Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Antimikrobiel karakterisering af avancerede materialer til bioteknologi applikationer

Published: August 4, 2018 doi: 10.3791/57710
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Facultad de Veterinaria y Ciencias Experimentales, Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir
* These authors contributed equally

Summary

Vi præsenterer en protokol for antimikrobiel karakterisering af avancerede materialer. Her, den antimikrobielle aktivitet på materielle overflader er målt ved hjælp af to metoder, der supplerer hinanden: den ene er baseret på agar disk diffusion test, og den anden er en standard procedure baseret på ISO 22196:2007 norm.

Abstract

Udvikling af nye avancerede materialer med forbedrede egenskaber bliver mere og mere vigtigt i en bred vifte af bioteknologiske applikationer. Således er mange roman biomaterialer er designet til at efterligne specifikke miljøer kræves for biomedicinske anvendelser som vævsmanipulering og kontrolleret medicinafgivelse. Udviklingen af materialer med forbedrede egenskaber til immobilisering af celler eller enzymer er også en nuværende forskningsemne i bioproces engineering. En af de mest ønskværdige egenskaber et materiale i disse programmer er imidlertid antimikrobiel kapacitet til at undgå eventuelle uønskede infektioner. For dette præsenterer vi let at følge protokoller for antimikrobiel karakterisering af materialer baseret på (i) agar disk diffusion testen (diffusion metode) og (ii) ISO 22196:2007-normen at måle den antimikrobielle aktivitet på materielle overflader (kontakt metode). Denne protokol skal udføres ved hjælp af Gram-positive og Gram-negative bakterier og gær til at dække en bred vifte af mikroorganismer. Som et eksempel, er 4 materialer med forskellige kemiske naturer testet efter denne protokol mod Staphylococcus aureus, Escherichia coliog Candida albicans. Resultaterne af disse test udstiller ikke-antimikrobielle aktivitet for det første materiale og øge antibakterielle aktivitet mod Gram-positive og Gram-negative bakterier til andre 3 materialer. Men ingen af de 4 materialer er stand til at hæmme væksten af Candida albicans.

Introduction

Implantatet fiasko er ofte en følge af mikrobielle infektioner, der opstår trods antimikrobiel profylakse og aseptisk arbejdsvilkår. Dette problem er forårsager høj sundhedspleje omkostninger og foruroligende blandt patienter1. Vigtige bakterier som Staphylococcus aureus i øjeblikket anses for at være meget farlige patogener i nosokomielle infektioner forbundet med katetre og andre medicinske implantater og er de vigtigste forurenende stoffer af medicinske instrumenter2. Udviklingen af nye antimikrobielle strategier er derfor bydende nødvendigt for både daglige og medicinske anvendelser.

Antimikrobielle stoffer omfatter antibiotika3, kvaternære ammoniumforbindelser4, metaloxider ioner5og antimikrobielle peptider (AMP'er)6. Antibiotika efterhånden mindre effektive på grund af bakteriel resistens7, som er stigende på grund af antibiotika overforbrug8. Kvaternære ammoniumforbindelser er kun meget effektive for en kortvarig brug på grund af mikrobiel resistens9. Metaloxider ioner har længe været udnyttet som meget effektiv antimikrobielle stoffer og bruges i mange almindelige kommercielle produkter herunder bandager, vandfiltre, maling, etc.10,11,12. Det er blevet påvist, at disse typer af forbindelser kan være giftige for nogle typer af pattedyrceller13.

Ampere vise fremragende antimikrobielle og immunmodulerende egenskaber14,15, og bakterier synes at finde det meget vanskeligt at udvikle en modstand mod dem16. Men, processen med at producere ren ampere er dyre; en fuldskala-produktionen er derfor ikke bæredygtigt. Således udviklet strategier til at imødegå problemerne i producerer forstærkere har været (f.eks., lille Molekylær antibakterielle peptoid efterligner17, peptoids18, α-peptider19 og β-peptider20). Methacrylat-ended polypeptider og polypeptoids er blevet syntetiseret for antimikrobielle og antifouling belægninger21.

