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Bioengineering

Herstellung von Gradient Nanopattern durch thermische Nanoimprinting Technik und Screening der Reaktion des menschlichen koloniebildenden Endothelzellen

Published: July 1, 2018 doi: 10.3791/57661
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 2, 2, 1
1School of Biomedical Engineering, Korea University, 2Department of Cardiology, Korea University Anam Hospital
* These authors contributed equally

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Fertigung der gradient Nanopattern Platten über thermische Nanoimprinting und die Methode der screening-Antworten der menschlichen endotheliale Vorläuferzellen in Nanostrukturen. Durch den Einsatz der beschriebenen Technologie ist es möglich, ein Gerüst zu produzieren, die Zelle Verhalten durch physikalische Reize bearbeiten können.

Abstract

Nanotopography finden sich in unterschiedlichen extrazellulären Matrizen (ECMs) um den Körper und ist bekannt als wichtige regulatorische Maßnahmen auf zelluläre Reaktionen haben. Allerdings ist es schwierig, das Verhältnis zwischen der Größe einer Nanostruktur und die Reaktionen der Zellen aufgrund der mangelnden richtigen Screening-Tools bestimmen. Hier zeigen wir die Entwicklung von reproduzierbaren und kostengünstige gradient Nanopattern Platten für die Manipulation von zellulären Antworten. Mit anodische Aluminiumoxid (AAO) als ein master-Form, gradient Nanopattern Platten mit Nanopillars der zunehmenden Durchmesserbereiche [120-200 nm (GP 120/200), 200-280 nm (GP 200/280) und 280-360 nm (GP 280/360)] wurden durch eine thermische Prägung Technik hergestellt. Diese Gradienten Nanopattern Platten wurden entwickelt, um die verschiedenen Größen des Nanotopography in das ECM zu imitieren und wurden verwendet, um die Reaktionen des menschlichen koloniebildenden Endothelzellen (hECFCs) Bildschirm. In diesem Protokoll beschreiben wir Schritt für Schritt Verfahren der Herstellung von gradient Nanopattern Platten für Zelle engineering, Techniken der hECFCs aus dem menschlichen peripheren Blut zu kultivieren und Kultivierung von hECFCs auf Nanopattern Platten.

Introduction

Vor kurzem hat die Reaktion der Zellen durch die physische Stimulation der Oberflächentopographie im Bereich der Zelle engineering1,2,3,4angestrahlt wurden. Daher konzentriert sich stärker auf dreidimensionale Nanostrukturen auf der Zelle Oberfläche Anlage5. Es wurde berichtet, dass der Integrin, das die Oberfläche Anerkennung Gerät der Zelle ist, die körperliche Anregung angetrieben durch die Mikro-Nano-Strukturen der ECM durch Mechano-Transduktion6überträgt. Diese mechanische Stimulation reguliert Zelle Verhalten durch Kontakt Leitung7 und induziert Zellskelett Reorganisation, Form, neben der fokalen Adhäsionen und Steifigkeit der Zellen8zu ändern.

Menschlichen endotheliale Vorläuferzellen (hEPCs) im Körper arbeiten eng mit der Mikroumgebung von den umliegenden ECM-9. Dies bedeutet, dass der physikalische Zustand des ECM als ein wichtiger Parameter für die spezifische Zellmatrix Adhäsion Komplexbildung wirkt soviel Blut fließen10Schubspannung abgeleitet. Es wird berichtet, dass die Oberfläche Nanotopography verbessert die in-vitro- Netzwerkbildung umfangreiche Kapillarrohr hEPCs11 und, dass ein ECM/Bio löslicher Faktor System kombiniert ermöglicht hEPCs, dysfunktionalen Substrate zu erkennen und fördert die Wunde heilen12,13. Dennoch ist das Verhältnis von ECM und hEPCs nicht klar.

Obwohl viele Forscher versucht zu klären, die Beziehung zwischen Zell-Reaktionen und körperliche Signale von verschiedenen Substraten14,15,16, verwendet diese Studien nur die feste Größe von einer Nanostruktur oder Nanopatterns mit unregelmäßigen Arrangements, die eine Beschränkung auf die Beziehung zwischen der Größe der Zelle und Nanostrukturen Verhalten aufzuklären haben. Das Problem hier ist ein Mangel an geeigneten Werkzeugen für das screening von zellulärer Reaktionen, die bestehende mühsam und iterative Ansätze zu finden, die optimale Größe der Nanostruktur ersetzen können. Daher ist eine einfache Technik für das screening von Zelle Reaktionen auf körperliche Reize ohne Wiederholung erforderlich.

Hier beschreiben wir eine Methode in unsere früheren Berichte17,18,19 , um ein gradient Nanopattern zu produzieren, in denen der Durchmesser der angeordneten Nanopillars schrittweise erhöht. Darüber hinaus beschrieben wir auch, wie man pflegen und analysieren das Verhalten von hECFCs auf gradient Nanopattern Platten zu ermitteln, die Wirkung von physikalischen Reize auf die Zellen. Eine milde Anodisierung, stufenweisen Ätzen und Anti-sticking Layer Beschichtungsverfahren dienten gradient AAO Schimmel zu fabrizieren. Durch die Annahme einer thermisches Prägung Lithographie-Technik, wurden identische Polystyrol gradient Nanopatterns auf eine kostengünstige und einfache Weise hergestellt. Mit Farbverlauf Nanopatterns ist es möglich, festzustellen, welche Größe der Nanostruktur hat einen großen Einfluss auf Zelle Verhalten in einem Experiment. Wir erwarten, dass dieser gradient Nanopattern hilfreich sind für das Verständnis der Mechanismen der Interaktion zwischen Blut abgeleitet hECFC oder andere Zellen und Nanostrukturen in verschiedenen Größen.

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Protocol

Diese Studie wurde von der Institutional Review Board Universitätsklinik Korea Anam (IRB Nr. genehmigt ED170495). Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki und ihrer späteren Änderungen durchgeführt.

