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Methodenartikel

Herstellung von Gradient Nanopattern durch thermische Nanoimprinting Technik und Screening der Reaktion des menschlichen koloniebildenden Endothelzellen

7.5K Aufrufe

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DOI:

10.3791/57661

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1. Juli 2018

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* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Fertigung der gradient Nanopattern Platten über thermische Nanoimprinting und die Methode der screening-Antworten der menschlichen endotheliale Vorläuferzellen in Nanostrukturen. Durch den Einsatz der beschriebenen Technologie ist es möglich, ein Gerüst zu produzieren, die Zelle Verhalten durch physikalische Reize bearbeiten können.

Zusammenfassung

Nanotopography finden sich in unterschiedlichen extrazellulären Matrizen (ECMs) um den Körper und ist bekannt als wichtige regulatorische Maßnahmen auf zelluläre Reaktionen haben. Allerdings ist es schwierig, das Verhältnis zwischen der Größe einer Nanostruktur und die Reaktionen der Zellen aufgrund der mangelnden richtigen Screening-Tools bestimmen. Hier zeigen wir die Entwicklung von reproduzierbaren und kostengünstige gradient Nanopattern Platten für die Manipulation von zellulären Antworten. Mit anodische Aluminiumoxid (AAO) als ein master-Form, gradient Nanopattern Platten mit Nanopillars der zunehmenden Durchmesserbereiche [120-200 nm (GP 120/200), 200-280 nm (GP 200/280) und 280-360 nm (GP 280/360)] wurden durch eine thermische Prägung Technik hergestellt. Diese Gradienten Nanopattern Platten wurden entwickelt, um die verschiedenen Größen des Nanotopography in das ECM zu imitieren und wurden verwendet, um die Reaktionen des menschlichen koloniebildenden Endothelzellen (hECFCs) Bildschirm. In diesem Protokoll beschreiben wir Schritt für Schritt Verfahren der Herstellung von gradient Nanopattern Platten für Zelle engineering, Techniken der hECFCs aus dem menschlichen peripheren Blut zu kultivieren und Kultivierung von hECFCs auf Nanopattern Platten.

Einleitung

Vor kurzem hat die Reaktion der Zellen durch die physische Stimulation der Oberflächentopographie im Bereich der Zelle engineering1,2,3,4angestrahlt wurden. Daher konzentriert sich stärker auf dreidimensionale Nanostrukturen auf der Zelle Oberfläche Anlage5. Es wurde berichtet, dass der Integrin, das die Oberfläche Anerkennung Gerät der Zelle ist, die körperliche Anregung angetrieben durch die Mikro-Nano-Strukturen der ECM durch Mechano-Transduktion6überträgt. Diese mechanische Stimulation regu....

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Protokoll

Diese Studie wurde von der Institutional Review Board Universitätsklinik Korea Anam (IRB Nr. genehmigt ED170495). Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki und ihrer späteren Änderungen durchgeführt.

1. Vorbereitung von Aluminium (Al) Substrat durch Elektropolieren

Vorsicht: Elektropolieren Lösung ist ätzend und giftig. Tragen Sie persönliche Schutzausrüstung einschließlich Nitril-Handschuhe, Schutzbrille und Kittel. Führen Sie diesen Schritt in einer Dampfhaube.

  1. Elektropolieren Lösung durch Mischen Ethyl Alkohol (C2H5OH, 99,9 %) ans....

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Ergebnisse


Abbildung 1 zeigt die SEM Bilder der vorgefertigten Gradienten AAO Formen je nach Art und Lage. Abbildung 2 zeigt SEM Bilder der gradient Nanopattern Platten mit regelmäßigen runden Nanopillars und Abbildung 3 ist Quantifizierung Daten der Nanopillar Durchmesser. In Tabelle 1 sind die Merkmale von vorgefertigten Nanopillars.

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Diskussion

Herstellung von einem AAO oft weist Mängel wie Risse, unregelmäßige Formen von Poren und brennen. Der Hauptgrund für diese Mängel ist eine elektrolytische Zusammenbruch, die stark von der Art der Metall Substrate werden eloxiert und der Widerstandsfähigkeit der Elektrolyt21betroffen ist. Da der Widerstand des Elektrolyten abhängig von seiner Temperatur schwankt, ist die Beseitigung der Hitze kontinuierlich von Elektroden der kritische Punkt, die standortbezogene Temperatur des Elektrolyten als sta.......

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch das grundlegende Wissenschaft Forschungsprogramm durch die National Research Foundation von Korea (NRF) gefördert durch das Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Technologie (MEST) [NRF-2015R1D1A1A01060397] und Bio & medizinische Technologieentwicklung unterstützt. Programm der NRF finanziert durch das Ministerium für Wissenschaft, ICT & Zukunft planen [NRF-2017M3A9C6029563].

....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Perchlorsäure 60%Daejung Chemie & Chemie Metalle6512-4100
Ethylalkohol, absolut 99,9Daejung Chemicals & Metalle4118-4100
Phosphorsäure 85%Daejung Chemie & Schweiz Metalle6532-4400
Methylalkohol 99,5%Daejung Chemikalien & Metalle5558-4400
Chrom(VI)-oxidDaejung Chemicals & Metalle2558-4400
Schwefelsäure 95%Daejung Chemicals & Metalle7781-4100
Wasserstoffperoxid 30%Daejung Chemicals & Germany Metalle4104-4400
n-Hexan 95%Daejung Chemicals & Metalle4081-4400
Toluol 99,5%Daejung Chemicals & Metalle8541-4400
(heptadecafluor-1,1,2,2,-tetrahydrodecyl)dimethylchlorsilanGelestSIH5840.4Feuchtigkeitsempfindliches
Methoxynonafluorbutan 99%Sigma aldrich464309
KollagenlösungStemcell#4902
GelatineSigma aldrichG1890Proteinüberzugslösung
Ficoll-PaqueGE Heathcare17-1440-03Hydrophile Polysaccharidlösung
EGM-2MVLonzaCC-3202Endothelzellexpansionsmedium
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122
Phosphatgepufferte KochsalzlösungGibco10010031
fötales RinderserumGibco12483-020
ParaformaldehydSigma aldrichP6148
GlutaraldehydSigma aldrichG5882-100ML
OsmiumtetroxidSigma aldrich201030-1G
HexamethyldisilazanSigma aldrich440191
Triton X-100Sigma aldrichX100-100MLOctylphenolethoxylat 
ZiegenserumGibco26050-088
Anti-Human-Vinculin-PrimärantikörperSigma aldrichV9131
F-Aktin-SondeMolekulare SondenA12379Fluoreszenz-konjugiertes Phalloidin
Alexa Fluor 488-konjugiertes Anti-Maus  IgG-AntikörperMolekulare SondenA11001Fluoreszenz-konjugierter Sekundärantikörper
4',6-Diamidino-2-phenylindol Sigma aldrichD9542
EindeckmediumDAKOS3023
Anti-humaner vWF-Primärantikörper DAKOA0082
Anti-Mensch  CD144 primärer Antikörper BD Biosciences#555661
Eponat 12&Handel; Einbettungskit, mit BDMATed Pella18012Epoxidharz
Uranylacetat, 25 gTed Pella19481
Bleicitrat, Trihydrat, 10 gTed Pella19312
Ultrareine AluminiumplatteGoodfellow26050-088
PolystyrolplatteGoodfellowST313120
8,0" SiliziumwaferSiltron29-01024-03Einseitig poliert, 725 & Mikro; m dick
Vakuumexsikkator, 4,4 LKartellKA.230
VakuumpumpeVakuumerV3. VOP100
NetzteilUnicorntechUDP-3003
MagnetrührerDaihan scientificSL.
ÜberkopfrührerDaihan scientificHT120DX
ZirkulatorDaihan scientificWCR-P12
Linearer beweglicher TischZaberA-LSQ300A-E01-KT07
Winkel, 90 GradZaberAB90MZubehör des linearen bewegtischen Tisches
PMP Pinzette, 145 mmVitlab67995Nichtmetallische Pinzette
PTFE-Becherglas, 250 mLCowieCW007.25
UltraschallreinigerBransonB2510MTH
PCB-CutterHozan Tool IndustrialK-110
Nanoimprint-GerätNanonexNX-2000
Sauerstoff-PlasmageneratorFemto ScienceCUTE
Niedertemperatur-SterilisatorLowtemCrystal 50
CO2 InkubatorPanasonicMCO-18AC
Confoal Laser-Scanning-MikroskopCarl ZeissLSM700
RasterelektronenmikroskopJEOLJSM6701
TransmissionselektronenmikroskopHitachiH-7500
%SMS03022

Referenzen

  1. Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nature materials. 13 (6), 558-569 (2014).
  2. Qian, W., Gong, L., Cui, X., Zhang, Z., Bajpai, A., Liu, C., Castillo, A., Teo, J. C., Chen, W.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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