Summary
Burada, degrade nanopattern plakaları termal nanoimprinting ile imalat ve insan endotelyal progenitor hücreler yanıt taşınımı için eleme yöntemi için bir iletişim kuralı mevcut. Açıklanan teknolojisini kullanan, hücre davranış fiziksel uyaranlara tarafından işleyebilirsiniz bir iskele üretmek mümkündür.
Abstract
Nanotopography çeşitli hücre dışı matrisler (ECMs) vücut etrafında bulunabilir ve hücresel reaksiyonlar üzerine önemli yasal eylemleri sahip olduğu bilinmektedir. Ancak, bir nanostructure boyutunu ve hücre uygun tarama araçları eksikliği nedeniyle yanıt arasındaki ilişkiyi belirlemek zordur. İşte, tekrarlanabilir ve düşük maliyetli degrade nanopattern plakaları hücresel yanıt manipülasyon gelişimini göstermektedir. Ana kalıp, degrade nanopattern pilakalar ve artan çap aralığı [120-200 nm (GP 120/200), 200-280 nm (GP 200/280) ve 280-360 nm (GP 280/360)] nanopillars olarak anodik alüminyum oksit (AAO) kullanarak basma tekniği bir termal tarafından fabrikasyon. Bu degrade nanopattern plakaları nanotopography ECM içinde çeşitli boyutlarda taklit etmek için tasarlanmıştır ve insan endotel koloni oluşturan hücre (hECFCs) yanıt-e doğru elemek için kullanılmıştır. Bu protokol için mühendislik, hECFCs insan periferik kandan yetiştirilmesi ve hECFCs nanopattern plakaları kültür teknikleri hücre için degrade nanopattern tabak imalatı, adım adım bir yordam açıklanmaktadır.
Introduction
Yanıt hücre yüzey topografyası fiziksel uyarılması tarafından son zamanlarda, hücre mühendislik1,2,3,4alanında kataloglarımızda. Bu nedenle, daha fazla dikkat hücre ek yüzey5üç boyutlu nanoyapıların üzerinde duruldu. Bu hücre yüzey tanıma oyunlarından biri, integrin ECM mikro-nano yapılar ile mekanik iletim6tarafından tahrik fiziksel uyarıcı iletir bildirilmiştir. Bu mekanik stimülasyon hücre davranış ile ilgili rehberlik7 düzenleyen ve odak yapışıklıklar ve sertlik hücre8' in yanı sıra şeklini değiştirmek için hücre iskeleti yeniden yapılanma neden olmaktadır.
İnsan endotelyal progenitor hücreler (hEPCs) vücuttaki yakından çevreleyen ECM9microenvironment ile etkileşim. Bu kesme stres kan akışı10' dan türetilmiş kadar ECM fiziksel durumunu belirli hücre-matris yapışması karmaşık oluşumu için önemli bir parametre olarak davranır gösterir. Bu yüzey nanotopography geniş kılcal tüp ağlar hEPCs11 ' in vitro oluşumunu artırır ve ECM/biyo çözünür faktör sistem kombine hEPCs işlevsel olmayan yüzeylerde tanımasını sağlar ve destekler bildirilmektedir şifa12,13yara. Yine de, ECM ve hEPCs arasındaki ilişkiyi açıkça anlaşılmış değildir.
Hücre yanıtları ve fiziksel ipuçları farklı yüzeylerde14,15,16arasındaki ilişkiyi açıklamak için pek çok araştırmacı çalıştı rağmen bu çalışmalar bir nanostructure yalnızca sabit boyutu kullanılan veya nanopatterns nanostructure ve hücre davranışını boyutu arasındaki ilişkiyi aydınlatmak için bir sınırlama var düzensiz düzenlemeler ile. Buradaki sorun nanostructure en uygun boyutu bulmak için varolan sıkıcı ve yinelemeli yaklaşımlar yerine hücresel yanıt süzmek için uygun araçlar eksikliğidir. Bu nedenle, basit bir teknik tekrarlama olmadan fiziksel elektrodlar hücre reaksiyonlar eleme için gereklidir.
Burada, bizim önceki raporlar17,18,19 içinde hangi görücü usulü nanopillars çapını yavaş yavaş artar bir degrade nanopattern üretmek için kullanılan bir yöntem açıklanmaktadır. Buna ek olarak, ayrıca nasıl yetiştirmek ve hECFCs fiziksel bir çekim gücü etkisi hücreleri belirlemek için degrade nanopattern plakaları davranışını analiz nitelendirdi. Hafif anodization, yavaş yavaş gravür ve anti-yapışma katman kaplama yöntemi degrade AAO kalıp imal etmek kullanılmıştır. Litografi tekniği basma bir termal benimseyerek, aynı polistren degrade nanopatterns bir maliyet-etkin ve facile şekilde üretilmiştir. Degrade nanopatterns kullanarak, hangi boyutunu nanostructure deney bir dizi hücre davranışı üzerinde büyük bir etkiye sahip belirlemek için mümkün olabilir. Biz bu gradyan nanopattern kan kaynaklı hECFC veya diğer hücreler ve taşınımı çeşitli boyutlarda arasındaki etkileşim mekanizmaları anlamada yardımcı olacaktır bekliyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada Kore Üniversitesi Anam Hastanesi (IRB No Kurumsal değerlendirme Komitesi tarafından kabul edildi ED170495). Tüm yordamları Helsinki Bildirisi'ne ve onun daha sonraki değişiklikler uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Elektro-parlatma tarafından alüminyum (Al) yüzey hazırlanması
Uyarı: Elektro-parlatma aşındırıcı ve zehirli bir çözümdür. Nitril eldiven, gözlük ve laboratuvar önlüğü de dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman giymek. Bir duman mahallede bu adımı gerçekleştirin.
- Elektro-parlatma çözüm etil alkol (C2H5OH, % 99.9) karıştırılarak hazırlamak ve perklorik asit (HClO4, %60) bir 1 L çift ceket ölçek (C2H5OH:HClO4 = 4:1).