1. Vorbereitung von Aluminium (Al) Substrat durch Elektropolieren

Vorsicht: Elektropolieren Lösung ist ätzend und giftig. Tragen Sie persönliche Schutzausrüstung einschließlich Nitril-Handschuhe, Schutzbrille und Kittel. Führen Sie diesen Schritt in einer Dampfhaube.

  1. Elektropolieren Lösung durch Mischen Ethyl Alkohol (C2H5OH, 99,9 %) ansetzen und Perchlorsäure (HClO4, 60 %) in einem 1 L-Doppelmantel-Becher (C2H5OH:HClO4 = 4:1).
  2. Schließen Sie den Doppelmantel Becher an einen Thermostaten und stellen Sie die Temperatur bei 7 ° C. Setzen Sie den Doppelmantel-Becher auf einen Magnetrührer. Lassen Sie die Lösung unter Rühren für mindestens 30 Minuten, bis die Temperatur auf 7 ° C sinkt.
  3. Tauchen die hochreine Al-Platte (99,999 %, 20 × 50 × 1 mm3) und Kohlenstoff Gegenelektrode in das Elektropolieren Lösung mit Krokodilklemmen und Kupferdraht. Passen Sie die Position der Al-Platte und Kohlenstoff Gegenelektrode gegeneinander antreten.
    Hinweis: Es ist notwendig, die Clips sorgfältig zu installieren, so nicht die Lösung zu berühren. Beim Kontakt mit der Lösung können Verunreinigungen fließt aus den Clips die Al-Platte verunreinigen.
  4. Die Al-Platte mit dem Pluspol und Kohlenstoff Gegenelektrode zum Minuspol verbinden, von einem Gleichstrom (DC) Stromversorgung.
  5. Schalten Sie den Magnetrührer und gelten Sie eine Spannung von 20 V. Maintain dieser Zustand für 4 min.
  6. Schalten Sie den Magnetrührer und lassen Sie den Strom für weitere 6 Minuten fließen.
    Hinweis: Der statische Zustand entfernt die meisten Verunreinigungen und Rauheit von der Al-Platte und der dynamische Zustand verbessert die Endqualität des Elektropolieren.
  7. Schalten Sie die Stromversorgung und trennen Sie die Al-Platte aus dem Clip manuell zu. Gründlich waschen Sie die Al-Platte mit entionisiertem Wasser, alle restlichen Lösung zu entfernen.
  8. Trocknen Sie die Al-Platte mit Stickstoff und Store unter Schutzgas. Führen Sie diese Trocknung am Ende aller Experimente in Schritt 1 und 2.
    Hinweis: Achten Sie beim Druckluft injiziert, Luftstrom aus dem polierten Teil auf die gegenüberliegende Seite. Im umgekehrten Fall können Verunreinigungen nicht poliert Teil entfliehen und verunreinigen die Al-Platte.

2. Herstellung von Gradient AAO Schimmel mit Phosphorsäure Elektrolyt

Vorsicht: Methylalkohol und seine Dämpfe sind okuläre giftig. Kontinuierliche Exposition gegenüber Chrom kann zu schweren Chrom-Vergiftung führen. Führen Sie diesen Schritt in einer Dampfhaube.

