Summary
Hier presenteren we een protocol om te testen van de virulentie van de plant met de plant pathogen Magnaporthe grisea. Dit verslag zal bijdragen tot de grootschalige screening van de biotypen van schimmels isolaten en dienen als een uitstekend uitgangspunt voor het begrijpen van de resistente mechanismen van planten tijdens de moleculaire veredeling.
Abstract
Planten bezitten een krachtig systeem om zich te verdedigen tegen potentiële bedreigingen door pathogene schimmels. Voor agrarisch belangrijke planten, echter het is gebleken dat huidige maatregelen ter bestrijding van deze ziekteverwekkers te conservatief en, dus, niet voldoende effectief, en ze kunnen potentieel vormen milieurisico's. Daarom is het uiterst noodzakelijke host-weerstand factoren bij het controlerende plantenziektes natuurlijk door de identificatie van resistente kiemplasma, de isolatie en karakterisatie van resistentiegenen en de moleculaire veredeling te identificeren van resistente cultivars. In dit verband is er nodig om een nauwkeurige, snelle en grootschalige beëntingsmethode om te fokken en ontwikkelen van resistentiegenen plant. De rijst blast schimmel pathogeen Magnaporthe grisea oorzaken ernstige ziekte symptomen en verliezen opleveren. Onlangs, M. grisea heeft ontpopt als een modelorganisme voor het bestuderen van de mechanismen van plant-schimmel pathogeen interacties. Vandaar, rapporteren we de ontwikkeling van een plant virulentie testmethode die specifiek is voor M. grisea. Deze methode biedt voor zowel spray inoculatie met een conidial suspensie en verwonden inoculatie met mycelium kubussen of druppels van conidial schorsing. De belangrijkste stap van de verwonding beëntingsmethode voor vrijstaande rijst bladeren is om wonden op de bladeren van de plant, die elke storing die wordt veroorzaakt door gastheer penetratieweerstand vermeden. Deze spray/verwonden protocol draagt bij aan de snelle, nauwkeurige en grootschalige screening van de biotypen van M. grisea isolaten. Dit geïntegreerd en systematische plant infectiemethode zal dienen als een uitstekend uitgangspunt voor het verkrijgen van een breed perspectief van onderwerpen in de fytopathologie.
Introduction
Rijst blast, veroorzaakt door M. grisea, is een van de ernstigste ziekten voor rijst variëteiten wereldwijd1,2. Het proces waarmee M. grisea gastheerplanten infecteert omvat een conidiën productie als oppervlakte gehechtheid, een conidiën kieming en de vorming van appressorium, een formatie van de penetratie peg en besmettelijke schimmeldraad differentiatie, en een ziekte verspreid 3. al deze fasen zijn gebruikelijk in vele andere plant plantpathogene schimmels en, inderdaad, een blokkade van alle ééntraps voorkomt dat de besmetting van waardplanten. Als gevolg van zijn economische belang en de genetische werkwillig, heeft M. grisea ontpopt als een modelorganisme voor het bestuderen van de mechanismen van de plant-schimmel pathogeen interacties1,4. Dus, het bestuderen van de moleculaire basis van deze ontwikkelingsstadia in M. grisea zal helpen ophelderen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de schimmel pathogeniteit en de identificatie van kandidaat-doelgenen voor screening en ontwerpen roman fungiciden5.
Recente verslagen over M. grisea infectie hebben gericht op de moleculaire mechanismen van de stadia van de pre-penetratie, met name de conidiation, de appressorium-vorming, de penetratie pinnen en de besmettelijke groei3, 6. het is daarom essentieel voor de ontwikkeling van een gedetailleerd protocol om te testen van M. grisea infectie. Hierin presenteren wij een gedetailleerde methode voor een infectie-test die maakt gebruik van de spray-gemedieerde infectie testen met een conidial vering en de inoculatie van wonden met mycelial stekkers van M. grisea. In dit verslag, het protocol is gericht op de cultuur van stammen, de voorbereiding van de conidiation oplossing voor het spuiten, en de mycelial plug-gemedieerde inoculatie van planten met M. grisea. Deze stappen worden beschreven in detail hieronder, en een schematische weergave van de volledige workflow van de methode en een typische laesie worden weergegeven in de figuren 1 en 2, respectievelijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. spray inoculatie met een suspensie van M. grisea conidiën
-
Schimmel cultuur voor M.grisea
- Het kweekmedium havermout tomaat agar (OTA) voorbereiden op schimmel stammen.
