 30 cm3/min. Appliquez une puissance de radiofréquence de 60 w. maintenir le plasma d’oxygène pour 90 s.
    Remarque : Il est recommandé d’utiliser des plaques de nanostructures imprégnées de plasma dans les 14 jours.
  4. Fixez la plaque de nanostructures au fond d’un plat de culture cellulaire à l’aide d’une goutte de toluène.
  5. Sceller les échantillons dans un sachet et stériliser avec stérilisateur à plasma à basse température.

6. la culture du hECFCs

Remarque : Effectuer toutes les procédures de centrifuger à 4 ° C, sauf indication contraire.

  1. Avant d’isoler le sang périphérique des cellules mononucléaires (PBMC), Incuber un plat enduit de collagène 12 puits culture à 37 ° C pendant 1 h.
  2. Laver le plat de 12 puits de culture à l’aide de 1 × salin de stérile tamponnée au phosphate (PBS).
  3. Recueillir 50 mL de sang humain à l’aide d’un tube d’inhibiteur de l’héparine.
  4. Mettre 6 mL de solution de polysaccharide hydrophile dans un tube de 15 mL et ajoutez 8 mL de sang à la solution de polysaccharide hydrophile.
    Remarque : Pipetter lentement le sang dans la solution de polysaccharide hydrophile.
  5. Centrifuger le tube à 1020 x g pendant 20 min granuler les cellules.
  6. Récolter la couche cellulaire opaque et transférer dans un nouveau tube de 15 mL.
  7. Ajouter 10 % sérum fœtal (SVF)-contenus PBS et centrifuger le tube à 1020 x g pendant 10 min granuler les cellules.
  8. Retirez le surnageant et ajouter le tampon de lyse des globules rouges. Rester sur la glace pendant 5 min.
  9. Ajouter 10 % FBS-contenus PBS et centrifuger le tube à 1020 x g pendant 5 min granuler les cellules.
  10. Retirez le surnageant et ajouter 10 % FBS-contenus PBS. Centrifuger le tube à 1020 x g pendant 5 min granuler les cellules.
  11. Retirez le surnageant et ajouter 1 mL de cellules endothéliales expansion milieu additionné de 10 % FBS. Graines de 8,0 × 106 cellules / puits pour chaque plat enduit de collagène.
  12. Changer le milieu de culture tous les jours pendant 1 semaine. Modifiez ensuite le milieu de culture tous les 2 jours.
    Remarque : hECFCs peut être trouvé après culture jour 10-14. hECFCs Voir la morphologie typique pavées et former une colonie que l'on peut observer en microscopie à contraste de phase. Immunofluorescence souillant de cadhérine endothéliale vasculaire (CD144) et le facteur de von Willebrand (vWF) peut être également exécutée pour la caractérisation de la hECFCs après la poursuite de l’expansion cellulaire.
  13. Pour cultiver le hECFCs, utilisez des cellules endothéliales expansion moyenne additionnée de 5 % FBS et pénicilline/streptavidine à 37 ° C en atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2. Remplacer le support une fois par jour.
  14. Après l’induction de la hECFC, poussent les cellules au passage 7 pour d’autres expériences.

7. ensemencement de cellules et de la Culture sur les plaques de nanostructures dégradé

Remarque : Étape 7 décrit la culture des hECFCs sur la plaque de nanostructures dégradé, mais les autres sources de cellules peuvent également être utilisés.

  1. Enduire les plaques de nanostructures dégradé avec 1 mL de solution de revêtement de protéine de 0,1 % dans du PBS pendant 10 min à température ambiante.
    Remarque : Le revêtement de protéine 0,1 % ne couvre pas les fonctionnalités de nanopillar.
  2. Préparer une suspension de hECFCs de la boîte de Pétri par une méthode de fractionnement cellulaire standard à l’aide de la trypsine.
  3. Diluer la suspension cellulaire pour atteindre le confluent désiré. Les semences du hECFCs sur les plaques de nanostructures dégradé et contrôle plat (p. ex., 1,0 × 104 cellules/cm2).
    Remarque : Lorsque hECFCs sont injectées à 1,0 × 104 cellules/cm2 sur plaques de nanostructures dégradé, la confluence de la cellule atteint généralement à 70-80 % après 2 jours.
  4. La culture des cellules sur des plaques plates ou dégradé nanostructures pour 2 jours dans l’incubateur.