  1. Primäre Anodisierung
    1. Um 1 L Phosphorsäure Elektrolyt vorzubereiten, laden Sie 590 mL entionisiertem Wasser in einer Glasflasche.
    2. Fügen Sie 400 mL Methylalkohol (CH3OH, 99 %) und 10 mL Phosphorsäure (H3PO4, 85 %) in der Glasflasche. Mischen Sie die Lösung gut durch Schütteln manuell oder mit magnetischen rühren.
    3. Gießen Sie 500 mL des Elektrolyten in ein 1 L Doppelmantel Becherglas. Tauchen Sie die polierte Al Platte und Carbon Gegenelektrode in die Lösung mit Krokodilklemmen und Kupferdraht.
    4. Gießen Sie zusätzliche Elektrolyt um die Begrenzung des Elektropolieren ca. 2-3 mm über die Oberfläche der Lösung zu finden.
      Hinweis: Wenn Anodisierung mit der Begrenzung des Elektropolieren berühren die Lösung durchgeführt wird, neigt die Al-Platte, während die Anodisierung brennen.
    5. Installieren Sie eine vertikale Welle auf einem U-Form-Sockel. Befestigen Sie eine obenliegende Rührer und Laufrad mit Metall-Klammern. Positionieren Sie den Propeller des Laufrades am unteren Ende der beiden Elektroden. Die Rotationsgeschwindigkeit des obenliegenden Rührers zwischen 200 und 300 u/min eingestellt.
    6. Schließen Sie den Doppelmantel Becher an einen Thermostaten und stellen Sie die Temperatur bei-10 ° C. Lassen Sie das System für mindestens 1 h unter Rühren, bis die Temperatur auf-10 ° C sinkt.
      Hinweis: Verwenden Sie nicht Wasser als Kühlmittel. Da das Wasser bei niedrigen Temperaturen gefriert, wird die Zirkulation nicht normal funktionieren. Es wird empfohlen, eine Mischung aus Wasser und Ethylalkohol bei einem Verhältnis von 1:1 als Kühlmittel verwenden.
    7. Wenden Sie eine Spannung von 195 V unter Rühren für 16 h.
      Hinweis: Wenn der Strom mehr als 50 steigt mA innerhalb 2 oder 3 Stunden nach Anlegen der Spannung, die Wahrscheinlichkeit, dass die Verbrennung erfolgt ist sehr hoch. Sofort beenden Sie den Prozess und ersetzen Sie die Al-Platte durch eine neue. Wenn dieses Problem wiederholt auftritt, überprüfen Sie, daß es keine Anomalie in der Temperaturregelung des Thermostaten. Wenn es keine Anomalie gibt, Ändern des Elektrolyts.
    8. Beenden Sie das Netzteil und manuell trennen Sie die Al-Platte aus dem Clip. Waschen Sie die eloxierte Al-Platte mit entionisiertem Wasser, alle restlichen Lösung zu entfernen.
  2. Aluminiumoxid-Radierung
    1. Bereiten Sie Chromsäure Radierung Lösung durch Auflösen von 9,0 g Chromoxid (CrO-3) und 20,3 mL Phosphorsäure (H3PO4, 85 %) in 500 mL entionisiertem Wasser vor.
    2. Gießen Sie die Radierung Lösung in 1 L Doppelmantel Becherglas. Stellen Sie die Temperatur bei 65 ° C.
    3. Tauchen Sie die eloxierte Al-Platte in der Radierung Lösung für mindestens 10 h unter Rühren. Verschließen Sie die Spitze des Bechers mit Alufolie.
    4. Spülen Sie die geätzte Al-Platte mehrmals mit entionisiertem Wasser.
  3. Sekundäre Anodisierung
    1. Legen Sie die gleichen Versuchsbedingungen als Schritt 2.1.1 zu 2.1.7.
    2. Laden der geätzten Al-Platte an der Anode des Systems und einer Spannung von 195 V 6 h. Dann schalten Sie die Stromversorgung und trennen Sie die Al-Platte aus dem Clip manuell zu. Waschen Sie die eloxierte Al-Platte mit entionisiertem Wasser.
      Hinweis: Wenn die Zeit des Waschens verzögert wird, erhöht die Porengröße der AAO unbeabsichtigt aufgrund der verbleibenden Phosphorsäure.
  4. Gradient Pore Verbreiterung
    1. Bereiten Sie eine immer größer werdende Porenlösung durch 5,765 g Phosphorsäure in 500 mL entionisiertem Wasser auflösen. Gießen Sie die Lösung in ein Becherglas 1 L Doppelmantel.
    2. Verbinden Sie den Doppelmantel-Becher mit Thermostaten und stellen Sie die Temperatur auf 30 ° C. Stellen Sie eine lineare Bewegung Bühne senkrecht neben den Becher. Befestigen Sie eine Halterung auf den beweglichen Teil der linearen Phase.
    3. Legen Sie den beweglichen Teil der linearen Phase in die Ausgangsposition. Befestigen Sie den Clip an der Halterung und laden Sie die eloxierte Al-Platte zu.
    4. Manipulieren Sie die Position der Platte Al manuell so, dass die Al-Platte direkt über der Oberfläche der Lösung kommen wird.
      Hinweis: In diesem Schritt sollte die Al-Platte berühren nicht die Lösung. Die Pore Erweiterung Prozess beginnt, sobald die Al-Platte die Lösung erreicht.
    5. Allmählich Tauchen die Al-Platte in die Lösung mit einer Geschwindigkeit von 4,86 µm/s 120 min um eine 35 mm AAO Form mit einer Größe von 120 gradient machen nm auf 200 nm (GP 120/200). Starten Sie im Moment, den die Al-Platte die Oberfläche der Lösung berührt, eine Stoppuhr.
    6. Um GP 200/280 und GP 280/360 Formen bilden, Tauchen Sie die gesamte Fläche des GP 120/200 Schimmel in die Pore Lösung für 2 oder 4 h, bzw. Erweiterung.
    7. Spülen Sie die gradient Al-Platte mit entionisiertem Wasser mehrmals.

(3) Ablagerung von Anti-Sticking Layer auf Farbverlauf AAO Schimmel mit selbst-zusammengebauten monomolekularen Film

Hinweis: Führen Sie Schritte 3.2.1 zu 3.3.3 in einem Handschuhfach. Schließen Sie eine Vakuumpumpe und trockenem Stickstoff-Gas-Injektor für das Handschuhfach. Legen Sie alle Proben, Reagenzien und Apparate in der Glove-Box vor der Entfeuchtung. Wiederholen Sie Evakuierung und Stickstoff Gas Einspritzzyklus mehr als dreimal, um ausreichend Feuchtigkeit aus dem Handschuhfach zu entfernen. Lassen Sie die trockenen Stickstoff fließen durch das Experiment.

  1. Hydroxyl-Änderung der AAO Schimmel mit Piranha-Behandlung
    1. Gießen Sie 140 mL Schwefelsäure (H2SO4, 95 %) in ein Becherglas Polytetrafluorethylen (PTFE). Fügen Sie 60 mL Wasserstoffperoxid tropfenweise (H2O2, 30 %). Lassen Sie es für 30 min, bis die Lösung abgekühlt ist.
      Vorsicht: Extrem vorsichtig sein beim Piranha-Lösung machen. Ab dem Zeitpunkt der Zugabe von Wasserstoffperoxid die Lösung kräftig kocht und erzeugt hohe Temperaturen. Führen Sie das Experiment in einer Dampfhaube.
    2. Eintauchen die AAO-Form in die Lösung für 30 s mit einer nichtmetallischen Pinzette.
    3. Spülen Sie die AAO Form mehrmals mit entionisiertem Wasser. Die Form in entionisiertem Wasser für 30 min einweichen und steckte es in Methylalkohol für weitere 30 Minuten.
      Vorsicht: Wenn die verwendete Piranha-Lösung zu verwerfen, verdünnen Sie die Lösung mit reichlich Wasser aus dem Wasserhahn.
    4. Trocknen Sie vollständig die AAO Form unter Vakuum für 3 h.
  2. Vorbereitung von 20 × HDFS Stammlösung
    Hinweis: HDFS ist die Abkürzung (Heptadecafluoro-1,1,2,2, - Tetrahydrodecyl) Dimethylchloro-Silan
    1. Füllen Sie ein Drittel der Flasche 1 L n-Hexan mit Molekularsieben. Verschließen Sie die Flasche mit Paraffin Film und speichern Sie es unter trockenem Stickstoff für 24 h.
    2. Filtern Sie die 200 mL n-Hexan mit einer Glasspritze und 0,2 µm PTFE Spritze Filter.
    3. Gießen Sie die 80 mL von gefilterten n-Hexan in eine 100 mL Flasche. 2 mL HDFS hinzugeben.
  3. Selbst-zusammengebauten monomolekularen Film Ablagerung
    1. 57 mL von gefilterten n-Hexan in einen 100-mL-Becherglas zu laden. Die AAO-Form in das Lösungsmittel eintauchen.
    2. N-Hexan zu 2,9 mM HDFS Lösung fügen Sie 3 mL der Stammlösung HDFS hinzu. Warten Sie 10 Minuten für die Reaktion auf fortfahren.
    3. Übertragen Sie die AAO Schimmel auf frische n-Hexan. Schließen Sie und versiegeln Sie alle Flaschen Reagenz. Schließen Sie das Stickstoff-Ventil, dann Proben aus dem Handschuhfach herausziehen.
      Hinweis: HDFS ist extrem empfindlich gegenüber Feuchtigkeit. Speichern Sie alle Reagenzien, die in einem Exsikkator HDFS enthalten.
    4. Genießen Sie die AAO Schimmel in 60 mL Methoxynonafluorobutane (C10H6F18O2, 99 %). Ultraschall reinigen die AAO-Form in einen Becher für 10 s pro einmal physisch entfernen adsorbiert HDFS Moleküle. Wiederholen Sie den Reinigungsvorgang 10 mal.
      Hinweis: Verfügbarmachen der AAO-Schimmel, Ultraschall für eine lange Zeit ohne Unterbrechungen wird die Oxidschicht beschädigt.
    5. Trocknen Sie vollständig die AAO Form unter Vakuum für 24 h.
      Hinweis: Ein erfolgreich abgelegten Anti-sticking-Layer ist besonders wasserabweisend und monatelang stabil, wenn Sie in einem Exsikkator gespeichert. Das Protokoll kann hier angehalten werden.

