Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

doi: 10.3791/57702 Published: April 19, 2018

Summary

אנו מציגים שיטה אוטומטית עבור שחזור תלת מימדי של Caenorhabditis elegans germline. השיטה שלנו קובעת את המספר והמיקום של כל גרעין בתוך germline ו ניתוחים germline חלבון הפצה, מבנה cytoskeletal.

Abstract

Germline Caenorhabditis elegans (C. elegans) משמש כדי ללמוד מספר תהליכי ביולוגית חשובה כולל תאי גזע, אפופטוזיס ופיתוח כרומוזום דינמיקה. בעוד germline מודל מעולה, הניתוח הוא לעתים קרובות שני עקב זמן העבודה הנדרש לצורך ניתוח תלת-ממדי. המפרט הגדולות במחקרים כאלה הם המיקום/המספר של גרעינים והפצה חלבון בתוך germline. כאן, אנו מציגים שיטה לבצע ניתוח אוטומטיות של germline באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית וגישות חישובית כדי לקבוע את המספר והמיקום של גרעינים בכל אזור של germline... השיטה שלנו מנתחת גם הפצה חלבון germline המאפשרת בחינה תלת מימדי של חלבון ביטוי מרקע גנטי. יתר על כן, המחקר שלנו מראה וריאציות באדריכלות cytoskeletal באזורים שונים של germline עשוי להכיל דרישות ספציפיות מרחבי התפתחותית. לבסוף, השיטה שלנו מאפשר אוטומטיות ספירת הזרע ב spermatheca של כל germline. יחדיו, השיטה שלנו מאפשר ניתוח פנוטיפי מהיר ולא לשחזור germline C. elegans .

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

שימור איתות המסלולים עם יונקים גורם C. elegans מודל מצויין ללמוד תהליכים ביולוגיים מספר1,2. במעבדה שלנו, אנו משתמשים germline C. elegans ללמוד תאי גזע, אפופטוזיס ופיתוח גנים. בעוד germline מבנה תלת מימדי, מחקרים רבים הם שניים בשל אופיו מהגידולים ועתירת של ניתוח תלת-ממדי. זה סביר מאוד כי ניתוח דו מימדי עלול לסלף ויוו אירועים ב germline. ההרמפרודיט למבוגרים C. elegans יש שתי זרועות germline, שכל אחד מהם בתים תא עצה דיסטלי סומאטית (DTC) המתחזק בתאי הנבט דיסטלי מצב וייעודים3,4. אלה בתאי הנבט מתחילים להבחין כאשר הם עוברים מן ה-DTC, בריחה השפעתה, ולהיות oocytes, זרע כפי שהם מגיעים לסוף הפרוקסימלית של germline. במהלך תהליך זה, גרעינים תא הנבט עוברים מיטוזה, לפני המעבר מיוזה5,6. ייצור הזרע מתבצעת באמצעות והעשים 4 (L4) של ההתפתחות, אחרי אשר oocytes מיוצרים במהלך הבגרות. הזרע נשמרות בתיקיה spermatheca שבו הם לדשן את oocytes כדי להפיק עוברי.

ישנם מספר גורמים גנטיים וסביבתיים יכולים להשפיע על התפתחות germline ב- C. elegans וכתוצאה מכך שינויים מספר גרעינים, מספר אירועים אפופטוטיים להיפגע, דינמיקה כרומוזום, ביטוי חלבונים ו/או לוקליזציה7 ,8,9,10,11. הניתוח של אירועים אלה דורש הזיהוי בכל שלב של בידול בהתבסס על מורפולוגיה גרעיני והפצה. לנתח במדויק את הפרמטרים הללו באופן ידני עם גודל מדגם גדולים הוא מהגידולים ולגזול. כדי לעקוף את החסרונות האלה ולאפשר את העקביות של ניתוח, פיתחנו שיטה אוטומטית בחינת תלת מימדי C. elegans germline לספור גרעינים, גרעינים הפצה, ביטוי חלבונים, ו cytoskeletal מבנה. על ידי שילוב מיקרוסקופיה קונפוקלית עם עיבוד תלת מימדי, יצרנו פרמטרים הגודל והצורה לצורך הזיהוי בכל שלב של בידול תא הנבט. יתרה מזאת, שיטה זו מאפשרת ספירת גרעיני תא נבט, זרע בתוספת ניקוד של כרומוזום מספר ב כל oocyte.

מבנה מכריע אחד ב germline הוא שלד התא, אשר מספק יציבות germline תא, איידס cytoplasmic streaming, הגנה germline הגרעינים12. באמצעות עיבוד חישובית, עלינו לבצע שחזור תלת מימדי של שלד התא germline, זיהה תכונות cytoskeletal שונות בתוך germline. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול צעד אחר צעד כדי להמחיש כיצד חישובית ניתוח בשילוב עם קונאפוקלית הדמיה מאפשר ניתוח מקיף של germline C. elegans .