Udvikling af nye antimikrobielle stoffer såsom avancerede materialer i ren eller hybrid form, stand til at forebygge og behandle multiresistente infektioner, er stadig mere nødvendig. En bred vifte af nye avancerede materialer til mange bioteknologi felter som væv og bioproces engineering er blevet udviklet med forbedrede kemiske og fysiske egenskaber i de sidste årtier gennem flere metoder: plasma-polymerisering podning på en hydrofobe substrat22,23,24, tilpasning af crosslinking massefylde25,26, polymerisering i løsning27,28,29 , 30, porogen opløsning31,32, og ved indarbejdelse af nanomaterialer såsom graphene oxid (GO)33,34,35,36 og Carbon nanofibers (CNFs)37.

Undersøgelse af disse nye materialer antimikrobiel kapacitet øges eksponentielt deres potentielle bioteknologi anvendelighed og er derfor blevet væsentligt. Vi præsenterer en nem at følge protokollen for at kvantificere den antimikrobiel aktivitet af sådanne nye avancerede materialer. Her, efter prøveforberedelse, to komplementære metoder er fulgt: først er baseret på agar disk diffusion test38 (diffusion metode) og andet er baseret på ISO 22196:2007 normen39 til måling af antimikrobiel aktivitet på materielle overflader (kontakt metode).

Protocol

1. Prøvetilberedning

  1. Skær de materielle prøver i 10 mm diameter diske med en diameter på 10 mm cylindrisk punch.
    Bemærk: Sprøde materialer kan blødgøres i passende steril opløsningsmidler i 1 time og derefter skåret i diske. For eksempel, hydrofile materialer såsom zink calciumalginat blev testet efter denne protokol og blev fugtet i autoklaveres vand før skære dem for at undgå at prøve at bryde. Andre hydrofobe materialer som poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) behøver dog ikke nogen form for tidligere hævelse for at være korrekt skåret.
  2. Tør prøve materiale diske på 60 ° C i et vakuum ovn (< 10-2 Torr) i 24 timer.
    Bemærk: Nogle materialer muligvis en høj tørring temperatur. Det er imidlertid vigtigt ikke at nå en temperatur, der termisk kunne nedbrydes materialet.
  3. Måle de materielle film tykkelser med en digital skydelære.
    Bemærk: Denne protokol anbefaler udnyttelse af materielle film med konstant og lignende tykkelser, når man sammenligner den antimikrobiel aktivitet af forskellige materialer.
  4. Sterilisere hver prøve ved nedsænkning i ethanol 70% i 10 min og efterfølgende ultraviolet (UV) stråling for 1 t pr. hver side.
    Bemærk: UV-stråling kan udføres placere hver prøve i en steril petriskål inde i en laminar flow hætte med en 12,0 W lampe af UV-C stråling.
    Forsigtig: Forskere bør ikke udsættes for UV-stråling, fordi det er mutagene.
  5. Udfør trin 1.1, 1.2, 1.3 og 1.4. med kontrol materielle diske.
    Bemærk: Polyethylenterephthalat (PET) eller alternative ikke-antimikrobielle materialer kan bruges som kontrol diske i metoden diffusion og kontakt. Desuden, når kendetegner nanocomposites eller behandlede materialer, grundmaterialet bør anvendes som kontrolmateriale.

2. anbefalede mikroorganismer

Bemærk: Vi anbefaler brug af 3 forskellige mikroorganismer til at studere den antimikrobielle kapacitet af de testede materiale mod en bred vifte af mikroorganismer.