4. Herstellung von Gradient Nanopattern-Platten durch thermische Prägung

Hinweis: Führen Sie Schritte 4.2 bis 4.7 in einem Reinraum.

  1. Schneiden Sie eine 1,1 mm dickem Polystyrol-Platte auf eine Größe von 2,9 mm breit von 3,7 mm lang mit einem Printed Circuit Board (PCB) Cutter.
  2. Schneiden Sie die AAO Form 35 mm von der Unterseite mit einem Nipper. Markieren Sie den probennamen und Herstellungsdatum auf der Rückseite.
  3. Eine 8.0" Wafer mit einer kleinen Dosis von Ethylalkohol zu reinigen. Setzen Sie die Polystyrol-Platten auf dem Wafer, dann montieren Sie die AAO-Form.
  4. Setzen Sie die Unterfolie in der Schublade des thermischen Imprinter. Legen Sie die Oberfolie auf die Dichtung.
  5. Setzen Sie die Wafer auf die Unterfolie. Legen Sie die Dichtung auf dem Wafer. Stellen Sie sicher, dass es kein Staub auf dem Wafer.
  6. Schließen Sie die Schublade des thermischen Imprinter. Anwenden von 165 ° C Hitze und 620.52 kPa Druck für 100 s.
  7. Die Probe auf Raumtemperatur abkühlen. Drehen Sie vorsichtig die Polystyrol-Platte um die AAO Form zu lösen.

5. die Sterilisation und hydrophilen Modifikation der Gradient Nanopattern Platten

  1. Legen Sie die Nanopattern-Platten auf einen quadratischen Teller. Gießen Sie 100 mL 70 % Ethylalkohol und UV-Licht für 30 min aussetzen.
  2. Trocknen Sie die Nanopattern-Platten mit Stickstoff. Übertragen Sie die Nanopattern-Platten auf eine Sauerstoff-Plasma-Generator.
  3. Die Kammer zu evakuieren, bis 1,33 erreicht PA. Dann Spritzen Sauerstoff mit einer Rate von 30 cm3/min gelten eine Hochfrequenz-Leistung von 60 W. Maintain Sauerstoffplasma für 90 s.
    Hinweis: Es wird empfohlen, plasmabehandelte Nanopattern Platten innerhalb von 14 Tagen zu verwenden.
  4. Legen Sie die Nanopattern-Platte am unteren Rand der Zelle Kulturschale mit einem Tropfen Toluol.
  5. Die Proben in einem Beutel verschließen und mit Niedrigtemperatur-Plasma Sterilisator sterilisieren.

6. Anbau von hECFCs

Hinweis: Führen Sie alle sandbacken Verfahren bei 4 ° C, sofern nicht anders angegeben.

  1. Vor das periphere Blut zu isolieren inkubieren MONONUKLEÄRE Zellen (PBMCs) die Kollagen-beschichtete 12-Well-Kulturschale bei 37 ° C für 1 h.
  2. Waschen Sie die 12-Well Kulturschale mit 1 × sterile Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
  3. Sammeln Sie 50 mL des menschlichen Blutes mit einem Heparin-Inhibitor-Rohr.
  4. 6 mL hydrophil Polysaccharid-Lösung in eine 15 mL-Tube und fügen Sie 8 mL Blut der hydrophil Polysaccharid-Projektmappe hinzu.
    Hinweis: Langsam pipette das Blut in die hydrophil Polysaccharid-Lösung.
  5. Zentrifugieren Sie das Rohr auf 1020 X g für 20 min. zu die Zellen zu Pellets.
  6. Ernten Sie der undurchsichtige Zellschicht, und übertragen Sie auf eine neue 15 mL Tube.
  7. Fügen Sie 10 % fetalen bovine Serum (FBS)-enthaltenen PBS und Zentrifugieren Sie das Rohr auf 1020 X g für 10 min. zu die Zellen zu Pellets.
  8. Entfernen des Überstands und Lyse der Erythrozyten Puffer. Halten Sie für 5 min auf Eis.
  9. Fügen Sie 10 % FBS enthaltenen PBS und Zentrifugieren Sie das Rohr auf 1020 X g für 5 min zu die Zellen zu Pellets.
  10. Entfernen Sie den überstand zu und fügen Sie 10 % FBS enthaltenen PBS. Zentrifugieren Sie das Rohr auf 1020 X g für 5 min zu die Zellen zu Pellets.
  11. Den überstand zu entfernen und fügen Sie 1 mL der Endothelzellen Erweiterung Medium ergänzt mit 10 % FBS. 8,0 × 106 Samenzellen pro Bohrloch für jedes Gericht mit Kollagen beschichtet.
  12. Ändern Sie das Kulturmedium täglich für 1 Woche. Ändern Sie das Kulturmedium dann alle 2 Tage.
    Hinweis: hECFCs finden Sie nach Kultur Tag 10-14. hECFCs zeigen typische Kopfsteinpflaster-ähnliche Morphologie und bilden eine Kolonie, die in Phasenkontrastmikroskopie beobachtet werden kann. Immunfluoreszenz-Färbung des vaskulären endothelialen Cadherin (CD144) und von-Willebrand-Faktor (vWF) kann auch zur Charakterisierung von der hECFCs nach weiteren Zelle Ausbau erfolgen.
  13. Um die hECFCs zu pflegen, nutzen Sie Endothelzellen Erweiterung Medium mit 5 % FBS und Penicillin/Streptavidin bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre mit 5 % CO2ergänzt. Ersetzen Sie das Medium einmal pro Tag.
  14. Wachsen Sie nach hECFC Induktion die Zellen Durchgang 7 für weitere Experimente.

