Vi presenterar en automatiserad metod för tredimensionell rekonstruktion av den Caenorhabditis elegans könsceller. Vår metod bestämmer antal och placering av varje kärnan inom könsceller och analyser könsceller protein distribution och cytoskeletal struktur.
Den Caenorhabditis elegans (C. elegans) könsceller används för att studera flera biologiskt viktiga processer inklusive stamceller utveckling, apoptos och kromosom dynamics. Medan könsceller är en utmärkt modell, är analysen ofta två dimensioner på grund av tid och arbetskraft krävs för tredimensionell analys. Stora värden i sådana studier är nummer/position av kärnor och protein fördelningen inom könsceller. Här presenterar vi en metod för att utföra automatiserad analys av de könsceller med konfokalmikroskopi och beräkningsvetenskapliga metoder för att fastställa antal och placering av atomkärnor i varje region av könsceller. Vår metod analyserar också könsceller protein distribution som gör tredimensionella undersökning av proteinuttryck i olika genetiska bakgrunder. Vår studie visar vidare, variationer i cytoskeletal arkitektur i olika regioner av de könsceller som kan rymma rumsliga utvecklingsmässiga behov. Slutligen, vår metod möjliggör automatiserad inventering av spermier i spermatheca av varje könsceller. Sammantaget möjliggör vår metod snabba och reproducerbara fenotypiska analys av den C. elegans könsceller.
Bevarande av signalering vägar med däggdjur gör C. elegans en utmärkt modell att studera flera biologiska processer1,2. I vårt labb använder vi den C. elegans könsceller att studera stamceller utveckling, apoptos och genuttryck. Medan könsceller är en tredimensionell struktur, är många studier två dimensionell på grund av hur tidskrävande och arbetsintensiva tredimensionell analys. Det är mycket troligt att tvådimensionell analys kan förvränga i vivo händelser i könsceller. I C. elegans vuxen hermafrodit har två könsceller armar, som inrymmer en somatisk distala spets cell (DTC) som upprätthåller distala könsceller i en odifferentierad staten3,4. Dessa könsceller börjar skilja när de flyttar bort från DTC, flyr sitt inflytande, och bli äggceller och spermier som de når proximala ände av könsceller. Under denna process genomgå bakteriecellen atomkärnor Mitos, innan de övergår till meios5,6. Spermieproduktionen kompletteras av larvstadium 4 (L4) av utvecklingen, varefter oocyter produceras under vuxenlivet. Sperman lagras i den spermatheca där de gödslar oocyter att generera embryon.
Det finns flera genetiska och miljömässiga faktorer som kan påverka könsceller utveckling i C. elegans som resulterar i förändringar i antalet kärnor, antal apoptotiska händelser, kromosom dynamik, och proteinuttryck eller lokalisering7 ,8,9,10,11. Analysen av dessa evenemang kräver identifiering av varje etapp av differentiering baserad på kärnkraft morfologi och distribution. För att korrekt analysera dessa parametrar manuellt med en stor urvalsstorlek är arbetskrävande och tidsödande. För att kringgå dessa nackdelar och aktivera konsekvens av analys, vi utvecklat en automatiserad metod för tredimensionella undersökning av den C. elegans könsceller för kärnor räkna, kärnor distribution, proteinuttryck, och cytoskeletal struktur. Genom att kombinera konfokalmikroskopi med tredimensionell rendering, genererade vi storlek och form parametrar för identifiering av varje etapp av bakteriecellen differentiering. Denna metod gör dessutom räkna av bakteriecellen kärnor och spermier plus poängsättning av kromosom nummer i varje äggcell.
En avgörande struktur i könsceller är cytoskelettet, som ger stabilitet till könsceller fack, aids cytoplasmiska streaming och skydd till könsceller kärnor12. Använda computational rendering, vi utfört tredimensionell rekonstruktion av könsceller cytoskelettet och identifierade distinkta cytoskeletal funktioner inom könsceller. Här beskriver vi ett stegvisa protokoll för att illustrera hur beräkningsinriktad analys i kombination med confocal imaging möjliggör omfattande analys av de C. elegans könsceller.
Vi föreslår en snabb metod för tredimensionell analys av C. elegans könsceller (figur 1). Med hjälp av tredimensionell analys är det möjligt att studera tredimensionell distribution av könsceller atomkärnor (figur 2 och figur 3), automatiserad rösträkningen celler (figur 2), rekonstruktion av könsceller cellskelettet ( Figur 3), distribution av proteiner (figur 4) och scoring antalet spermier i spermatheca och kromosomer i oocyter (figur 5). Metoden inte bara möjliggör enkel och exakt kvantifiering av könsceller men identifierar fysiologiskt relevanta fenotyper.
Målet med detta protokoll är att förbättra noggrannheten och minska tiden som krävs för könsceller analys. Efter standardpreparatet av dissekerade germlines, är en tredimensionell modell av könsceller atomkärnor utarbetats av computational rendering. Samtidigt som observationen av könsceller atomkärnor fördelning i rymden, beräknar tredimensionell rendering antalet kärnor på specifika regioner i könsceller. Den kritiska faktorn i vår metod är exakt definition av storlek och form parametrar av atomkärn…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Monash Microimaging för deras tekniska support. Vissa stammar tillhandahölls av stadens Caenorhabditis genetik, som är finansierad av NIH Office infrastruktur forskningsprogram (P40 OD010440). Detta arbete stöddes av en Monash University biomedicin Discovery gemenskap, NHMRC projektbidrag (GNT1105374), NHMRC Senior Research Fellowship (GNT1137645) och veski innovation fellowship: VIF 23 till Roger Pocock.
C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
OP50 Escherichia coli bacteria | Homemade | ||
Nematode Growth Media (NGM) plates | Homemade | ||
polyclonal rabbit anti-REC-8 | SDIX | 29470002 | |
Alexa 488 conjugated antibody raised in goat | Thermofisher Scientific | A-21236 | |
Cytoskeletal dye phalloidin | Thermofisher Scientific | A-12380 | |
DAPI | Thermofisher Scientific | 62248 | |
Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P5899 | |
Tetramisol | Sigma Aldrich | P5899 | |
MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506 | |
1M HEPES buffer, pH 7.4 | Sigma Aldrich | G0887 | |
10X PBS pH 7.4 | Thermofisher Scientific | AM9625 | |
Tween-20 | Sigma Aldrich | P1389 | |
EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
37% Paraformaldehyde solution | Merck Millipore | 1040031000 | |
Normal goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
Fluoroshield fixing reagent | Sigma Aldrich | F6182 | |
Ethanol | Millipore | 1009832511 | |
Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
20°C & 25°CIncubator | Any brand | ||
Light microscope | Any brand | ||
Confocal microscope | Any brand (Leica, Zeiss) | ||
Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software. | Bitplane | ||
Phospho buffered saline, pH 7.4 | Homemade | ||
Teflon microscope slides | Tekdon | 941-322-8288 |