אנו מציעים שיטה מהירה עבור ניתוח תלת-ממדי של C. elegans germline (איור 1). באמצעות ניתוח תלת-ממדי, זה אפשרי ללמוד תלת מימדי התפלגות אוטומטית germline גרעינים (איור 2 , איור 3), ספירת תאים (איור 2), שחזור של שלד התא germline ( איור 3), הפצה של חלבונים (איור 4), וניקוד מספר הזרע אצל spermatheca הכרומוזומים oocytes (איור 5). השיטה לא רק מאפשר כימות קל ומדויק germline אלא מזהה פנוטיפים רלוונטי מבחינה פיזיולוגית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. גידול תולעת והכנה

הערה: עיין טבלה של חומרים עבור כל מוצר המידע.

  1. OP50 Escherichia coli תרבות: התרבות חיידקים OP50 Lysogeny מרק בשר (ליברות) (טריפטון 1% 0.5% שמרים, 0.5% NaCl, pH 7.0) בן לילה ב 37 ° C ללא אנטיביוטיקה.
  2. זרע µL 400 של חיידקים OP50 ללוחות מדיה (NGM) צמיחה נמטודות (1.5 גר' NaCl, 8.5 גר' אגר, 1.25 גרם peptone, 1 מ"ל של CaCl 1 מ'2, 1 מ"ל של כולסטרול 5 מ"ג/מ"ל אתנול, 1 מ"ל של 1 מ' MgSO4 ו- 25 מ של 1 מ' KPO4 מאגר) אוויר יבש החיידקים במשך 48 שעות.
  3. לבחור תולעים על צלחות NGM הזריעה, דגירה 15 ° C או 20 º C.
    1. לניתוח של germline אנדרוגינוס למבוגרים, לאסוף מוזן היטב תולעים L4 לדשא חיידקי ואת דגירה בין לילה ב 20 º C.
    2. בשביל הניקוד זרע מספר אנדרוגינוסים, דגירה L4 תולעים ב 20 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות עד התולעים מגיעים את הנשירה L4/למבוגרים בלבד. כדי לסנכרן את התולעים לבמה L4, להכין ביצים על-ידי בחירת תולעים בוגרות עם הרבה ביצים בפתרון אקונומיקה (1 M NaOH ואקונומיקה ביחס 1:1). לאפשר את הביצים בוקעות ולקחת L4 חיות בשביל הניסוי.
  4. הכן שקופיות מיקרוסקופ טפלון על ידי הצבת µL 25 של פולי-L-ליזין פתרון בשקופית והפצת הפתרון, באמצעות טיפ פיפטה. לאחר הסרת העודפים פולי-L-ליזין עם מגבת נייר, לאפשר שהשקופיות אוויר יבש, דגירה השקופיות ב 65 מעלות צלזיוס למשך 15-20 דקות.

2. Germline לנתיחה,6,מכתימים13

  1. ספוט µL 10 של 0.01% tetramisole (הרדמה) ב- coverslip 22 מ"מ × 22 מ"מ ולבחור אחד - בן יום תולעים בוגרות לתוכו.
  2. לנתח את התולעת בזנב כמו זה הופך להיות מורדם באמצעות מזרק (5 מ"ל) ומחט (24" פרק 1"), ולוודא כי germline אינו פגום.
    הערה: הקרע צריך להתבצע לפני התולעת הופך משותק לחלוטין כך הלחץ השלילי התולעת ואת תנועת תולעת סיוע של הוצאה של germline. הבקיע זרע, עבור לנקוט שלא יגרמו נזק את spermatheca על ידי המחט במהלך ניתוח. להימנע מלגעת את germline עם המחט למעט הנקודה לנתיחה לאחר spermatheca. אם יש לשבור בתא germline או הפרשות germline נצפית, אמור germline לא לשמש לניתוח.
  3. מקם את coverslip הפוכה בשקופית מצופה פולי-L-ליזין, שמירה על ביתור germline בשקופית.
  4. להסיר עודפי נוזלים תחת coverslip על ידי הצבת מגדל נייר בפינה של coverslip, ולאחר מכן המקום השקופית של חנקן נוזלי עבור מינימלית 1 להסיר במהירות את coverslip באמצעות מחט עם germlines על השקופית.
  5. להעביר את השקופיות-20 ° C מתנול עבור 30-60 s בחדר ולאחר מכן תקופת דגירה של 30 דקות בתמיסה תיקון המוכנים באופן טרי (1 x פוספט buffered מלוחים (PBS) המכיל מ' 0.08 HEPES pH 6.9, 1.6 מ מ MgSO4, מ מ 0.8 אתילן גליקול-bis(beta-aminoethyl אתר)-N, N, N', N'-paraformaldehyde חומצה (EGTA) ו- 3.7% tetraacetic) בטמפרטורת החדר.
  6. לשטוף את השקופיות על-ידי הצבת בחדר המכיל 1 x PBS, pH 7.4 עם 0.1% Tween-20 במשך 10 דקות חזור על שלב זה פעם אחת.
  7. לחסום את germlines עם µL 30 של חסימת פתרון (30% של נסיוב עז שהוכנו על ידי הוספת µL 900 של עז נסיוב 1700 µL של מזוקקים H2O ו- 300 µL של 10 x PBS) בחדר לחים שהוכנו על ידי הנחת מגבת נייר רטובה בתוך קופסת פלסטיק בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  8. הוסף µL 50 של REC-8 נוגדן פתרון מוכן בנסיוב עז 30% ב- 1:300 יחס אל כל דגימה. דגירה בין לילה ב 4 º C.
  9. לשטוף את השקופיות על-ידי הצבת בחדר המכיל PBS x 1 עם 0.1% Tween-20 במשך 10 דקות חזור על השלב פעם ולהסיר עודפי נוזלים על ידי הנחת מגבת נייר בפינה של השקופית.
  10. להכין נוגדן משני פתרון על ידי דילול fluorophore ירוק (488 ננומטר פליטה אורך גל) מצומדת נוגדנים משניים (1:1000), phalloidin (אקטין הכתם, בקני) ודאפי (DNA הכתם, בקני) 30% עז נורמלית בסרום.
  11. הוסף µL 50 של נוגדנים משניים פתרון לשקופית.
  12. תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר.
  13. לשטוף את השקופיות פעמיים על-ידי הצבת בחדר המכיל PBS x 1 עם 0.1% Tween-20 במשך 10 דקות תנגבי עודף נוזלים.
  14. להוסיף 30 µL של תיקון ריאגנט אותן לשקופית במקום 12 מ מ2 x 1.5 מיקרומטר coverslip על העליונה, לייבש את השקופיות ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