- Weeg 30-50 g havermout, voeg dit toe aan 800 mL gedestilleerd/gedeïoniseerd water (ddH2van O) en kook het mengsel gedurende 30 minuten in de elektrische pot.
- Filtreer het gekookte havermout SAP in het bekerglas door een stuk van gaas.
- 150 mL tomatensap en 20 gram agar aan het filtraat in het bekerglas toevoegt ddH2O en vul aan tot 1000 mL.
-
Voorbereiding van experimentele materialen
- Geniet van ongeveer 50 zaden van rijst (Oryza sativa) cultivar Lijiangxintuan-heigu (LTH) in ddH2O voor 3 d of geniet van ongeveer 50 zaden van gerst (Hordeum vulgare cv Golden beloof) in ddH2O voor ongeveer 1 d.
- Wikkel de zaden van rijst of gerst in vochtig gaas en ontkiemen hen op vochtige filterpapier in ongeveer 30 petrischaaltjes met een diameter van 10 cm x 10 cm bij 28 ° C. De rijst zaad kiemkracht tijd is ongeveer 2-3 d, de gerst zaaitijd kiemkracht is ongeveer 2 d. De relatieve vochtigheid in de kas is ongeveer 70%.
- Plant de zaailingen van de rijst of gerst in potten met behulp van gesteriliseerde met autoclaaf potgrond en drenken en dan bedek ze met een laagje vermiculiet.
- Plaats de planten in een geschikte kas of groei kabinet bij 25 ° C gedurende ongeveer 1 ~ 2 weken.
- Snijd 3 lagen filtreerpapier in cirkels met een steriele chirurgische schaar (elke cirkel moet hebben een diameter van 8 cm) en leg ze op 100 mm steriele kunststofplaten.
- DdH2O toevoegen aan elk gerecht om te genieten van het koffiefilter.
- Zorg ervoor dat het filter papier volledig nat is, maar geen extra water toevoegen.
- Verwijder overtollig water met een vacuümpomp.
- Plaats 2 steriele tandenstokers in de cultuur-schotel ter ondersteuning van de rijst/gerst verlaat; de tandenstokers ruimte ~ 2-3 cm uit elkaar.
- Verzamelen van de bladeren van de rijst 2 weken na het zaaien de zaden of neem de bladeren van de gerst 7 d na het zaaien de zaden.
- Met behulp van 4 - tot 6-blad zaailingen van rijst/gerst, knip het onderste deel van de stengel op ~ 5 cm van de bovenkant en verzamelen van de bladeren.
-
Spray inoculatie protocol
- Cultuur van de schimmel druk op OTA platen in een thermostatische incubator (25 ° C) voor ~ 4 d.
- Voeg ~ 2 mL ddH2O met behulp van een 0,5 - 5 mL pipet aan elke 4 dagen oude plaat.
- Schraap met een inenting lus, de mycelia van de stam van de wild-type M. grisea en de gemuteerde stam in mycelia puin.
- Het puin mycelia verzamelen en overbrengen naar een nieuwe OTA-plaat. Neem de mycelia puin en klap droog in de schone Bank.
- De afdekplaat met 3 lagen van gaas om de vochtigheid nodig voor de groei van de conidiën in een kas bij 25 ° C in de dag (14u) en 23 ° C in de nacht (10 h) voor 24-48 h.
- Voeg 2 mL ddH2O toe aan elk gerecht en schraap de conidiën zachtjes met steriel katoenen wissers gevolgd door een filtratie door 2 lagen papier van de lens. Wees voorzichtig niet om krassen op het oppervlak van het kweekmedium.