7. Zell-Aussaat und Kultur auf den Gradient Nanopattern Platten

Hinweis: Schritt 7 beschreibt die Kultur der hECFCs auf der gradient Nanopattern Platte, aber andere Quellen der Zelle können auch verwendet werden.

  1. Bestreichen Sie die Steigung Nanopattern Platten mit 1 mL 0,1 % Protein Beschichtungslösung mit PBS-Puffer für 10 min bei Raumtemperatur.
    Hinweis: Die 0,1 % Protein-Beschichtung deckt nicht die Nanopillar-Funktionen.
  2. Machen Sie eine hECFCs Suspension aus der Kulturschale, indem eine Zelle teilen Standardmethode mit Trypsin.
  3. Verdünnen Sie die Zellsuspension zur Erreichung der gewünschten Mündung. Samen der hECFCs auf den gradient Nanopattern Platten und flache Kontrolle (z. B. 1,0 × 104 Zellen/cm2).
    Hinweis: Wenn hECFCs auf 1,0 × 104 Zellen/cm2 gradient Nanopattern Platten ausgesät werden, erreicht die Zelle Konfluenz in der Regel zu 70-80 % nach 2 Tagen.
  4. Kulturzellen Sie auf flachen oder Farbverlauf Nanopattern Platten für 2 Tage im Inkubator.

8. Beobachtung und Analyse

  1. Rasterelektronenmikroskop (REM) Bildgebung
    1. HECFCs für Übernachtung auf flachen oder Farbverlauf Nanopattern Platten mit 2,5 % Glutaraldehyd bei 4 ° C kultiviert zu beheben.
    2. 1 % Osmium ausgefällt für 1 h bei Raumtemperatur zu behandeln. Waschen Sie Proben mit PBS.
    3. Proben mit Ethylalkohol von niedrigen zu hohen Konzentration (50 %, 70 %, 80 %, 90 % und 100 %) für 10 min pro jeden Schritt zu entwässern.
    4. Hexamethyldisilazane (HMDS) für 15 min bei Raumtemperatur zu behandeln. Danach waschen Sie Proben mit frischen HMDS und Proben unter dem Abzug mindestens 1 Tag bis die verbleibende HMDS vollständig verdunstet.
    5. Bestreichen Sie die Proben mit Platin Sputter Coater für 5 min und untersuchen Sie die Proben mit einer SEM
  2. Getriebe-Elektronenmikroskop (TEM) Bildgebung
    1. HECFCs für Übernachtung auf flachen oder Farbverlauf Nanopattern Platten mit 2 % Paraformaldehyd und 2,5 % Glutaraldehyd Mischung mit PBS-Puffer bei 4 ° C kultiviert zu beheben.
    2. Führen Sie nach Fixierung mit 1 % Osmium ausgefällt und Proben, die mit der Methode in 8.1.3 zu entwässern.
    3. Proben in Epoxidharz einbetten. 60 nm dicke Schichten aus Blöcken und legen Sie einen Abschnitt auf einem TEM-Raster.
    4. Färben Sie den Abschnitt mit der Mischung aus 10 mg Uranyl Acetat in 100 mL Methanol und 0,1 mg Blei Citrat in 100 mL destilliertem Wasser. Bilder mit einem TEM zu erhalten.
  3. Fluoreszenz-Färbung
    1. Beheben Sie hECFCs kultiviert auf flachen oder Farbverlauf Nanopattern Platten mit 4 % Paraformaldehyd bei Raumtemperatur 15 Minuten.
    2. Permeabilize und Proben mit 5 % Ziege Serum und 0,1 % Octylphenol bei Raumtemperatur für 30 min in PBS (PBST) ethoxylate zu blockieren.
    3. Inkubieren Sie Proben mit Anti-Human vinkulin primären Antikörper (1: 500 in PBST) bei Raumtemperatur 2 h. Spülen Proben dreimal mit PBST.
    4. Inkubieren Sie Proben mit Fluoreszenz-konjugiert Phalloidin (1:1, 000 in PBST), Fluoreszenz-konjugierten Sekundärantikörper (1:1, 000 in PBST) bei Raumtemperatur 2 h. Spülen Proben dreimal mit PBST.
    5. Inkubieren Sie Proben mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI, 1:1,000 in PBST) in 5 min bei Raumtemperatur.
    6. Fallen Sie 10 µL Eindeckmedium auf der Oberfläche der gradient Nanopattern. Das Eindeckmittel einem deckgläschen auflegen.
    7. Legen Sie die Probe auf dem Kopf stehend auf der Probe-Bühne und Abrufen von Bildern mit konfokale Fluoreszenzmikroskop.
  4. Bildanalyse
    1. Übertragen Sie aufgenommenen Bilder von der hECFCs auf eine Bild-Analyse-System.
    2. Wählen Sie die zufällige Phalloidin Färbung Bild. Passen Sie den Schwellenwert und erstellen Sie ein binäres Bild, in dem Zellen vom Hintergrund unterscheiden.
    3. Zeichnen Sie die Konturen um Zellen manuell die Anzahl Filopodien pro Zelle zu Zelle Fläche und Umfang zu messen.
    4. Wählen Sie das zufällige Feld der vinkulin Färbung Bild. Passen Sie den Schwellenwert und erstellen Sie ein binäres Bild fokale Adhäsion Bereiche.
      Hinweis: Stellen Sie Bild Schwelle entsprechend um künstliche über - oder unter - Abfüllungen von fokalen Adhäsion Bereiche zu vermeiden.
    5. Die Anzahl der fokale Adhäsion der einzelnen Zellen.