  1. Bruge renkulturer af 3 mikroorganismer: Gram-positive bakterier Staphylococcus aureus, gramnegative bakterier Escherichia coliog gær Candida albicans.
    Bemærk: Andre mikroorganisme arter kan også blive testet med denne protokol ved at ændre inkubation betingelserne om nødvendigt.
    Forsigtig: Kræves biosikkerhed målinger skal følges efter typen af mikroorganisme ansat i denne protokol.
  2. Arbejde med pre sterile eller autoklaveres materiale og bruge en bunsenbrænder under hele processen med den mikrobielle manipulation eller en biologisk sikkerhed kabinet (hvis nødvendigt) at sikre aseptiske forhold.
    Bemærk: Anbefalede autoklave betingelser er 121 ° C i 15 min. for kultur medier og 121 ° C i 20 min. for arbejde materiale og biologiske restprodukter.

3. agar Disk Diffusion Test (Diffusion metode)

Bemærk: Når en flydende diffusion af antimikrobielle forbindelser kan være den vigtigste antimikrobiel mekanisme af avancerede materialer, diffusion metode kan give meget nyttige oplysninger om antimikrobiel kapaciteten af disse materialer. Den materielle disk beliggende i centrum af agar plade kan danne en gennemsigtig ring zone (halo) hvor en væksthæmning af mikroorganismer opstår efter 24 h af kultur (Se figur 1).

  1. Diffusion afprøvningsprocedure
    1. Forberede og autoklave tryptic soja agar (TSA) efter fabrikantens anvisninger.
    2. Hæld TSA i sterile petriskåle under aseptiske forhold ved hjælp af en bunsenbrænder eller en laminar flow hætte.
      Bemærk: TSA pladerne skal være 4-6 mm tyk.
    3. Kultur de forskellige mikroorganismer skal testes aerobt for 18-24 h i Petriskålene med TSA i en inkubator ved 37 ° C.
    4. Forberede og autoklave tryptic soja bouillon (TSB) efter fabrikantens anvisninger.
    5. Hæld TSB i en 50 mL steriliseret centrifugeglasset med en steriliseret serologisk pipette under aseptiske forhold ved hjælp af en bunsenbrænder eller en laminar flow hætte.
    6. Resuspend et par kolonier fra trin 3.1.3 i 25 mL af TSB indeholdt i en steril centrifugeglasset ved hjælp af en steril vatpind og vortex dem i 1 minut til at opnå en ensartet blanding.
    7. Justere absorbansen (ved 540 nm) af kultur med et spektrofotometer til den passende antal kolonidannende enheder (CFU) pr. mL: ca 1.5 x 108 CFU/mL for bakterier og fra 1 x 106 til 5 x 106 CFU/mL for gær.
      Bemærk: De kultur og kuvette diskenheder til absorbansen skal vælges afhængigt af Spektrofotometer udnyttet.
    8. Vortex mikrobielle suppen i 5 sekunder for at forbedre den mikroorganisme spredning og kortvarigt dykke en steril vatpind i denne mikrobielle suspension. Fjern overskydende væske fra svaber ved at trykke det mod rørvæggen indeholdende kulturen.
    9. Jævnt streak mikrobielle bouillon suspension med en steril vatpind på overfladen af TSA plader i 3 fly til at dække deres hele overfladen med mikroorganismen og lad det tørre i 5 min efter podning.
      Bemærk: For at fjerne eventuel fugt, TSA pladerne skal placeres åben i en inverteret position ved 37 ° C i 10-15 min. før podning.
    10. Sterilisere et par pincet ved at nedsænke dem i et bægerglas med ethanol 96% og derefter flammende dem med en bunsenbrænder eller alkohol brænder.
    11. Anbring prøven diske for at blive testet og kontrollere disk på midten af TSA plader med en steril pincet.
    12. Inkuber aerobt TSA pladerne i en inverteret position ved 37 ° C i 24 timer.
      Bemærk: For at undgå enhver risiko for forurening, det anbefales at udruge TSA pladerne i en inverteret holdning. Men hvis prøven disk frigøres fra TSA plader, ikke udføre dette trin i en inverteret holdning. I dette tilfælde anbefales det at tørre plader i laminar flow hætte. Denne antimikrobiel test skal udføres i det mindste i quadriplicate på forskellige dage for at sikre reproducerbarhed.
  2. Kontrol af mikrobielle suspension koncentration og renhed
    Bemærk: Følgende trin er nødvendige for at kontrollere, at den mikrobielle koncentration bestemmes med Spektrofotometer taktfast 3.1.7 er korrekte og sikre, at der var ingen mikrobielle miljøforurening. En mikrobiel miljøforurening kan opdages let ved forekomsten af forskellige typer af mikrobielle kolonier efter 24 h af kultur. Derudover skal ingen mikrobiel kontaminering af TSB medium under dens manipulation i de serielle tifoldsfortyndinger sikres med en negativ TSB kontrol plade.
    1. Undvære den sterile TSB (udarbejdet i trin 3.1.4) i sterilt microcentrifuge rør med en mikropipette med passende autoklaveres tips under aseptiske forhold. En af dem vil blive udnyttet som en negativ TSB kontrol.
    2. Udføre seriel tifoldsfortyndinger med den mikrobielle bouillon suspension udnyttet i trin 3.1.9 i sterile microcentrifuge rør indeholdende TSB.
    3. Sprede 100 µL af hver fortynding på TSA plader ved hjælp af en steriliseret Drigalski spatel eller et alternativt instrument. Også sprede 100 μL af TSB medium uden mikroorganisme (udarbejdet i trin 3.2.1) på en TSA plade som en negativ TSB kontrol plade.
    4. Inkuber aerobt TSA pladerne aerobt ved 37 ° C i 24 timer.
    5. Tæl antallet af kolonier til at kontrollere at CFU/mL er lig den, fastsættes i trin 3.1.7.
    6. Kontroller, at der er ingen mikrobielle miljøforurening på TSA plader med kun én type af kolonier.
    7. Kontroller, at der er nogen mikrobiel forurening på TSB negativ kontrol pladen viser ingen kolonier

