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Bioengineering

Fabbricazione di GNSM gradiente termico Nanoimprinting tecnica e Screening della risposta delle cellule endoteliali umane formanti colonie

Published: July 1, 2018 doi: 10.3791/57661
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 2, 2, 1
1School of Biomedical Engineering, Korea University, 2Department of Cardiology, Korea University Anam Hospital
* These authors contributed equally

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per la fabbricazione di piastre gradiente GNSM via nanoimprinting termica e il metodo di screening risposte di cellule progenitrici endoteliali umane alle nanostrutture. Utilizzando la tecnologia descritta, è possibile produrre un ponteggio che può manipolare il comportamento delle cellule di stimoli fisici.

Abstract

Nanotopography può essere trovato in varie matrici extracellulari (ECMs) intorno al corpo ed è conosciuto per avere importanti atti normativi su reazioni cellulari. Tuttavia, è difficile da determinare la relazione tra le dimensioni di una nanostruttura e le risposte delle cellule a causa della mancanza di un'adeguata selezione di strumenti. Qui, ci mostra lo sviluppo delle piastre GNSM gradiente riproducibile ed economica per la manipolazione delle risposte cellulari. Utilizzando ossido di alluminio anodico (AAO) come uno stampo master, gradiente GNSM piastre con nanopillars delle gamme di diametro crescente [120-200 nm (GP 120/200), 200-280 nm (GP 200/280) e 280-360 nm (GP 280/360)] sono stati fabbricati da una termica imprinting tecnica. Queste piastre di gradiente GNSM sono state progettate per imitare le varie dimensioni dei nanotopography in ECM e sono state utilizzate per lo screening delle risposte delle cellule formanti colonie endoteliali umane (hECFCs). In questo protocollo, descriviamo la procedura dettagliata di fabbricare gradiente GNSM piastre per ingegneria, tecniche di coltivazione hECFCs da sangue periferico umano e hECFCs il GNSM piastre di coltura delle cellule.

Introduction

Recentemente, la risposta delle cellule dalla stimolazione fisica della topografia superficiale è stato messo in luce nel campo della cella ingegneria1,2,3,4. Di conseguenza, si è concentrati più su nanostrutture tridimensionali al superficie cellulare allegato5. È stato segnalato che l'integrina, che è il dispositivo di riconoscimento superficie della cella, trasmette lo stimolo fisico guidato dalle strutture micro-nano di ECM a Meccano-trasduzione6. Questa stimolazione meccanica regola il comportamento delle cellule attraverso contatto Guida7 e induce la riorganizzazione del citoscheletro di cambiare forma, oltre alle adesioni focali e la rigidità delle cellule8.

Cellule progenitrici endoteliali umane (hEPCs) del corpo interagiscono strettamente con il microambiente circostante ECM9. Questo indica che lo stato fisico del ECM si comporta come un parametro importante per la formazione di complessi di adesione cellula-matrice specifica come shear stress derivato da sangue flusso10. È stato riferito che nanotopography superficie migliora la formazione in vitro di vasto tubo capillare reti di hEPCs11 e che un fattore solubile di ECM/bio sistema combinato consente hEPCs di riconoscere substrati disfunzionale e promuove Wound healing12,13. Tuttavia, il rapporto tra ECM e hEPCs non è chiaro.

Anche se molti ricercatori hanno cercato di chiarire il rapporto tra le risposte delle cellule e fisici spunti da diversi substrati14,15,16, questi studi utilizzati solo la dimensione fissa di una nanostruttura o nanopatterns con regime irregolare che hanno una limitazione per chiarire la relazione tra le dimensioni del comportamento delle cellule e nanostrutture. Il problema qui è una mancanza di idonei strumenti per lo screening delle risposte cellulari che possono sostituire approcci esistenti noiosi e iterativi per trovare la dimensione ottimale della nanostruttura. Di conseguenza, una tecnica semplice è richiesta per le reazioni di cella su stimolazioni fisiche senza ripetizione della selezione.

Qui, descriviamo un metodo utilizzato nella nostra precedente report17,18,19 per produrre un gradiente GNSM in cui il diametro della nanopillars organizzato aumenta progressivamente. Inoltre, abbiamo anche descritto come coltivare e analizzare il comportamento del hECFCs il gradiente GNSM piastre per determinare l'effetto di stimoli fisici sulle cellule. Un lieve anodizzazione, acquaforte graduale e metodo di rivestimento antiaderente strato sono stati utilizzati per fabbricare il gradiente della muffa AAO. Adottando una termica imprinting tecnica di Litografia, identico in polistirolo nanopatterns gradiente sono state prodotte in modo conveniente e facile. Utilizzando nanopatterns gradiente, è fattibile per determinare quale dimensione di nanostruttura ha un grande effetto sul comportamento delle cellule in un unico set di esperimento. Ci aspettiamo che questo gradiente GNSM sarà utile nella comprensione dei meccanismi di interazione tra hECFC derivate dal sangue o altre cellule e varie misure di nanostrutture.

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Protocol

Questo studio è stato approvato dalla Institutional Review Board presso ospedale di Corea Università Anam (IRB No. ED170495). Tutte le procedure sono state effettuate conformemente alla dichiarazione di Helsinki e sue modifiche successive.