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Representative Results


Abbildung 1 zeigt die SEM Bilder der vorgefertigten Gradienten AAO Formen je nach Art und Lage. Abbildung 2 zeigt SEM Bilder der gradient Nanopattern Platten mit regelmäßigen runden Nanopillars und Abbildung 3 ist Quantifizierung Daten der Nanopillar Durchmesser. In Tabelle 1 sind die Merkmale von vorgefertigten Nanopillars.

Abbildung 4A zeigt das Schema der Anbau von hECFCs Blut abgeleitet. Abbildung 4 b zeigt Phase Kontrast Bild des Thecultivated hECFCs. Abbildung 4 zeigt, dass hECFC Marker mit CD144 (grün), vWF (rot) und Kern (blau) gefärbt. Abbildung 5A zeigt repräsentative SEM Bilder von hECFCs nach 2 Tagen auf dem flachen, GP 120/200, GP 200/280, Kulturund GP 280/360 Platten. Abbildung 5 b und C zeigen quantitative Daten zur Zelle Fläche und Umfang im Vergleich zu der Wohnung. Die Quantifizierung Daten ergab, dass Zellen gewachsen auf Nanopillar Oberflächen von kleiner Größe reduzierten Zelle Fläche und Umfang zeigte. Abbildung 5 ist die repräsentative SEM Bilder der hECFCs, die die Morphologie der bestehenden Filopodien zu zeigen. Abbildung 5E zeigt die quantitative Daten über Filopodien Zahl im Vergleich zu der Wohnung. Bedeutende Filopodial Auswuchs verzeichneten Zellen kultiviert auf GP 120/200, während keine signifikante Veränderung im Vergleich zu der Wohnung in GP200/280 oder GP280/360 beobachtet wurde. Abbildung 5F zeigt repräsentative TEM Bilder von hECFCs nach 2 Tagen der Kultur auf flachen und gradient Nanopattern Platten.

Figure 1
Abbildung 1: Gradient AAO Schimmel. REM-Bilder des Verlaufs Formen AAO für GP 120/200, 200/280 GP und GP 280/360 Platten entsprechend der Position der Formen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 . Steigung Nanopattern Platten. REM-Bilder von Säule-Typenschilder gradient Nanopattern für GP 120/200, 200/280 GP und GP 280/360 Platten je nach Position der Platten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 . Größe Steigung von Nanopillar Durchmesser. Quantifizierung Daten zeigen den Verlauf der Nanopillar Durchmesser für GP 120/200, 200/280 GP und GP 280/360 Teller, beziehungsweise. Balken stehen für Standardfehler. Diese Zahl wurde von [Acta Biomaterialia] geändert 20. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Elastizitätsmodul (GPa) Nanopillar Durchmesser (nm) Nanopillar Pitch (nm) Abstand von Mitte zu Mitte (nm) Nanopillar Höhe (nm) Nanopillar Steifigkeit (N/m)
Wohnung 2.43±0.19 – – – – –
GP 120/200 1.74±0.11 120 – 200 320 – 240 440 276.9±21.9 9,35
GP 200/280 2.01±0.05 200 – 280 240 – 160 440 268.1±25.9 55.78
GP 280/360 2.1±0.13 280-360 160 / 80 440 293.6±23.6 134.15

Tabelle 1. Eigenschaften von vorgefertigten Nanopillars. Quantifizierten Daten zeigen des Elastizitätsmoduls, Durchmesser, Tonhöhe, Abstand von Mitte zu Mitte, Höhe und Steifigkeit der vorgefertigten Nanopillars. Diese Tabelle wurde von [Acta Biomaterialia] geändert 20.

Figure 4
Abbildung 4 . Charakterisierung der hECFCs. (A) schematische Darstellung zeigt Zeitplan für die hECFCs von Erwachsenen peripherem Blut abgeleitet. (B) Phase Kontrast Bild der hECFC Kolonie, abgeleitet aus dem peripheren Blut Erwachsener am 14. Tag. (C) Immunofluorescent Bilder zeigen CD144 (grün), befleckt vWF (rot) und Zellkern mit DAPI (blau). Diese Zahl wurde von [Acta Biomaterialia] geändert 20. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 . hECFCs auf flachen und gradient Nanopattern Platten für 2 Tage kultiviert. (A) repräsentative REM-Aufnahme des hECFCs auf Flat, GP 120/200, 200/280 GP und GP 280/360 Platten kultiviert. (B und C) Daten der Quantifizierung von Fläche und Umfang des hECFCs (n = 50). * p <.05 im Vergleich zu der Wohnung. (D) repräsentative SEM Bilder von der Vorderkante des hECFCs auf flachen und gradient Nanopattern Platten. (E) Quantifizierung Daten Anzahl der Filopodien pro ein hECFC (n = 20). * p <.05 im Vergleich zu der Wohnung. (F) Vertreter TEM Bild des hECFC kultiviert auf Wohnung und gradient Nanopattern Platten. Weiße Pfeile zeigen die Interaktionspunkte zwischen hECFCs und Substrat-Oberfläche. Diese Zahl wurde von [Acta Biomaterialia] geändert 20. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Ergänzende Abbildung 1: Wasser Kontaktwinkel von unberührten AAO und HDFS behandelt AAO. Kontakt Winkelmessungen hydrophoben Eigenschaften von HDFS zusammengebaut selbst Monolayer (A) vor und (B) nach der Behandlung. Klicken Sie bitte hier, um diese Zahl zu downloaden.