3. מיקרוסקופיה קונפוקלית

  1. הפעל את מיקרוסקופ קונפוקלי, לייזרים, סורק תהודה ותוכנות מיקרוסקופ קונפוקלי. במקום את השקופיות עם germlines מוכתם על המחזיק שקופית מעל המטרה X 63.
  2. לאתר של germline, להתמקד בחלק העליון germline ולסמן אותו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי תוכנה. באופן דומה להתמקד בתחתית germline ולסמן אותו כדי לקבוע את עובי germline הכולל.
  3. תמונה germline כולו על-ידי הגדרת עובי כל פרוסה עד 0.5 מיקרומטר. לסמן את רכישת germline ולהתחיל להשלים. לסרוק כל פרוסה 8 פעמים, ממוצע של הערכים לשיפור איכות התמונה. בסורק התהודה יאפשר סריקה מהירה כדי למנוע הלבנת במהלך דימות. אם לא קיים המיקרוסקופ סורק תהודה, להפחית את מספר סריקות עד ארבע כדי למנוע הלבנת.

4. post Imaging ניתוח של גרעינים מספר והפצה

הערה: עיין משלים איור 1 לקבלת צילומי מסך של כלי תוכנה, לחצני המשמשים.

  1. ייבאו את התמונה Imaris 8.4.1 או גירסאות מאוחרות יותר של התוכנה.
  2. הגדרת אזור mitotic אזור המעבר, באזור meiotic, אזור oocyte, spermatheca של germline על-ידי זיהוי המורפולוגיה גרעיני בכל אזור.
  3. השתמש בלחצן פונקציה פני השטח (איור משלים 1A) של התוכנה כדי לבחור את האזור של ריבית.
  4. לבטל את אשף יצירת משטח אוטומטי וצייר ידנית האזור של ריבית על הפרוסה הראשונה והאחרונה של התמונה מתוך ערימה תלת מימדי.
  5. לחץ על משטח יצירה.
    הערה: התוכנה באופן אוטומטי יפתחו את המחסן בין הראשונים והאחרונים מחסנית.
  6. להסוות כל הערוצים למעט דאפי על-ידי לחיצה על לחצן מסכת ערוץ (איור משלים 1B-C).
  7. להגדיר פרמטרים גודל הגרעין באמצעות לחצן function ספוט (איור משלים 1A). עבור האזור mitotic, הגדרה של XY בקוטר של 2 מיקרומטר תוך השארת קוטר Z מוגדר. עבור אזור המעבר, להגדיר XY בקוטר של 2 מיקרומטר, קוטר Z כמו 1.5 מיקרומטר. (1D איור משלים).
    הערה: פתרון בעיות על הקוטר בהתאם רמת ההגדלה ואת המפרט של המיקרוסקופ. עבור פרוטוקול הנוכחי, המטרה בשימוש היה בן 63 X וסיפק נוסף ההגדלה 1.70 פעמים במהלך דימות. אם המטרה משתנה, למשל 40 X, הקוטר צריך להשתנות בהתאם. פתרון בעיות צריכה להתבצע עם wildtype germlines להקים הפרמטרים הנכונים. האזור mitotic של זרוע germline פראי סוג יש כ 250 גרעינים. הקוטר צריך לשנות כדי להשיג ערך זה. השתמש germlines לפחות 15 כדי לקבוע את ערך אופטימלי עבור הקוטר. בגישה דומה אמור לשמש לכיול אזור המעבר (150-170 גרעינים) ואזור meiotic (600-700 גרעינים).
  8. להגביל את הגילוי של כתמים על-ידי הגדרת את הסף המינימלי (איור משלים 1E). שימוש דאפי מוכתם פראי סוג germlines להקים את הסף המינימלי על ידי הגדלת את הסף המינימלי עיבוד תלת מימדי עד המקום הראשון מופיע מחוץ germline.
  9. לשמור את התמונה, לקבל את מספר גרעינים מטבלת שנוצר באופן אוטומטי על ידי התוכנה. ייצוא התמונות כמו קבצים TIF.