4. måling af antimikrobiel aktivitet på materielle overflader (kontakt metode)


Bemærk: Når overflade kontakt kan være den vigtigste antimikrobiel mekanisme nogle avancerede materialer, den kontakt metode kan give meget nyttige oplysninger om antimikrobiel kapacitet af disse materialer. I denne metode, mikroorganismer, som er placeret direkte på den materielle overflade og deres væksthæmning kan bestemmes efter en vis tid.

  1. Indledende procedure
    1. Forberede og autoklave TSB efter fabrikantens anvisninger.
    2. Hæld TSB i en 50 mL steriliseret centrifugeglasset med en steriliseret serologisk pipette under aseptiske forhold ved hjælp af en bunsenbrænder eller en laminar flow hætte.
    3. Kultur de forskellige mikroorganismer skal testes aerobt natten over i røret med TSB i en orbitalryster (140 rpm) ved 37 ° C.
    4. Fortyndes de overnattende kultur i 20 mL af TSB i en 50 mL steriliseret centrifugeglasset til en koncentration på ca. 106 CFU/mL (bestemmes med et spektrofotometer ved 540 nm).
      Bemærk: De kultur og kuvette diskenheder til absorbansen skal vælges afhængigt af Spektrofotometer udnyttet.
    5. Udføre seriel tifoldsfortyndinger af denne kultur i steril microcentrifuge rør indeholdende TSB. Sprede 100 µL af kultur på TSA plader og inkuberes det aerobt ved 37 ° C i 24 timer.
    6. Tæl antallet af kolonier til at sikre en oprindelige celle koncentration af ca 1 x 106 CFU/mL
    7. Sted 4 kontrol diske for mikrobiel tælle efter 24 h og 4 prøve diske af hver type af de testede materialer for mikrobiel tælle efter 24 h i adskiller wells af en steril 48-godt plade.
    8. Tilsæt 150 µL af den mikrobielle suspension på hver disk overflade.
  2. Mikrobielle regner kontrol og gennemtestede materialer (efter 24 h)
    1. Efter trin 4.1.6, aerobt Inkuber 4 prøve diskene tilbage i 48-godt pladen ved 37 ° C i 24 timer.
      Bemærk: Denne 24 h inkubationstiden kan ændres for at studere væksthæmning til kortere eller længere tid.
    2. Efter 24 h inkubation, afpipetteres 850 µL af steril PBS på overfladen af de 4 prøve diske og bland det med de 150 µL af den mikrobielle suspension.
    3. Indsamle PBS/mikrobielle suspension blandingen og hver disk fra 48-godt plade og overføre dem til en 10 mL steriliseret tube.
    4. Vortex PBS/mikrobielle suspension blandingen og hver disk i 1 min., der sonikeres det på 50 Hz til 5 min og vortex det igen i 1 min til at sikre, at ingen levedygtige mikroorganismer forbliver levet op til de materielle overflade.
    5. Udføre seriel tifoldsfortyndinger af hver sonicated kultur i steril microcentrifuge rør indeholdende TSB og sprede 100 µL af kultur på TSA plader og inkuberes det aerobt ved 37 ° C i 24 timer.
    6. Tæl antallet af kolonier, som er antallet af levedygtige mikroorganismer på hver prøve og kontrol disk overflade. Udtrykke dette antallet af levedygtige celler i (CFU/mL).
    7. Tage et fotografi af den endelige mikrobielle kultur for at prøve og kontrol diske.