Ergänzende Abbildung 2. SEM Bilder von vorgefertigten gradient Nanopattern Platten mit gleichen AAO Schimmel. Vergleichende REM-Bild setzt sich für die Überprüfung der Haltbarkeit der AAO Schimmel. (A) Gradient Nanopattern Platte mit frisch zubereiteten Form hergestellt. (B) Steigung Nanopattern Platte mit AAO Schimmel nach Prägung 15-mal produziert. Klicken Sie bitte hier, um diese Zahl zu downloaden.

Ergänzende Abbildung 3. Einfluss von Protein-Beschichtung. REM-Bilder von hECFCs, die auf GP 120/200, 200/280 GP oder GP 280/360 gradient Nanopattern gezüchtet wurden Platten (A) ohne oder (B) mit der Protein-Beschichtung. Diese Zahl wurde von [Acta Biomaterialia] geändert 20 Klicken Sie bitte hier, um diese Zahl zu downloaden.

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Discussion

Herstellung von einem AAO oft weist Mängel wie Risse, unregelmäßige Formen von Poren und brennen. Der Hauptgrund für diese Mängel ist eine elektrolytische Zusammenbruch, die stark von der Art der Metall Substrate werden eloxiert und der Widerstandsfähigkeit der Elektrolyt21betroffen ist. Da der Widerstand des Elektrolyten abhängig von seiner Temperatur schwankt, ist die Beseitigung der Hitze kontinuierlich von Elektroden der kritische Punkt, die standortbezogene Temperatur des Elektrolyten als stabil in einem Hochspannungs-Eloxal Zustand. In diesem Protokoll hergestellt wir AAO Formen durch Ändern Masudas zweistufigen Anodisierung22,23. Fast die Hälfte das Elektrolyt durch Methylalkohol ersetzt nicht nur verhindert, dass das Elektrolyt Einfrieren bei niedrigen Temperaturen, sondern auch beraubt die Elektrode der Wärme durch Verdunstung an der Unterseite der Pore24. Der Grund für die Verwendung einer obenliegenden Rührer und Laufrad statt einem Magnetrührer ist auch zur Kontrolle der Temperatur zu gewährleisten. Die typische Magnetrührer hat eine hohe Wahrscheinlichkeit der Leerlauf wegen der versehentlichen Fehlausrichtung der magnetischen Bar bei Dauerbetrieb. Dieses Problem führt die unsachgemäße Verbreitung des Elektrolyten, Erhöhung der Temperatur, und führt zu brennen.

Um eine Größe Steigung an der AAO-Form zu geben, Tauchen wir allmählich AAO in einer Phosphorsäure Ätzen Lösung. Die Poren sind im Verhältnis zu der Zeit bleibt die AAO in der Radierung Lösung erweitert, wie in Abbildung 1dargestellt. Unter dieser Bedingung ist die Poren größer werdende Durchschnittsrate 0,67 nm/min. Manipulation der Untertauchens Geschwindigkeit und Zeit die Neigung der Größe gradient und maximale Porendurchmesser von der AAO verändern wird. Die maximal mögliche Porendurchmesser beträgt 400 nm. Wenn der Porendurchmesser übersteigt 400 nm, die Abstand Wand zwischen Poren wird so dünn, dass es den Druck während der thermischen Prozess Prägung nicht hinnehmen kann.

Ein HDFS selbst-zusammengebauten monomolekularen Film ist bekannt, um die materielle Oberfläche25eine hydrophobe Eigenschaft hinzufügen zu können. Das HDFS Molekül macht eine starke kovalente Bindung mit den Hydroxylgruppen auf der AAO-Oberfläche von Piranha Behandlung26eingeführt. Daher kann als ergänzende Abbildung 1 eine solide selbst-zusammengebauten monomolekularen Film zustande, wenn eine große Anzahl von Hydroxylgruppen auf der Substratoberfläche vorhanden sind. Für optimale Qualität mit einem HDFS selbst-zusammengebauten monomolekularen Film empfehlen wir die Durchführung der Reaktion in einer getrockneten Atmosphäre. HDFS Feuchtigkeit ausgesetzt ist, eine Seite Reaktion mit Wasser bildet Dimere, Trimere und sogar Oligomere Silan-Moleküle, und verringert die Gesamtqualität der selbst-zusammengebauten monomolekularen Film.

Bei Verwendung der AAO-Form mit einer Größe Steigung in thermischen Nanoimprinting, erhielten Zellplatten Kultur mit einer Steigung von Nanopillars Abbildung 2 und Abbildung 3. Die thermische Nanoimprinting Methode hat einen Vorteil, dass es eine große Anzahl von identischen Nanopattern Platten produzieren kann, mithilfe einer AAO-master-Form. Zusätzliche Abbildung2 zeigt, dass es keinen Unterschied in der Qualität der Nanopattern produziert, auch nach fünfzehn Prägung Prozesse, im Vergleich zu den Nanopattern durch die neue AAO Form produziert. Der Grund für die Wahl von Polystyrol als Material für die Übertragung eines Nanopattern ist, dass das Styropor eine entsprechende Glasübergangstemperatur (100 ° C) für thermische Prägung hat, und es weit in kommerziellen Zelle Kultur Gerichte aufgrund verbreitet ist seiner transparent und nicht toxische Eigenschaften.