5. post Imaging ניתוח הבקיע הזרע ואת מספר כרומוזום

  1. לבצע עיבוד תלת-ממדית על-ידי בחירה spermatheca את אזור בעל עניין. כדי לזהות כל זרע, להגדיר את קוטר הנקודה בין 0.75 - מיקרומטר 1.0 עבור X ו- Y-ציר, בעוד קוטר Z נשאר לא מוגדר. השתמש בלחצן פונקציה כתמים כמוצג באיור1 משלים.
  2. להחסיר את הרקע על ידי מתקתק רקע לחסר תיבת ושימוש רקע תיקון ערכים המחושבים על-ידי התוכנה (1D איור משלים).
    הערה: התוכנה Imaris בוחר נקודות בעוצמה גבוהה קודם, לכן השפעת הרקע הוא מינימלי כל עוד אין הבדל משמעותי בין האזור עניין ואת הרקע. השיטה השנייה היא כדי להגדיר באופן ידני את התיקון רקע, במידת הצורך ערכים שניתן לתת את הרקע. תיקון ידני הרקע יהיה הולם אם האינטנסיביות של דגימות עצמאי צריך השוואה.
  3. התאם את הסף עיבוד תלת מימדי לזהות כל זרע דאפי צבעונית spermatheca (איור משלים 1E).
  4. לספירת כרומוזום, להגדיר את קוטר הנקודה < מיקרומטר 0.75 עבור X ו- Y-ציר לפני פיתוח מודלים תלת מימדיים.
  5. שמור את התמונה וייצא כקובץ TIF.

6. post Imaging ניתוח עבור שחזור Cytoskeletal של Germline

  1. לזהות את האזור עניין ב germline, להסוות כל הערוצים למעט phalloidin על-ידי לחיצה על לחצן מסיכה ערוצים .
  2. הגדרת יחידת השטח של 0.25 מיקרומטר באמצעות לחצן פונקציה פני השטח (איור 1 משלים).
    הערה: פירוש כל מיקרומטר 0.25 יעובד לתוך מודלים תלת מימדיים. פרטי המשטח יכול להיות קבועה עבור כל אזור germline שבו ייווצר מודל פני שטח תלת-ממדי עבור כל מיקרומטר 0.25. עם זאת, עבור האזור oocyte, פרטי המשטח ניתן להגדיל עד 0.35 - 0.5 מיקרומטר בשל הנוכחות של סיבי אקטין מוגדרים היטב באזור זה.
  3. להחסיר את הרקע על ידי מתקתק רקע לחסר תיבת ושימוש רקע תיקון ערכים המחושבים על-ידי התוכנה (1D איור משלים).
  4. להתאים את הסף עיבוד תלת מימדיים בהתאם למבנה הדורשים ניתוח (איור משלים 1E).
  5. שמור את תמונת תלת מימדי מפותחת וייצא כקובץ TIF.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

איור 1 מציין את משך הזמן הנדרש לצורך ניתוח germline תלת מימדי. אנדרוגינוסים L4 מודגרות ב- 20 ° C היו גזור כדי לבודד germlines, צבעונית עם דאפי, phalloidin נוגדנים נגד germline חלבונים. Germlines הם עם תמונה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. מיקרוסקופ מוכתמים, קונאפוקלית דורש כ 24 ה ניתוח חישובית עבור germline שלם דורש 10-15 דקות כדי לספור את מספר והמיקום של גרעינים, לזהות את התפלגות חלבון, לנתח את המבנה cytoskeletal ואת הציון מספר של זרע. ניתוח ידני מלא דורש מעל 2 h לכל germline ונתון מפעיל השפעה, ולכן השיטה האוטומטית שלנו תפוקה גבוהה מקצרת את זמן הניתוח, משפר את הפארמצבטית.

