Summary
여기, 우리는 열 nanoimprinting 통해 그라데이션 nanopattern 판의 제조와는 nanostructures 인간의 내 피 조상 세포의 응답을 검사 하는 방법에 대 한 프로토콜을 제시. 설명 된 기술을 사용 하 여 물리적 자극에 의해 셀 동작을 조작할 수 있는 비 계를 생산 가능 하다.
Abstract
Nanotopography 다양 한 세포 외 매트릭스 (ECMs) 몸 주위에서 찾을 수 있습니다 그리고 세포 반응에 중요 한 규제 조치를 알려져 있습니다. 그러나,는 nanostructure의 크기와 적절 한 검사 도구의 부족으로 인하여 세포의 응답 사이의 관계를 결정 하기가 어렵습니다. 여기, 우리가 세포 응답의 조작에 대 한 재현 가능 하 고 비용 효율적인 그라데이션 nanopattern 번호판의 개발을 보여줍니다. 마스터 금형, 증가 직경 범위 [120-200 nm (GP 120/200), 200-280 nm (GP 200/280), 280-360 nm (GP 280/360)]의 nanopillars 그라데이션 nanopattern 접시로 양극 알루미늄 산화물 (AAO)을 사용 하 여 열 기술을 각 인에 의해 조작 했다. 이 그라데이션 nanopattern 번호판 nanotopography ECM에서의 다양 한 크기를 모방 하도록 설계 되었습니다 그리고 인간 내 피 식민지 형성 세포 (hECFCs)의 응답에 사용 되었다. 이 프로토콜에서 우리 세포 공학, 인간 주변 혈액에서 hECFCs를 재배 하 고 hECFCs nanopattern 접시에 배양의 기술에 대 한 그라데이션 nanopattern 번호판 조작의 단계별 절차를 설명 합니다.
Introduction
최근, 표면 지형의 물리적 자극에 의해 세포의 응답 세포 공학1,2,,34의 분야에서 각광 되어 있다. 따라서, 더 많은 관심은 셀 첨부 파일 표면5에서 3 차원 nanostructures에 집중 되었습니다. Integrin은 세포의 표면 인식 장치, 메카노 변환6ECM의 마이크로-나노 구조에 의해 구동 하는 물리적 자극 전송으로 보고 되었습니다. 이 기계적인 자극 연락처 안내7 셀 동작을 조절 하 고 초점 유착 및 강성8셀 모양을 변경 하려면 cytoskeletal 개편을 유도 한다.
본문에서 인간의 내 피 조상 세포 (hEPCs) 주변 ECM9의 microenvironment와 밀접 하 게 상호 작용합니다. 이 혈액 흐름10에서 파생 된 전단 응력으로 ECM의 물리적 상태 특정 세포-매트릭스 접착 복잡 한 형성을 위한 중요 한 매개 역할을 나타냅니다. 그것은 표면 nanotopography hEPCs11 의 광범위 한 모 세관 튜브 네트워크의 생체 외에서 형성을 강화 하 고 역 기능 기질을 인식 하는 hEPCs를 가능 하 게 하 고 촉진 ECM/바이오 수용 성 요소가 시스템 결합을 보고합니다 상처 치유12,13. 그럼에도 불구 하 고, ECM과 hEPCs 사이의 관계는 명확 하 게 이해 되지 않습니다.
많은 연구 자들은 세포 반응과 다른 기판14,,1516에서 실제 신호 사이의 관계를 명확 하 게 하려고, 이러한 연구는 nanostructure의 고정된 크기에만 사용 또는 nanopatterns nanostructure 및 셀 동작의 크기 사이의 관계를 명료 하 게 하는 제한이 불규칙 한 준비. 여기에 문제 적당 한 도구는 nanostructure의 최적의 크기를 찾습니다 기존의 지루하고 반복적인 접근을 대체할 수 있는 세포 응답을 심사의 부족 이다. 따라서, 간단한 기술은 반복 없이 물리적 stimulations에 셀 반응 검사 필요 합니다.
여기, 우리는 우리의 이전 보고서17,,1819 에 그라데이션 nanopattern 있는 배열된 nanopillars의 직경은 점차적으로 증가 생산 하기 위해 사용 되는 방법을 설명 합니다. 또한, 우리는 또한 배양 세포에 물리적 자극의 효과 결정 하기 위해 그라데이션 nanopattern 접시에 hECFCs의 동작을 분석 하는 방법을 설명 합니다. 온화한 양극, 점진적 에칭, 그리고 반대로 고정 레이어 코팅 방법 그라데이션 AAO 금형 제작에 사용 되었다. 리소 그래피 기술을 각 인 열을 채택 하 여 동일한 폴리스 티 렌 그라데이션 nanopatterns는 비용 효율적이 고 손쉬운 방법으로 생산 되었다. 그라데이션 nanopatterns를 사용 하 여, 그것은 nanostructure의 크기는 셀 동작에 큰 영향을 실험 한 세트에 결정 가능 합니다. 우리는이 그라데이션 nanopattern 혈액 파생 된 hECFC 또는 다른 셀과 nanostructures의 다양 한 크기 간의 상호 작용 메커니즘을 이해에 도움이 될 것입니다 기대 합니다.
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Protocol
이 연구는 고려 대학교 안 암 병원 (IRB No.에서 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다 ED170495)입니다. 모든 절차는 헬싱키 선언 및 나중의 개정에 따라 실행 되었다.