- Spoel de conidiën suspensie in een nieuwe 50 mL-buis met een 100-1000 µL pipet.
- Centrifugeer gedurende 5 min op een minimum van 5.000 x g bij 25 ° C.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet te geven 2 x 104 conidiën per mL in een 0,025% (v/v) Tween-20 oplossing. De oplossing van Tween-20 is meestal ongeveer 10-20 mL.
- Giet de entsuspensie in een hand-held sproeier.
- Spay ongeveer 10 mL van de conidial ophanging op de bladeren van de rijst 2-week-oude rijst zaailingen of gerst bladeren van 7-dag oude gerst zaailingen en uit te broeden ze bij 25 ° C in een donkere, vochtige kamer voor ~ 24 h. Spray de planten van de controle met de 0,025% (v/v) Tween-20 oplossing.
- Breng de bladeren in een andere vochtige kamer onder tl-licht bij 25 ° C voor een fotoperiode van 12u.
- De symptomen van de ziekte bij 5 d na de inoculatie opnemen. Onderzoeken van het zieke rijst/gerst bladen van ~ 6 cm in lengte. De standaard beoordeling is volgens het scoresysteem voor blast weerstand van de International Rice Research Institute (IRRI). De details van het scoresysteem voor blast weerstand zijn vermeld in tabel 1.
- Foto van de bladeren te evalueren van de infectie van de geteste soorten. De infectie werd beoordeeld door het aantal laesies per 3,6 cm2.
2. het verwonden van inoculatie met Mycelium kubussen of druppels van Conidial opschorting van M. grisea
- Met behulp van een anatomische naald, schraap drie 2-3 cm lange wonden in de belangrijkste aderen van vrijstaande rijst/gerst bladeren; Wees voorzichtig niet te doordringen van de bladeren.
- De geschraapt bladeren zetten tandenstokers en spray een 0,02% (v/v) Tween-20 oplossing op de bladeren vormen een laag van druppels.
- Snijd een mycelial stekker van 0,5 x 0,5 cm voor elke stam M. grisea (wild-type, mutant, aanvulling stammen, of andere teststammen) van een OTA-plaat.
- Zet de mycelial stekkers of 25 µL druppels conidial vering op de gewonde bladeren en de bladeren bij 25 ° C in een vochtige kamer voor 3-8 d uit te broeden.
- De letsels op 5-7 d na inoculatie onderzoeken. De methode van onderzoek is het zelfde zoals het was voor de spray beëntingsmethode (zie stap 1.3.13).
- Onderzoeken van het zieke rijst/gerst bladen van ~ 6 cm in lengte en fotograferen om te evalueren van de infectie van de geteste soorten. De infectie werd beoordeeld door het aantal laesies per 3,6 cm2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De volledige werkstroom voor de techniek is afgebeeld in Figuur 1. De plant infectie testen werden uitgevoerd op 14-dag oude gevoelig rijst zaailingen (O. sativa cv CO-39) of gevoelig 7 dagen oude gerst verlaat (H. vulgare cv Golden beloof)7,8,9. Om te testen voor een infectie op de rijst bladeren, een conidial suspensie (1.0 x 105 sporen/mL) van de M. grisea wild-type stam P131 en de schrapping van de gemuteerde stam van Com1 waren bereid en vervolgens gespoten op het blad omhulsels van de 14-dagen oude gevoelig CO-39 zaailingen, die vervolgens werden bewaard in een vochtige kamer voor 5 d10. De P131-geïnoculeerd CO-39 laat de typische robuuste laesies voor rijst blast weergegeven, maar de bladeren Com1-geënt toonde duidelijk infectie gebreken en kon niet een volledige infectie(Figuur 2)ontlokken. De wild-type stam P131 is een soort verkregen door u-Liang Peng in 198818. De MoKMT2H null mutant (ΔMoKMT2H) werd verkregen door Cao et al. in ons lab met behulp van een target gene vervanging strategie11. De mutant Com1 werd geïsoleerd door Yang et al. in u-Liang Peng's lab10.