- Çift ceket kabı bir sirkülatörün bağlanmak ve 7 ° C'de sıcaklığı ayarlamak Çift ceket kabı bir manyetik karıştırıcı koymak. Sıcaklık 7 ° C'ye düşünceye kadar karıştırma için en az 30 dakika altında çözüm bırakın
- Ultrasaf Al plaka bırakın (% 99.999, 20 × 50 × 1 mm3) ve karbon sayacı elektrot timsah klipleri ve bakır tel kullanarak elektro-parlatma çözüm içine. Al plaka ve birbirine yüz için karbon sayacı elektrot konumunu ayarlamak.
Not: Dikkatli bir şekilde küçük resimleri yüklemek için gerekli olan çözüm dokunmak. Ne zaman belgili tanımlık eriyik, temas yabancı maddelerin dışarı kırpmak--dan akan Al plaka kontamine. - Pozitif terminal ve karbon sayacı elektrot eksi terminali için Al plaka bağlanmak, bir doğru akım (DC) güç kaynağı.
- Manyetik karıştırıcı açmak ve bir gerilim koru bu devlet için 4 dk V. 20 uygulayın.
- Manyetik karıştırıcı açmak ve başka bir 6 min için akış için geçerli izin.
Not: Statik koşulu kirleri ve pürüzlülük çoğunu Al plaka kaldırır ve dinamik koşulu elektro-parlatma final kalitesini artırır. - Güç kaynağını ve el ile Al plaka kırpmak--dan ayrı. Titizlikle Al plaka tüm kalan çözümü kaldırmak için deiyonize su ile yıkayın.
- Azot ve depo inert gaz altında Al plakalı kuru. Adım 1 ve 2 tüm deneylerin sonunda bu kurutma işlemi gerçekleştirin.
Not: Basınçlı hava enjekte, diğer tarafa cilalı bölümünden hava akışı olun. Tersi durumda, yabancı maddelerin sigara cilalı bölümünden kaçış ve Al plaka kontamine.
2. ile fosforik asit elektrolit degrade AAO kalıp imalatı
Uyarı: Metil alkol ve onun duman oküler toksik vardır. Krom sürekli maruz ciddi krom zehirlenmesi için yol açabilir. Bir duman mahallede bu adımı gerçekleştirin.
- Birincil anodization
- Fosforik asit elektrolit 1 L hazırlamak için bir cam şişe içine 590 mL deiyonize su yükleyin.
- Metil alkol (CH3OH, % 99) 400 mL ekleyin ve 10 mL Cam şişe içine fosforik asit (H3PO4, % 85). Çözüm de sallayarak el ile veya manyetik karıştırma ile karıştırın.
- Elektrolit 500 mL 1 L çift ceket kabı dökün. Cilalı Al plaka ve karbon sayacı elektrot timsah klipleri ve bakır tel ile çözüm içine bırakın.
- Elektro-parlatma 2-3 mm yukarıda çözüm yüzeyinin sınırını bulmak için ek elektrolit dökün.
Not: Eğer Anodization çözüm dokunmadan elektro-parlatma sınır ile yürütülen, Al plaka anodization sırasında yazmak eğilimindedir. - Dik milli bir U şeklinde Kaide yükleyin. Bir havai karıştırıcı ve metal kelepçeler kullanılarak fan ekleyin. Her iki elektrot daha düşük sonuna yakın fan pervane getirin. Havai karıştırıcı dönme hızı 200 ve 300 rpm arasında ayarlayın.
- Çift ceket kabı bir sirkülatörün bağlanmak ve sıcaklığı-10 ° C'de ayarlamak Sıcaklığı-10 ° C'ye düşünceye kadar karıştırma altında en az 1 h için sistemi terk
Not: Su soğutucu kullanmayın. Düşük sıcaklıklarda su donuyor çünkü kan dolaşımı normal çalışmaz. Bu bir su karışımı ve etil alkol oranı 1:1 soğutucu olarak kullanmak için tavsiye edilir. - 195 V 16 h için karıştırma altında bir gerilim uygulanır.
Not: Geçerli 50'den fazla çıkarsa mA 2 veya 3 gerilim uygulandıktan sonra saat içinde yanan oluşacaktır olasılık çok yüksek. Hemen işlemini durdurmak ve Al plaka yenisiyle değiştirin. Tekrar tekrar bu sorun ortaya çıkarsa, sirkülatörün sıcaklık kontrolü hiçbir anormallik olup olmadığını denetleyin. Hiçbir anormallik, elektrolit değiştirin. - Güç kaynağı durdurmak ve el ile Al plaka kırpmak--dan ayrı. Anodize Al plaka tüm kalan çözümü kaldırmak için deiyonize su ile yıkayın.
- Alümina gravür
- Kromik asit 500 mL deiyonize su 9.0 g krom oksit (CrO3) ve fosforik asit (H3PO4, % 85) 20,3 mL çözülerek çözüm aşındırma hazırlayın.
- Gravür çözüm 1 L çift ceket kabı dökün. Sıcaklık 65 ° C'de ayarla
- Anodize Al plaka gravür çözüm için en az 10 h karıştırma altında bırakın. Üst ölçek kabı alüminyum folyo ile kapatın.
- Kazınmış Al plaka deiyonize su ile birkaç defa durulayın.
- İkincil anodization
- Aynı deneysel koşullar adım 2.1.1-2.1.7 ayarlayın.
- Sistem anot kazınmış Al plakasına yüklemek ve bir gerilim 195 V 6 h için geçerlidir. Daha sonra güç kaynağını ve el ile Al plaka kırpmak--dan ayırmak. Hemen anodize Al plaka deiyonize su ile yıkayın.
Not: Çamaşır zaman gecikmeli AAO gözenek boyutunu istemeden kalan fosforik asit nedeniyle artar.
- Degrade gözenek genişletme
- Gözenek genişleyen çözüm 5.765 g 500 mL deiyonize su fosforik asit çözülerek hazırlayın. Çözüm 1 L çift ceket kabı dökün.
- Çift ceket kabı için sirkülatörün bağlanmak ve sıcaklığı 30 ° C'de ayarlamak Doğrusal hareketli sahne kabı yanındaki dikey olarak yerleştirin. Köşeli ayraç doğrusal sahne hareketli parçası ekleyin.