1. preparazione del substrato di alluminio (Al) di elettrolucidatura

Attenzione: Soluzione di elettrolucidatura è corrosivo e tossico. Indossare indumenti protettivi, compresi guanti di nitrile, occhiali e camice da laboratorio. Eseguire questo passaggio in una cappa aspirante.

  1. Preparare l'elettrolucidatura soluzione mescolando etilico alcol (C2H5OH, 99,9%) e l'acido perclorico (HClO4, 60%) in un becher di intercapedine di 1 L (C2H5OH:HClO4 = 4:1).
  2. Collegare il becher giacca doppio a un circolatore e impostare la temperatura a 7 ° C. Porre il becher giacca doppio su un agitatore magnetico. Lasciare la soluzione sotto agitazione per almeno 30 min fino a quando la temperatura scende a 7 ° C.
  3. Immergere la piastra Al ultrapura (99.999%, 20 × 50 × 1 mm3) e carbonio contatore elettrodo nella soluzione di elettrolucidatura utilizzando pinze a coccodrillo e filo di rame. Regolare la posizione della piastra Al e il controelettrodo di carbonio di fronte a altro.
    Nota: È necessario installare le clip con attenzione per non toccare la soluzione. Quando a contatto con la soluzione, le impurità che scorre fuori dalle clip possono contaminare la piastra Al.
  4. Collegare la piastra Al polo positivo e l'elettrodo contatore carbonio al terminale negativo, di una corrente continua (DC) tensione di alimentazione.
  5. Spegnere l'agitatore magnetico e applicare una tensione di 20 V. mantenere questo stato per 4 min.
  6. Accendere l'agitatore magnetico e permettere alla corrente di fluire per altri 6 min.
    Nota: La condizione statica rimuove le impurità e rugosità dalla piastra Al, e la condizione dinamica migliora la qualità finale di elettrolucidatura.
  7. Spegnere l'alimentazione e separare manualmente la piastra dalla clip. Rigorosamente lavare la piastra Al con acqua deionizzata per rimuovere tutti i residui di soluzione.
  8. Asciugare la piastra Al con azoto e store sotto gas inerte. Condurre questo processo di essiccazione alla fine di tutti gli esperimenti nel passaggio 1 e 2.
    Nota: Quando si inietta aria compressa, rendere il flusso d'aria dalla parte lucida verso il lato opposto. In caso contrario, le impurità possono sfuggire dalla parte non-lucido e contaminare la piastra Al.

2. fabbricazione di stampo AAO gradiente con elettrolita acido fosforico

Attenzione: Alcool metilico e ai suoi fumi sono tossici oculari. Continua esposizione a cromo può portare ad avvelenamento grave cromo. Eseguire questo passaggio in una cappa aspirante.