אוטומטי גרעינים הבקיע מגלה כי זרוע germline בתים כ 1,000-1,200 גרעינים (איור 2C), המתאימים היטב עם המדריך שפורסמו בעבר הבקיע נתונים1. כדי לאשר שאת הדיוק של הניקוד, מספר מוטציות ותנאים שונים הם משתמשים (איור 2D-G). למשל, אנחנו לעומת rnp-8(tm435), cpb-3(bt17)ותולעים glp-1(e2141) מוטנטים בעלי חיים פראי סוג. סופר אוטומטיות לשכפל צמצום ידוע מספר גרעינים משטרת שיקאגו-3 ו- glp-1 מוטציה germlines14,15,16,17. ירידה חמורה במספר גרעינים נצפתה גם ב glp-1(e2141) הרגיש החשבונאי כאשר מודגרות ב 25 º C. חלוקת הגרעינים תלויה השלב של בידול. האזור mitotic, המכיל כ 250 גרעינים בסוג הפרוע, הוא צמוד גדושות עם גרעינים בהשוואה לשאר germline (איור 3)1. המרווח בין הגרעינים mitotic הוא מינימאלי, הגרעינים ממוקמים בכל רחבי האזור mitotic. עם זאת, כמו הגרעינים תעבור הדיסטלי, הם מופיעים יותר ויותר אל עבר היקף germline (איור 3). השינוי בחלוקת מתחיל באיזור המעבר ומשלימה הגרעינים הזנת המיוזה/pachytene.

Germline יש מבנים cytoskeletal ספציפיים בשלבים שונים של בידול. אנו דמיינו F-אקטין ידי מכתימה את germline עם phalloidin. התפלגות F-אקטין מ דיסטלי proximal סוף germline שהיה נפרד בכל אזור (איור 3 ואיור 5). באופן כללי, ישנם שני מבנים נפרדים אשר מופיעות בתור 'גליל בתוך גליל'. -האזור mitotic, אקטין הפנימי נראה כמו גוש מוצק בצורת ספציפי (איור 3). Germline מגיע לאזור המעבר, אקטין הפנימי ההנחה היא מבנה גלילי יותר, היא תהפוך לגליל חלול כפי שהוא מגיע מאוחר pachytene. השכבה השנייה של אקטין מכסה השכבה הפנימית נותנת צורה germline. מבנה אקטין זה 'גליל בתוך גליל' נעלם לכיוון האזור oocyte (איור 5). -האזור oocyte, מופיע אקטין סיבי עבה. Oocytes מופרדים באמצעות rachis אקטין, למרות שהוא נראה דינמי כדי לאפשר את התנועה של oocytes כדי spermatheca. לבסוף, אקטין ב spermatheca גם צורות צרורות עבה של סיבי אקטין. עם זאת, סיבי מופיעים ארוז קרוב יותר מאשר באזור oocyte. המבנה cytoskeletal מופיעה כדי להשלים את דפוסי ההפצה של גרעינים (איור 3). האזור mitotic, הגרעינים מופיעים שימוקמו סביב המבנה הפנימי אקטין. כשהם מגיעים המיוזה/pachytene, הגרעינים לארגן בין שני הגלילים אקטין עוזב באמצע germline בעיקר ללא גרעינים (איור 3). זה כנראה יכול לסייע ללא הפרעה cytoplasmic streaming ב germline. Germlines היו מוכתמים נוגדן כנגד חלבון REC-8, נותחו על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. REC-8 homogeneously מופץ סביב הגרעינים הראשונים של germline מאוחר יותר ביקע ויש השפיל במהלך המיוזה18. התפלגות REC-8 בניתוח חתך תלת-ממדי germline מציג את ההתפלגות של חלבון באזור mitotic (איור 4).

עיבוד תלת מימדי של סוף הפרוקסימלית germline כוללת את spermatheca דיסטלי כדי spermatheca שלושת oocytes. הניתוח שלנו זיהה ממוצע של 151 הזרע אצל כל spermatheca (n = 18). זה מקביל שפורסמו בספרות, המציין את המהימנות של השיטה (איור 5F)19. ניתן לבצע ניתוח זה יחד עם cytoskeletal או חלבון הפצה לימודים. הגנום C. elegans מופץ בין כרומוזום 6. Oocytes מפותחת פראי סוג, כרומוזומים אלה גלויים, ניתן לספור. ההפרדה הזאת כרומוזום ניתן ללמוד יציבות כרומוזום או פגמים אחרים הקשורים oocyte פיתוח. על-ידי עיבוד תלת-ממדי, ניתן לאבחן את מספר הכרומוזומים, אם הכרומוזומים מופרדים כראוי, לקבל את המספר יכול להיות במדויק (איור 5).