1. 알루미늄 (Al) 전해 연마에 의해 기판의 준비
주의: 연마 솔루션 부식성 이며 독성이 있습니다. 니트 릴 장갑, 고글 및 실험실 외 투를 포함 한 개인 보호 장비를 착용 하십시오. 증기 두건에서이 단계를 수행 합니다.
- 에틸 알코올 (C2H5오, 99.9%)을 혼합 하 여 연마 솔루션을 준비,과 염소 산 (HClO4, 60%)는 1 L 이중 자 켓 비이 커에 (C2H5OH:HClO4 = 4:1).
- 이중 자 켓 비 커는 circulator에 연결 하 고 7 ° c.에 온도 설정 자력 교 반기에는 이중 자 켓 비이 커를 넣어. 온도 7 ° c.에 떨어질 때까지 적어도 30 분 동안 교 반에서 솔루션을 두고
- 담가 초순 알 판 (99.999%, 20 × 50 × 1 m m3) 및 악어 클립 및 구리 와이어를 사용 하 여 연마 솔루션으로 탄소 카운터 전극. 알 판과 서로 얼굴을 탄소 카운터 전극의 위치를 조정 합니다.
참고: 그것은 신중 하 게 클립을 설치 하는 데 필요한 솔루션을 만질 수 없습니다. 솔루션, 접촉 시 불순물 클립에서 밖으로 흐르는 알 판을 오염 수 있습니다. - 알 판 긍정적인 터미널과 탄소 카운터 전극 부정적인 터미널 연결, 직류 (DC)의 전원 공급 장치.
- 자력 교 반기를 끄고 20 유지가이 상태 4 분 대의 전압을 적용.
- 자력, 켜고 다른 6 분에 대 한 흐름을 전류 허용.
참고: 정적 상태 알 판에서 불순물과 거칠기의 대부분을 제거 하 고 동적 조건 연마의 최종 품질을 향상. - 전원 공급 장치를 끄고 수동으로 클립에서 알 플레이트를 분리. 엄격 하 게 모든 나머지 솔루션을 제거 하는 이온된 수로 알 판 세척.
- 건조 질소와 불활성 가스 저장소 알 판. 단계 1과 2에서에서 모든 실험의 끝이 건조 과정을 수행 합니다.
참고: 압축 공기를 주입, 반대 측에 광택된 부분에서 공기 흐름을 확인 합니다. 반대 경우에 불순물 비 광택 부분에서 탈출 하 고 알 접시를 오염 시킬 수 있습니다.
2. 인산의 산 성 전해질과 그라데이션 AAO 금형의 제작
주의: 메 틸 알코올 및 그 연기는 눈 독성입니다. 크롬에 지속적인 노출은 심각한 크롬 중독 될 수 있습니다. 증기 두건에서이 단계를 수행 합니다.
- 1 차 양극
- 인산의 산 성 전해질의 1 리터를 준비 하려면 이온된 수의 590 mL 유리 병에 로드 합니다.
- 추가 메 틸 알코올 (채널3오, 99%)의 400 mL와 10 mL의 유리 병에 인산 (H3포4, 85%). 잘 흔들어 수동으로 또는 자석 교 반 솔루션을 믹스.
- 전해질의 500 mL를 1 L 이중 자 켓 비이 커에 붓으십시오. 악어 클립 및 구리 와이어 솔루션으로 광택된 알 판과 탄소 카운터 전극을 담가.
- 부 추가 전해질을 연마 솔루션의 표면 위에 2-3 mm의 경계를 찾습니다.
참고: 양극 연마 솔루션을 만지기의 경계와 수행, 알 판은 양극 동안 굽기 경향이 있다. - U 자형 받침대에 수직 샤프트를 설치 합니다. 오버 헤드 교 반기와 임 펠 러 금속 클램프를 사용 하 여 첨부 합니다. 두 전극의 하단 근처 임 펠 러의 위치는 프로 펠 러입니다. 200, 300 rpm 사이 오버 헤드 교 반기에의 회전 속도 설정 합니다.
- 이중 자 켓 비 커는 circulator에 연결 하 고-10 ° c.에 온도 설정 온도-10 ° c.에 떨어질 때까지 교 반에 적어도 1 시간을 위한 시스템
참고: 냉각수로 물을 사용 하지 마십시오. 물이 낮은 온도에서 동결, 때문에 순환을 정상적으로 작동 하지 않습니다. 냉각수로 1: 1의 비율로 물과 에틸 알콜의 혼합물을 사용 하는 것이 좋습니다. - 16 h에 대 한 감동에서 195 V의 전압을 적용 합니다.
참고: 현재 50 개 이상의 상승 2 또는 3에 전압을 적용 한 후 h mA, 불타는 발생할 것 이다 확률 매우 높습니다. 즉시 프로세스를 중지 하 고 알 접시를 새 것으로 교체. 이 문제가 반복적으로 발생 하는 경우는 circulator의 온도 제어에 아무 이상 인지 확인 합니다. 아무 이상이 라면 전해질을 변경 합니다. - 전원 공급 장치를 중지 하 고 수동으로 클립에서 알 플레이트를 분리 합니다. 워시 모든 나머지 솔루션을 제거 하는 이온된 수와 산화 알 판.
- 알 루미나 에칭
- 크롬 산 이온을 제거 된 물 500 mL에 크롬 산화물 (크로마 뇽 인3)와 인산 (H3포4, 85%)의 20.3 mL 9.0 g을 용 해 하 여 솔루션을 에칭을 준비 합니다.