8. observation et analyse

  1. Imagerie du microscope électronique à balayage (SEM)
    1. Difficulté hECFCs cultivés sur plaques de nanostructures plat ou dégradées avec le glutaraldéhyde à 2,5 % à 4 ° C pendant une nuit.
    2. Traiter le tétroxyde d’osmium 1 % pendant 1 h à température ambiante. Laver les échantillons avec du PBS.
    3. Déshydrater les échantillons avec de l’alcool éthylique de faible à forte concentration (50 %, 70 %, 80 %, 90 % et 100 %) pendant 10 min par chaque étape.
    4. Traiter l’hexaméthyldisilazane (HMDS) pendant 15 min à température ambiante. Après cela, laver échantillons avec HMDS fraîche et laisser des échantillons sous la hotte au moins 1 jour, jusqu'à ce que le HMDS résiduel s’évapore complètement.
    5. Enrober les échantillons avec platine par pulvérisation cathodique coater pendant 5 min et examiner les échantillons avec une SEM
  2. Imagerie de transmission electron microscope (TEM)
    1. Difficulté hECFCs cultivé sur des plaques de nanostructures plat ou dégradées avec 2 % paraformaldéhyde et 2,5 % mélange de glutaraldéhyde dans du PBS à 4 ° C pour la nuit.
    2. Effectuer après fixation à l’aide de 1 % le tétroxyde d’osmium et déshydrater les échantillons à l’aide de la méthode en 8.1.3.
    3. Incorporer des échantillons en résine époxy. Faire des coupes épaisses de 60 nm de blocs et placez une section sur une grille TEM.
    4. Tache de la section avec un mélange d’acétate d’uranyle 10 mg dans 100 mL d’alcool méthylique et citrate de plomb 0,1 mg dans 100 mL d’eau distillée. Obtenir des images avec un TEM.
  3. Coloration de fluorescence
    1. Difficulté hECFCs cultivé sur des plaques de nanostructures plat ou dégradé avec 4 % de paraformaldéhyde à température ambiante pendant 15 min.
    2. Permeabilize et bloquer les échantillons avec 5 % chèvre sérum et 0,1 % octylphénol éthoxylé dans PBS (PBST) à température ambiante pendant 30 min.
    3. Incuber les échantillons avec anti-homme vinculine anticorps primaire (1/500 dans le PBST) à température ambiante pour échantillons de rinçage 2 h. trois fois avec PBST.
    4. Incuber les échantillons avec la phalloïdine conjugué à fluorescence (1 / 1 000 dans le PBST), fluorescence-conjugués anticorps secondaire (1 / 1 000 dans le PBST) à température ambiante pour échantillons de rinçage 2 h. trois fois avec PBST.
    5. Incuber les échantillons avec 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, 1 : 1 000 dans le PBST) à température ambiante pendant 5 min.
    6. Déposer 10 µL de milieu de montage sur la surface de nanostructures dégradé. Placez une lamelle sur le milieu de montage.
    7. Placer l’échantillon à l’envers sur la scène de l’échantillon et d’acquérir des images à l’aide de microscope confocal fluorescence.
  4. Analyse d’images
    1. Transférer les photos prises de la hECFCs à un système d’analyse des images.
    2. Choisissez le champ aléatoire de la phalloïdine, image de coloration. Régler le seuil et créer une image binaire, dans lequel les cellules sont distinguent par le fond.
    3. Dessiner des contours autour des cellules pour mesurer la cellule aire et le périmètre et dénombrer manuellement les filopodes par cellule.
    4. Choisissez le champ aléatoire de vinculine image de coloration. Régler le seuil et créer une image binaire des zones d’adhérence focale.
      Remarque : Réglez correctement seuil d’image pour éviter l’artificiel plus - ou moins - filling des zones d’adhérence focale.
    5. Compter le nombre d’adhérence focale de chaque cellule.

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Representative Results


La figure 1 montre des images de la SEM des moules AAO gradients fabriqués selon leur type et leur position. Figure 2 montre les images de la SEM des plaques de nanostructures dégradé avec nanopillars arrondies régulières, et la Figure 3 est données de quantification du diamètre nanopillar. Le tableau 1 répertorie les caractéristiques de la nanopillars préfabriqués.

Figure 4 a montre le schéma de production de dérivés du sang hECFCs. Figure 4 b montre l’image de contraste de phase de thecultivated hECFCs. La figure 4 montre hECFC marqueurs colorés avec CD144 (vert), vWF (rouge) et le noyau (en bleu). Figure 5 a montre des images représentatives de SEM de hECFCs après 2 jours de culture sur le plat, la GP 120/200, GP 200/280 et plaques GP 280/360. Figure 5 b et C représentent des données quantitatives sur la cellule aire et périmètre par rapport à l’appartement. Les données de quantification a révélé que les cellules cultivées sur des surfaces de nanopillar de plus petite taille ont montré cellulaire réduite aire et le périmètre. La figure 5 est les images représentatives de la SEM de hECFCs qui montrent la morphologie des filopodes existants. 5E de la figure représente les données quantitatives sur les filopodes nombre par rapport à l’appartement. L’excroissance des filopodes significative a été observée chez les cellules cultivées sur la GP 120/200, tandis qu’aucune variation significative a été observée chez GP200/280 ou GP280/360 par rapport à l’appartement. Figure 5F montre des images TEM représentatives de hECFCs après 2 jours de culture sur des plaques de nanostructures plat et dégradé.