Figure 1
איור 1 . ציר זמן עבור ניתוח אוטומטיות. זמן השוואה בין ניתוח ידנית וחישובית של germline C. elegans . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 . הפצת גרעינים ב germline. (א) דאפי מוכתם germline מציג mitotic, המעבר ואזורי pachytene/meiotic. (ב) חישובית מודל תלת מימדי של germline. (ג) רישום נקודות עבור המספר הכולל של גרעינים ב פראי סוג germlines. (D-F) הניקוד עבור מספר גרעינים ב mitotic, המעבר, ואזורי meiotic germlines מוטציה פראי סוג rnp-8, משטרת שיקאגו-3, glp-1 . (ז) השוואה במספר הכולל של גרעינים ב החשבונאי glp-1 ב- 20 ° C ו- 25 º C. קו שגיאה מייצג שגיאה סטנדרטית. המבחן של התלמיד. n < 0.0001, * * *n < 0.001, * *n < 0.01, *n < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 . מבנה cytoskeletal germline. (A-B) ארגון של שלד התא הפנימי אקטין (אדום) של germline על האזור mitotic. אקטין הפנימית יש מבנה ' מאטום לשקוף ' לעומת אקטין החיצוני-האזור mitotic. (C-D) -האזור pachytene, שלד התא ההנחה היא מבנה גלילי על ידי יצירת שני צילינדרים שביניהן מאורגנים הגרעינים (כחול). (E-F) ארגון של גרעינים germline באזורים mitotic ו- pachytene. חלוקת גרעין האטום הוא יותר לכיוון ההיקף של 'germtube' על האזור pachytene בהשוואה לאזור mitotic (ירוק) ולהיות אמצע germline ללא גרעינים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 . REC-8 ביטוי באזור mitotic. (א) מציג בקצה הדיסטלי של germline REC-8-צבעונית micrograph. (בג) עיבוד תלת מימדי של REC-8 מכתים (ראה בכחול) והפצה של חלבון בין האטומים mitotic (ירוק). צביעת REC-8 הוא שופע פחות קרובים לאזור mitotic (מסומן על-ידי נקודות לבנות המייצג את הגרעינים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 . מבנה Germline בסוף מקורב. (א) דאפי כתמים germline בסוף הפרוקסימלית. (ב) עיבוד תלת ממדי של דאפי מכתים מראה זרע ב- spermatheca (צהוב) ו הכרומוזומים oocytes (לבן). (ג-ה) המבנה התלת-ממדי cytoskeletal בסוף germline הפרוקסימלית. האדום מציין את סיום proximal מלאה וסימון ירוק את spermatheca. ניתוח חתך צלב עולה כי שלד התא לא רק יוצרת מבנה filamentous של אקטין סביב oocytes, אך גם מפריד בין oocytes. (ו) גרף המציג את המספר של זרע כל spermatheca ואת הממוצע המתקבל spermatheca מרובים (n = 18). קו שגיאה מייצג שגיאה סטנדרטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Supplementary Figure 1
משלים איור 1 . תיאור כלי תוכנה. (א) מקומות וכלים משטח לגילוי גרעינים, חלבון מכתים. (בג) בחירת אזור תלת מימדי עניין באמצעות הכלי משטח. (ד) הגדרת XY-הקוטר, בכלי של כתמים, לגילוי גרעינים. תלוי באזור של עניין מכתים, ניתן להשתמש התיקון קוטר ורקע ציר z. (ה) מינימום וזיהוי הסף העוצמה המקסימלית. בגישה דומה יכול לשמש עבור הפונקציה השטח שבו במקום להגדיר את הקוטר, ניתן להגדיר את פרטי המשטח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

המטרה של פרוטוקול זה נועד לשפר את הדיוק ולצמצם את משך הזמן הנדרש לצורך ניתוח germline. לאחר הכנת תקן germlines גזור, מודל תלת מימדי של גרעינים germline מוכן על ידי עיבוד חישובית. תוך מתן אפשרות התבוננות germline הפצה גרעינים בחלל, עיבוד תלת מימדי מחשבת את מספר גרעינים על אזורים ספציפיים של germline. היבט קריטי של השיטה שלנו היא הגדרה מדויקת של הפרמטרים הגודל והצורה של גרעין האטום. זה תלוי על בהירות של צביעת ואת ההגדלה המשמש את התמונה. נוכל לאשר את הדיוק של שיטת השוואת לאור נתונים מנותח באופן ידני1. לאשר עוד יותר את הדיוק של השיטה שלנו, אנו נעשה שימוש מוטציות מרובות בתנאים שונים, אישר את התוצאות עם ספרות שפורסמה. הוא גם אישר את היכולת של השיטה לזהות פנוטיפים עדין וחזק - משטרת שיקאגו-3 ו- glp-1 מוטציות, בהתאמה. בנוסף, שיטה זו מראה הסתגלות לשינויים גרעינים בגודל וצורה בתוך את germline או אפילו בין זנים. מאפיין זה מאפשר גם את הזיהוי והניקוד של מבנים קטנים יותר germline כגון כרומוזומים, זרע. השיטה מאפשרת גם להמשך פתרון בעיות עבור פרמטרים של גודל וצורה, אם נדרש. הניתוח שלנו הצליח להבהיר את ההפצה של גרעינים ב germline והראה את זה גרעינים ב mitotic אזורים pachytene הינם מאורגנים בתבניות שונות. על-ידי החלת עיבוד תלת-REC-8 ו דאפי מכתים, הראנו גם את ההתפלגות של REC-8 בתוך הגרעינים של האזור mitotic.