- 에칭 솔루션은 1 L 이중 자 켓 비이 커에 붓으십시오. 65 ° c.에 온도 설정
- 젖어 감동에서 적어도 10 h 에칭 솔루션에 양극 처리 알 판. 알루미늄 호 일로 비 커의 최고 봉인.
- 에칭된 알 판이 이온된 물으로 여러 번 헹 구 십시오.
- 2 차 양극
- 2.1.1 2.1.7 단계로 동일한 실험 조건을 설정 합니다.
- 시스템의 양극에 에칭된 알 판 로드 고 195 V 6 h의 전압을 적용 합니다. 그런 다음, 전원 공급 장치를 해제 하 고 수동으로 클립에서 알 플레이트를 분리. 즉시 씻어 이온된 수와 산화 알 판.
참고: 세척의 시간 지연 되 면 AAO의 기 공 크기 때문에 잔여 인산 실수로 증가 합니다.
- 그라데이션 공 확대
- 5.765 g의 인산 이온을 제거 된 물 500 mL에 용 해 하 여 기 공 확대 솔루션을 준비 합니다. 1 L 이중 자 켓 비 커에 솔루션을 붓는 다.
- 이중 자 켓 비 커는 circulator에 연결 하 고 30 ° c.에 온도 설정 비 커 옆 선형 이동 단계를 세로로 배치 합니다. 선형 단계의 움직이는 부분에는 브래킷을 부착 합니다.
- 선형 단계의 움직이는 부분이 홈 위치를 설정 합니다. 브래킷에 클립을 부착 하 고 안전한 모서리 처리 알루미늄 플레이트를 로드.
- 알 판 솔루션의 표면 위에 바로 올 것 이다 그래야 알 판의 위치를 수동으로 조작 합니다.
참고: 이 단계에서 알 판 솔루션 터치 해서는. 기 공 과정 확대 즉시 알 판에 도달 하는 솔루션으로 시작 됩니다. - 점차적으로 알 판 120 분 120에서 그라데이션 크기를 가진 35mm AAO 형 확인 4.86 µ m/s의 속도로 솔루션에 젖어 200 nm nm (GP 120/200). 알 판 솔루션의 표면 접촉 하는 순간에는 스톱 워치를 시작 합니다.
- GP 200/280와 GP 280/360 금형을 각각 2 또는 4 h에 대 한 솔루션을 확대 하는 기 공에 있는 GP 120/200 형의 전체 영역을 담가.
- 그라데이션 알 판이 이온된 물으로 여러 번 헹 구 십시오.
3. 자기 조립된 단층으로 그라데이션 AAO 형에 반대로 고정 층의 증 착
참고: 글러브 박스에 3.2.1 3.3.3 단계를 수행 합니다. 글러브 박스에는 진공 펌프와 건조 질소 가스 주입기를 연결 합니다. 습 과정 전에 글러브 박스에 모든 샘플, 시 약, 기구를 배치 합니다. 적절 하 게 장갑 상자에서 습기를 제거 하 피난 및 질소 가스 주입 주기 3 번 이상 반복 합니다. 건조 질소를 하자는 실험을 통해 흐름.
- 피 처리 된 AAO 금형의 수 산 기 수정
- 황산의 140 mL를 붓고 (H2이렇게4, 95%) 소계 (PTFE) 비 커에. 60 mL dropwise 과산화 수소 (H2O2, 30%)를 추가 합니다. 솔루션은 냉각 될 때까지 30 분 동안 그것을 둡니다.
주의: 피 라 솔루션을 만들 때 매우 주의 해야 합니다. 과산화 수소를 추가의 순간에서 솔루션 적극적으로 비등 하 고 높은 온도 생성 합니다. 증기 두건에서 실험을 수행 합니다. - 담가 30 솔루션에 AAO 몰드 s 비금속 족집게를 사용 하 여.
- AAO 형이 이온된 물으로 여러 번 헹 구 십시오. 또 다른 30 분 동안 메 틸 알코올에 넣어와 30 분 이온된 수에 있는 형을 담근 다.
주의: 사용 되는 피 솔루션을 삭제 하는 경우 풍부한 양의 물이 수도 꼭지 솔루션을 희석. - 완전히 진공 3 h에 대 한 아래 AAO 형 건조.
- 황산의 140 mL를 붓고 (H2이렇게4, 95%) 소계 (PTFE) 비 커에. 60 mL dropwise 과산화 수소 (H2O2, 30%)를 추가 합니다. 솔루션은 냉각 될 때까지 30 분 동안 그것을 둡니다.
- 20 × HDFS 재고 솔루션의 준비
참고: HDFS는 (heptadecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrodecyl)의 약어 dimethylchloro 실- 분자 체로 1 L n-헥 산 병의 1 / 3를 채우십시오. 파라핀 영화와 함께 병을 밀봉 하 고 24 h 건조 질소에서 그것을 저장.
- 유리 주사기와 0.2 µ m PTFE 주사기 필터를 사용 하 여 n-헥 산의 200 mL를 필터링 합니다.
- 필터링 된 n-헥 산의 80 mL 100 mL 유리병에 붓으십시오. HDFS의 2 개 mL를 추가 합니다.
- 자기 조립된 단층 증 착
- 100 mL 비 커에 필터링 된 n-hexane의 57 mL를 로드 합니다. 용 매에 AAO 금형을 담가.
- 2.9 mM HDFS 솔루션 n-헥 산을 HDFS 재고 솔루션의 3 mL를 추가 합니다. 반응 진행에 대 일 분을 기다립니다.