  1. Anodizzazione primario
    1. Per preparare 1 L di elettrolita acido fosforico, caricare 590 mL di acqua deionizzata in una bottiglia di vetro.
    2. Aggiungere 400 mL di alcool metilico (CH3OH, 99%) e 10 mL di acido fosforico (H3PO4, 85%) nella bottiglia di vetro. Miscelare la soluzione bene agitando manualmente o con agitazione magnetica.
    3. Versare 500 mL di elettrolita in un becher di intercapedine 1 L. Immergere la piastra e carbonio elettrodo contatore Al lucido nella soluzione con pinze a coccodrillo e filo di rame.
    4. Versare ulteriore elettrolito per individuare il limite di elettrolucidatura 2-3 mm sopra la superficie della soluzione.
      Nota: Se anodizzazione è effettuato con il contorno di elettrolucidatura toccando la soluzione, la piastra Al tende a bruciare durante l'anodizzazione.
    5. Installare un pozzo verticale su un piedistallo a forma di U. Allegare un agitatore e girante utilizzando fascette metalliche. Posizionare l'elica della girante vicino l'estremità inferiore di entrambi gli elettrodi. Impostare la velocità di rotazione dell'agitatore overhead tra 200 e 300 giri/min.
    6. Collegare il becher giacca doppio a un circolatore e impostare la temperatura a-10 ° C. Lasciare il sistema per almeno 1 h sotto agitazione fino a quando la temperatura scende a-10 ° C.
      Nota: Non utilizzare acqua come refrigerante. Poiché l'acqua si ghiaccia a basse temperature, la circolazione non funziona normalmente. Si consiglia di utilizzare una miscela di acqua e alcol etilico con un rapporto di 1:1 come refrigerante.
    7. Applicare una tensione di 195 V sotto agitazione per 16 h.
      Nota: Se la corrente aumenta più di 50 mA entro 2 o 3 h dopo l'applicazione della tensione, la probabilità che si verifichi la masterizzazione è molto alta. Immediatamente interrompere il processo e sostituire la piastra Al con uno nuovo. Se questo problema si verifica ripetutamente, verificare che non esiste nessuna anomalia nel controllo di temperatura della pompa di circolazione. Se non c'è nessuna anomalia, cambiare l'elettrolita.
    8. Interrompere l'alimentazione elettrica e separare manualmente la piastra dalla clip. Lavare la piastra Al anodizzato con acqua deionizzata per rimuovere tutti i residui di soluzione.
  2. Acquaforte di allumina
    1. Preparare l'acido cromico acquaforte soluzione sciogliendo 9,0 g di ossido di cromo (CrO3) e 20,3 mL di acido fosforico (H3PO4, 85%) in 500 mL di acqua deionizzata.
    2. Versare la soluzione di incisione nel 1 L giacca doppio contenitore. Impostare la temperatura a 65 ° C.
    3. Immergere la piastra Al anodizzato nella soluzione acquaforte per almeno 10 h sotto agitazione. Sigillare la parte superiore del bicchiere con carta stagnola.
    4. Sciacquare la piastra Al incisa parecchie volte con acqua deionizzata.
  3. Anodizzazione secondario
    1. Impostare le stesse condizioni sperimentali come passo 2.1.1 a 2.1.7.
    2. Caricare la piastra Al acidato all'anodo del sistema e applicare una tensione di 195 V per 6 h. Spegnere l'alimentazione, quindi separare manualmente la piastra dalla clip. Lavare immediatamente la piastra Al anodizzato con acqua deionizzata.
      Nota: Quando il tempo di lavaggio è ritardato, il formato del poro di AAO involontariamente aumenta a causa del residuo acido fosforico.
  4. Ampliamento di gradiente poro
    1. Preparare una soluzione di allargamento dei pori sciogliendo 5,765 g di acido fosforico in 500 mL di acqua deionizzata. Versare la soluzione in un becher di intercapedine 1 L.
    2. Collegare il becher di intercapedine per la pompa di circolazione ed impostare la temperatura a 30 ° C. Luogo una fase di movimento lineare verticalmente accanto al bicchiere. Fissare una staffa alla parte mobile della fase lineare.
    3. Impostare la parte mobile della fase lineare nella posizione iniziale. Fissare la clip alla staffa e caricare la piastra Al anodizzato.
    4. Modificare manualmente la posizione della piastra Al modo che la piastra Al arriverà proprio sopra la superficie della soluzione.
      Nota: In questo passaggio, la piastra Al non dovrebbe toccare la soluzione. Il poro ampliamento processo inizia non appena la piastra Al raggiunge la soluzione.
    5. Immergere gradualmente la piastra nella soluzione ad una velocità di 4,86 µm/s per 120 min fare uno stampo AAO di 35mm con una dimensione di sfumatura da 120 nm ai 200 nm (GP 120/200). Avviare un cronometro al momento che la piastra Al contatto con la superficie della soluzione.
    6. Per fare stampi GP 200/280 e 280/360 GP, immergere l'intera area di GP 120/200 muffa nel poro ampliamento soluzione per 2 o 4 h, rispettivamente.
    7. Sciacquare la piastra Al gradiente più volte con acqua deionizzata.

3. deposizione dello strato antiaderente su gradiente AAO stampo con Self-Assembled Monolayer

Nota: Eseguire passaggi 3.2.1 a 3.3.3 in un vano portaoggetti. Collegare una pompa a vuoto e iniettore gas azoto secco per il vano portaoggetti. Posizionare tutti i campioni, reagenti e apparati in glove box prima del processo di deumidificazione. Ripetere il ciclo di iniezione gas evacuazione e azoto più di tre volte per rimuovere adeguatamente l'umidità dalla casella di guanto. Lasciate che l'azoto secco flusso attraverso l'esperimento.

  1. Modifica dell'idrossile di stampo AAO con trattamento Piranha
    1. Versare 140 mL di acido solforico (H2SO4, 95%) in un becher di politetrafluoroetilene (PTFE). Aggiungere 60 mL di perossido di idrogeno goccia a goccia (H2O2, 30%). Lasciare per 30 minuti fino a quando la soluzione si è raffreddato.
      Attenzione: Essere estremamente attenti quando si effettua la soluzione Piranha. Dal momento dell'aggiunta di perossido di idrogeno, la soluzione vigorosamente bolle e genera temperature elevate. Eseguire l'esperimento in una cappa aspirante.
    2. Immergere lo stampo AAO nella soluzione per 30 s utilizzando una pinzetta non metallica.
    3. Lavare lo stampo AAO più volte con acqua deionizzata. Immergere lo stampo in acqua deionizzata per 30 min e metterlo in alcool metilico per altri 30 min.
      Attenzione: Quando scartare dalla soluzione Piranha, diluire la soluzione con una copiosa quantità di acqua di rubinetto.
    4. Asciugare completamente lo stampo AAO sotto vuoto per 3 h.
  2. Preparazione della soluzione di riserva HDFS × 20
    Nota: HDFS è l'abbreviazione di (heptadecafluoro-1,1,2,2, - tetrahydrodecyl) dimethylchloro-Silano
    1. Riempire un terzo di una bottiglia di n-esano 1 L con setacci molecolari. Tappare la bottiglia con la pellicola di paraffina e conservarlo sotto azoto secco per 24 h.
    2. Filtrare i 200 mL di n-esano utilizzando una siringa di vetro e 0,2 µm PTFE siringa filtro.
    3. Versare 80 mL di n-esano filtrato in un flacone di vetro da 100 mL. Aggiungere 2 mL di HDFS.
  3. Deposizione di monostrato auto-assemblato
    1. Caricare 57 mL di n-esano filtrato in un becher da 100 mL. Immergere lo stampo AAO in solvente.
    2. Aggiungere 3 mL di soluzione madre HDFS n-esano per rendere la soluzione HDFS 2,9 mM. Attendere 10 minuti per la reazione di procedere.
    3. Trasferire lo stampo AAO fresco n-esano. Chiudere e sigillare tutti i flaconi di reagente. Chiudere la valvola dell'azoto, poi tirare fuori i campioni da glove box.
      Nota: HDFS è estremamente sensibile all'umidità. Conservare tutti i reagenti che contengono HDFS in un essiccatore.
    4. Immergere lo stampo AAO in 60 mL di methoxynonafluorobutane (C10H6F18O2, 99%). Pulizia con ultrasuoni lo stampo AAO in un becher per 10 s per una sola volta per rimuovere fisicamente adsorbite molecole HDFS. Ripetere la procedura di pulizia 10 volte.
      Nota: Esponendo la muffa AAO a ultrasuoni per lungo tempo senza intervalli danneggiano lo strato di ossido.
    5. Asciugare completamente lo stampo AAO sotto vuoto per 24 h.
      Nota: Un strato antiaderente correttamente depositato è super idrorepellente e stabile per mesi se conservato in un essiccatore. Il protocollo può essere messo in pausa qui.