5. antimikrobielle resultater analyse

Figure 1
Figur 1: mål for den normaliserede bredde af antimikrobielle "halo". Dette panel viser diameter af zonen hæmning (diz) og disk diameter (d). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Diffusion metode resultater analyse
    1. Måle diameteren af zonen hæmning (diz) og disk diameter (d) (Se figur 1) med en digital skydelære.
      Bemærk: Hæmning zone eller antimikrobielle "halo" er dannet som følge af mikrobiel væksthæmning produceret af antimikrobielle materielle disken (Se figur 1). Det er muligt at konstatere, at der er en gennemsigtig ring zone tæt på prøve i forhold til resten af pladen hvor mikroorganismer er vokset korrekt (uigennemsigtig zone).
    2. Bestemme den normaliserede bredde af antimikrobielle "halo" (nwhalo) af hver disk ved anvendelse af ligning (1).
      (1)Equation 1
    3. Bestemme middelværdi og standardafvigelse af normaliserede bredden af antimikrobielle "halo" med 4 bestemmes nwhalo værdier af hver prøve.
    4. Tage et fotografi af den endelige mikrobielle kultur med den materielle disk.
      Bemærk: Diameter af zonen hæmning (diz) og disk diameter (d) kan også være målt fra fotografi taget i trin 5.1.4 ved hjælp af en egnet billedbehandling software.
  2. Kontakt metode resultater analyse
    1. Bestem antallet af levedygtige mikroorganismer inddrives efter ligning (2).
      (2)Equation 2
      Bemærk: Her, N er antallet af levedygtige mikroorganismer inddrives per cm2 pr. prøveemne; C er kimtal; D er fortyndingsfaktoren; A er arealet af prøveemnet i cm2 bestemmes med prøve disk diameter.
    2. Fastslå tabet af levedygtighed (LV) afspejler hæmning af cellevækst ved anvendelse af ligning (3).
      (3)Equation 3
      Bemærk: Her, C er det gennemsnitlige antal levedygtige mikroorganismer (N) i CFU/mL•cm2, inddrives fra kontrol-enheder efter 24 h; S er antallet af levedygtige mikroorganismer (N) i CFU/mL•cm2, inddrives fra proeveemnerne efter 24 timer.
    3. Bestemme middelværdi og standardafvigelse af tab af levedygtighed med de 4 bestemmes LV(%) værdier af hver prøve.

Representative Results

Denne protokol blev ansat, som et eksempel, for at teste den antimikrobielle kapacitet 4 materialer med forskellige kemiske naturer mod 3 anbefales mikroorganismer: Staphylococcus aureus, Escherichia coliog Candida albicans . Agar disk diffusion testresultater (diffusion metode) udstillet ikke-antimikrobielle aktivitet for det første materiale (M1) som det er sket i kontrol disk (C, billedet ikke vises) og øge antibakterielle aktivitet mod Gram-positive og Gram-negative bakterier til de andre 3 materialer, M2, M3 og M4 (Se figur 2).