Figure 1
Figure 1. Gradient moule AAO. Images de SEM de gradient AAO moules pour plaques GP 120/200, 200/280 de GP et GP 280/360 selon la position de moules. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 . Plaques de nanostructures dégradé. Images de SEM de plaques de nanostructures gradient pilier-type pour les plaques GP 120/200, 200/280 de GP et GP 280/360 selon la position des plaques. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 . Gradient de taille de diamètre nanopillar. Données de quantification montrant le gradient de nanopillar diamètres pour GP 120/200, 200/280 de GP et GP 280/360 plaques, respectivement. Barres représentent les écart-type. Ce chiffre a été modifié de [Acta Biomaterialia] 20. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Module de Young (GPa) Diamètre Nanopillar (nm) Nanopillar Pitch (nm) Distance de centre à Centre (nm) Hauteur de Nanopillar (nm) Rigidité Nanopillar (N/m)
Plat 2.43±0.19 – – – – –
GP 120/200 1.74±0.11 120-200 320-240 440 276.9±21.9 9.35
GP 200/280 2.01±0.05 200-280 240-160 440 268.1±25.9 55,78
GP 280/360 2.1±0.13 280-360 160-80 440 293.6±23.6 134.15

Tableau 1. Caractéristiques des préfabriqués nanopillars. Données quantifiées indiquant le module de Young, diamètre, hauteur, distance Centre à Centre, hauteur et la raideur de nanopillars fabriquées. Ce tableau a été modifié de [Acta Biomaterialia] 20.

Figure 4
Figure 4 . Caractérisation des hECFCs. (A) annexe affichage Diagramme schématique des hECFCs dérivés du sang périphérique adult. (B) Phase contrast image de colonie de hECFC, dérivé de sang périphérique adult le 14e jour. (C) les images par immunofluorescence montrant CD144 (vert), vWF (rouge) et le noyau de la cellule colorent au DAPI (bleu). Ce chiffre a été modifié de [Acta Biomaterialia] 20. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 . hECFCs cultivés sur le plat et le gradient de nanostructures plaques durant 2 jours. (A) image de SEM représentatif de hECFCs cultivé sur des plaques plane, GP 120/200, 200/280 de GP et GP 280/360. (B et C) Données de quantification de l’aire et le périmètre de hECFCs (n = 50). * p <.05 par rapport à l’appartement. (D) les images de SEM représentatif du bord d’attaque des hECFCs sur des plaques de nanostructures plat et dégradé. (E) données de Quantification du nombre des filopodes par un hECFC (n = 20). * p <.05 par rapport à l’appartement. (F) image représentant TEM de hECFC cultivés sur un plat et nanostructures gradient plaques. Flèches blanches indiquent les points d’interaction entre hECFCs et le substrat de la surface. Ce chiffre a été modifié de [Acta Biomaterialia] 20. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Complémentaire Figure 1. Angle de contact de l’eau de l’AAO Immaculée et HDFS traités AAO. Mesures d’angle de contact présentant des propriétés hydrophobes du HDFS self-assembled monocouche (A) avant et, (B) après le traitement. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.

Supplémentaires Figure 2. Images de SEM de plaques de nanostructures gradient fabriqué avec le même moule AAO. Comparatif image SEM définit pour vérifier la durabilité des moisissures de l’AAO. (A) Gradient nanostructures tôles fabriquées avec de la moisissure fraîchement préparé. (B) plaque de nanostructures de Gradient produite avec de la moisissure de l’AAO après imprégnation de 15 fois. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.

Supplémentaire Figure 3. Influence du revêtement protéique. Images de SEM de hECFCs qui ont été cultivés sur des nanostructures gradient GP 120/200, GP 200/280 ou GP 280/360 plaques (A) sans ou (B) avec le revêtement de la protéine. Ce chiffre a été modifié de [Acta Biomaterialia] 20 S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.