Abraded bladeren van wild-type rijst planten met mycelial stekkers van ΔMoKMT2H via de spray methode of verwonden methode11 geënt warenom te controleren of de M. grisea ΔMoKMT2H de cellen van de gastheer door middel van wonden, kan infecteren. De bladeren die spray-geënt met ΔMoKMT2H waren bleek geen klaarblijkelijke tekortkomingen in de ΔMoKMT2H -infectie in vergelijking met de P131/wild-type stam; echter werden klaarblijkelijke tekortkomingen vastgesteld voor bladeren geënt met ΔMoKMT2H via wonden(Figuur 2). Verdere testen de plant infectie met gerst bladeren, gezond of gewonde bladeren (cv Golden beloof) waren geënt met conidial druppels of mycelial stekkers, respectievelijk, of Com1, ΔMoKMT2H, P131. 5 d na inoculatie, had typische rijst blast laesies volledig ontwikkeld op de bladeren geënt met de ΔMoKMT2H of P131 stam, overwegende dat minder en kleinere laesies zijn gevonden op de bladeren geënt met de Com1 mutant (Figuur 2 B).
Figuur 1 : Een regeling ter illustratie van de plant infectie. Plant zaden zijn ontkiemd in de bodem in kunststof potten (50 mm2 x 50 mm diep, met een drainage gat), twee zaden per pot, en de zaailingen werden gekweekt in een kas. De cultuur en de inentingen van de hoogoven schimmel M. grisea werden geteeld op OTA platen. Voor de conidiën beëntingsmethode spuiten, was de conidiën schorsing opgeschort in een 0,02% (v/v) Tween-20 oplossing en gespoten op de rijst/gerst planten. De krassen beëntingsmethode, waren de bladeren van de plant geschraapt rijst/gerst kunststofplaten zetten en vervolgens door een mycelial stekker of de opschorting van de conidiën geënt. En vervolgens alle behandelde plant bladeren waren donker-gekweekt voor 24u en licht-gekweekt voor 12u. Ten slotte, het aantal kolonies in eenheden van 3,6 cm2 was opgenomen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Com1 en MoKMT2H zijn vereist voor een conidium vorming en pathogeniteit op rijst bladeren. (A) dit paneel toont de inoculatie van rijst verlaat via conidiën spray (links) mycelial stekker (rechts) met conidiën van de M. grisea wild-type P131, mutant Com1en/of ΔMoKMT2H. Typische bladeren werden waargenomen 7 d na de mycelial plug-gemedieerde inoculatie, die werd uitgevoerd op vrijkomen rijst bladeren. Typische laesies werden 5 d na de mycelial plug-gemedieerde inoculatie waargenomen. (B) gerst bladeren waren geënt via conidiën spray (links) of de mycelial stekker (rechts). Als het besturingselement van een mock behandeling, was een gelijk volume een 0,025% (v/v) Tween-20 oplossing gespoten. Voor de inoculatie van de wond, is uit Cao et al. de figuur van P131 gewijzigd 11. de MoKMT2H in de Ascomycota schimmels is een functionele homolog van Ash1, die in H3K4 en H3K36 methylering11 betrokken is. De bar = 1 cm. De Δcom1 -mutanten werden aanzienlijk verlaagd in virulentie op de rijst en gerst zaailingen10. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Schaal | Beschrijving |
| 1 | Kleine bruine vlekjes van pin-puntgrootte |
| 2 | Kleine rondachtige iets langwerpig, necrotisch grijze vlekken, ongeveer 1-2 mm in diameter, met een duidelijke bruine marge. Laesies zijn meestal te vinden op de bovenste bladeren |
| 3 | Laesie type is gelijk aan 2, maar significant aantal laesie zijn op theupper bladeren |
| 4 | Typische gevoelig blast laesies, 3 mm of langer, infecteren van minder dan 4% van het theleaf gebied |
| 5 | Typische gevoelig blast laesies, 3 mm of langer, infecteren minder dan 4-10% van de oppervlakte van het blad |
| 6 | Typische gevoelig blast laesies, 3 mm of langer, infecteren minder dan 11-25% van de oppervlakte van het blad |
| 7 | Typische gevoelig blast laesies, 3 mm of langer, infecteren minder dan 26-50% van de oppervlakte van het blad |
| 8 | Typische gevoelig blast laesies, 3 mm of langer, infecteren minder dan 51-75% van het blad gebied, veel bladeren dode |