4. fabbricazione di gradiente GNSM piastre di stampa termica

Nota: Eseguire passaggi 4.2 a 4.7 in una camera pulita.

  1. Tagliare un foglio di polistirene spessore 1,1 mm a una dimensione di 2,9 mm di larghezza da 3,7 mm di lunghezza con un cutter di circuito stampato (PWB).
  2. Tagliare la muffa AAO 35 mm dal fondo utilizzando un taglierino. Contrassegnare il campione nome e data di produzione sul retro.
  3. Pulire una cialda 8.0" con una piccola dose di alcool etilico. Mettere i fogli di polistirolo sul wafer, quindi montare lo stampo AAO.
  4. Mettere il film inferiore nel cassetto di una stampante termica. Fissare la pellicola superiore per la guarnizione.
  5. Mettere la cialda sulla pellicola inferiore. Posizionare la guarnizione sul wafer. Assicurarsi che non ci sia polvere sul wafer.
  6. Chiudere il cassetto dell'unità di stampa termica. Applicare 165 ° C di calore e 620.52 kPa di pressione per 100 s.
  7. Raffreddare il campione a temperatura ambiente. Ruotare delicatamente il foglio di polistirolo per rilasciare lo stampo AAO.

5. sterilizzazione e modifica idrofila del gradiente GNSM piastre

  1. Posizionare le piastre GNSM su un piatto quadrato. Versare 100 mL di alcool etilico al 70% ed esporre ai raggi ultravioletti per 30 min.
  2. Asciugare le piastre GNSM con azoto. Trasferire le piastre GNSM a un generatore di plasma di ossigeno.
  3. Evacuare la camera fino a 1.33 PA. Quindi, inietti l'ossigeno ad un tasso di 30 cm3/min applica una radio frequenza potenza di 60 w. Mantieni il plasma di ossigeno per 90 s.
    Nota: Si consiglia di utilizzare piastre trattate al plasma GNSM entro 14 giorni.
  4. Fissare la piastra di GNSM alla parte inferiore di una piastra di coltura cellulare utilizzando una goccia di toluene.
  5. Sigillare i campioni in un sacchetto e sterilizzare con sterilizzatore del plasma a bassa temperatura.

6. coltura di hECFCs

Nota: Effettuare tutte le procedure di centrifugazione a 4 ° C se non specificato diversamente.

  1. Prima di isolare il sangue periferico (PBMCs), le cellule mononucleari Incubare una piastra di coltura di 12-pozzetti rivestite con collagene a 37 ° C per 1 h.
  2. Lavare il piatto 12-pozzetti cultura utilizzando 1 × tamponata sterile di fosfato salino (PBS).
  3. Raccogliere 50 mL di sangue umano, utilizzando un tubo di inibitore dell'eparina.
  4. Mettere 6 mL di soluzione di polisaccaride idrofila in una provetta da 15 mL e aggiungere 8 mL di sangue per la soluzione di polisaccaride idrofila.
    Nota: Pipettare lentamente il sangue nella soluzione polisaccaride idrofila.
  5. Centrifugare la provetta a 1020 x g per 20 min agglomerare le cellule.
  6. Raccogliere lo strato opaco delle cellule e trasferimento in un nuovo tubo da 15 mL.
  7. Aggiungere 10% siero bovino fetale (FBS)-contenute PBS e centrifugare la provetta a 1020 x g per 10 min agglomerare le cellule.
  8. Rimuovere il supernatante e aggiungere buffer di lisi di globuli rossi. Tenere il ghiaccio per 5 min.
  9. Aggiungere 10% FBS-contenute PBS e centrifugare la provetta a 1020 x g per 5 min agglomerare le cellule.
  10. Rimuovere il supernatante e aggiungere 10% FBS-contenute PBS. Centrifugare la provetta a 1020 x g per 5 min agglomerare le cellule.
  11. Rimuovere il supernatante e aggiungere 1 mL di medium di espansione delle cellule endoteliali supplementato con 10% FBS. Semi di 8,0 × 106 cellule per pozzetto per ogni piatto rivestite con collagene.
  12. Cambiare il terreno di coltura ogni giorno per 1 settimana. Quindi, modificare il terreno di coltura ogni 2 giorni.
    Nota: hECFCs può essere trovato dopo cultura giorno 10-14. hECFCs visualizzare tipica acciottolato-come la morfologia e formare una colonia che può essere osservata in microscopia di contrasto di fase. Colorazione di immunofluorescenza di cadherin endothelial vascolare (CD144) e fattore di von Willebrand (vWF) può essere eseguita anche per la caratterizzazione della hECFCs dopo l'ulteriore espansione delle cellule.
  13. Per coltivare la hECFCs, utilizzare supplementato di espansione delle cellule endoteliali con 5% di FBS e penicillina/streptavidina a 37 ° C in atmosfera umidificata contenente 5% CO2. Sostituire il mezzo una volta al giorno.
  14. Dopo induzione di hECFC, crescere le cellule a passaggio 7 per ulteriori esperimenti.