- Doğrusal sahne hareketli parçası konumuna ayarlayın. Küçük resmi vidalar ve eloksallı Al plaka yükleyin.
- Böylece Al plaka tam çözüm yüzeyi üzerinde gelecek Al plaka konumunu el ile işlemek.
Not: Bu adımda, Al plaka çözüm dokunmamanız gerektiğini. Al plaka çözüm ulaşır ulaşmaz gözenek genişletme işlemi başlar. - Yavaş yavaş bir 35 mm AAO kalıp boyutu 120 degrade oluşturmak için 120 dakika için 4,86 µm/s hızında çözüm içine Al plaka bırakın nm 200 nm (GP 120/200). Bir kronometre Al plaka çözüm yüzeyine dokunduğundan Şu anda başlar.
- GP 200/280 ve GP 280/360 kalıpları yapmak için çözüm için 2 veya 4 h, sırasıyla genişletme gözenek GP 120/200 kalıp tüm alan bırakın.
- Degrade Al plaka deiyonize su ile birkaç defa durulayın.
3. kendi kendine monte Monolayer degrade AAO küf Anti-yapışma katmanda birikimi
Not: 3.2.1 3.3.3 torpido gözünde adımları. Bir vakum pompası ve kuru azot gazı enjektör eldiven kutusuna bağlanın. Tüm örnekler, reaktifler ve çizgisel nem alma işlemi öncesinde eldiven kutusuna yerleştirin. Tahliye ve azot gaz enjeksiyon döngüsü üç defadan fazla yeterli nem eldiven kutusundan kaldırmak için yineleyin. Kuru azot izin akış deneyi ile edildi.
- Hidroksil AAO kalıp Piranha tedavi ile modifikasyonu
- 140 mL sülfürik asit dökmek (H2SO4, %95) bir politetrafloroetilin (PTFE) ölçek. Hidrojen peroksit dropwise 60 mL (H2O2, % 30) ekleyin. Çözüm soğuduktan kadar 30 dk için bırakın.
Uyarı: Piranha çözüm konusunda son derece dikkatli olun. Hidrojen peroksit ekleme andan itibaren çözüm şiddetle kaynar ve yüksek sıcaklık üretir. Deneme bir duman mahallede gerçekleştirin. - AAO kalıp 30 için çözüm içinde kaybolmanızı s ametal bir cımbız kullanarak.
- AAO kalıp deiyonize su ile birkaç defa durulayın. Kalıp içinde 30 dk için deiyonize suyla ıslatın ve metil alkol başka bir 30 dk için koydum.
Uyarı: Kullanılan Piranha çözüm atma zaman musluk suyu bol miktarda çözüm oranında seyreltin. - AAO kalıp 3 h için vakum altında kurumasını.
- 140 mL sülfürik asit dökmek (H2SO4, %95) bir politetrafloroetilin (PTFE) ölçek. Hidrojen peroksit dropwise 60 mL (H2O2, % 30) ekleyin. Çözüm soğuduktan kadar 30 dk için bırakın.
- 20 × HDFS hisse senedi çözüm hazırlanması
Not: HDFS (heptadecafluoro-1,1,2,2, - tetrahydrodecyl) bir kısaltma olduğunu dimethylchloro-silane- -Üçte bir 1 L n-hekzan şişe moleküler elekler ile doldurun. Parafin film şişeyle mühür ve 24 saat için kuru azot altında saklayın.
- 200 mL n-hekzan cam şırınga ve 0.2 µm PTFE şırınga filtre kullanarak filtre.
- Filtre uygulanmış n-hekzan 80 mL 100 mL Cam şişe içine dökün. HDFS 2 mL ekleyin.
- Kendi kendine monte monolayer ifade
- Filtre uygulanmış n-hekzan bir 100 mL ölçek 57 mL yükleyin. AAO kalıp çözücü bırakın.
- HDFS hisse senedi çözüm 3 mL n-2,9 mM HDFS çözüm yapmak hekzan için ekleyin. Devam etmek reaksiyon için 10 dakika bekleyin.
- AAO kalıp taze n-hekzan aktarın. Kapatın ve tüm reaktif şişe mühür. Azot Vanayı kapat sonra torpido örnekleri dışarı çekin.
Not: HDFS nem için son derece duyarlıdır. HDFS bir desiccator içeren tüm reaktifler saklayın. - AAO kalıp 60 mL methoxynonafluorobutane (C10H6F18O2, % 99) emmek. Ultrasonik AAO kalıp bir ölçek 10 temiz s fiziksel olarak kaldırmak için bir kez başına adsorbe HDFS molekülleri. Temizlik yordamı 10 kez yineleyin.
Not: Aralıkları olmadan uzun bir süre için ultrasonik AAO kalıp açığa oksit tabaka zarar verir. - AAO kalıp 24 h için vakum altında kurumasını.
Not: Bir başarıyla yatırılan Anti-yapışma süper su geçirmez ve ay için istikrarlı bir desiccator içinde depolanan katmanıdır. Protokol burada duraklatılmış.
4. degrade Nanopattern plakaları termal sürecinden tarafından imalatı
Not: 4.2-4.7 bir temiz oda adımları.
- 1,1 mm kalınlığında polistren sac 3.7 mm uzunluğunda bir baskılı devre kartı (PCB) kesici kullanarak 2,9 mm geniş bir boyutuna kesme.
- AAO kalıp 35 mm bir nipper kullanarak alt kesti. Üretim arkasında tarih ve örnek adı mark.
- Bir 8.0" gofret etil alkol küçük bir doz ile temizleyin. Polistren levhalar üzerinde gofret yapıp, işleri AAO kalıp bağlama.
- Alt film termal imprinter çekmeceye koy. En iyi film için conta iliştirin.
- Gofret alt film koymak. Conta gofret yerleştirin. Gofret üzerinde toz yok olduğundan emin olun.
- Termal imprinter çekmeceyi kapat. 165 ° C ısı ve 620.52 kPa basınç 100 için geçerli s.
- Oda sıcaklığında örneğe ne yapıyorsun? Yavaşça AAO kalıp serbest bırakmak için Polistren levha twist.