Figure 2
Figur 2: antimikrobiel diffusion metode resultater. Dette panel viser den antimikrobielle diffusion metode for de 4 materiale (M1, M2, M3 og M4) diske (10 mm diameter x 1 mm tykkelse) mod S. aureus og E. coli efter 24 timers inkubation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3 viser de forskellige normaliseret bredder af antimikrobielle "halo" (nwhalo) for de forskellige eksempel materialer M1, M2, M3 og M4 mod Gram-positive og Gram-negative bakterier beregnes med ligningen (1). Ingen af de 4 materialer var imidlertid at hæmme væksten af gær Candida albicans (billeder ikke vist).

Figure 3
Figur 3: antimikrobiel diffusion "halo" resultater. Dette panel viser de normaliserede "halo" (nwhalo) for hvert materiale (M1, M2, M3 og M4) disk (10 mm diameter x 1 mm tykkelse) mod S. aureus og E. coli efter 24 timers inkubation. Forskellene er statistisk signifikant (p < 0,01). Dog udstillet prøve M1 ingen antimikrobiel aktivitet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Resultaterne af den kontakt metode også udstillet ikke-antimikrobielle aktivitet for det første materiale (M1), som det er sket i kontrol disk (C) og stigende antibakterielle aktivitet mod Grampositive og gramnegative bakterier til andre 3 materialer (jf. Figur 4).

Figure 4
Figur 4: antimikrobiel kontakt metode resultater. Dette panel viser de respektive 90 mm plader af de 4 materiale (M1, M2, M3 og M4) overflade antimikrobiel aktivitet assay ifølge ISO 22196:2007 efter 24 timers inkubation for S. aureus og E. coli (fortyndingsfaktoren af 10-4). C er de levedygtige bakterier inddrives fra kontrol disk efter 24 timers inkubation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Tabet af levedygtighed (%) blev bestemt ved ligning (2) og (3) som anført i denne protokol (Se figur 5).

Figure 5
Figur 5: tab af levedygtigheden af kontaktmetode. Dette panel viser tabet af levedygtighed (%) til M1, M2, M3 og M4 mod S. aureus og E. coli på de materielle overflader. Prøven M1 udstillet ingen antimikrobiel aktivitet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Ingen af de 4 materialer var imidlertid at hæmme væksten af gær Candida albicans af metoden kontakt enten (billeder ikke vist). Derfor, 3 af disse 4 avancerede materialer viste positiv antimikrobiel resultater mod Gram-positive og Gram-negative bakterier og således kunne være meget nyttig for mange bioteknologiske applikationer med høje antibakterielle aktivitet krav. Ingen af de 4 materialer var imidlertid at hæmme gær vækst.

Discussion

Den antimikrobielle aktivitet af nye avancerede materialer kan analyseres ved denne let at følge protokol bestående af 2 supplerende procedurer baseret på 2 eksisterende metoder: agar disk diffusion teste38 og den antimikrobielle aktivitet målt på materielle overflader efter ISO 22196:2007 normen39.

I feltet forskning er mange af de antimikrobielle test rapporteret i litteraturen højt assay-afhængige. Derfor er det meget vigtigt at have detaljerede og sammenhængende protokoller på plads på tværs af laboratorier. Denne artikel er et skridt i retningen. Derudover kunne det være meget nyttigt for mange forskere, der er mindre erfaren på dette område og kræver dybtgående, trinvise procedurer til at følge for præcise resultater.