- 신선한 n-헥 산에 AAO 몰드를 전송. 닫고 모든 시 약 병을 밀봉 합니다. 질소 밸브 다음 장갑 상자에서 샘플 합니다.
참고: HDFS는 습기에 매우 민감합니다. 모든 시 약은 desiccator에서 HDFS를 포함 하는 저장 합니다. - Methoxynonafluorobutane (C10H6F18O2, 99%)의 60 mL AAO 몰드를 담근 다. 10 비 커에 AAO 금형 초음파 청소를 물리적으로 제거를 한 번 당 s HDFS 분자 흡착. 10 번 청소 절차를 반복 합니다.
참고: AAO 금형 초음파 간격 없이 장시간 노출 하는 것은 산화물 층을 손상 됩니다. - 완전히 진공 24 h에 대 한 아래 AAO 형 건조.
참고: 성공적으로 입금된 방지 고정 레이어는 슈퍼 발 수 하 고 달에 대 한 안정적인는 desiccator에 저장 될 때. 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다.
4. 열 각 인에 의해 그라데이션 Nanopattern 번호판의 제작
참고: 클린 룸에서 4.2-4.7 단계를 수행 합니다.
- 인쇄 회로 기판 (PCB) 커터를 사용 하 여 긴 3.7 m m를 폭 2.9 m m의 크기에 1.1 m m 두꺼운 폴리스 티 렌 시트를 잘라.
- AAO 형 35 m m는 집게를 사용 하 여 아래쪽에서 잘라. 샘플 이름 및 뒷면에 제조의 날짜를 표시 합니다.
- 청소는 8.0"웨이퍼 에틸 알코올의 작은 복용량으로. 웨이퍼에 폴리스 티 렌 시트 후 AAO 형을 탑재.
- 아래 영화 열 imprinter의 서랍에 넣어. 개 스를 최고의 영화를 연결 합니다.
- 아래 영화에 웨이퍼를 넣어. 장소는 웨이퍼에 가스 켓입니다. 웨이퍼에 먼지는 다는 것을 확인 하십시오.
- 열 imprinter의 서랍을 닫습니다. 열의 165 ° C와 100에 대 한 압력의 620.52 kPa 적용 s.
- 차가운 실내 온도에 샘플. 부드럽게 폴리스 티 렌 시트 AAO 몰드 릴리스를 트위스트.
5. 살 균 및 그라데이션 Nanopattern 플레이트의 친수성 수정
- 정사각형 접시에 nanopattern 접시를 놓습니다. 70% 에틸 알콜 100ml를 부 어 그리고 30 분 동안 자외선에 노출.
- 건조 질소로 nanopattern 격판덮개. 산소 플라즈마 생성기 nanopattern 접시를 전송 합니다.
- 1.33에 도달할 때까지 챔버를 철수 아빠 그런 다음 30 c m3의 속도로 산소를 주입/분 적용 유지 90 산소 플라즈마 W. 60의 라디오 주파수 전력 s.
참고: 14 일 이내 플라즈마 처리 nanopattern 접시를 사용 하는 것이 좋습니다. - 톨루엔의 방울을 사용 하 여 셀 문화 접시의 바닥에 nanopattern 플레이트를 연결 합니다.
- 주머니에 샘플을 봉인 하 고 저온 플라즈마 살 균과 소독.
6입니다. hECFCs의 재배
참고: 다른 설명이 없는 한 4 ° C에서 모든 centrifuging 절차를 수행 합니다.
- 말 초 혈액을 분리 하기 전에 단 세포 (PBMCs), 1 시간 동안 37 ° C에 12-잘 문화 콜라겐 코팅 접시를 품 어.
- 1 × 버퍼링 멸 균 인산 염 (PBS)를 사용 하 여 12-잘 문화 접시 세척.
- 헤 파 린 억제제 튜브를 사용 하 여 인간의 혈액 50 mL 수집 합니다.
- 15 mL 튜브에 친수성 다 당 류 솔루션의 6 mL를 넣어 고 친수성 다 당 류 솔루션을 혈액의 8 mL를 추가 합니다.
참고: 친수성 다 당 류 솔루션으로 피를 천천히 플라스틱. - 작은 셀을 20 분 동안 1020 x g에서 튜브 원심
- 불투명 셀 레이어를 수확 하 고 새로운 15 mL 튜브에 전송.
- 추가 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)-PBS를 포함 하 고 10 분 작은 셀 1020 x g에서 튜브 원심.
- 제거는 상쾌한 고-적혈구 세포의 용 해 버퍼를 추가 합니다. 5 분 동안 얼음에 계속.
- 10 %FBS 포함 된 PBS를 추가 하 고 작은 셀을 5 분 동안 1020 x g에서 튜브 원심.
- 제거는 상쾌한 고 10 %FBS 포함 된 PBS를 추가 합니다. 작은 셀을 5 분 동안 1020 x g에서 튜브 원심
- 상쾌한을 제거 하 고 10% 보완 하는 내 피 세포 확장 매체의 1 mL을 추가 FBS. 콜라겐 코팅 각 요리에 대 한 잘 당 종자 8.0 × 106 셀.
- 1 주 동안 매일 문화 매체를 변경 합니다. 그런 다음, 문화 매체 매 2 일 변경.