עיבוד תלת מימדי של אקטין מכתים איפשרה בדיקה מקיפה של מבני germline cytoskeletal. Germline נראה שני מבנים נפרדים אקטין, אבל הם שומרים על מגע פיזי. בעוד מחדש של שלד התא עבור germline כולו אפשרית כישות אחת, התוצאות הטובות ביותר ניתן להשיג אם האזורים של עניין הם בחר לתוך mitotic, מעבר מיגדרי, ואזורים meiotic. שלד התא germline דיסטלי יש צורה לא מוגדרת, מתפתח לתוך מבנה filamentous בסוף הפרוקסימלית. פרוטוקול שלנו ולכן מאפשר שחזור תלת מימדי של שלד התא אקטין germline על-ידי הגדרת פרמטרים ספציפיים כדי להתאים את הערכות להבדלים בחלוקה אקטין. הפן הקריטי ביותר של הניתוח זו ההגדרה פרמטרים כגון גודל הגרעינים ודרישת פרטי המשטח. הפחתת גודל הגרעינים מתחת הגודל הממשי יסכנו את התוכנה כדי לאסוף נקודות האור בתוך האטומים כאובייקטים נפרדים. באופן דומה, ערכים פרטים משטח גבוה יוביל ההפסד של מבנים תלת מימדי מדויק. השיטה המוצעת מסתמך על הדיוק של דיסקציה ואת איכות ההכתמה germline. Germline פגום עלול להוביל שחרורו של גרעינים מ germline, גורם מספור לא מדויק. רקע של ההכתמה יגרום גם את הגרעינים לא מדויק הספירה של עיבוד תלת מימדי פסולים.

השיטה שלנו מרחיב ידועים בשיטות אוטומטיות של ניתוח germline שבו אנו מסוגלים לנתח את מספר גרעינים ואת ההפצה/ביטוי של חלבונים germline בחלל עם פרוטוקול אחד20. שנית, שיטת שלנו מאפשרת בדיקה נוספת של מבנים קטנים יותר כגון כרומוזומים בתוך germline. סגרגציה כרומוזום היא היבט חשוב של פיתוח oocyte21. באמצעות השיטה שלנו, זה אפשרי לזהות את המספר ואת המיקום של כרומוזומים שבו המרחק יכולה להיות מוגדרת על ידי כיול נגד פראי סוג oocytes. כל מוטציה המשפיעים על ההפרדה כרומוזום שניתן ללמוד באמצעות כלי זה. בנוסף, ניתן להאריך את שיטת ללמוד הכרומוזומים העוברים בשלב 2-תא. הניתוח חישובית מספק גם המספר של זרע ב- spermatheca, מספר הכרומוזומים, oocyte ו germline cytoskeletal מבנים. יחדיו, השיטה מספקת ניתוח מקיף של germline C. elegans באמצעות נוהל בודדת תוך הפחתת זמן ניתוח במידה ניכרת. השיטה מבטלת את הדרישה של כלים מרובים עבור כל ניתוח (מספר גרעינים, חלבון הפצה ומבנה cytoskeletal) ומסירה את הזמן קידוד הנדרש של כל תוכנה ספציפית. לבסוף, בשיטה זו ניתן להרחיב באופן יעיל ללימודים תולעת השני כולל ניתוח תלת-ממדי של תולעים חיות מסומם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים.

Acknowledgments

אנו מודים Microimaging מונש לתמיכה טכנית שלהם. זנים מסוימים נמסרו על ידי המרכז גנטיקה Caenorhabditis , אשר ממומן על ידי משרד NIH תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440). עבודה זו נתמכה על ידי מלגת גילוי וההתערבות של אוניברסיטת מונש, גרנט פרויקט NHMRC (GNT1105374), מלגת מחקר בכיר NHMRC (GNT1137645), וסקי חדשנות מלגת: 23 ערנית על רוג'ר Pocock.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III  Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
OP50 Escherichia coli bacteria Homemade
Nematode Growth Media (NGM) plates Homemade
polyclonal rabbit anti-REC-8  SDIX 29470002
Alexa 488 conjugated antibody raised in goat Thermofisher Scientific A-21236
Cytoskeletal dye phalloidin  Thermofisher Scientific A-12380
DAPI  Thermofisher Scientific  62248
Poly-L-lysine  Sigma Aldrich P5899
Tetramisol  Sigma Aldrich P5899
MgSO4 Sigma Aldrich M7506
1M HEPES buffer, pH 7.4  Sigma Aldrich G0887
10X PBS pH 7.4  Thermofisher Scientific AM9625
Tween-20  Sigma Aldrich P1389
EGTA Sigma Aldrich E3889
37% Paraformaldehyde solution Merck Millipore 1040031000
Normal goat serum Sigma Aldrich G9023
Fluoroshield fixing reagent  Sigma Aldrich F6182
Ethanol  Millipore  1009832511
Methanol Sigma Aldrich 34860
20°C & 25°CIncubator  Any brand
Light microscope Any brand
Confocal microscope   Any brand (Leica, Zeiss)
Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software. Bitplane
Phospho buffered saline, pH 7.4 Homemade
Teflon microscope slides  Tekdon   941-322-8288