Denne protokol kan bruges med mange typer materiale skæres i disk figurer på 10 mm i diameter. Sprøde materialer kan være hævet i en egnet opløsningsmiddel for 1 h til at gengive opskæringsprocessen lettere. Hydrofile materialer som alginates kan således være hydreret i autoklaveres destilleret vand. Andre opløsningsmidler som ethanol, keton og dichlormethan, kan være ansat til at svulme hydrofobe materialer til 1 time før skære dem. Men nogle materialer som poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) behøver ikke at være hævet, og de kan blive skåret direkte. Efter dette er det meget vigtigt at tør prøve materiale diskene i et vakuum ovn og sterilisere hver prøven med ethanol og UV-stråling i 1 time for at undgå enhver risiko for forurening.

Denne protokol anbefaler TSA og TSB som kultur medier og brugen af renkulturer af 3 mikroorganismer til at nå en bred vifte af mikroorganismer: Gram-positive bakterier Staphylococcus aureus, gramnegative bakterier Escherichia coli, og gær Candida albicans. Dog kunne alternative kultur medier og andre mikroorganismer har behov for forskellige inkubation betingelser også anvendes med denne protokol. Nogle gange, er kun 1 mikroorganisme testet til at have en oprindelige idé af antimikrobiel aktivitet af et nyt materiale.

De materialer, der viser stærk antimikrobiel aktivitet mod de anbefalede 3 forskellige typer af mikroorganismer bør også testes mod antibiotika-resistente patogene organismer såsom methicillin-resistente Staphylococcus epidermidis (MRSE), som har været med succes udnyttet med denne protokol. Andre vigtige resistente mikroorganismer, som forårsager megen bekymring er den Gram-positive methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) og vancomycin-resistente enterokokker (VRE) og den gramnegative Pseudomonas aeruginosa40,41.

Biofilm hæmning og antimikrobiel aktivitet af materialer mod andre typer af mikroorganismer som virus og parasitter kan ikke testes med denne protokol. Men denne protokol giver et meget godt udgangspunkt for en antimikrobiel undersøgelse af en ny avanceret materiale.

I antimikrobiel agar disk diffusion test opstår et kritisk skridt når prøven disk skal være placeret i midten af pladen, fordi nogle materialer fold så snart de kommer i kontakt med agar medier. I dette tilfælde anbefales det at bruge et sterile par pincet skal omhyggeligt udfolde prøven. På den anden side i kontaktmetode, det er afgørende at vaske kontrollen og prøve diske meget godt med PBS af pipettering dem fire gange efterfulgt af en kraftig vortexing og ultralydbehandling for at sikre, at ingen levedygtige mikroorganismer forbliver overholdt til materialet overflade.

Denne video protokol kan udnyttes i mange bioteknologiske applikationer, såsom bioproces engineering, vævsmanipulering, kontrolleret medicinafgivelse, emballagematerialer, spildevandsbehandling og landbrug, som bruger biomaterialer med et højt ønskeligt antimikrobiel kapacitet.

De opnåede resultater med denne protokol er kvalitativ (billeder) og kvantitative (normaliseret bredden af den antibakterielle "halo" og tabet af levedygtighed) med en god analyse af dens reproducerbarhed (gennemsnit ± standardafvigelse). Når man sammenligner forskellige materialer, skal disse middelværdier, der er opnået med diffusion og kontakt metode resultater analysen analyseres ved en-vejs ANOVA, efterfulgt af Tyrkiets post hoc analyse, for at studere hvis de er, statistisk signifikant forskellige (p < 0,01).