참고: hECFCs 문화 10-14 일 후 찾을 수 있습니다. hECFCs 일반 조약돌 모양의 형태를 표시 하 고 단계 대조 현미경에서 관찰 될 수 있는 식민지를 형성 한다. 혈관 내 피 cadherin (CD144) 및 폰 Willebrand 인자 (vWF)의 면역 형광 염색 추가 셀 확장 후에 hECFCs의 특성 또한 수행할 수 있습니다. - hECFCs을 육성, 5 %FBS 페니실린/streptavidin 5% CO2를 포함 하는 습도 분위기에서 37 ° C에서 보완 하는 내 피 세포 확장 매체를 사용 합니다. 매체는 하루에 한 번씩 교체 합니다.
- HECFC 유도 후 추가 실험을 위한 통로 7 세포 성장.
7. 셀 시드 및 그라데이션 Nanopattern 접시에 문화
참고: 7 단계 그라데이션 nanopattern에, hECFCs의 문화를 설명 하지만 다른 셀 소스도 사용할 수 있습니다.
- 실 온에서 10 분에 대 한 PBS에 0.1% 단백질 코팅 솔루션의 1 mL와 그라데이션 nanopattern 플레이트 코트.
참고: 0.1% 단백질 코팅 nanopillar 기능을 다루지 않습니다. - 트립 신을 사용 하 여 표준 셀 분할 방법으로 문화 접시에서 hECFCs 정지를 확인 합니다.
- 원하는 합류를 달성 하기 위해 세포 현 탁 액을 희석. HECFCs 그라데이션 nanopattern 플레이트와 플랫 컨트롤 (예: 1.0 × 104 셀/cm2) 씨앗
참고: HECFCs 1.0 × 104 셀/cm2 그라데이션 nanopattern 접시에에 씨를 뿌리고 때 셀 confluency 일반적으로 도달 한다 70-80 %2 일 후. - 인큐베이터에 2 일에 대 한 평면 또는 그라데이션 nanopattern 플레이트에 셀 문화.
8. 관찰 및 분석
- 스캐닝 전자 현미경 (SEM) 이미징
- 하룻밤에 4 ° C에서 2.5%도 평면 또는 그라데이션 nanopattern 접시에 경작 하는 hECFCs를 수정 합니다.
- 실 온에서 1 h 1% 오스뮴 tetroxide를 취급 합니다. PBS로 세척 샘플입니다.
- 샘플에서 각 단계 마다 10 분에 대 한 높은 농도 (50%, 70%, 80%, 90%, 및 100%)에 에틸 알콜을 탈수.
- 실 온에서 15 분 동안 hexamethyldisilazane (HMDS)를 취급 합니다. 그 후, 신선한 HMDS와 세척 하 고 떠나 연기 후드 아래 샘플 최소 1 일 잔여 HMDS 완전히 증발 때까지.
- 코트와 5 분 동안 플래티넘 스퍼터 coater 샘플 하 고는 SEM.와 샘플
- 전송 전자 현미경 (TEM) 이미징
- 하룻밤을 위해 2 %paraformaldehyde 2.5%도 혼합물 PBS에 4 ° C에서 플랫 또는 그라데이션 nanopattern 접시에 경작 하는 hECFCs를 수정 합니다.
- 수행 후 고정 1% 오스뮴 tetroxide를 사용 하 고 탈수 8.1.3에 메서드를 사용 하 여 샘플.
- 에폭시 수 지에 샘플을 포함 합니다. 블록에서 60 nm 두꺼운 부분을 확인 하 고 가장 격자에 섹션을 배치.
- 섹션 10 mg uranyl 아세테이트 100 mL 메 틸 알코올에서 및 증류수 100 mL 물에 0.1 mg 리드 시트르산의 혼합물으로 얼룩. TEM 이미지를 얻을.
- 형광 염색
- 15 분 동안 실 온에서 4 %paraformaldehyde 평면 또는 그라데이션 nanopattern 접시에 경작 하는 hECFCs를 수정 합니다.
- Permeabilize 고 5% 염소 혈 청 및 0.1% octylphenol ethoxylate PBS (PBST)에서 30 분 동안 실내 온도에 샘플을 차단 합니다.
- 반대로 인간 vinculin 1 차적인 항 체 (PBST에서 1: 500) PBST와 세 번 2 h. 린스 샘플에 대 한 실 온에서 샘플을 품 어.
- 2 헤 린스 샘플 PBST 3 번에 대 한 실 온에서 샘플 형광 활용 된 phalloidin (PBST에 1:1, 000), 형광 활용 된 이차 항 체 (PBST에 1:1, 000)를 품 어.
- 5 분 동안 실내 온도에 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, PBST에 1:1,000)와 함께 샘플을 품 어.
- 그라데이션 nanopattern의 표면에 장착 매체의 10 µ L를 드롭. 설치 매체에 coverslip 장소입니다.
- 샘플 거꾸로 샘플 단계에 놓고 공초점 형광 현미경을 사용 하 여 이미지를 취득 합니다.
- 이미지 분석
- 이미지 분석 시스템에는 hECFCs의 캡처된 이미지를 전송.
- Phalloidin 얼룩 이미지의 임의의 필드를 선택 합니다. 임계값을 조정 하 고 셀 배경에서 가지는 바이너리 이미지를 만듭니다.
- 셀 영역 및 경계를 측정 하 여 세포 당 filopodia 수를 수동으로 계산 셀 주위 윤곽을 그립니다.
- Vinculin 얼룩 이미지의 임의의 필드를 선택 합니다. 임계값을 조정 하 고 초점 접착 분야의 이진 이미지를 생성 합니다.