7. cellula semina e cultura sulle piastre GNSM gradiente

Nota: Passaggio 7 descrive la cultura del hECFCs sulla piastra gradiente GNSM, ma altre fonti di cellule possono anche essere utilizzati.

  1. Rivestire le piastre GNSM gradiente con 1 mL di soluzione di rivestimento di proteine 0,1% in PBS per 10 min a temperatura ambiente.
    Nota: Il rivestimento di proteine 0,1% non copre le caratteristiche nanopillars.
  2. Fare una sospensione di hECFCs dalla piastra di coltura di un metodo standard per la divisione delle cellule con tripsina.
  3. Diluire la sospensione cellulare per raggiungere la confluenza desiderata. Seme del hECFCs sul gradiente GNSM piastre e controllo piatto (ad esempio, 1,0 × 104 cellule/cm2).
    Nota: Quando hECFCs sono seminate ad 1,0 × 104 cellule/cm2 il gradiente GNSM piastre, il confluency di cella raggiunge solitamente al 70-80% dopo 2 giorni.
  4. Coltura le cellule su piastre piane o gradiente GNSM per 2 giorni nell'incubatrice.

8. osservazione e analisi

  1. Formazione immagine del microscopio elettronico a scansione (SEM)
    1. Difficoltà hECFCs coltivate su piastre piane o gradiente GNSM con glutaraldeide 2,5% a 4 ° C per una notte.
    2. Trattare il tetrossido di osmio 1% per 1 h a temperatura ambiente. Campioni di lavaggio con PBS.
    3. Disidratare i campioni con alcol etilico da bassa ad alta concentrazione (50%, 70%, 80%, 90% e 100%) per 10 min per ogni passo.
    4. Trattare esametildisilazano (HMDS) per 15 min a temperatura ambiente. Dopo di che, lavare campioni con HMDS fresco e lasciare i campioni sotto la cappa con almeno 1 giorno fino a quando il residuo HMDS evapora completamente.
    5. Rivestire i campioni con platino sputter coater per 5 min ed esaminare i campioni con un SEM
  2. Formazione immagine del microscopio elettronico (TEM) di trasmissione
    1. Difficoltà hECFCs coltivate su piastre piane o gradiente GNSM con miscela 2% paraformaldeide e 2,5% glutaraldeide in PBS a 4 ° C per una notte.
    2. Eseguire post-fissazione utilizza tetrossido di osmio 1% e disidratare campioni usando il metodo in 8.1.3.
    3. Incorporare i campioni in resina epossidica. Fanno 60 sezioni spesse nm da blocchi e posizionare una sezione su una griglia TEM.
    4. Macchia la sezione con la miscela di acetato di uranile 10 mg in 100 mL di alcole metilico e citrato di piombo di 0,1 mg in 100 mL di acqua distillata. Ottenere immagini con un TEM.
  3. Macchiatura di fluorescenza
    1. Difficoltà hECFCs coltivate su piastre piane o gradiente GNSM con paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente per 15 min.
    2. Permeabilize e bloccare i campioni con 5% di capra del siero e 0,1% Ottilfenolo etossilato in PBS (PBST) a temperatura ambiente per 30 min.
    3. Incubare i campioni con l'anticorpo primario anti-umani vinculina (1: 500 in PBST) a temperatura ambiente per 2 h. risciacquo campioni tre volte con PBST.
    4. Incubare i campioni con falloidina fluorescenza-coniugati (1:1, 000 in PBST), fluorescenza-coniugato anticorpo secondario (1:1, 000 in PBST) a temperatura ambiente per 2 h. risciacquo campioni tre volte con PBST.
    5. Incubare i campioni con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1:1,000 in PBST) a temperatura ambiente per 5 min.
    6. Goccia 10 µ l di soluzione di montaggio sulla superficie del gradiente GNSM. Porre un coprivetrino sul mezzo di montaggio.
    7. Posizionare il campione upside-down sul palco campione e acquisire immagini utilizzando il microscopio a fluorescenza confocale.
  4. Analisi dell'immagine
    1. Trasferire le immagini acquisite dell'hECFCs a un sistema di analisi di immagine.
    2. Scegliere il campo casuale della falloidina colorazione immagine. Regolare la soglia e creare un'immagine binaria in cui le cellule sono distinte dallo sfondo.
    3. Disegnare contorni intorno alle cellule per misurare l'area di cella e il perimetro e contare manualmente il numero di filopodi per cella.
    4. Scegliere il campo casuale del vinculin colorazione immagine. Regolare la soglia e creare un'immagine binaria delle zone di adesione focale.
      Nota: Regolare la soglia di immagine in modo appropriato per evitare artificiale sopra - o sotto - filling delle zone di adesione focale.
    5. Contare il numero di adesione focale di ogni cella.