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hubbard, E. J. Caenorhabditis elegans germ line: a model for stem cell biology. Dev Dyn. 236, (12), 3343-3357 (2007).
  2. Joshi, P. M., Riddle, M. R., Djabrayan, N. J., Rothman, J. H. Caenorhabditis elegans as a model for stem cell biology. Dev Dyn. 239, (5), 1539-1554 (2010).
  3. Kershner, A., et al. Germline stem cells and their regulation in the nematode Caenorhabditis elegans. Adv Exp Med Biol. 786, 29-46 (2013).
  4. Byrd, D. T., Knobel, K., Affeldt, K., Crittenden, S. L., Kimble, J. A DTC niche plexus surrounds the germline stem cell pool in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 9, (2), 88372 (2014).
  5. Kimble, J., Crittenden, S. L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the sperm/oocyte decision in Caenorhabditis elegans. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 405-433 (2007).
  6. Hansen, D., Hubbard, E. J., Schedl, T. Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline. Dev Biol. 268, (2), 342-357 (2004).
  7. Crittenden, S. L., et al. A conserved RNA-binding protein controls germline stem cells in Caenorhabditis elegans. Nature. 417, (6889), 660-663 (2002).
  8. Eckmann, C. R., Crittenden, S. L., Suh, N., Kimble, J. GLD-3 and control of the mitosis/meiosis decision in the germline of Caenorhabditis elegans. Genetics. 168, (1), 147-160 (2004).
  9. Schumacher, B., et al. Translational repression of C. elegans p53 by GLD-1 regulates DNA damage-induced apoptosis. Cell. 120, (3), 357-368 (2005).
  10. McMullen, P. D., et al. Macro-level modeling of the response of C. elegans reproduction to chronic heat stress. PLoS Comput Biol. 8, (1), 1002338 (2012).
  11. Hubbard, E. J., Korta, D. Z., Dalfo, D. Physiological control of germline development. Adv Exp Med Biol. 757, 101-131 (2013).
  12. Wolke, U., Jezuit, E. A., Priess, J. R. Actin-dependent cytoplasmic streaming in C. elegans oogenesis. Development. 134, (12), 2227-2236 (2007).
  13. Jones, A. R., Francis, R., Schedl, T. GLD-1, a cytoplasmic protein essential for oocyte differentiation, shows stage- and sex-specific expression during Caenorhabditis elegans germline development. Dev Biol. 180, (1), 165-183 (1996).
  14. Hasegawa, E., Karashima, T., Sumiyoshi, E., Yamamoto, M. C. elegans CPB-3 interacts with DAZ-1 and functions in multiple steps of germline development. Dev Biol. 295, (2), 689-699 (2006).
  15. Austin, J., Kimble, J. glp-1 is required in the germ line for regulation of the decision between mitosis and meiosis in C. elegans. Cell. 51, (4), 589-599 (1987).
  16. Berry, L. W., Westlund, B., Schedl, T. Germ-line tumor formation caused by activation of glp-1, a Caenorhabditis elegans member of the Notch family of receptors. Development. 124, (4), 925-936 (1997).
  17. Fox, P. M., Schedl, T. Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201, (1), 167-184 (2015).
  18. Pasierbek, P., et al. A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction. Genes and Development. 15, (11), 1349-1360 (2001).
  19. Klass, M., Wolf, N., Hirsh, D. Development of the male reproductive system and sexual transformation in the nematode Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 52, (1), 1-18 (1976).
  20. Korta, D. Z., Tuck, S., Hubbard, E. J. S6K links cell fate, cell cycle and nutrient response in C. elegans germline stem/progenitor cells. Development. 139, (5), 859-870 (2012).
  21. Laband, K., et al. Chromosome segregation occurs by microtubule pushing in oocytes. Nat Commun. 8, (1), 1499 (2017).
ניתוח חישובית של Germline <em>Caenorhabditis elegans</em> ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gopal, S., Pocock, R. Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton. J. Vis. Exp. (134), e57702, doi:10.3791/57702 (2018).More

Gopal, S., Pocock, R. Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton. J. Vis. Exp. (134), e57702, doi:10.3791/57702 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter