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Bioengineering

उंनत सामग्री के रोगाणुरोधी लक्षण वर्णन के लिए इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों

Published: August 4, 2018 doi: 10.3791/57710
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Facultad de Veterinaria y Ciencias Experimentales, Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir
* These authors contributed equally

Summary

हम उन्नत सामग्री के रोगाणुरोधी लक्षण वर्णन के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद. यहां, सामग्री सतहों पर रोगाणुरोधी गतिविधि दो तरीकों कि एक दूसरे के पूरक द्वारा मापा जाता है: एक आगार डिस्क प्रसार परीक्षण पर आधारित है, और अंय आईएसओ 22196:2007 आदर्श पर आधारित एक मानक प्रक्रिया है ।

Abstract

बढ़ाया संपत्तियों के साथ नए उंनत सामग्री के विकास और अधिक और इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला में अधिक महत्वपूर्ण होता जा रहा है । इस प्रकार, कई उपंयास जैव सामग्री ऐसे ऊतक इंजीनियरिंग और नियंत्रित दवा वितरण के रूप में बायोमेडिकल अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक विशिष्ट वातावरण नकल डिजाइन किया जा रहा है । कोशिकाओं या एंजाइमों के स्थिरीकरण के लिए बेहतर गुणों के साथ सामग्री के विकास में भी एक मौजूदा अनुसंधान विषय है प्रक्रिया इंजीनियरिंग. हालांकि, इन आवेदनों में एक सामग्री के सबसे वांछित गुणों में से एक रोगाणुरोधी क्षमता किसी भी अवांछनीय संक्रमण से बचने के लिए है । इस के लिए, हम आसानी से वर्तमान (i) के आधार पर सामग्री के रोगाणुरोधी लक्षण वर्णन के लिए प्रोटोकॉल का पालन करें डिस्क प्रसार परीक्षण (प्रसार विधि) और (ii) आईएसओ 22196:2007 आदर्श सामग्री सतहों पर रोगाणुरोधी गतिविधि को मापने के लिए (संपर्क विधि) । यह प्रोटोकॉल सूक्ष्मजीवों की एक विस्तृत रेंज को कवर करने के लिए ग्राम पॉजिटिव और ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया और खमीर का उपयोग किया जाना चाहिए । एक उदाहरण के रूप में, विभिंन रासायनिक प्रकृति के साथ 4 सामग्री Staphylococcus aureus, ई कोलाई, और Candida albicansके खिलाफ इस प्रोटोकॉल के बाद परीक्षण कर रहे हैं । इन परीक्षणों के परिणाम पहली सामग्री के लिए गैर रोगाणुरोधी गतिविधि प्रदर्शन और अन्य 3 सामग्री के लिए ग्राम सकारात्मक और ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया के खिलाफ जीवाणुरोधी गतिविधि में वृद्धि. हालांकि, 4 सामग्री में से कोई भी Candida albicansके विकास को बाधित कर रहे हैं ।

Introduction

प्रत्यारोपण विफलता अक्सर रोगाणुरोधी प्रोफिलैक्सिस और अपूतित काम कर रहे स्थितियों के बावजूद होते हैं कि माइक्रोबियल संक्रमण का एक परिणाम है । यह समस्या बहुत उच्च स्वास्थ्य देखभाल लागत पैदा कर रहा है और1रोगियों के बीच चिंताजनक है । महत्वपूर्ण बैक्टीरिया जैसे Staphylococcus aureus वर्तमान में बहुत ही खतरनाक रोगजनकों और अन्य चिकित्सा प्रत्यारोपण के साथ जुड़े nosocomial संक्रमण में रोगज़नक़ों माना जाता है और चिकित्सा उपकरणों के मुख्य संदूषणों रहे हैं2. इसलिए, उपंयास रोगाणुरोधी रणनीतियों के विकास तत्काल दोनों दैनिक और चिकित्सा का उपयोग करता है के लिए आवश्यक है ।

रोगाणुरोधी एजेंटों एंटीबायोटिक दवाओं3, चतुर्धातुक अमोनियम यौगिकों4, धातु आयनों/आक्साइड5, और रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स (AMPs)6शामिल हैं । एंटीबायोटिक बैक्टीरिया प्रतिरोध के कारण कम कुशल होते हैं,जो एंटीबायोटिक अति8के बढ़ने पर होता है । चतुर्धातुक अमोनियम यौगिकों केवल माइक्रोबियल प्रतिरोध9की वजह से एक अल्पकालिक उपयोग के लिए बहुत ही कुशल हैं । धातु आयनों/आक्साइड लंबे समय के रूप में बहुत प्रभावी रोगाणुरोधी एजेंटों का उपयोग किया गया है और पट्टियों, पानी फिल्टर, पेंट, आदि10,11,12सहित कई आम वाणिज्यिक उत्पादों में उपयोग किया जाता है । हालांकि, यह प्रदर्शित किया गया है कि यौगिकों के इन प्रकार के स्तनधारी कोशिकाओं के कुछ प्रकार के लिए विषाक्त किया जा सकता है13.

AMPs उत्कृष्ट रोगाणुरोधी और इम्यूनोमॉड्यूलेटरी गुण दिखाएँ14,15, और बैक्टीरिया उन्हें16के खिलाफ एक प्रतिरोध विकसित करने के लिए बहुत मुश्किल लगता है लगता है. हालांकि, शुद्ध AMPs का उत्पादन करने की प्रक्रिया महंगी है; इसलिए, बड़े पैमाने पर उत्पादन व्यवहार्य नहीं है । इस प्रकार, रणनीतियों का उत्पादन AMPs में समस्याओं का मुकाबला करने के लिए विकसित किया गया है (जैसे, छोटे आणविक जीवाणुरोधी peptoid नकल17, peptoids18, α-पेप्टाइड्स19 और β-पेप्टाइड्स20). Methacrylate-समाप्त polypeptides और polypeptoids रोगाणुरोधी और antifouling कोटिंग्स के लिए संश्लेषित किया गया है21.

ऐसे शुद्ध या संकर रूप में उंनत सामग्री के रूप में नए रोगाणुरोधी एजेंटों के विकास, को रोकने और बहुऔषध प्रतिरोधी संक्रमण के इलाज में सक्षम है, तेजी से आवश्यक है । कई ऐसे ऊतक और जैव प्रक्रिया इंजीनियरिंग के रूप में इंजीनियरिंग क्षेत्रों के लिए नई उंनत सामग्री का एक व्यापक रेंज पिछले दशकों में सुधार रासायनिक और भौतिक संपत्तियों के साथ कई तरीकों के माध्यम से विकसित किया गया है: प्लाज्मा-बहुलकीकरण पर भ्रष्टाचार एक hydrophobic सब्सट्रेट22,23,24, crosslinking घनत्व की सिलाई25,26, बहुलकीकरण समाधान में27,28,29 , 30, porogen विघटन31,३२, और मैटीरियल्स के निगमन जैसे ग्राफीन ऑक्साइड (GO)३३,३४,३५,३६ और द्वारा कार्बन nanofibers (CNFs)३७.

इन नई सामग्रियों की रोगाणुरोधी क्षमता का अध्ययन तेजी से उनके संभावित इंजीनियरिंग प्रयोज्यता में वृद्धि कर सकता है और है, इसलिए, आवश्यक हो गया है । हम एक आसान करने के लिए पालन करने के लिए इस तरह के नए उन्नत सामग्री के रोगाणुरोधी गतिविधि यों तो प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. यहां, नमूना तैयार करने के बाद, दो पूरक तरीकों का पालन कर रहे हैं: पहला आगार डिस्क प्रसार परीक्षण३८ (प्रसार विधि) पर आधारित है और दूसरा आईएसओ 22196:2007 नॉर्म३९ पर रोगाणुरोधी गतिविधि को मापने पर आधारित है सामग्री सतहों (संपर्क विधि) ।

Protocol

1. नमूना तैयारी

  1. एक 10 मिमी व्यास बेलनाकार पंच के साथ 10 मिमी व्यास डिस्क में सामग्री के नमूनों में कटौती ।
    नोट: भंगुर सामग्री 1 घंटे के लिए उपयुक्त बाँझ सॉल्वैंट्स में नरम किया जा सकता है और फिर डिस्क में कटौती । उदाहरण के लिए, जस्ता alginate के रूप में हाइड्रोफिलिक सामग्री इस प्रोटोकॉल के बाद परीक्षण किया गया और उंहें काटने से पहले autoclaved पानी में गीला कर रहे थे ताकि नमूना तोड़ने से बचने के लिए । हालांकि, पॉली (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) जैसे अन्य hydrophobic सामग्रियों में किसी भी तरह की पिछली सूजन की जरूरत नहीं है ताकि ठीक से कटौती की जा सके ।
  2. ६० ° c में एक वैक्यूम ओवन (< 10-2 Torr) में 24 घंटे के लिए नमूना सामग्री डिस्क को सुखाएं ।
    नोट: कुछ सामग्री एक उच्च सुखाने तापमान की आवश्यकता हो सकती है । हालांकि, यह एक तापमान है कि थर्मल सामग्री नीचा कर सकता तक पहुंचने के लिए महत्वपूर्ण नहीं है ।
  3. उपाय सामग्री फिल्म एक डिजिटल कैलिपर के साथ मोटाई ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल जब विभिन्न सामग्रियों की रोगाणुरोधी गतिविधि की तुलना लगातार और इसी तरह की मोटाई के साथ सामग्री फिल्मों के उपयोग की सिफारिश की.
  4. प्रत्येक पक्ष प्रति 1 घंटे के लिए 10 मिनट और बाद में पराबैंगनी (यूवी) विकिरण के लिए ७०% इथेनॉल में विसर्जन द्वारा प्रत्येक नमूना निष्फल ।
    नोट: यूवी विकिरण यूवी-सी विकिरण के एक १२.० डब्ल्यू चिराग के साथ एक लामिना प्रवाह हुड के अंदर एक बाँझ पेट्री डिश में प्रत्येक नमूना रखने प्रदर्शन किया जा सकता है ।
    चेतावनी: शोधकर्ताओं ने खुद को उजागर नहीं करना चाहिए यूवी विकिरण, क्योंकि यह mutagenic है.
  5. १.१, १.२, १.३ और १.४ चरण निष्पादित करें । नियंत्रण सामग्री डिस्क के साथ ।
    नोट: पॉलीथीन terephthalate (पीईटी) या वैकल्पिक गैर रोगाणुरोधी सामग्री प्रसार और संपर्क विधि में नियंत्रण डिस्क के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, जब निस्र्पक नैनोकंपोजिट या इलाज सामग्री, आधार सामग्री नियंत्रण सामग्री के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।

2. अनुशंसित सूक्ष्मजीवों

नोट: हम सूक्ष्मजीवों की एक विस्तृत श्रृंखला के खिलाफ परीक्षण सामग्री की रोगाणुरोधी क्षमता का अध्ययन करने के लिए 3 अलग सूक्ष्मजीवों के उपयोग की सलाह देते हैं ।

  1. 3 सूक्ष्मजीवों की शुद्ध संस्कृतियों का प्रयोग करें: ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया Staphylococcus aureus, ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया ई कोलाई, और खमीर Candida albicans।
    नोट: अन्य सूक्ष्मजीवों प्रजातियों को भी यदि आवश्यक हो तो गर्मी की स्थिति को संशोधित करके इस प्रोटोकॉल के साथ परीक्षण किया जा सकता है ।
    चेतावनी: आवश्यक सुरक्षा मापन इस प्रोटोकॉल में कार्यरत सूक्ष्मजीवों के प्रकार के अनुसार पीछा किया जाना चाहिए ।
  2. पूर्व बाँझ या autoclaved सामग्री के साथ काम और माइक्रोबियल हेरफेर या एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट की पूरी प्रक्रिया के दौरान एक Bunsen बर्नर का उपयोग करें (यदि आवश्यक हो) अपूतित शर्तों को सुनिश्चित करने के लिए ।
    नोट: अनुशंसित आटोक्लेव शर्तों के दौरान १२१ ° c संस्कृति माध्यमों के लिए 15 मिनट और १२१ ° c कार्य सामग्री और जैविक अवशेषों के लिए 20 मिनट के दौरान कर रहे हैं ।

3. आगर डिस्क प्रसार परीक्षण (प्रसार विधि)

नोट: जब रोगाणुरोधी यौगिकों के एक तरल प्रसार उन्नत सामग्री के मुख्य रोगाणुरोधी तंत्र हो सकता है, प्रसार विधि इन सामग्रियों की रोगाणुरोधी क्षमता के बारे में बहुत ही उपयोगी जानकारी प्रदान कर सकते हैं. सामग्री आगर प्लेट के केंद्र में स्थित डिस्क एक पारदर्शी अंगूठी क्षेत्र (हेलो) जहां सूक्ष्मजीवों के विकास निषेध के बाद होता है फार्म कर सकते है संस्कृति के 24 ज ( चित्रा 1देखें) ।

  1. प्रसार परीक्षण प्रक्रिया
    1. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए तैयार और आटोक्लेव tryptic सोया आगार (TSA) ।
    2. एक Bunsen बर्नर या एक लामिना प्रवाह हूड का उपयोग अपूतित शर्तों के तहत बाँझ पेट्री व्यंजन में TSA डालो ।
      नोट: TSA प्लेटें 4-6 मिमी मोटी होना चाहिए ।
    3. संस्कृति विभिन्न सूक्ष्मजीवों के लिए एरोबिक का परीक्षण किया जा 18 – पेट्री व्यंजन में 24 घंटे एक मशीन में TSA के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर.
    4. तैयार और आटोक्लेव tryptic सोया शोरबा (TSB) निर्माता के निर्देशों का पालन ।
    5. एक Bunsen बर्नर या एक लामिना प्रवाह हूड का उपयोग अपूतित शर्तों के तहत एक पूर्व निष्फल सीरम वैज्ञानिक पिपेट के साथ एक ५० मिलीलीटर पूर्व निष्फल केंद्रापसारक ट्यूब में TSB डालो ।
    6. एक बाँझ कपास झाड़ू का उपयोग कर और एक समान मिश्रण को प्राप्त करने के लिए उन्हें 1 मिनट के लिए भंवर में निहित TSB के 25 मिलीलीटर में कदम 3.1.3 से कुछ कालोनियों resuspend ।
    7. (५४० एनएम पर) एक spectrophotometer के साथ संस्कृति के उपयुक्त संख्या के लिए (CFU) प्रति मिलीलीटर इकाइयों को समायोजित करें: लगभग १.५ x 108 CFU/एमएल बैक्टीरिया के लिए और 1 x 106 से 5 x 106 CFU/
      ध्यान दें: संस्कृति और cuvette मात्रा अवशोषण को मापने के लिए उपयोग किया spectrophotometer के प्रकार के अनुसार चुना जाना चाहिए ।
    8. भंवर सूक्ष्मजीवों फैलाव में सुधार करने के लिए 5 सेकंड के लिए माइक्रोबियल शोरबा और संक्षेप में इस माइक्रोबियल निलंबन में एक बाँझ कपास झाड़ू जलमग्न । यह संस्कृति युक्त ट्यूब दीवार के खिलाफ दबाकर झाड़ू से तरल की अतिरिक्त निकालें ।
    9. समान रूप से 3 विमानों में TSA प्लेटों की सतह पर बाँझ कपास झाड़ू के साथ माइक्रोबियल शोरबा निलंबन के साथ सूक्ष्मजीवों के साथ उनकी पूरी सतह को कवर और इसे टीका के बाद 5 मिनट के लिए सूखी ।
      नोट: किसी भी नमी को दूर करने के लिए, TSA प्लेटों ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक औंधा स्थिति में खुला रखा जाना चाहिए टीका से पहले 10-15 मिनट के लिए ।
    10. उंहें इथेनॉल ९६% के साथ एक चोंच में डुबो और फिर उंहें एक Bunsen बर्नर या शराब बर्नर के साथ ज्वलंत द्वारा चिमटी की एक जोड़ी निष्फल ।
    11. नमूना डिस्क प्लेस के लिए परीक्षण किया और TSA प्लेटों बाँझ चिमटी की जोड़ी का उपयोग कर के केंद्र में डिस्क नियंत्रण ।
    12. 24 ज के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक औंधा स्थिति में एरोबिक्स TSA प्लेटें ।
      नोट: आदेश में किसी भी संक्रमण जोखिम से बचने के लिए, यह एक औंधा स्थिति में TSA प्लेटों की मशीन के लिए सिफारिश की है । हालांकि, यदि नमूना डिस्क TSA प्लेट्स से अलग है, एक औंधा स्थिति में इस कदम का प्रदर्शन नहीं करते । इस मामले में, यह लामिना फ्लो हूड में प्लेटें सूखी सिफारिश की है । इस रोगाणुरोधी परीक्षण reproducibility सुनिश्चित करने के लिए विभिन्न दिनों पर कम से quadriplicate में प्रदर्शन किया जाना चाहिए.
  2. माइक्रोबियल निलंबन एकाग्रता और पवित्रता की जांच
    नोट: निम्न चरणों का पालन करने के लिए जाँच करने के लिए आवश्यक हैं कि माइक्रोबियल एकाग्रता चरण 3.1.7 में spectrophotometer के साथ निर्धारित सही है और यह सुनिश्चित करें कि वहाँ कोई माइक्रोबियल पर्यावरण संदूषण था. एक माइक्रोबियल पर्यावरण संदूषण की संस्कृति के 24 ज के बाद माइक्रोबियल कालोनियों के विभिंन प्रकार की उपस्थिति से आसानी से पता लगाया जा सकता है । इसके अलावा, दशमलव सीरियल कमजोर पड़ने में इसके हेरफेर के दौरान TSB माध्यम की कोई माइक्रोबियल संदूषण एक नकारात्मक TSB नियंत्रण प्लेट के साथ सुनिश्चित किया जाना चाहिए ।
    1. बाँझ TSB वितरण (कदम 3.1.4 में तैयार) बाँझ microcentrifuge ट्यूबों में autoclaved स्थितियों में उपयुक्त अपूतित सुझावों के साथ एक micropipette का उपयोग कर. उनमें से एक एक नकारात्मक TSB नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाएगा ।
    2. TSB युक्त बाँझ microcentrifuge ट्यूबों में कदम 3.1.9 में उपयोग माइक्रोबियल शोरबा निलंबन के साथ दशमलव सीरियल कमजोर पड़ने प्रदर्शन करते हैं ।
    3. फैले एक पूर्व निष्फल Drigalski रंग या एक वैकल्पिक साधन का उपयोग कर TSA प्लेटों पर प्रत्येक कमजोर पड़ने के १०० µ एल । इसके अलावा सूक्ष्मजीवों के बिना TSB मध्यम के १०० μL फैला (चरण 3.2.1 में तैयार) एक TSA प्लेट पर एक नकारात्मक TSB नियंत्रण प्लेट के रूप में ।
    4. मशीन एरोबिक्स TSA 24 घंटे के लिए ३७ ° c पर एरोबिक्स प्लेटें ।
    5. CFU/mL चरण 3.1.7 में निर्धारित करने के लिए समान है कि जांच करने के लिए कालोनियों की संख्या की गणना करें ।
    6. जांच करें कि वहां कालोनियों के केवल एक प्रकार के साथ TSA प्लेटों पर कोई माइक्रोबियल पर्यावरण संदूषण है ।
    7. जांच करें कि कोई माइक्रोबियल संक्रमण TSB नकारात्मक नियंत्रण प्लेट पर कोई कालोनियों दिखा रहा है

4. सामग्री सतहों पर रोगाणुरोधी गतिविधि की माप (संपर्क विधि)


नोट: जब सतह से संपर्क कुछ उन्नत सामग्री के मुख्य रोगाणुरोधी तंत्र हो सकता है, संपर्क विधि इन सामग्रियों की रोगाणुरोधी क्षमता के बारे में बहुत ही उपयोगी जानकारी प्रदान कर सकते हैं. इस विधि में, सूक्ष्मजीवों सीधे सामग्री की सतह पर रखा जाता है और उनके विकास निषेध समय की एक निश्चित राशि के बाद निर्धारित किया जा सकता है ।

  1. प्रारंभिक प्रक्रिया
    1. तैयार करें और निर्माता के निर्देशों का पालन TSB आटोक्लेव ।
    2. एक Bunsen बर्नर या एक लामिना प्रवाह हूड का उपयोग अपूतित शर्तों के तहत एक पूर्व निष्फल सीरम वैज्ञानिक पिपेट के साथ एक ५० मिलीलीटर पूर्व निष्फल केंद्रापसारक ट्यूब में TSB डालो ।
    3. संस्कृति विभिन्न सूक्ष्मजीवों के लिए एक कक्षीय शेखर में TSB के साथ ट्यूब में रात भर एरोबिक परीक्षण किया जा करने के लिए (१४० rpm) ३७ डिग्री सेल्सियस पर.
    4. लगभग 106 CFU/एमएल (५४० एनएम पर एक spectrophotometer के साथ निर्धारित) की एकाग्रता के लिए एक ५० मिलीलीटर पूर्व निष्फल केंद्रापसारक ट्यूब में TSB के 20 मिलीलीटर में रातोंरात संस्कृति को पतला ।
      ध्यान दें: संस्कृति और cuvette मात्रा अवशोषण को मापने के लिए उपयोग किया spectrophotometer के प्रकार के अनुसार चुना जाना चाहिए ।
    5. TSB युक्त बाँझ microcentrifuge ट्यूबों में इस संस्कृति के दशमलव धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रदर्शन करते हैं । प्रसार १०० TSA प्लेटों पर संस्कृति के µ एल और यह एरोबिक्स गर्मी ३७ ° c पर 24 घंटे के लिए ।
    6. लगभग 1 x 106 CFU/एमएल के एक प्रारंभिक कोशिका एकाग्रता सुनिश्चित करने के लिए कालोनियों की संख्या की गणना
    7. माइक्रोबियल गिनती के लिए 4 नियंत्रण डिस्क प्लेस के बाद 24 एच और 4 एक बाँझ ४८-अच्छी तरह से थाली के अलग कुओं में 24 एच के बाद माइक्रोबियल गिनती के लिए परीक्षण सामग्री के प्रत्येक प्रकार के नमूना डिस्क ।
    8. प्रत्येक डिस्क की सतह पर माइक्रोबियल निलंबन के पिपेट १५० µ एल ।
  2. नियंत्रण और परीक्षण सामग्री पर माइक्रोबियल गिनती (24 घंटे के बाद)
    1. कदम 4.1.6 के बाद, एरोबिक्स 4 नमूना ४८-अच्छी तरह से प्लेट में शेष 24 घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
      नोट: यह 24 एच मशीन समय कम या ज्यादा समय में विकास निषेध का अध्ययन करने के क्रम में संशोधित किया जा सकता है ।
    2. मशीन के 24 ज, 4 नमूना डिस्क की सतह पर बाँझ पंजाबियों के पिपेट ८५० µ l के बाद और यह माइक्रोबियल निलंबन के १५० µ एल के साथ मिश्रण ।
    3. ४८-अच्छी तरह से थाली से पंजाब/माइक्रोबियल निलंबन मिश्रण और प्रत्येक डिस्क ले लीजिए और उंहें एक 10 मिलीलीटर पूर्व निष्फल ट्यूब के लिए स्थानांतरण ।
    4. भंवर पंजाब/माइक्रोबियल निलंबन मिश्रण और 1 मिनट के लिए प्रत्येक डिस्क, यह 5 मिनट के लिए ५० हर्ट्ज पर sonicate और यह फिर से 1 मिनट के लिए यह सुनिश्चित करें कि कोई व्यवहार्य सूक्ष्मजीवों सामग्री की सतह का पालन रहने के लिए ।
    5. TSB युक्त बाँझ microcentrifuge ट्यूबों में प्रत्येक sonicated संस्कृति के दशमलव सीरियल कमजोरियां प्रदर्शन और TSA प्लेटों पर संस्कृति के १०० µ एल प्रसार और यह एरोबिक ३७ डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए ।
    6. कालोनियों की संख्या की गणना, जो प्रत्येक नमूने और नियंत्रण डिस्क सतह पर व्यवहार्य सूक्ष्मजीवों की संख्या रहे हैं । (CFU/एमएल) में व्यवहार्य कोशिकाओं की इस संख्या को व्यक्त करते हैं ।
    7. नमूना और नियंत्रण डिस्क के लिए अंतिम माइक्रोबियल संस्कृति की एक तस्वीर ले लो ।

5. रोगाणुरोधी परिणाम विश्लेषण

Figure 1
चित्रा 1: रोगाणुरोधी "हेलो" की सामान्यीकृत चौड़ाई के लिए माप. इस पैनल को निषेध क्षेत्र (डीiz) और डिस्क व्यास (डी) के व्यास से पता चलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. प्रसार विधि परिणाम विश्लेषण
    1. निषेध क्षेत्र (डीiz) और डिस्क व्यास (डी) के व्यास को मापने ( चित्रा 1देखें) एक डिजिटल कैलिपर के साथ ।
      नोट: निषेध क्षेत्र या रोगाणुरोधी "हेलो" रोगाणुरोधी सामग्री डिस्क द्वारा उत्पादित माइक्रोबियल विकास निषेध का एक परिणाम के रूप में गठन किया है ( चित्रा 1देखें). यह देखने के लिए संभव है कि वहाँ एक पारदर्शी अंगूठी क्षेत्र है जहां सूक्ष्मजीवों ठीक से बड़े हो गए हैं प्लेट के बाकी के साथ तुलना में नमूने के लिए बंद (अपारदर्शी क्षेत्र).
    2. (1) समीकरण लागू करने के द्वारा प्रत्येक डिस्क के रोगाणुरोधी"हेलो" () की सामान्यीकृत चौड़ाई निर्धारित करें ।
      1Equation 1
    3. प्रत्येक नमूने के 4 निर्धारित किया गया है के साथ "हेलो" रोगाणुरोधी की सामान्यीकृत चौड़ाई का मतलब है और मानक विचलन निर्धारित करें ।
    4. सामग्री डिस्क के साथ अंतिम माइक्रोबियल संस्कृति की एक तस्वीर ले लो ।
      नोट: निषेध क्षेत्र (डीiz) और डिस्क व्यास (डी) के व्यास भी एक उपयुक्त छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके कदम 5.1.4 में लिया तस्वीर से मापा जा सकता है ।
  2. संपर्क विधि परिणाम विश्लेषण
    1. समीकरण (2) के अनुसार बरामद व्यवहार्य सूक्ष्मजीवों की संख्या निर्धारित करें ।
      2Equation 2
      नोट: यहां, N व्यवहार्य सूक्ष्मजीवों के प्रति परीक्षण नमूना प्रति सेमी2 बरामद की संख्या है; सी प्लेट गिनती है; D कमजोर पड़ने का कारक है; एक सेमी2 नमूना डिस्क व्यास के साथ निर्धारित में परीक्षण नमूना की सतह क्षेत्र है ।
    2. व्यवहार्यता की हानि (एल. वी.) का निर्धारण करने के लिए समीकरण लागू करने से सेल के विकास के निषेध को प्रतिबिंबित (3) ।
      3Equation 3
      नोट: यहां, सी CFU/एमएल • सेमी2, 24 ज के बाद नियंत्रण नमूनों से बरामद में व्यवहार्य सूक्ष्मजीवों (N) की औसत संख्या है; एस CFU/एमएल • सेमी2, 24 एच के बाद परीक्षण नमूनों से बरामद में व्यवहार्य सूक्ष्मजीवों (N) की संख्या है ।
    3. प्रत्येक नमूने के 4 निर्धारित LV (%) मूल्यों के साथ व्यवहार्यता की हानि के माध्य और मानक विचलन निर्धारित करें ।

Representative Results

Staphylococcus aureus, ई कोलाई, और Candida albicans : इस प्रोटोकॉल, एक उदाहरण के रूप में, 3 अनुशंसित सूक्ष्मजीवों के खिलाफ विभिन्न रासायनिक प्रकृति के साथ 4 सामग्री की रोगाणुरोधी क्षमता का परीक्षण करने के लिए नियोजित किया गया था . आगर डिस्क प्रसार परीक्षण (प्रसार विधि) के परिणाम के रूप में यह नियंत्रण डिस्क (सी, छवि नहीं दिखाया गया) और ग्राम पॉजिटिव और चना-नकारात्मक के खिलाफ जीवाणुरोधी गतिविधि में वृद्धि हुई पहले सामग्री (M1) के लिए गैर रोगाणुरोधी गतिविधि का प्रदर्शन अन्य 3 सामग्री M2 के लिए बैक्टीरिया, एम 3 और M4 ( चित्रा 2देखें).

Figure 2
चित्रा 2: रोगाणुरोधी प्रसार विधि परिणाम. इस पैनल 4 सामग्री (M1, M2, एम 3, और M4) डिस्क (10 मिमी व्यास x 1 मिमी मोटाई) के खिलाफ aureus और ई. कोलाई के बाद के लिए रोगाणुरोधी प्रसार विधि से पता चलता है 24 मशीन के एच । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चित्रा 3 अलग उदाहरण सामग्री एम 1, M2, एम 2, और ग्राम पॉजिटिवऔरग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया (1) के साथ की गणना के खिलाफ एम 4 के लिए रोगाणुरोधी "हेलो" () के विभिंन सामान्यीकृत चौड़ाई दिखाता है । हालांकि, 4 सामग्री में से कोई भी खमीर Candida albicans के विकास को बाधित कर रहे थे (नहीं दिखाया छवियां) ।

Figure 3
चित्रा 3: रोगाणुरोधी प्रसार "हेलो" परिणाम. इस पैनल के सामान्यीकृत "हेलो" ((M1,M2, एम 3, और M4) डिस्क (10 मिमी व्यास x 1 मिमी मोटाई) के खिलाफ aureus और ई. कोलाई के लिए प्रत्येक सामग्री के लिए ( अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण है (p < 0.01) । हालांकि, नमूना M1 कोई रोगाणुरोधी गतिविधि प्रदर्शित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

संपर्क विधि के परिणाम भी पहले सामग्री (M1) के लिए गैर रोगाणुरोधी गतिविधि का प्रदर्शन के रूप में यह नियंत्रण डिस्क में हुई (सी) और Grampositive और ग्राम के खिलाफ जीवाणुरोधी गतिविधि में वृद्धि-अन्य 3 सामग्री के लिए नकारात्मक बैक्टीरिया (देखें चित्रा 4) ।

Figure 4
चित्रा 4: रोगाणुरोधी संपर्क विधि परिणाम. इस पैनल के संबंधित ९० मिमी प्लेटों से पता चलता है 4 सामग्री (एम 1, M2, एम 3, और M4) सतह रोगाणुरोधी गतिविधि परख के अनुसार आईएसओ 22196:2007 के बाद 24 एस aureus और ई. कोलाई के लिए मशीन के (कमजोर पड़ने फैक्टर 10-4). सी व्यवहार्य बैक्टीरिया नियंत्रण डिस्क से बरामद करने के बाद 24 मशीन के एच है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

व्यवहार्यता की हानि (%) समीकरण द्वारा निर्धारित किया गया था (2) और (3) इस प्रोटोकॉल में संकेत के रूप में ( चित्रा 5देखें) ।

Figure 5
चित्रा 5: संपर्क विधि द्वारा व्यवहार्यता की हानि । इस पैनल की व्यवहार्यता के नुकसान से पता चलता है (%) एम 1, M2, एम 3 के लिए, और एस aureus और ई. के खिलाफ M4 सामग्री सतहों पर कोलाई । नमूना M1 कोई रोगाणुरोधी गतिविधि का प्रदर्शन किया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

हालांकि, 4 सामग्री में से कोई भी संपर्क विधि द्वारा खमीर Candida albicans के विकास को बाधित कर रहे थे (चित्र नहीं दिखाया गया है) । इसलिए, इन 4 उंनत सामग्री के 3 ग्राम सकारात्मक और ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया के खिलाफ सकारात्मक रोगाणुरोधी परिणाम दिखाया और इस प्रकार उच्च जीवाणुरोधी गतिविधि आवश्यकताओं के साथ कई इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए बहुत उपयोगी हो सकता है । हालांकि, 4 सामग्री में से कोई भी खमीर विकास को बाधित कर रहे थे ।

Discussion

नई उन्नत सामग्री के रोगाणुरोधी गतिविधि 2 मौजूदा तरीकों के आधार पर २ पूरक प्रक्रियाओं से मिलकर इस आसान करने के लिए पालन प्रोटोकॉल द्वारा विश्लेषण किया जा सकता: आगर डिस्क प्रसार परीक्षण३८ और रोगाणुरोधी गतिविधि पर मापा सामग्री आईएसओ 22196:2007 नॉर्म३९के अनुसार सतहों ।

इस शोध के क्षेत्र में, रोगाणुरोधी परीक्षणों के कई साहित्य में रिपोर्ट उच्च परख पर निर्भर हैं । इसलिए, यह बहुत महत्वपूर्ण है प्रयोगशालाओं में जगह में विस्तृत और सुसंगत प्रोटोकॉल है । यह लेख उस दिशा में एक कदम है । इसके अलावा, यह बहुत शोधकर्ताओं जो कम इस क्षेत्र में अनुभवी है और आवश्यकता में गहराई, कदम दर कदम प्रक्रियाओं सटीक परिणामों के लिए पालन करने के लिए बहुत उपयोगी हो सकता है ।

इस प्रोटोकॉल 10 मिमी व्यास के डिस्क आकार में कटौती सामग्री के कई प्रकार के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है । भंगुर सामग्री 1 एच के लिए एक उपयुक्त विलायक में सूजन को काटने की प्रक्रिया को आसान प्रदान कर सकते हैं । इस प्रकार, alginates के रूप में हाइड्रोफिलिक सामग्री autoclaved आसुत जल में हाइड्रेटेड किया जा सकता है । ऐसे इथेनॉल, कीटोंन के रूप में अंय सॉल्वैंट्स, और dichloromethane, उंहें काटने से पहले 1 एच के लिए hydrophobic सामग्री प्रफुल्लित करने के लिए नियोजित किया जा सकता है । हालांकि, कुछ सामग्रियों जैसे पॉली (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) में सूजन होने की जरूरत नहीं है और उन्हें सीधे काटा जा सकता है । उसके बाद, यह बहुत महत्वपूर्ण है एक वैक्यूम ओवन में नमूना सामग्री डिस्क सूखी और 1 के लिए इथेनॉल और यूवी विकिरण के साथ प्रत्येक नमूना निष्फल किसी भी संदूषण जोखिम से बचने के लिए ।

इस प्रोटोकॉल की सिफारिश TSA और संस्कृति मीडिया के रूप में TSB और 3 सूक्ष्मजीवों की शुद्ध संस्कृतियों का उपयोग करने के लिए सूक्ष्मजीवों की एक विस्तृत रेंज तक पहुंचने: ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया Staphylococcus aureus, ग्राम नकारात्मक जीवाणु ई कोलाई, और खमीर Candida albicans। हालांकि, वैकल्पिक संस्कृति मीडिया और विभिंन गर्मी की स्थिति की जरूरत में अंय सूक्ष्मजीवों भी इस प्रोटोकॉल के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है । कई बार, केवल 1 सूक्ष्मजीवों के लिए एक नई सामग्री के रोगाणुरोधी गतिविधि का एक प्रारंभिक विचार है परीक्षण किया है ।

सूक्ष्मजीवों की सिफारिश की 3 विभिंन प्रकार के खिलाफ मजबूत रोगाणुरोधी गतिविधि दिखा सामग्री भी एंटीबायोटिक के खिलाफ परीक्षण किया जाना चाहिए प्रतिरोधी रोगजनकों जैसे methicillin प्रतिरोधी Staphylococcus epidermidis (MRSE), जो सफलतापूर्वक इस प्रोटोकॉल के साथ उपयोग किया गया है । अन्य महत्वपूर्ण दवा प्रतिरोधी सूक्ष्मजीवों जो ज्यादा चिंता का कारण बन रहे हैं ग्राम पॉजिटिव methicillin प्रतिरोधी Staphylococcus aureus (MRSA) और vancomycin प्रतिरोधी Enterococci (VRE), और चना-नकारात्मक Pseudomonas aeruginosa४०,४१.

इस प्रोटोकॉल के साथ इस तरह के वायरस और परजीवी के रूप में सूक्ष्मजीवों के अंय प्रकार के खिलाफ सामग्री की एक फिल्म निषेध और रोगाणुरोधी गतिविधि का परीक्षण नहीं किया जा सकता । हालांकि, इस प्रोटोकॉल एक नई उंनत सामग्री के एक रोगाणुरोधी अध्ययन के लिए एक बहुत ही उपयोगी प्रारंभिक बिंदु प्रदान करता है ।

रोगाणुरोधी आगार डिस्क प्रसार परीक्षण में, एक महत्वपूर्ण कदम है जब नमूना डिस्क प्लेट के केंद्र में रखा जाना है क्योंकि कुछ सामग्री के रूप में जल्द ही गुना के रूप में वे आगार मीडिया के साथ संपर्क में मिलता है । इस मामले में, यह सावधानी से नमूना खुलासा करने के लिए चिमटी की एक बाँझ जोड़ी का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है । दूसरी ओर, संपर्क विधि में, यह है कि कोई व्यवहार्य सूक्ष्मजीवों सामग्री के लिए पालन सुनिश्चित करने के क्रम में उन्हें चार बार एक जोरदार भंवर और sonication द्वारा पीछा pipetting द्वारा पंजाबियों के साथ बहुत अच्छी तरह से नियंत्रण और नमूना डिस्क धोने के लिए महत्वपूर्ण है सतह.