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Representative Results


La figura 1 Mostra immagini di SEM degli stampi AAO gradienti fabbricati secondo il loro tipo e la posizione. La figura 2 Mostra immagini di SEM di gradiente GNSM piastre con nanopillars regular-arrotondato, e nella figura 3 è dati di quantificazione del diametro nanopillars. La tabella 1 elenca le caratteristiche della nanopillars fabbricato.

Figura 4A Mostra lo schema di coltivazione di emoderivati hECFCs. Figura 4B spettacoli l'immagine di contrasto di fase di thecultivated hECFCs. Figura 4 Mostra hECFC marcatori colorati con CD144 (verde), sindrome di Raynaud (rosso) e nucleo (blu). Figura 5A Mostra immagini rappresentative di SEM di hECFCs dopo 2 giorni di cultura in piano, GP 120/200, GP 200/280 e 280/360 GP piastre. Figura 5B e C rappresentano dati quantitativi sulla cella area e il perimetro rispetto al piatto. I dati di quantificazione ha rivelato che le cellule coltivate su nanopillars superfici di piccole dimensioni hanno mostrato riduttrice delle cellule area e il perimetro. Figura 5 è il rappresentante immagini di SEM di hECFCs che mostrano la morfologia dei filopodi esistente. Figura 5E raffigura i dati quantitativi sul numero di filopodi rispetto al piatto. Escrescenza filopodial significativa è stata osservata in cellule coltivate su GP 120/200, mentre nessun cambiamento significativo è stato osservato in GP200/280 o GP280/360 in confronto con il piatto. Figura 5F Mostra immagini rappresentative del TEM di hECFCs dopo 2 giorni di cultura sulle piastre GNSM piatto e gradienti.

Figure 1
Figura 1. Gradiente della muffa AAO. Immagini di SEM di gradiente AAO stampi per piastre GP 120/200, 200/280 GP e GP 280/360 in base alla posizione di stampi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 . Piastre di sfumatura GNSM. Immagini di SEM di pilastro-targhette gradiente GNSM per piastre GP 120/200, GP 200/280 e 280/360 GP secondo la posizione delle piastre. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 . Gradiente di dimensioni di diametro nanopillars. Dati di quantificazione mostrando il gradiente di nanopillars diametri per GP 120/200, GP 200/280 e piastre GP 280/360, rispettivamente. Barre rappresentano errore standard. Questa figura è stata modificata da [Acta Biomaterialia] 20. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Modulo di Young (GPa) Diametro di nanopillars (nm) Nanopillars Pitch (nm) Distanza da centro a centro (nm) Altezza nanopillars (nm) Nanopillars rigidità (N/m)
Piatto 2.43±0.19 – – – – –
GP 120/200 1.74±0.11 120-200 320-240 440 276.9±21.9 9.35
GP 200/280 2.01±0.05 200-280 240 – 160 440 268.1±25.9 55.78
GP 280/360 2.1±0.13 280-360 160 – 80 440 293.6±23.6 134,15

Tabella 1. Caratteristiche del fabbricato nanopillars. Dati quantificati risultati modulo di Young, diametro, passo, distanza di interasse, altezza e rigidità del fabbricato nanopillars. Questa tabella è stata modificata da [Acta Biomaterialia] 20.

Figure 4
Figura 4 . Caratterizzazione di hECFCs. (A) pianificazione visualizzando diagramma schematico di hECFCs derivati da sangue periferico adulto. Immagine di contrasto di fase (B) della colonia di hECFC, derivato da sangue periferico adulto il giorno 14. (C) immunofluorescente immagini che mostrano CD144 (verde), vWF (rosso) e il nucleo cellulare colorato con DAPI (blu). Questa figura è stata modificata da [Acta Biomaterialia] 20. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 . hECFCs coltivate su piastre piatte e gradiente GNSM per 2 giorni. (A) immagine rappresentativa SEM hECFCs coltivate su piastre di piatto, GP 120/200, 200/280 GP e GP 280/360. (B e C) Dati di quantificazione dell'area e perimetro di hECFCs (n = 50). * p <,05 rispetto al piatto. (D) immagini al SEM rappresentative della leading edge di hECFCs sulle piastre GNSM piatto e gradienti. (E) dati di quantificazione del numero di filopodi per uno hECFC (n = 20). * p <,05 rispetto al piatto. (F) immagine rappresentante TEM di hECFC coltivate sul piatto e gradiente GNSM piastre. Frecce bianche indicano i punti di interazione tra superficie hECFCs e substrato. Questa figura è stata modificata da [Acta Biomaterialia] 20. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Complementare Figura 1. Angolo di contatto acqua di AAO incontaminata e HDFS trattati AAO. Misure di angolo di contatto mostrando proprietà idrofobe di HDFS self-assembled monostrato (A) prima e, (B) dopo il trattamento. Per favore clicca qui per scaricare questa figura.