Herstellung von Nanostrukturen mit hoher Streckung mit thermischen Nanoimprinting Methode ist schwierig. Weil wenn Prozess, wie z. B. Druck und Zeit erhöhen Bedingungen, wird die Form des polymersubstrates, macht es schwer, die Form aus dem Substrat zu trennen tief eingelassen. Daher ist es sehr schwierig, Nanopatterns mit einem Seitenverhältnis von 1:3 oder mehr unserer Nanoimprinting Technik zu produzieren. Doch laut TEM Bilder beobachteten wir Abbildung 5, haben wir eine interessante Tatsache, dass die Membran von Zellen auf Nanopatterns nicht in Kontakt mit der Unterseite der Nanopattern gefunden. Das heißt, wurden alle physikalischen Reize, die eine Reaktion von Zellen zu manipulieren, können aus den oberen Teilen der Nanopattern entstanden. Daher in dieser Studie haben wir nicht das Seitenverhältnis bei der Untersuchung der Reaktionen der Zelle auf die Nanopattern zu berücksichtigen. Wie ergänzende Abbildung 3zeigt, hatte 0,1 % Protein Beschichtungslösung keinen Einfluss auf die Befestigung der hECFCs auf den Nanopillar Flächen. Darüber hinaus verringert diese nanoskaligen Reize von den gradient Nanopattern Platten Zelle Fläche und Umfang von hECFCs und erhöhte Filopodial Auswuchs Abbildung 5.

Zusammenfassend haben wir gradient Nanopattern Platten durch Manipulation eine Reaktion des hECFCs in Vitro. Um genau welche Größe von Nanostrukturen kennen, die die Zellen stark betroffen sind, ist eine zukünftige Arbeit erforderlich, um eine Zelle-spezifische-sortierte Nanopillar design durch die Neigung der Größe gradient und Minimum-Maximum Durchmesser der Nanopillars anpassen. Wir erwarten, dass dieser gradient Nanopattern werden ein faszinierendes Werkzeug, um Bildschirm die Interaktion zwischen Zellen und Nanostrukturen sowie fortschrittliche Zelle Nischen in denen Nanostrukturen frei in der Größe angepasst werden können.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch das grundlegende Wissenschaft Forschungsprogramm durch die National Research Foundation von Korea (NRF) gefördert durch das Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Technologie (MEST) [NRF-2015R1D1A1A01060397] und Bio & medizinische Technologieentwicklung unterstützt. Programm der NRF finanziert durch das Ministerium für Wissenschaft, ICT & Zukunft planen [NRF-2017M3A9C6029563].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Perchloric acid 60% Daejung Chemicals & Metals 6512-4100
Ethyl alcohol, absolute 99.9% Daejung Chemicals & Metals 4118-4100
Phosphoric acid 85% Daejung Chemicals & Metals 6532-4400
Methyl alcohol 99.5% Daejung Chemicals & Metals 5558-4400
Chromium(VI) oxide Daejung Chemicals & Metals 2558-4400
Sulfuric acid 95% Daejung Chemicals & Metals 7781-4100
Hydrogen peroxide 30% Daejung Chemicals & Metals 4104-4400
n-hexane 95% Daejung Chemicals & Metals 4081-4400
Toluene 99.5% Daejung Chemicals & Metals 8541-4400
(heptadecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrodecyl)dimethylchlorosilane Gelest SIH5840.4 Moisture sensitive
Methoxynonafluorobutane 99% Sigma aldrich 464309
Collagen solution Stemcell #4902
Gelatin Sigma aldrich G1890 Protein coating solution
Ficoll-Paque GE Heathcare 17-1440-03 Hydrophilic polysaccharide solution
EGM-2MV Lonza CC-3202 Endothelial cell expansion medium
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
Phosphate buffered saline Gibco 10010031
Fetal bovine serum Gibco 12483-020
Paraformaldehyde Sigma aldrich P6148
Glutaraldehyde Sigma aldrich G5882-100ML
Osmium tetroxide Sigma aldrich 201030-1G
Hexamethyldisilazane Sigma aldrich 440191
Triton X-100 Sigma aldrich X100-100ML Octylphenol ethoxylate 
Goat serum Gibco 26050-088
anti-human vinculin primary antibody  Sigma aldrich V9131
F-actin probe Molecular Probes A12379 Fluorescence-conjugated phalloidin
Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody Molecular Probes A11001 Fluorescence-conjugated secondary antibody 
4',6-diamidino-2-phenylindole  Sigma aldrich D9542
Mounting medium DAKO S3023
Anti-human vWF primary antibody  DAKO A0082
Anti-human CD144 primary antibody  BD Biosciences #555661
Eponate 12™ Embedding Kit, with BDMA Ted Pella 18012 Epoxy resin
Uranyl Acetate, 25g Ted Pella 19481
Lead Citrate, Trihydrate, 10g Ted Pella 19312
Ultra pure aluminum plate Goodfellow 26050-088
Polystyrene sheet Goodfellow ST313120
8.0" silicon wafer Siltron 29-01024-03 Single side polished, 725 µm thick
Vacuum desiccator, 4.4 L Kartell KA.230
Vacuum pump Vacuumer V3.VOP100
Power supply Unicorntech UDP-3003
Magnetic stirrer Daihan scientific SL.SMS03022
Overhead stirrer Daihan scientific HT120DX
Circulator Daihan scientific WCR-P12
Linear moving stage Zaber A-LSQ300A-E01-KT07
Angle bracket, 90 degrees Zaber AB90M Accessory of the linear moving stage
PMP forcep, 145 mm Vitlab 67995 Nonmetallic tweezer
PTFE beaker, 250 mL Cowie CW007.25
Ultrasonic cleaner Branson B2510MTH
PCB cutter Hozan Tool Industrial K-110
Nanoimprint device Nanonex NX-2000
Oxygen plasma generator Femto Science CUTE
Low temperature sterilizer Lowtem Crystal 50
CO2 Incubator Panasonic MCO-18AC
Confoal laser scanning microscope Carl Zeiss LSM700
Scanning electron microscope JEOL JSM6701
Transmission electron microscope Hitachi H-7500

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References

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Biotechnik Ausgabe 137 anodische Aluminiumoxid Nanoimprint Lithographie gradient Nanopattern Platten extrazelluläre Matrix körperliche Stimulation menschliche Kolonie-bildenden Endothelzellen
Herstellung von Gradient Nanopattern durch thermische Nanoimprinting Technik und Screening der Reaktion des menschlichen koloniebildenden Endothelzellen
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