| 9 | Typische gevoelig blast laesies, 3 mm of meer, infecteren van meer dan 75% van de oppervlakte van het blad |
Tabel 1: een scoresysteem voor blast weerstand. De tabel is uit de International Rice Research Institute (IRRI) genoemd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Plant ziekte resistentiegenen spelen een essentiële rol bij het voorkomen van infecties door ziekteverwekkers, met inbegrip van schimmel ziekteverwekkers1,12. Rijst blast is gebruikt als een model te begrijpen van de aard van pathogen bevolking structuren en genen4van de weerstand van de plant. Daarom is het noodzakelijk de ziekte weerstand genotype en avirulentie genotypen van de belangrijkste soorten vezelgewassen op grote schaal om ziekte-resistente planten die geteeld voortdurend worden kunnen te identificeren te onderzoeken. Bovendien, de voordelen van avirulentie genotypen van veld ziekteverwekkers vereisen de rationele verdeling van de verschillende resistente genotypes van12,13van de rassen van de host. Echter, huidige inoculatie methoden algemeen interfereren met de screening voor weerstand en pathogen identificatie14,15,16,17.
Hier presenteren we een snelle en nauwkeurige methode om de kweekproef voor de plant. Deze beëntingsmethode is geschikt voor de identificatie van resistente planten tijdens het fokken van proeven en van het fenotype van een populatie van de nakomelingen tijdens het klonen van resistentiegenen. Wij opgericht hier, een methode voor het enten van de gewonde plant verlaat met M. grisea. Omdat de weerstand van de gastheer een belangrijke rol speelt bij het voorkomen van de verspreiding van een ziekteverwekker, deze methode van de in vitro , die wonden op de geteste rijst verlaat en geënt van de ontploffing van de rijst op de wond, is handig voor het maken van een infectie direct in de bladeren zonder te doordringen van de epidermis van het blad en de epidermale celwand. Bovendien, deze beëntingsmethode is geschikt voor verschillende blad leeftijden. De resultaten van de inoculatie zijn stabiele en nauwkeurig. De methode van verwonding inoculatie kan worden gebruikt voor inoculatie met mycelia te identificeren van de pathogeniteit van schimmel stammen die alleen lage hoeveelheden conidiën produceren.
Dit protocol zal verder bijdragen aan ons begrip van de pathogene mechanismen die zijn bewaard in schimmels, evenals de pathogeen-specifieke factoren die mogelijk een schimmel om te weerstaan en onderdrukken van de aangeboren immuniteit van de gastheer13. Echter is de inoculatie van de wond niet van toepassing wanneer het proberen om te bepalen van het tarief van een conidial invasie en mycelia expansie. Maar in de natuurlijke toestand, de spray beëntingsmethode kan betere afspiegeling van de pathogeniteit van een ziekteverwekker. De spray beëntingsmethode is eenvoudig te bedienen en helpt bij het verbeteren van de efficiency van het werk. Deze resultaten wijzen op een nauwkeurige en stabiele beëntingsmethode nodig zijn voor screening tezamen, en planten resistentiegenen en pathogeniteit te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de speciale wetenschappelijke onderzoeksproject van de Universiteit van Peking landbouw (YQ201603) en het Wetenschappelijk Project van de educatieve Commissie van Peking (KM201610020005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Filter paper | GE Healthcare brand(Sweden) | 10311387 | |
| 50-mL tube | CORNING(Amercia) | 430290 | |
| Centrifuge | Eppendorf(Amercia) | 5804R | |
| Culture dish | Thermofisher(Amercia) | 150326 | |
| 0.5-5 mL pipette | Eppendorf | 4920000105 | |
| 100-1000uL pipette | Eppendorf | 4920000083 | |
| Vacuum pump | Leybold | D25B | |
| Dissection needle | FST | 26000-35 | |
| Incubator | MEMMERT | PYX313 | |
| Inoculation ring | Greiner Bio One | 731175 |
References
- Li, W. T., et al. A natural allele of a transcription factor in rice confers broad-spectrum blast resistance. Cell. 170 (1), 114-126 (2017).