इस वीडियो प्रोटोकॉल जैसे कई इंजीनियरिंग के अनुप्रयोगों में उपयोग किया जा सकता है, जैसे कि, इंजीनियरिंग, टिशू इंजीनियरिंग, नियंत्रित दवा वितरण, पैकेजिंग सामग्री, अपशिष्ट जल उपचार, और कृषि, जो एक उच्च के साथ उपयोग करता है वांछनीय रोगाणुरोधी क्षमता ।

इस प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त परिणामों गुणात्मक (छवियों) और मात्रात्मक (जीवाणुरोधी "हेलो" और व्यवहार्यता की हानि की सामान्यीकृत चौड़ाई) अपनी reproducibility का एक अच्छा विश्लेषण के साथ कर रहे हैं (± मानक विचलन मतलब) । जब विभिंन सामग्रियों की तुलना, ये मतलब प्रसार और संपर्क विधि परिणाम विश्लेषण के साथ प्राप्त मूल्यों को एक तरह से ANOVA द्वारा विश्लेषण किया जाना चाहिए, तुर्की के पोस्ट हॉक विश्लेषण के बाद, ताकि अध्ययन के लिए अगर वे कर रहे हैं, सांख्यिकीय, काफी भिंन (p < 0.01) ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक 2017-231-001UCV और 2018-231-001UCV अनुदान के माध्यम से इस काम के लिए वित्तीय सहायता के लिए Universidad Católica de वालेंसिया San विसेंट Mártir स्वीकार करना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cylindrical punch  10 mm diameter
Petri dishes soria genlab P101 90 mm diameter, sterile
Tryptic soy agar (TSA) Liofilchem 610052 Dehydrated medium 500 g (powder)
Tryptic soy broth (TSB) Liofilchem 610053 Dehydrated medium 500 g (powder)
Sterile cotton swab EUTOTUBO 300200
Centrifuge tubes VIDRA FOC, SA 429900 50 mL, sterile
Ethanol VWR 83813360 Absolute ethanol
Sterile 48-wells plate COSTAR 3548 Flat bottom with lid, tissue culture treated, non-pyrogenic, polystyrene
A pair of tweezers BRAUN 24612036 Toothless
Sterile phosphate buffered saline (PBS). VWR E404-100TAPBS
Vaccum oven with a connected vacuum pump JP Selecta, SA 5900620
Laminar flow hood TELSTAR Technologies, SL TELSTAR AH-100 12.0 W lamp of UV-C radiation
Class II Biological safety cabinet LABOGENE MARS 1200
Incubator ASTEC CO, LTD SCA-165DR
Vortex mixer Biosan V-1 Plus
Spectrophotometer Macherey-Nagel, Germany Nanocolor UV/VIS II
Bunsen burner JP Selecta, SA 7001539
Alcohol burner VIDRA FOC, SA 1658/20 In case sterilisation is necessary to be performed inside class II biological safety cabinet
Orbital shaker sartorius stedim 8864845
Sonicator SELECTA 3000617 50/60 Hz
Digital calliper ACHA 17-260 0-150 mm
Serological pipette Fisherbrand 13-678-11 25 mL, sterile
Serological pipette VWR 612-4950 5 mL, sterile
Serological pipette VWR 612-5541 10 mL, sterile
Micropipette GILSON FA10005P Pipetman L P200L, plastic 20-200 µL
Micropipette GILSON F123602 Pipetman P1000, 200-1000 µL
Micropipette  GILSON FA10016 Pipetman L P12X300L, 20-300 µL
Micropipette tips LABBOX TIBP-200-960 2-200 µL
Micropipette tips LABBOX TIBP-1K0-480 100-1000 µL
Pre-sterilized tube  INSULAB 301402 10 mL 
Photo camera Canon EOS 5D Any camera with high resolution can also be utilized
Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus  strain V329 Cucarella et al. J Bacteriol 183 (9),  2888–2896 (2001)
Gram-negative bacteria Escherichia coli Colección Española de Cultivos Tipo CECT CECT 101
Yeast Candida albicans Colección Española de Cultivos Tipo CECT CECT 1394
Microcentrifuge tubes  DASLAB 175508 1,5 mL
Autoclave JP Selecta, SA 4002136
Spectrophotometer-cuvettes UVAT Bio CB F-0902-02 4,5 mL
Drigalski spatula LABBOX SPRP-L05-1K0 Sterile, disposable 
glass balls (2 mm diameter) Hecht Karl 1401/2 Autoclavable, alternative device to the Drigalski spatula
Autoclave bags DELTALAB 200318 To sterilize microbiological residues or contaminated material
Electronic pipette filling device JetPip JET BIOFIL
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 LABBOX SBG3-100-010 100 mL, for autoclaving culture media
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 LABBOX SBG3-250-010 250 mL, for autoclaving culture media
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 LABBOX SBG3-500-010 500 mL, for autoclaving culture media
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 LABBOX SBG3-1K0-010 1000 mL, for autoclaving culture media
Latex gloves DENIA 2278000000
Indicator tape for sterilization LABBOX STAP-A55-001 Self-adhesive tape with impregnated paper turning to colour when exposed to sterilization process.
Universal test tube rack LABBOX MTSP-001-001 To hold centrifuge tubes
Microcentrifuge tube rack VWR 211-0210 To hold microcentrifuge tubes
Sterile loop ACEFE S.A. 100140055 10 µL of capacity for microbial culture 
Material M1 Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) Material type 1 
Material M2 Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) Material type 2 
Material M3 Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) Material type3
Material M4 Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) Material type 4 
Material C Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) Control material

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समस्या १३८ उंनत सामग्री रोगाणुरोधी लक्षण वर्णन डिस्क प्रसार भूतल सामग्री इंजीनियरिंग
उंनत सामग्री के रोगाणुरोधी लक्षण वर्णन के लिए इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों
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Martí, M., Frígols, B., Serrano-Aroca, A. Antimicrobial Characterization of Advanced Materials for Bioengineering Applications. J. Vis. Exp. (138), e57710, doi:10.3791/57710 (2018).

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