5. sterilizasyon ve degrade Nanopattern plakaları hidrofilik değiştirilmesi
- Nanopattern plaka üzerinde bir kare tabak yerleştirin. 100 mL % 70 Etil alkol dökün ve 30 dk için ultraviyole ışık için maruz.
- Azot ile nanopattern tabak kuru. Nanopattern plakaları bir oksijen plazma jeneratörü aktarın.
- 1.33 ulaşıncaya kadar tahliye odası baba. O zaman, 30 cm3oranında oksijen enjekte/dk. 60 W. koru oksijen plazma 90 için bir radyo frekansı güç uygulamak s.
Not: Bu plazma tedavi nanopattern plakaları 14 gün içinde kullanmak için tavsiye edilir. - Nanopattern plaka Toluen bir damla kullanarak bir hücre kültür çanak alt kısmına takın.
- Bir kese örneklerinde mühür ve düşük sıcaklık plazma ısıtıcı ile sterilize.
6. hECFCs tarımı
Not: Aksi belirtilmediği sürece 4 ° C'de tüm centrifuging prosedürlerini yürütecektir.
- Periferik kan yalıtma önce mononükleer hücreler (PBMCs), bir 12-şey kültür kolajen kaplı yemek için 1 h 37 ° C'de kuluçkaya.
- 1 × steril fosfat tamponlu tuz (PBS) kullanarak 12-şey kültür bulaşık yıka.
- 50 mL heparin inhibitörü tüp kullanarak insan kanı toplamak.
- 6 mL hidrofilik polisakkarit çözeltisi 15 mL tüp içinde koymak ve 8 mL kan hidrofilik polisakkarit ekleyin.
Not: Yavaş yavaş kan hidrofilik polisakkarit çözümde pipette. - Tüp vasıl 1020 x g hücreleri cips 20 dk santrifüj kapasitesi.
- Opak hücre katmanı hasat ve yeni bir 15 mL tüp aktarın.
- % 10 fetal Sığır serum (FBS) Ekle-PBS kapsanan ve tüp vasıl 1020 x g hücreleri cips 10 dk santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant kaldırın ve kırmızı kan hücre lizis arabellek ekleyin. 5 min için buz üzerinde tutun.
- % 10 PBS FBS yer alan ekleyin ve tüp vasıl 1020 x g hücreleri cips 5 dakika santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant kaldırın ve % 10 PBS FBS yer alan ekleyin. Santrifüj tüpü 1020 x g hücreleri cips 5 min için de kapasitesi.
- Süpernatant kaldırın ve 1 mL % 10 ile desteklenmiş endotel hücre genişletme orta ekleyin FBS. Her kolajen kaplı yemek için iyi başına tohum 8.0 × 106 hücre.
- Kültür orta 1 hafta boyunca her gün değiştirin. O zaman, kültür orta 2 günde değiştirin.
Not: hECFCs kültür 10-14 gün sonra bulundu. hECFCs tipik Arnavut kaldırımlı benzeri morfoloji göstermek ve faz kontrast mikroskobu içinde gözlenen bir koloni oluşturur. Von Willebrand faktör (vWF) ve vasküler endotel cadherin (CD144) ayirt boyama da daha fazla hücre genişletme sonra hECFCs karakterizasyonu için gerçekleştirilebilir. - HECFCs yetiştirmek için endotel hücre genişletme orta %5 FBS ve penisilin/streptavidin oksijen bir atmosferde % 5 CO2içeren 37 ° C'de ile takıma kullanın. Orta günde bir kez değiştirin.
- HECFC indüksiyon sonra geçiş 7 daha fazla deneyler için hücreleri büyümeye.
7. hücre tohum ve degrade Nanopattern tabaklarda kültür
Not: Adım 7 hECFCs kültür degrade nanopattern plaka üzerinde açıklar, ancak diğer hücre kaynakları da kullanılabilir.
- 1 mL %0.1 protein kaplama çözeltisi PBS içinde oda sıcaklığında 10 dakika ile kat degrade nanopattern tabaklar.
Not: % 0.1 protein kaplama nanopillar özelliklerinin içermez. - HECFCs süspansiyon tripsin kullanarak standart bir hücreyi bölme yol tarafından kültür yemek yapmak.
- İstenen izdiham ulaşmak için hücre süspansiyon sulandırmak. Degrade nanopattern plakaları ve düz kontrol (örneğin, 1,0 × 104 hücreleri/cm2) üzerine hECFCs tohum.
Not: HECFCs 1,0 × 104 hücreleri/cm2 degrade nanopattern plakaları seribaşı zaman, hücre confluency genellikle 2 gün sonra % 70-80 ulaşır. - Hücreleri düz veya degrade nanopattern plakaları kuluçka 2 gün için kültür.
8. gözlem ve analiz
- Taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntüleme
- Düz veya degrade nanopattern plakaları ile 4 ° C'de % 2.5 oxazolidin gece için kültürlü hECFCs saptamak.
- % 1 osmiyum tetroxide 1 h için oda sıcaklığında tedavi. Örnekleri PBS ile yıkayın.
- Etil alkol düşük yüksek konsantrasyon (% 50, % 70, %80, % 90 ve % 100) her adım başı 10 dk örnekleriyle kurutmak.
- Hexamethyldisilazane (HMDS) 15 dakika oda sıcaklığında tedavi. Bundan sonra örnekleri ile taze HMDS yıkama ve örnekleri duman başlık altında kalan HMDS tamamen buharlaşır kadar en az 1 gün bırakın.
- Platin sputter coater 5 min için örnekleriyle kat ve bir SEM ile incelemek
- Transmisyon Elektron mikroskobu (TEM) görüntüleme
- Gece için 4 ° C'de %2 paraformaldehyde ve % 2.5 oxazolidin karışımı içinde PBS ile düz veya degrade nanopattern tabaklarda kültürlü hECFCs saptamak.
- Sonrası fiksasyon gerçekleştirmek % 1 osmiyum tetroxide kullanarak ve istimal belgili tanımlık yöntem içinde 8.1.3 örnekleri kurutmak.