참고: 피하기 위해 인공 이상-또는 아래-filling 초점 접착 분야의 이미지 임계값을 적절 하 게 조정. - 각 셀의 초점 접착의 수를 계산 합니다.
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Representative Results
그림 1 에서는 그들의 형식 및 위치에 따라 조작된 그라데이션 AAO 금형의 SEM 이미지. 그림 2 는 일반 둥근 nanopillars와 그라데이션 nanopattern 플레이트의 SEM 이미지 이며 그림 3 nanopillar 직경의 정량화 데이터. 표 1 조작된 nanopillars의 특성을 나열합니다.
그림 4A 혈액 파생 된 hECFCs의 재배의 계획을 보여 줍니다. 그림 4B 쇼 thecultivated hECFCs의 위상 대비 이미지. 그림 4C hECFC 마커 물 CD144 (녹색), vWF (빨간색), 그리고 핵 (파란색)을 보여줍니다. 그림 5A 평면에, GP 120/200, GP 200/280, 문화와 GP 280/360 격판덮개의 2 일 후 hECFCs의 대표 SEM 이미지를 보여줍니다. 그림 5B 와 C 셀 영역 및 경계 평면에 비해 양적 데이터를 묘사. 부 량 데이터 공개 작은 크기의 nanopillar 표면에 성장 하는 세포 감소 셀 면적 및 변 길이 보였다. 그림 5D 기존 filopodia의 형태를 표시 하는 hECFCs의 대표 SEM 이미지 이다. 그림 5E filopodia 수 평면에 비해 양적 데이터를 보여 줍니다. 중요 한 filopodial 결과 중요 한 변화가 관찰 되었다 GP200/280 또는 GP280/360 평면 비교 하는 동안 GP 120/200, 배양 세포에서 관찰 되었다. 그림 5 층 문화 평평 하 고 그라데이션 nanopattern 접시에 2 일 후 hECFCs의 대표 가장 이미지를 보여줍니다.
그림 1입니다. 그라데이션 AAO 형. 그라데이션의 SEM 이미지 AAO GP 120/200, GP 200/280, 및 GP 280/360 접시 형의 위치에 따라 주조한 다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 그라데이션 nanopattern 판. 기둥 형 그라데이션 nanopattern 플레이트의 SEM 이미지 GP 120/200, GP 200/280, 및 GP 280/360 접시 격판덮개의 위치에 따라. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . Nanopillar 직경의 크기 그라데이션. 부 량 데이터 각각 GP 120/200, GP 200/280, 및 GP 280/360 판, nanopillar 직경의 그라디언트를 보여주는. 표준 오류를 나타내는 막대입니다. 이 그림은 [Acta Biomaterialia]에서 수정 된 20. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 영의 계수 (GPa) | Nanopillar 직경 (nm) | Nanopillar 피치 (nm) | 센터에 센터 거리 (nm) | Nanopillar 높이 (nm) | Nanopillar 강성 (N/m) | |
| 평면 | 2.43±0.19 | - | - | - | - | - |
| GP 120/200 | 1.74±0.11 | 120-200 | 320-240 | 440 | 276.9±21.9 | 9.35 |
| GP 200/280 | 2.01±0.05 | 200-280 | 240-160 | 440 | 268.1±25.9 | 55.78 |
| GP 280/360 | 2.1±0.13 | 280-360 | 160-80 | 440 | 293.6±23.6 | 134.15 |
표 1입니다. 특성 조작된 nanopillars. 계량된 데이터는 탄성 계수, 직경, 피치, 센터에 센터 거리, 높이 및 조작된 nanopillars의 강성을 보여주는. 이 테이블 [Acta Biomaterialia]에서 수정 된 20.
그림 4 . HECFCs 특성 (A) hECFCs의 회로도 표시 일정 성인 말 초 혈액에서 파생 된. (B) 단계 대조 이미지 hECFC 식민지의 날 14 성인 말 초 혈액에서 파생. (C) Immunofluorescent 이미지 CD144 (녹색) 보여주는 vWF (빨간색), 그리고 세포 핵 스테인드 DAPI (파란색)와 함께. 이 그림은 [Acta Biomaterialia]에서 수정 된 20. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 . hECFCs 2 일 동안 평평 하 고 그라데이션 nanopattern 접시에 배양. (A) hECFCs 평면, GP 120/200, GP 200/280, 그리고 GP 280/360 판에 교양의 대표적인 SEM 이미지. (B와 C) HECFCs의 둘레와 면적의 정량화 데이터 (n = 50). * p <.05 평면 비교. 평평 하 고 그라데이션 nanopattern 접시에 hECFCs의 첨단의 (D) 대표 SEM 이미지. 1 hECFC 당 filopodia의 수의 (E) 부 량 데이터 (n = 20). * p <.05 평면 비교. ((F)) hECFC 평면 및 그라데이션 nanopattern 격판덮개에 교양의 대표 편 이미지. 흰색 화살표 hECFCs 및 기판 표면 사이 상호 작용 지점을 나타냅니다. 이 그림은 [Acta Biomaterialia]에서 수정 된 20. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 1입니다. 물 접촉 각 깨끗 한 AAO와 HDFS의 취급 AAO. 