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Discussion

Fabrication d’un AAO souvent souffre de défauts tels que fissures, des formes irrégulières des pores et brûlant. La principale raison de ces défauts est appelée une répartition électrolytique, qui est fortement affectée par la nature des substrats métalliques étant anodisé et la résistivité de l' électrolyte21. Étant donné que la résistivité de l’électrolyte varie en fonction de sa température, éliminer la chaleur en continu des électrodes est le point critique pour maintenir la température de l’électrolyte de localisation stable dans une telle condition anodisation haute tension. Dans ce protocole, nous avons fabriqué moules AAO en modifiant en deux étapes anodisation22,23 de Masuda. Remplacement de presque la moitié de l’électrolyte avec alcool méthylique non seulement empêche l’électrolyte en gel à basse température mais prive également l’électrode de chaleur par évaporation au fond des pores24. La raison à l’aide d’un agitateur généraux et la roue au lieu d’un agitateur magnétique est aussi d’assurer le contrôle de la température. L’agitateur magnétique typique a une forte probabilité de marche au ralenti en raison de l’alignement accidentel de la barre aimantée pendant le fonctionnement à long terme. Ce problème provoque la mauvaise circulation de l’électrolyte, augmentant sa température et conduisant à la combustion.

Pour donner un gradient de taille au moule AAO, nous plongé progressivement l’AAO dans un solution de mordançage à l’acide phosphorique. Les pores sont élargies proportionnellement à la fois que l’AAO reste dans la solution de décapage, comme illustré à la Figure 1. Dans ces conditions, le taux moyen de pore-élargissement est 0,67 nm/min. manipuler l’immersion vitesse et le temps va changer la pente de la diamètre de pore dégradé et maximum de taille de l’AAO. Le diamètre des pores possible maximale est de 400 nm. Lorsque le diamètre des pores est supérieur à 400 nm, le mur de l’espacement entre les pores devient si mince qu’il ne peut tolérer la pression au cours du processus d’impression thermique.

Un monocouches auto-assemblées HDFS est connu pour être en mesure d’ajouter une propriété hydrophobe à la surface matérielle25. La molécule HDFS fait une liaison covalente forte avec les groupements hydroxyles sur la surface de l’AAO introduite par le traitement de Piranha26. Par conséquent, comme le montre supplémentaire Figure 1, un solide monocouches auto-assemblées peut être formé lorsqu’un grand nombre de groupes hydroxyles est présent sur la surface du substrat. Pour une qualité optimale avec une monocouches auto-assemblées HDFS, nous suggérons de mener la réaction dans une atmosphère déshumidifiée. Lorsque HDFS est exposé à l’humidité, une réaction secondaire avec de l’eau forme des dimères, trimères et oligomères même des molécules de silane et diminue la qualité globale de la monocouches auto-assemblées.

À utiliser le moule AAO avec un gradient de taille dans les dispositifs thermiques, plaques de culture cellulaire avec une pente de nanopillars ont été obtenus Figure 2 et Figure 3. La méthode thermique uns a un avantage qu’il peut produire une grande quantité de plaques de nanostructures identiques à l’aide d’un moule de maître AAO. Complémentaire de la Figure 2 montre qu’il n’y a aucune différence dans la qualité de la nanostructures produites, même après quinze processus d’empreinte, par rapport à la nanostructures produites par le nouveau moule AAO. La raison du choix de polystyrène comme matériau pour transférer un nanostructures est que le polystyrène a une température de transition de verre (100 ° C) pour l’impression thermique, et il est largement utilisé dans les récipients de culture de cellule commerciale en raison de sa Propriétés transparentes et non toxiques.

Il est difficile de fabrication de nanostructures à haut rapport d’aspect à l’aide de la méthode de dispositifs thermiques. Parce que, quand les conditions de processus, telles que l’augmentation de pression et de temps, le moule devient profondément ancré dans le substrat polymère, rendant difficile de distinguer le moule du substrat. Il est donc très difficile de produire des nanopatterns ayant un aspect ratio de 1:3 ou plus en utilisant notre technique de dispositifs. Toutefois, selon les images TEM, nous avons observé la Figure 5, nous avons découvert un fait intéressant que la membrane des cellules sur nanopatterns n’était pas en contact avec le fond de la nanomotif. En d’autres termes, tous les stimuli physiques qui permettent de manipuler une réponse des cellules étaient provenaient les parties supérieures des nanostructures. Donc, dans cette étude, nous n’avons pas à examiner le rapport d’aspect dans l’étude des réactions de la cellule à la nanostructures. Comme le montre supplémentaire Figure 3, 0,1 % solution de revêtement protéique eu aucune influence sur la fixation de hECFCs sur les surfaces nanopillar. En outre, ces stimuli minimisations des plaques nanostructures gradient diminue la cellule aire et le périmètre de la hECFCs et l’excroissance des filopodes accrue Figure 5.

En résumé, nous avons établi des plaques de nanostructures dégradé en manipulant une réponse des hECFCs in vitro. Pour savoir exactement quelle taille de nanostructures, les cellules sont grandement touchés, une œuvre future est nécessaire pour concevoir un nanopillar format cellule-spécifique en ajustant la pente du diamètre taille dégradé et minima-maxima de la nanopillars. Nous espérons que ce gradient nanostructures pour être un outil fascinant à l’écran de l’interaction entre les cellules et nanostructures ainsi que de fournir des niches cellulaire avancé dans lequel nanostructures peut être ajustée librement dans la taille.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le programme de recherche de sciences fondamentales grâce à la Fondation de la recherche nationale de Corée (NRF) financé par le ministère de l’éducation, Science et technologie (MEST) [FRO-2015R1D1A1A01060397] et Bio & développement de la technologie médicale Programme de la NRF, financée par le ministère de la Science, TIC & avenir planification [FRO-2017M3A9C6029563].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Perchloric acid 60% Daejung Chemicals & Metals 6512-4100
Ethyl alcohol, absolute 99.9% Daejung Chemicals & Metals 4118-4100
Phosphoric acid 85% Daejung Chemicals & Metals 6532-4400
Methyl alcohol 99.5% Daejung Chemicals & Metals 5558-4400
Chromium(VI) oxide Daejung Chemicals & Metals 2558-4400
Sulfuric acid 95% Daejung Chemicals & Metals 7781-4100
Hydrogen peroxide 30% Daejung Chemicals & Metals 4104-4400
n-hexane 95% Daejung Chemicals & Metals 4081-4400
Toluene 99.5% Daejung Chemicals & Metals 8541-4400
(heptadecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrodecyl)dimethylchlorosilane Gelest SIH5840.4 Moisture sensitive
Methoxynonafluorobutane 99% Sigma aldrich 464309
Collagen solution Stemcell #4902
Gelatin Sigma aldrich G1890 Protein coating solution
Ficoll-Paque GE Heathcare 17-1440-03 Hydrophilic polysaccharide solution
EGM-2MV Lonza CC-3202 Endothelial cell expansion medium
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
Phosphate buffered saline Gibco 10010031
Fetal bovine serum Gibco 12483-020
Paraformaldehyde Sigma aldrich P6148
Glutaraldehyde Sigma aldrich G5882-100ML
Osmium tetroxide Sigma aldrich 201030-1G
Hexamethyldisilazane Sigma aldrich 440191
Triton X-100 Sigma aldrich X100-100ML Octylphenol ethoxylate 
Goat serum Gibco 26050-088
anti-human vinculin primary antibody  Sigma aldrich V9131
F-actin probe Molecular Probes A12379 Fluorescence-conjugated phalloidin
Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody Molecular Probes A11001 Fluorescence-conjugated secondary antibody 
4',6-diamidino-2-phenylindole  Sigma aldrich D9542
Mounting medium DAKO S3023
Anti-human vWF primary antibody  DAKO A0082
Anti-human CD144 primary antibody  BD Biosciences #555661
Eponate 12™ Embedding Kit, with BDMA Ted Pella 18012 Epoxy resin
Uranyl Acetate, 25g Ted Pella 19481
Lead Citrate, Trihydrate, 10g Ted Pella 19312
Ultra pure aluminum plate Goodfellow 26050-088
Polystyrene sheet Goodfellow ST313120
8.0" silicon wafer Siltron 29-01024-03 Single side polished, 725 µm thick
Vacuum desiccator, 4.4 L Kartell KA.230
Vacuum pump Vacuumer V3.VOP100
Power supply Unicorntech UDP-3003
Magnetic stirrer Daihan scientific SL.SMS03022
Overhead stirrer Daihan scientific HT120DX
Circulator Daihan scientific WCR-P12
Linear moving stage Zaber A-LSQ300A-E01-KT07
Angle bracket, 90 degrees Zaber AB90M Accessory of the linear moving stage
PMP forcep, 145 mm Vitlab 67995 Nonmetallic tweezer
PTFE beaker, 250 mL Cowie CW007.25
Ultrasonic cleaner Branson B2510MTH
PCB cutter Hozan Tool Industrial K-110
Nanoimprint device Nanonex NX-2000
Oxygen plasma generator Femto Science CUTE
Low temperature sterilizer Lowtem Crystal 50
CO2 Incubator Panasonic MCO-18AC
Confoal laser scanning microscope Carl Zeiss LSM700
Scanning electron microscope JEOL JSM6701
Transmission electron microscope Hitachi H-7500

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References

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