Complementare nella figura 2. Immagini di SEM di piastre fabbricato GNSM gradiente con stesso stampo AAO. Immagine di SEM comparativa imposta per verificare la durata dello stampo AAO. (A) gradiente GNSM piatto prodotto con muffa appena fatta. (B) piastra GNSM gradiente prodotto con muffa AAO dopo l'imprinting 15 volte. Per favore clicca qui per scaricare questa figura.

Complementare nella figura 3. Influenza del rivestimento proteico. Immagini di SEM di hECFCs che sono state coltivate su GP 120/200, 200/280 GP o GP 280/360 GNSM gradiente piastre (A) senza o (B) con il rivestimento di proteine. Questa figura è stata modificata da [Acta Biomaterialia] 20 Per favore clicca qui per scaricare questa figura.

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Discussion

Fabbricazione di un AAO spesso soffre di difetti quali cricche, forme irregolari di pori e la masterizzazione. La ragione principale di questi difetti è chiamata un breakdown elettrolitico, che è fortemente influenzata dalla natura dei substrati metallici essendo anodizzato e la resistività del elettroliti21. Poiché la resistività dell'elettrolito varia a seconda della sua temperatura, eliminando calore continuamente dagli elettrodi è il punto critico per mantenere la temperatura tra piazze dell'elettrolito come stabile in una condizione d'anodizzazione ad alta tensione. In questo protocollo, abbiamo fabbricato stampi AAO modificando in due fasi anodizzazione22,23 di Masuda. Sostituzione di quasi la metà dell'elettrolito con alcool metilico non solo impedisce il congelamento a basse temperature l'elettrolita ma priva anche l'elettrodo di calore per evaporazione nella parte inferiore del poro24. Il motivo per utilizzare un agitatore e girante invece di un agitatore magnetico è anche per garantire il controllo della temperatura. L'agitatore magnetico tipico ha un'alta probabilità di funzionamento al minimo a causa del disallineamento accidentale della barra magnetica durante il funzionamento a lungo termine. Questo problema induce l'impropria circolazione dell'elettrolito, alzando la temperatura e che porta a bruciare.

Per dare una sfumatura di dimensione per la muffa AAO, siamo immersi gradualmente l'AAO in un acido fosforico acquaforte soluzione. I pori sono allargati in proporzione al tempo che il AAO rimane nella soluzione acquaforte, come mostrato nella Figura 1. In questa circostanza, il tasso medio di poro-allargamento è 0,67 nm/min., manipolando la velocità e l'ora immergendo cambierà il pendio del diametro del poro di gradiente e massima dimensione di AAO. Il diametro dei pori possibile massimo è di 400 nm. Quando il diametro dei pori supera i 400 nm, il muro di spaziatura tra i pori diventa così sottile che non può tollerare la pressione durante il thermal processo di imprinting.

Un monostrato auto-assemblato HDFS è conosciuto per essere in grado di aggiungere una proprietà idrofobica al materiale superficie25. La molecola HDFS rende un forte legame covalente con i gruppi idrossilici sulla superficie AAO introdotta da Piranha trattamento26. Di conseguenza, come mostrato nella Figura 1 complementare, un monostrato auto-assemblato solido può essere formato quando un gran numero di gruppi idrossilici è presente sulla superficie del substrato. Per una qualità ottimale con un monostrato auto-assemblato HDFS, suggeriamo conducendo la reazione in un atmosfera deumidificata. Quando HDFS è esposto all'umidità, una reazione collaterale con acqua forma dimeri e trimeri anche oligomeri di molecole di silano e diminuisce la qualità complessiva del monostrato auto-assemblato.

Al momento utilizzando lo stampo AAO con una sfumatura di dimensione in termica nanoimprinting, piastre per colture cellulari con una pendenza del nanopillars sono stati ottenuti nella figura 2 e Figura 3. Il metodo termico nanoimprinting ha un vantaggio in quanto può produrre una grande quantità di piastre GNSM identici utilizzando uno stampo master AAO. Complementare la figura 2 Mostra che non c'è alcuna differenza nella qualità del GNSM prodotte, anche dopo quindici processi di imprinting, rispetto ai GNSM prodotta dalla nuova muffa AAO. La ragione per la scelta di polistirolo come materiale per il trasferimento di un GNSM è il polistirolo ha una temperatura di transizione vetrosa appropriato (100 ° C) per la stampa termica, che è ampiamente usato in piastre di coltura cellulare commerciale a causa sua Proprietà trasparente e non tossica.

Fabbricazione di nanostrutture con elevato rapporto di aspetto con metodo termico nanoimprinting è difficile. Perché, quando condizioni di processo, quali aumento di pressione e di tempo, la muffa diventa profondamente radicata nel substrato polimerico, rendendolo difficile separare lo stampo dal substrato. Pertanto, è molto impegnativo per produrre nanopatterns avendo un aspect ratio di 1:3 o più utilizzando la nostra tecnica nanoimprinting. Tuttavia, secondo immagini TEM abbiamo osservato nella figura 5, abbiamo trovato un fatto interessante che la membrana delle cellule il nanopatterns non era a contatto con il fondo del GNSM. In altre parole, tutti gli stimoli fisici che possono manipolare una risposta delle cellule sono stati originati dalla parte superiore della GNSM. Pertanto, in questo studio, non abbiamo dovuto tenere conto delle proporzioni nello studiare le risposte della cellula per la GNSM. Come mostrato in complementare Figura 3, soluzione di rivestimento di 0,1% della proteina ha avuto alcuna influenza sull'attacco di hECFCs sulle superfici nanopillars. Inoltre, questi stimoli nanometriche dalle piastre gradiente GNSM diminuito la cella area e il perimetro di hECFCs e di conseguenza aumentato filopodial Figura 5.

In sintesi, abbiamo stabilito il gradiente GNSM piastre manipolando una risposta del hECFCs in vitro. Per sapere esattamente quale taglia di nanostrutture le cellule sono fortemente influenzate, un lavoro futuro è necessario per progettare un nanopillars cellula-specifico di dimensioni regolando la pendenza del gradiente e minimo-massimo diametro della nanopillars. Ci aspettiamo che questo gradiente GNSM per essere uno strumento affascinante per l'interazione tra cellule e nanostrutture a schermo, nonché di fornire nicchie avanzato delle cellule in cui nanostrutture può essere regolata liberamente nella dimensione.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato dal programma di ricerca di scienza base attraverso la nazionale Ricerca Fondazione della Corea (NRF) finanziato dal Ministero dell'istruzione, scienza e tecnologia (MEST) [NRF-2015R1D1A1A01060397] e Bio & Medical Technology Development Programma della NRF finanziato dal Ministero della scienza, ICT & futuro pianificazione [NRF-2017M3A9C6029563].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Perchloric acid 60% Daejung Chemicals & Metals 6512-4100
Ethyl alcohol, absolute 99.9% Daejung Chemicals & Metals 4118-4100
Phosphoric acid 85% Daejung Chemicals & Metals 6532-4400
Methyl alcohol 99.5% Daejung Chemicals & Metals 5558-4400
Chromium(VI) oxide Daejung Chemicals & Metals 2558-4400
Sulfuric acid 95% Daejung Chemicals & Metals 7781-4100
Hydrogen peroxide 30% Daejung Chemicals & Metals 4104-4400
n-hexane 95% Daejung Chemicals & Metals 4081-4400
Toluene 99.5% Daejung Chemicals & Metals 8541-4400
(heptadecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrodecyl)dimethylchlorosilane Gelest SIH5840.4 Moisture sensitive
Methoxynonafluorobutane 99% Sigma aldrich 464309
Collagen solution Stemcell #4902
Gelatin Sigma aldrich G1890 Protein coating solution
Ficoll-Paque GE Heathcare 17-1440-03 Hydrophilic polysaccharide solution
EGM-2MV Lonza CC-3202 Endothelial cell expansion medium
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
Phosphate buffered saline Gibco 10010031
Fetal bovine serum Gibco 12483-020
Paraformaldehyde Sigma aldrich P6148
Glutaraldehyde Sigma aldrich G5882-100ML
Osmium tetroxide Sigma aldrich 201030-1G
Hexamethyldisilazane Sigma aldrich 440191
Triton X-100 Sigma aldrich X100-100ML Octylphenol ethoxylate 
Goat serum Gibco 26050-088
anti-human vinculin primary antibody  Sigma aldrich V9131
F-actin probe Molecular Probes A12379 Fluorescence-conjugated phalloidin
Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody Molecular Probes A11001 Fluorescence-conjugated secondary antibody 
4',6-diamidino-2-phenylindole  Sigma aldrich D9542
Mounting medium DAKO S3023
Anti-human vWF primary antibody  DAKO A0082
Anti-human CD144 primary antibody  BD Biosciences #555661
Eponate 12™ Embedding Kit, with BDMA Ted Pella 18012 Epoxy resin
Uranyl Acetate, 25g Ted Pella 19481
Lead Citrate, Trihydrate, 10g Ted Pella 19312
Ultra pure aluminum plate Goodfellow 26050-088
Polystyrene sheet Goodfellow ST313120
8.0" silicon wafer Siltron 29-01024-03 Single side polished, 725 µm thick
Vacuum desiccator, 4.4 L Kartell KA.230
Vacuum pump Vacuumer V3.VOP100
Power supply Unicorntech UDP-3003
Magnetic stirrer Daihan scientific SL.SMS03022
Overhead stirrer Daihan scientific HT120DX
Circulator Daihan scientific WCR-P12
Linear moving stage Zaber A-LSQ300A-E01-KT07
Angle bracket, 90 degrees Zaber AB90M Accessory of the linear moving stage
PMP forcep, 145 mm Vitlab 67995 Nonmetallic tweezer
PTFE beaker, 250 mL Cowie CW007.25
Ultrasonic cleaner Branson B2510MTH
PCB cutter Hozan Tool Industrial K-110
Nanoimprint device Nanonex NX-2000
Oxygen plasma generator Femto Science CUTE
Low temperature sterilizer Lowtem Crystal 50
CO2 Incubator Panasonic MCO-18AC
Confoal laser scanning microscope Carl Zeiss LSM700
Scanning electron microscope JEOL JSM6701
Transmission electron microscope Hitachi H-7500

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References

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