접촉 각 측정 HDFS의 소수 성 특성을 보여주는 자기 전에 단층 (A) 와 (B) 치료 후에 조립. 이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 2. 같은 AAO 형 조작된 그라데이션 nanopattern 플레이트의 SEM 이미지. AAO 금형의 내 구성을 검증 하기 위한 비교 SEM 이미지를 설정 합니다. (A) 그라데이션 nanopattern 플레이트 갓 만든된 금형 생산. (B) 그라데이션 nanopattern 플레이트 생산 AAO 형 15 번 각 인 후. 이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 3입니다. 단백질 코팅의 영향. GP 120/200, GP 200/280, 또는 GP 280/360 그라데이션 nanopattern에 경작 했다 hECFCs의 SEM 이미지 없이 (A) 또는 (B) 단백질 코팅 접시. 이 그림은 [Acta Biomaterialia]에서 수정 된 20 이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
종종는 AAO의 제조 결함 균열, 모 공, 그리고 굽기의 불규칙 한 형태에서에서 겪고 있다. 이러한 결함에 대 한 주요 이유 알루 되 고 금속 기판의 자연과 전해질21의 저항력에 의해 강하게 영향을 전해 쇠 약을 이라고 합니다. 전해질의 저항력의 온도 따라 다르며, 전극에서 지속적으로 열 제거 이므로 이러한 높은 전압 아노다이징 조건에서 안정적으로 전해질의 locational 온도 유지 하기 위해 중요 한 포인트. 이 프로토콜에서 우리는 마스 다의 2 단계 양극22,23를 수정 하 여 AAO 금형 조작. 메 틸 알코올로 거의 절반 전해질을 대체 뿐만 아니라 전해질 낮은 온도에서 동결 하는 것을 방지 하지만 또한 아래쪽 공24의 증발에 의해 전극의 열을 빼앗아. 자력 교 반기 대신 오버 헤드 교 반기와 임 펠 러를 사용 하는 이유는 온도 제어를 보장 하기 위해 이기도 합니다. 전형적인 자력 마그네틱 바의 실수로 부정합으로 인하여 장기 동작 시 공회전의 확률이 매우 높은 있다. 이 문제는 전해질, 그것의 온도 제기 하 고 굽기로 이어지는의 부적절 한 순환을 유도 합니다.
크기 그라데이션 AAO 형에 게, 우리는 점차적으로 인산의 산 성 솔루션을 에칭에 AAO 몰두. 그림 1에서 보듯이 모 AAO 에칭 솔루션에 유지 하는 시간에 비례하여 확대 됩니다. 이 조건 하에서 평균 기 공 확대 속도가 0.67 nm/분 immersing 속도 및 시간 조작 AAO의 크기 그라데이션 및 최대 기 공 직경의 기울기를 변경 됩니다. 최대 가능한 기 공 직경은 400 nm. 기 공 직경 400을 초과 하는 때 nm, 숨 구멍 사이 간격 벽 너무 얇은 열 과정을 각 인 하는 동안 압력을 용인할 수 없다 그것은 된다.
HDFS 자기 조립된 단층25소재 표면 소수 성 속성을 추가할 수 있을 알려져 있다. HDFS 분자 피 치료26에 의해 도입 된 AAO 표면에 수 산 기 그룹을 가진 강한 공유 결합을 만든다. 따라서, 보충 그림 1 에서 보는 바와 같이 고체 자기 조립된 단층 수 형성 될 기판 표면에 수 산 기 그룹의 많은 수 있을 때. HDFS 자기 조립된 단층으로 최적의 품질, dehumidified 분위기에서 반응을 수행 하는 것이 좋습니다. HDFS 습기에 노출 되 면 물으로 측 반응 이합체, trimers, 그리고 심지어 올리고 실 란 분자의 형성 하 고 자기 조립된 단층의 전반적인 품질을 감소.
열 nanoimprinting에 크기 그라데이션으로 AAO 몰드를 사용 하 여, 따라 그림 2 및 그림 3nanopillars의 그라데이션으로 셀 배양 배지 획득 했다. 열 nanoimprinting 메서드는 하나의 AAO 마스터 몰드를 사용 하 여 동일한 nanopattern 플레이트의 대량 생산할 수 있는 장점이 있다. 보충 그림 2 nanopattern 새로운 AAO 금형에 의해 생산 하는 nanopattern에 비해 15 각 인 프로세스 후에 생산의 품질에 차이가 있다는 것을 보여준다. nanopattern 전송에 대 한 자료로 폴리스 티 렌을 선택 하기 위한 이유는 폴리스 티 렌 열 각 인에 대 한 적절 한 유리 전이 온도 (100 ° C)는 그것은 널리 상업 셀 문화 요리 때문에 이용의 투명 하 고 비 독성 속성입니다.
열 nanoimprinting 메서드를 사용 하 여 높은 종횡비 nanostructures 날조 하는 것은 어렵습니다. 때 프로세스, 압력 및 시간 증가, 같은 조건 때문에 금형 깊이 폴리머 기판, 기판에서 금형을 분리 열심히 하에 포함 된다. 따라서, 그것은 생산 nanopatterns는 가로 세로 비율 1:3 이상 우리의 nanoimprinting 기술을 사용 하는 데 매우 도전적 이다. 그러나, 가장 이미지에 따라 그림 5C관찰, 우리 nanopatterns 셀의 막 하지는 nanopattern의 하단 접촉 했다는 흥미로운 사실을 발견 했다. 즉, 셀의 응답을 조작할 수 있는 모든 물리적 자극은 nanopattern의 최고 부분에서 기인 되었다. 따라서, 본이 연구에서는 우리 없었다 공부는 nanopattern 셀의 응답에서 가로 세로 비율을 고려 하는. 보충 그림 3에서 보듯이, 0.1% 단백질 코팅 솔루션 nanopillar 표면에 hECFCs의 첨부 파일에 아무런 영향을 했다. 또한, 이러한 나노 자극 그라데이션 nanopattern 격판덮개에서 hECFCs 및 증가 filopodial 파생물 그림 5의 둘레와 셀 영역 감소.