- Chi, M. H., Park, S. Y., Kim, S., Lee, Y. H. A novel pathogenicity gene is required in the rice blast fungus to suppress the basal defenses of the host. PLoS Pathogens. 5 (4), 1000401 (2009).
- Jia, Y., Valent, B., Lee, F. N. Determination of host responses to Magnaporthe grisea.on detached rice leaves using a spot inoculation method. Plant Disease. 87 (2), 129-133 (2003).
- Ebbole, D. J. Magnaporthe as a model for understanding host-pathogen interactions. Annual Review of Phytopathology. 45, 437-456 (2007).
- Hamer, J. E., Talbot, N. J. Infection-related development in the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Current Opinion in Microbiology. 1 (6), 693-697 (1998).
- Howard, R. J., Valent, B. Breaking and entering: host penetration by the fungal rice blast pathogen Magnaporthe grisea. Annual Review of Microbiology. 50, 491-512 (1996).
- Chen, X. L., et al. N-Glycosylation of Effector Proteins by an α-1,3- Mannosyltransferase Is Required for the Rice Blast Fungus to Evade Host Innate Immunity. The Plant Cell. 26 (3), 1360-1376 (2014).
- Zhang, Y., et al. M.ARG1, MoARG5,6 and MoARG7 involved in arginine biosynthesis are essential for growth, conidiogenesis, sexual reproduction, and pathogenicity in Magnaporthe oryzae. Microbiological Research. 180, 11-22 (2015).
- Du, Y. X., et al. A serine/threonine-protein phosphatase PP2A catalytic subunit is essential for asexual development and plant infection in Magnaporthe oryzae. Current Genetics. 59 (1-2), 33-41 (2013).
- Yang, J., et al. A novel protein com1 is required for normal conidium morphology and full virulence in Magnaporthe oryzae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 23 (1), 112-123 (2010).
- Cao, Z. J., et al. An ash1-like protein MoKMT2H null mutant is delayed for conidium germination and pathogenesis in Magnaporthe oryzae. BioMed Research International. 2016, 1575430 (2016).
- Bryan, G. T., et al. A single amino acid difference distinguishes resistant and susceptible alleles of the rice blast resistance gene Pi-ta. The Plant Cell. 12 (11), 2033-2045 (2000).
- Zhou, J. M. Plant pathology: a life and death struggle in rice blast disease. Current Biology. 26 (18), 843-845 (2016).
- Guo, M., et al. MoGrr1, a novel F-box protein, is involved in conidiogenesis and cell wall integrity and is critical for the full virulence of Magnaporthe oryzae. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (19), 8075-8088 (2015).
- Talbot, N. J. On the trail of a cereal killer: Exploring the biology of Magnaporthe grisea. Annual Review of Microbiology. 57, 177-202 (2009).
- Wilson, R. A., Talbot, N. J. Under pressure: investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae. Nature Reviews Microbiology. 7, 185-195 (2009).
- Jia, Y. L., Lee, F. N., McClung, A. Determination of Resistance Spectra of the Pi-ta and Pi-k Genes to U.S. Races of Magnaporthe oryzae Causing Rice Blast in a Recombinant Inbred Line Population. Plant Disease. 93, 639-644 (2009).
- Peng, Y. L., Shishiyama, J. Temporal sequence of cytological events in rice leaves infected with Pyricularia oryzae. Canadian Journal of Botany. 66 (4), 730-735 (1988).