- Epoksi reçine örnekleri katıştır. Blok 60 nm kalın bölümleri yapmak ve bir bölüm bir TEM ızgara üzerinde yer.
- Bölüm 10 mg uranyl asetat 100 mL metil alkol ve 0.1 mg kurşun sitrat 100 mL distile su karışımı ile leke. Bir TEM ile görüntü elde.
- Floresans boyama
- Düz veya degrade nanopattern plakaları ile 15 dakika oda sıcaklığında %4 paraformaldehyde kültürlü hECFCs saptamak.
- Permeabilize ve örnekleri %5 keçi serum ve % 0.1 octylphenol PBS (PBST) ethoxylate, oda sıcaklığında 30 dakika ile blok.
- Örnekleri ile Anti-insan vinculin birincil antikor (PBST 1:500), oda sıcaklığında 2 h. durulama örnekleri üç kez ile PBST için kuluçkaya.
- Floresans Birleşik örnekleri ile floresan Birleşik phalloidin (1:1, 000 PBST), ikincil antikor (PBST 1:1, 000), oda sıcaklığında 2 h. durulama örnekleri üç kez ile PBST için kuluçkaya.
- Örnekleri ile 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, PBST 1:1,000), oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
- 10 µL montaj orta gradyan nanopattern yüzey üzerinde bırak. Bir coverslip montaj medyada yer.
- Örnek baş aşağı örnek sahnesinde yerini ve confocal floresan mikroskop kullanarak görüntüleri.
- Görüntü Analizi
- HECFCs çekilen bir görüntü analiz sistemi aktarın.
- Resim boyama phalloidin rasgele alanı seçin. Eşik ayarlayın ve hücrelerin arka plandan farklı olan bir ikili görüntü oluşturun.
- Hücre alan ve çevre ölçmek ve el ile filopodia hücre başına saymak için hücrelerin etrafındaki hatlarını çizin.
- Resim boyama vinculin rasgele alanı seçin. Eşik ayarlayın ve odak yapışma alanlarda ikili bir görüntüsünü oluşturabilirsiniz.
Not: Görüntü eşik yapay bitti - veya altında - filling odak yapışma alanları önlemek için uygun şekilde ayarlayın. - Her hücrenin odak yapışma saymak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 SEM görüntüleri uydurma degrade AAO kalıp türüne ve konumuna göre gösterir. Şekil 2 SEM görüntüleri degrade nanopattern plakaları ile normal yuvarlak nanopillars gösterir ve Şekil 3 nanopillar çapının miktar verilerdir. Tablo 1 fabrikasyon nanopillars özellikleri listeler.
Şekil 4A kan kaynaklı hECFCs ekimi düzeni gösterir. Şekil 4B gösterir thecultivated hECFCs faz kontrast görüntü. Şekil 4 c hECFC işaretleri lekeli CD144 (yeşil), vWF (kırmızı) ve çekirdek (mavi) gösterir. Şekil 5A kültür düz, GP 120/200, GP 200/280 ve GP 280/360 tabak 2 gün sonra hECFCs temsilcisi SEM görüntüleri gösterir. Şekil 5B ve C hücre alan ve çevre ile karşılaştırıldığında düz nicel veriler tasvir. Miktar veri hücreleri daha küçük boyutu nanopillar yüzeylerde yetiştirilen azaltılmış hücre alan ve çevre gösterdiğini ortaya koydu. Şekil 5 d varolan filopodia morfoloji gösteren hECFCs temsilcisi SEM görüntüleri olduğunu. Şekil 5E filopodia numarası ile karşılaştırıldığında düz nicel veriler gösteriyor. Önemli filopodial yapılan önemli bir değişiklik GP200/280 veya GP280/360 ile karşılaştırıldığında düz gözlendi iken 120/200 GP kültürlü hücrelerdeki gözlendi. Şekil 5F kültür düz ve degrade nanopattern plakaları 2 gün sonra hECFCs temsilcisi TEM görüntüleri gösterir.
Şekil 1. Degrade AAO kalıp. SEM görüntüleri geçişin AAO kalıpları konumuna göre GP 120/200, GP 200/280 ve GP 280/360 plakaları için kalıplar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . Gradyan nanopattern plakaları. Sütun türü degrade nanopattern plakaların SEM görüntüleri göre pozisyon plakaların GP 120/200, GP 200/280 ve GP 280/360 plakaları için. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . Nanopillar çapı boyutu degrade. Nanopillar çapları degrade GP 120/200, GP 200/280 ve GP 280/360 plakaları için sırasıyla gösteren miktar veri. Çubuklar standart hata gösterir. Bu rakam [Acta Biomaterialia] güncellenmiştir 20. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Young katsayısı (GPa) | Nanopillar çapı (nm) | Nanopillar Pitch (nm) | Merkezi-merkezi mesafe (nm) | Nanopillar yüksekliği (nm) | Nanopillar sertlik (N/m) | |
| Düz | 2.43±0.19 | - | - | - | - | - |
| GP 120/200 | 1.74±0.11 | 120-200 | 320-240 | 440 | 276.9±21.9 | 9.35 |
| GP 200/280 | 2.01±0.05 | 200-280 | 240-160 | 440 | 268.1±25.9 | 55.78 |
| GP 280/360 | 2.1±0.13 | 280-360 | 160-80 | 440 | 293.6±23.6 | 134.15 |
Tablo 1. Özellikleri uydurma nanopillars. Young katsayısı, çapı, pitch, merkezi-merkezi mesafe, yükseklik ve uydurma nanopillars sertliği gösteren quantified veri. Bu tablo [Acta Biomaterialia] güncellenmiştir 20.
Şekil 4 . HECFCs karakterizasyonu. (A) hECFCs Şematik diyagramı gösteren program elde edilen yetişkin periferik kandan. (B) faz kontrast görüntü hECFC koloninin gün 14 yetişkin periferik kandan elde. (C) CD144 (yeşil) gösterilen immünfloresan görüntüleri vWF (kırmızı) ve hücre çekirdeği DAPI (mavi) ile lekeli. Bu rakam [Acta Biomaterialia] güncellenmiştir 20. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 . hECFCs düz ve degrade nanopattern tabaklarda 2 gündür kültürlü. (A) düz, GP 120/200, GP 200/280 ve GP 280/360 tabaklarda kültürlü hECFCs temsilcisi SEM görüntüsü. (B ve C) Miktar veri alan ve çevre hECFCs (n = 50). * p <.05 düz ile karşılaştırıldığında. (D) hECFCs düz ve degrade nanopattern plakaları öncü temsilcisi SEM görüntüleri. (E) miktar veri filopodia bir hECFC başına sayısı (n = 20). * p <.05 düz ile karşılaştırıldığında. (F) hECFC temsilcisi TEM görüntüsü degrade nanopattern ve düz tabak kültürlü. Beyaz ok hECFCs ve substrat yüzey arasındaki etkileşim gösteriyor. Bu rakam [Acta Biomaterialia] güncellenmiştir 20. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Takıma giren Şekil 1. Su temas açısı bozulmamış AAO ve HDFS tedavi AAO. HDFS hidrofobik özellikleri gösteren kişi açı ölçümleri önce monolayer (A) ve (B) tedaviden sonra kendini toplandı. Bu rakam indirmek için buraya tıklayınız.
Ek Şekil 2. SEM görüntüleri aynı AAO kalıp ile fabrikasyon degrade nanopattern plakaların. Karşılaştırmalı SEM görüntü AAO kalıp dayanıklılığını doğrulamak için ayarlar. (A) degrade nanopattern plaka ile taze yapılmış kalıp üretti. (B) degrade nanopattern plaka 15 kez basma sonra AAO kalıp ile üretilen. Bu rakam indirmek için buraya tıklayınız.
Ek şekil 3. Protein kaplama etkisi. GP 120/200, GP 200/280 veya GP 280/360 degrade nanopattern kültürlü hECFCs SEM görüntüleri tabaklar olmadan (A) veya (B) protein kaplama ile. Bu rakam [Acta Biomaterialia] güncellenmiştir 20 Bu rakam indirmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sık sık bir AAO imalatı kusurları çatlaklar, gözenekleri ve yazma düzensiz şekiller gibi muzdarip. Ana nedeni bu kusurları için güçlü Eloksal metal yüzeylerde yapısı ve elektrolit21direnci etkilenir elektrolitik bir arıza denir. Bağlı olarak sıcaklık elektrolit direnci değişir bu yana ısı sürekli elektrotlar ortadan kaldırmak olarak böyle bir yüksek gerilim Eloksal durum ahırda elektrolit gerektirebileceği sıcaklığı korumak için kritik nokta olduğunu. Bu iletişim kuralı, AAO kalıpları Masuda'nın iki adım anodization22,23değiştirerek biz imal edilmiştir. Neredeyse yarım elektrolit metil alkol ile yerine sadece elektrolit düşük sıcaklıklarda buz gibi engeller, ancak aynı zamanda tarafından gözenek24dibinde buharlaşma ısı elektrot bıraktığı. Bir havai karıştırıcı ve fan yerine manyetik karıştırıcı kullanılmasının nedeni de sıcaklık kontrolü sağlamaktır. Tipik manyetik karıştırıcı manyetik çubuğunun yanlışlıkla hatalı hizalaması sayesinde uzun vadeli işlem sırasında rölanti yüksek bir olasılık var. Bu sorun sıcaklık yetiştirme ve yanma için önde gelen elektrolit uygunsuz dolaşım neden olmaktadır.
Boyutu degrade AAO kalıp vermek için yavaş yavaş bir fosforik asit çözüm aşındırma AAO dalmış. Gözenekleri AAO gravür çözüm kalır zaman orantılı olarak Şekil 1' de gösterildiği gibi genişletilmiş. Bu durum altında ortalama gözenek geni_letici 0.67 nm/dak immersing hız ve zaman manipüle AAO boyutu degrade ve maksimum gözenek çapı eğimi değişecek oranıdır. Maksimum mümkün gözenek çapı 400 olduğunu nm. Ne zaman gözenek çapı aşıyor 400 nm, gözenekleri arasındaki aralığı duvar termal basma işlemi sırasında basınç tahammül edemez ince olur.
Bir HDFS otomatik olarak birleştirilmiş monolayer için malzeme yüzey25hidrofobik özellik eklemek mümkün olduğu bilinmektedir. HDFS molekülün hidroksil grupları ile güçlü bir kovalent bağ Piranha tedavi26tarafından tanıtılan AAO yüzeyinde yapar. Çok sayıda hidroksil grupları substrat yüzeyinde mevcut olduğunda bu nedenle, ek Şekil 1 ' de gösterildiği gibi katı bir kendi kendine monte monolayer oluşturulabilir. Bir HDFS otomatik olarak birleştirilmiş monolayer ile en iyi kalite için biz tepki dehumidified bir ortamda yürütmek öneririz. HDFS neme maruz kaldığında, su ile bir yan reaksiyon Dimer, trimers ve hatta reaksiyonlar silane molekülleri oluşturur ve kendi kendine monte monolayer genel kalitesini düşürür.
Termal nanoimprinting boyutu Gradyanda AAO kalıp kullanarak üzerine, hücre kültürü plakaları nanopillars bir gradyan ile Şekil 2 ve Şekil 3elde edilmiştir. O-ebilmek üretmek aynı nanopattern tabak büyük miktarda bir AAO Ana kalıp kullanarak termal nanoimprinting yöntemi bir avantaja sahiptir. Ek resim 2 yeni AAO kalıp tarafından üretilen nanopattern göre bile on beş basma işlemleri sonra üretilen nanopattern kalitesini fark gösterir. Polistiren bir nanopattern aktarmak için bir malzeme olarak seçtiğiniz için nedeni olduğunu polistiren uygun cam geçiş sıcaklığı (100 ° C) için termal sürecinden vardır ve yaygın ticari hücre kültür yemekleri owing için kullanılan onun şeffaf ve toksik olmayan özellikleri.
Termal nanoimprinting yöntemini kullanarak yüksek en boy oranıyla nanoyapıların imalatı zordur. Ne zaman işlem koşulları zaman ve basınç artışı gibi çünkü kalıp derinden yapım o sert kalıp--dan belgili tanımlık substrate ayırmak polimer substrat içine gömülü olur. Bu nedenle, en-boy oranı 1:3 veya daha fazla bizim nanoimprinting tekniği kullanarak sahip nanopatterns üretmek için çok zordur. Ancak, TEM görüntüleri göre biz Şekil 5Cgözlenen, membran nanopatterns sayfasında bulunan bir hücreler nanopattern alt temas değildi ilginç bir gerçeği bulduk. Başka bir deyişle, bir yanıt hücre işleyebilirsiniz tüm fiziksel uyaranlara nanopattern en iyi bölgelerinden gelen kökenli. Bu nedenle, bu çalışmada, biz hücrenin yanıt-e doğru nanopattern eğitim en boy oranını dikkate almak yoktu. Ek Şekil 3' te gösterildiği gibi % 0,1 protein kaplama çözüm nanopillar yüzeylerde hECFCs eki üzerinde herhangi bir etkisi vardı. Ayrıca, bu benzeşim uyaranlara degrade nanopattern plakalar üzerinden hücre alan ve çevre hECFCs ve artan filopodial akıbet Şekil 5azalmıştır.
Özetle, biz hECFCs vitroyanıt işleyerek degrade nanopattern plakaları kurdu. Hücreleri büyük ölçüde etkilenen nanoyapıların tam olarak ne boyutunu bilmek, gelecekteki iş hücre özel boyutlu nanopillar nanopillars boyutu degrade ve minimum-maksimum çapının eğimi ayarlayarak tasarlamak için gereklidir. Biz hücreleri ve taşınımı arasındaki etkileşimi ekran gibi gelişmiş hücre nişler içinde nanoyapıların serbestçe boyutu ayarlanabilir sağlamak için büyüleyici bir aracı olarak gradyan bu nanopattern bekliyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser temel bilim araştırma programı aracılığıyla Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (Milli Eğitim Bakanlığı, bilim ve teknoloji (MEST) [NATO Mukabele Gücü-2015R1D1A1A01060397] ve biyolojik ve tıbbi teknoloji geliştirme tarafından finanse edilen NMG) tarafından desteklenmiştir NMG Bilim Bakanlığı, ICT ve gelecek planlama [NATO Mukabele Gücü-2017M3A9C6029563] tarafından finanse edilen program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perchloric acid 60% | Daejung Chemicals & Metals | 6512-4100 | |
| Ethyl alcohol, absolute 99.9% | Daejung Chemicals & Metals | 4118-4100 | |
| Phosphoric acid 85% | Daejung Chemicals & Metals | 6532-4400 | |
| Methyl alcohol 99.5% | Daejung Chemicals & Metals | 5558-4400 | |
| Chromium(VI) oxide | Daejung Chemicals & Metals | 2558-4400 | |
| Sulfuric acid 95% | Daejung Chemicals & Metals | 7781-4100 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Daejung Chemicals & Metals | 4104-4400 | |
| n-hexane 95% | Daejung Chemicals & Metals | 4081-4400 | |
| Toluene 99.5% | Daejung Chemicals & Metals | 8541-4400 | |
| (heptadecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrodecyl)dimethylchlorosilane | Gelest | SIH5840.4 | Moisture sensitive |
| Methoxynonafluorobutane 99% | Sigma aldrich | 464309 | |
| Collagen solution | Stemcell | #4902 | |
| Gelatin | Sigma aldrich | G1890 | Protein coating solution |
| Ficoll-Paque | GE Heathcare | 17-1440-03 | Hydrophilic polysaccharide solution |
| EGM-2MV | Lonza | CC-3202 | Endothelial cell expansion medium |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010031 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Paraformaldehyde | Sigma aldrich | P6148 | |
| Glutaraldehyde | Sigma aldrich | G5882-100ML | |
| Osmium tetroxide | Sigma aldrich | 201030-1G | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma aldrich | 440191 | |
| Triton X-100 | Sigma aldrich | X100-100ML | Octylphenol ethoxylate |
| Goat serum | Gibco | 26050-088 | |
| anti-human vinculin primary antibody | Sigma aldrich | V9131 | |
| F-actin probe | Molecular Probes | A12379 | Fluorescence-conjugated phalloidin |
| Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes | A11001 | Fluorescence-conjugated secondary antibody |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | Sigma aldrich | D9542 | |
| Mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Anti-human vWF primary antibody | DAKO | A0082 | |
| Anti-human CD144 primary antibody | BD Biosciences | #555661 | |
| Eponate 12™ Embedding Kit, with BDMA | Ted Pella | 18012 | Epoxy resin |
| Uranyl Acetate, 25g | Ted Pella | 19481 | |
| Lead Citrate, Trihydrate, 10g | Ted Pella | 19312 | |
| Ultra pure aluminum plate | Goodfellow | 26050-088 | |
| Polystyrene sheet | Goodfellow | ST313120 | |
| 8.0" silicon wafer | Siltron | 29-01024-03 | Single side polished, 725 µm thick |
| Vacuum desiccator, 4.4 L | Kartell | KA.230 | |
| Vacuum pump | Vacuumer | V3.VOP100 | |
| Power supply | Unicorntech | UDP-3003 | |
| Magnetic stirrer | Daihan scientific | SL.SMS03022 | |
| Overhead stirrer | Daihan scientific | HT120DX | |
| Circulator | Daihan scientific | WCR-P12 | |
| Linear moving stage | Zaber | A-LSQ300A-E01-KT07 | |
| Angle bracket, 90 degrees | Zaber | AB90M | Accessory of the linear moving stage |
| PMP forcep, 145 mm | Vitlab | 67995 | Nonmetallic tweezer |
| PTFE beaker, 250 mL | Cowie | CW007.25 | |
| Ultrasonic cleaner | Branson | B2510MTH | |
| PCB cutter | Hozan Tool Industrial | K-110 | |
| Nanoimprint device | Nanonex | NX-2000 | |
| Oxygen plasma generator | Femto Science | CUTE | |
| Low temperature sterilizer | Lowtem | Crystal 50 | |
| CO2 Incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Confoal laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Scanning electron microscope | JEOL | JSM6701 | |
| Transmission electron microscope | Hitachi | H-7500 |
References
- Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nature materials. 13 (6), 558-569 (2014).
- Qian, W., Gong, L., Cui, X., Zhang, Z., Bajpai, A., Liu, C., Castillo, A., Teo, J. C., Chen, W. Nanotopographic Regulation of Human Mesenchymal Stem Cell Osteogenesis. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (48), 41794-41806 (2017).
- Naganuma, T. The relationship between cell adhesion force activation on nano/micro-topographical surfaces and temporal dependence of cell morphology. Nanoscale. 9 (35), 13171-13186 (2017).
- Han, J., Lin, K. H., Chew, L. Y. Study on the regulation of focal adesions and cortical actin by matrix nanotopography in 3D environment. Journal of Physics: Condensed Matter. 29 (45), 455101 (2017).
- Liu, X., Wang, S. Three-dimensional nano-biointerface as a new platform for guiding cell fate. Chemical Society Reviews. 43 (8), 2385-2401 (2014).
- Turner, L. A., Dalby, M. J. Nanotopography-potential relevance in the stem cell niche. Biomaterials science. 2 (11), 1574-1594 (2014).
- Driscoll, M. K., Sun, X., Guven, C., Fourkas, J. T., Losert, W. Cellular contact guidance through dynamic sensing of nanotopography. ACS nano. 8 (4), 3546-3555 (2014).
- Yim, E. K., Darling, E. M., Kulangara, K., Guilak, F., Leong, K. W. Nanotopography-induced changes in focal adhesions, cytoskeletal organization, and mechanical properties of human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 31 (6), 1299-1306 (2010).
- Davis, G. E., Senger, D. R. Endothelial extracellular matrix. Circulation research. 97 (11), 1093-1107 (2005).
- Nakayama, K. H., Surya, V. N., Gole, M., Walker, T. W., Yang, W., Lai, E. S., Ostrowski, M. A., Fuller, G. G., Dunn, A. R., Huang, N. F. Nanoscale patterning of extracellular matrix alters endothelial function under shear stress. Nano letters. 16 (1), 410-419 (2015).
- Bettinger, C. J., Zhang, Z., Gerecht, S., Borenstein, J. T., Langer, R. Enhancement of in vitro capillary tube formation by substrate nanotopography. Advanced materials. 20 (1), 99-103 (2008).
- Katz, B. Z., Zamir, E., Bershadsky, A., Kam, Z., Yamada, K. M., Geiger, B. Physical state of the extracellular matrix regulates the structure and molecular composition of cell-matrix adhesions. Molecular biology of the cell. 11 (3), 1047-1060 (2000).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J.
- Tajima, S., Chu, J., Li, S., Komvopoulos, K. Differential regulation of endothelial cell adhesion, spreading, and cytoskeleton on low-density polyethylene by nanotopography and surface chemistry modification induced by argon plasma treatment. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 84 (3), 828-836 (2008).
- Mohiuddin, M., Pan, H. A., Hung, Y. C., Huang, G. S. Control of growth and inflammatory response of macrophages and foam cells with nanotopography. Nanoscale research letters. 7 (1), 394 (2012).
- Kyle, D. J., Oikonomou, A., Hill, E., Bayat, A. Development and functional evaluation of biomimetic silicone surfaces with hierarchical micro/nano-topographical features demonstrates favourable in vitro foreign body response of breast-derived fibroblasts. Biomaterials. 52, 88-102 (2015).
- Seo, H. R., Joo, H. J., Kim, D. H., Cui, L. H., Choi, S. C., Kim, J. H., Cho, S. W., Lee, K. B., Lim, D. S. Nanopillar Surface Topology Promotes Cardiomyocyte Differentiation through Cofilin-Mediated Cytoskeleton Rearrangement. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (20), 16803-16812 (2017).
- Hwang, J. H., Lee, D. H., Byun, M. R., Kim, A. R., Kim, K. M., Park, J. I., Oh, H. T., Hwang, E. S., Lee, K. B., Hong, J. H. Nanotopological plate stimulates osteogenic differentiation through TAZ activation. Scientific Reports. 7 (1), 3632 (2017).
- Bae, D., Moon, S. H., Park, B. G., Park, S. J., Jung, T., Kim, J. S., Lee, K. B., Chung, H. M. Nanotopographical control for maintaining undifferentiated human embryonic stem cell colonies in feeder free conditions. Biomaterials. 35 (3), 916-928 (2014).
- Cui, L. H., Joo, H. J., Kim, D. H., Seo, H. R., Kim, J. S., Choi, S. C., Huang, L. H., Na, J. E., Lim, I. R., Kim, J. H. Manipulation of the response of human endothelial colony-forming cells by focal adhesion assembly using gradient nanopattern plates. Acta biomaterialia. 65, 272-282 (2017).
- Lee, W., Park, S. J. Porous anodic aluminum oxide: anodization and templated synthesis of functional nanostructures. Chemical reviews. 114 (15), 7487-7556 (2014).
- Masuda, H., Fukuda, K. Ordered metal nanohole arrays made by a two-step replication of honeycomb structures of anodic alumina. science. 268 (5216), 1466 (1995).
- Masuda, H., Satoh, M. Fabrication of gold nanodot array using anodic porous alumina as an evaporation mask. Japanese Journal of Applied Physics. 35 (1B), L126 (1996).
- Zaraska, L., Sulka, G. D., Jaskuła, M. The effect of n-alcohols on porous anodic alumina formed by self-organized two-step anodizing of aluminum in phosphoric acid. Surface and Coatings Technology. 204 (11), 1729-1737 (2010).
- Yang, K. Y., Kim, J. W., Byeon, K. J., Lee, H. Selective deposition of the silver nano-particles using patterned the hydrophobic self-assembled monolayer patterns and zero-residual nano-imprint lithography. Microelectronic engineering. 84 (5), 1552-1555 (2007).
- Park, B. G., Lee, W., Kim, J. S., Lee, K. B. Superhydrophobic fabrication of anodic aluminum oxide with durable and pitch-controlled nanostructure. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 370 (1), 15-19 (2010).