요약 하자면, 우리는 생체 외에서hECFCs의 응답을 조작 하 여 그라데이션 nanopattern 접시를 설립. 정확히 어떤 셀 크게 영향을 받는 nanostructures의 크기를 알고, 미래 일이는 nanopillars의 크기 그라데이션 및 최소-최대 직경의 기울기를 조정 하 여 셀 특정 크기의 nanopillar를 디자인 하는 데 필요한. 우리는이 그라데이션 nanopattern 매혹적인 도구를 셀과 nanostructures 간의 상호 작용을 화면으로 제공 하는 고급 셀 틈새는 nanostructures 조정 될 수 있다 자유롭게 크기에서를 기대 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 기본적인 과학 연구 프로그램을 통해 국가 연구 재단의 한국 (NRF)는 교육, 과학 및 기술 (MEST) [NRF-2015R1D1A1A01060397] 및 바이오 의료 기술 개발 자금에 의해 지원 되었다 과학기술부, 정보 통신 및 미래 계획 [NRF-2017M3A9C6029563]에 의해 투자 하는 NRF의 프로그램.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perchloric acid 60% | Daejung Chemicals & Metals | 6512-4100 | |
| Ethyl alcohol, absolute 99.9% | Daejung Chemicals & Metals | 4118-4100 | |
| Phosphoric acid 85% | Daejung Chemicals & Metals | 6532-4400 | |
| Methyl alcohol 99.5% | Daejung Chemicals & Metals | 5558-4400 | |
| Chromium(VI) oxide | Daejung Chemicals & Metals | 2558-4400 | |
| Sulfuric acid 95% | Daejung Chemicals & Metals | 7781-4100 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Daejung Chemicals & Metals | 4104-4400 | |
| n-hexane 95% | Daejung Chemicals & Metals | 4081-4400 | |
| Toluene 99.5% | Daejung Chemicals & Metals | 8541-4400 | |
| (heptadecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrodecyl)dimethylchlorosilane | Gelest | SIH5840.4 | Moisture sensitive |
| Methoxynonafluorobutane 99% | Sigma aldrich | 464309 | |
| Collagen solution | Stemcell | #4902 | |
| Gelatin | Sigma aldrich | G1890 | Protein coating solution |
| Ficoll-Paque | GE Heathcare | 17-1440-03 | Hydrophilic polysaccharide solution |
| EGM-2MV | Lonza | CC-3202 | Endothelial cell expansion medium |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010031 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Paraformaldehyde | Sigma aldrich | P6148 | |
| Glutaraldehyde | Sigma aldrich | G5882-100ML | |
| Osmium tetroxide | Sigma aldrich | 201030-1G | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma aldrich | 440191 | |
| Triton X-100 | Sigma aldrich | X100-100ML | Octylphenol ethoxylate |
| Goat serum | Gibco | 26050-088 | |
| anti-human vinculin primary antibody | Sigma aldrich | V9131 | |
| F-actin probe | Molecular Probes | A12379 | Fluorescence-conjugated phalloidin |
| Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes | A11001 | Fluorescence-conjugated secondary antibody |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | Sigma aldrich | D9542 | |
| Mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Anti-human vWF primary antibody | DAKO | A0082 | |
| Anti-human CD144 primary antibody | BD Biosciences | #555661 | |
| Eponate 12™ Embedding Kit, with BDMA | Ted Pella | 18012 | Epoxy resin |
| Uranyl Acetate, 25g | Ted Pella | 19481 | |
| Lead Citrate, Trihydrate, 10g | Ted Pella | 19312 | |
| Ultra pure aluminum plate | Goodfellow | 26050-088 | |
| Polystyrene sheet | Goodfellow | ST313120 | |
| 8.0" silicon wafer | Siltron | 29-01024-03 | Single side polished, 725 µm thick |
| Vacuum desiccator, 4.4 L | Kartell | KA.230 | |
| Vacuum pump | Vacuumer | V3.VOP100 | |
| Power supply | Unicorntech | UDP-3003 | |
| Magnetic stirrer | Daihan scientific | SL.SMS03022 | |
| Overhead stirrer | Daihan scientific | HT120DX | |
| Circulator | Daihan scientific | WCR-P12 | |
| Linear moving stage | Zaber | A-LSQ300A-E01-KT07 | |
| Angle bracket, 90 degrees | Zaber | AB90M | Accessory of the linear moving stage |
| PMP forcep, 145 mm | Vitlab | 67995 | Nonmetallic tweezer |
| PTFE beaker, 250 mL | Cowie | CW007.25 | |
| Ultrasonic cleaner | Branson | B2510MTH | |
| PCB cutter | Hozan Tool Industrial | K-110 | |
| Nanoimprint device | Nanonex | NX-2000 | |
| Oxygen plasma generator | Femto Science | CUTE | |
| Low temperature sterilizer | Lowtem | Crystal 50 | |
| CO2 Incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Confoal laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Scanning electron microscope | JEOL | JSM6701 | |
| Transmission electron microscope | Hitachi | H-7500 |
References
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