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne anerkende Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir for den finansielle støtte til dette arbejde gennem 2017-231-001UCV og 2018-231-001UCV tilskud.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cylindrical punch  10 mm diameter
Petri dishes soria genlab P101 90 mm diameter, sterile
Tryptic soy agar (TSA) Liofilchem 610052 Dehydrated medium 500 g (powder)
Tryptic soy broth (TSB) Liofilchem 610053 Dehydrated medium 500 g (powder)
Sterile cotton swab EUTOTUBO 300200
Centrifuge tubes VIDRA FOC, SA 429900 50 mL, sterile
Ethanol VWR 83813360 Absolute ethanol
Sterile 48-wells plate COSTAR 3548 Flat bottom with lid, tissue culture treated, non-pyrogenic, polystyrene
A pair of tweezers BRAUN 24612036 Toothless
Sterile phosphate buffered saline (PBS). VWR E404-100TAPBS
Vaccum oven with a connected vacuum pump JP Selecta, SA 5900620
Laminar flow hood TELSTAR Technologies, SL TELSTAR AH-100 12.0 W lamp of UV-C radiation
Class II Biological safety cabinet LABOGENE MARS 1200
Incubator ASTEC CO, LTD SCA-165DR
Vortex mixer Biosan V-1 Plus
Spectrophotometer Macherey-Nagel, Germany Nanocolor UV/VIS II
Bunsen burner JP Selecta, SA 7001539
Alcohol burner VIDRA FOC, SA 1658/20 In case sterilisation is necessary to be performed inside class II biological safety cabinet
Orbital shaker sartorius stedim 8864845
Sonicator SELECTA 3000617 50/60 Hz
Digital calliper ACHA 17-260 0-150 mm
Serological pipette Fisherbrand 13-678-11 25 mL, sterile
Serological pipette VWR 612-4950 5 mL, sterile
Serological pipette VWR 612-5541 10 mL, sterile
Micropipette GILSON FA10005P Pipetman L P200L, plastic 20-200 µL
Micropipette GILSON F123602 Pipetman P1000, 200-1000 µL
Micropipette  GILSON FA10016 Pipetman L P12X300L, 20-300 µL
Micropipette tips LABBOX TIBP-200-960 2-200 µL
Micropipette tips LABBOX TIBP-1K0-480 100-1000 µL
Pre-sterilized tube  INSULAB 301402 10 mL 
Photo camera Canon EOS 5D Any camera with high resolution can also be utilized
Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus  strain V329 Cucarella et al. J Bacteriol 183 (9),  2888–2896 (2001)
Gram-negative bacteria Escherichia coli Colección Española de Cultivos Tipo CECT CECT 101
Yeast Candida albicans Colección Española de Cultivos Tipo CECT CECT 1394
Microcentrifuge tubes  DASLAB 175508 1,5 mL
Autoclave JP Selecta, SA 4002136
Spectrophotometer-cuvettes UVAT Bio CB F-0902-02 4,5 mL
Drigalski spatula LABBOX SPRP-L05-1K0 Sterile, disposable 
glass balls (2 mm diameter) Hecht Karl 1401/2 Autoclavable, alternative device to the Drigalski spatula
Autoclave bags DELTALAB 200318 To sterilize microbiological residues or contaminated material
Electronic pipette filling device JetPip JET BIOFIL
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 LABBOX SBG3-100-010 100 mL, for autoclaving culture media
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 LABBOX SBG3-250-010 250 mL, for autoclaving culture media
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 LABBOX SBG3-500-010 500 mL, for autoclaving culture media
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 LABBOX SBG3-1K0-010 1000 mL, for autoclaving culture media
Latex gloves DENIA 2278000000
Indicator tape for sterilization LABBOX STAP-A55-001 Self-adhesive tape with impregnated paper turning to colour when exposed to sterilization process.
Universal test tube rack LABBOX MTSP-001-001 To hold centrifuge tubes
Microcentrifuge tube rack VWR 211-0210 To hold microcentrifuge tubes
Sterile loop ACEFE S.A. 100140055 10 µL of capacity for microbial culture 
Material M1 Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) Material type 1 
Material M2 Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) Material type 2 
Material M3 Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) Material type3
Material M4 Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) Material type 4 
Material C Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) Control material

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sydnor, E. R. M., Perl, T. M. Hospital epidemiology and infection control in acute-care settings. Clin Microbiol Rev. 24 (1), 141-173 (2011).
  2. Chessa, D., et al. Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis Virulence Strains as Causative Agents of Persistent Infections in Breast Implants. PLoS One. 11 (1), e0146668 (2016).
  3. Pandey, H., Parashar, V., Parashar, R., Prakash, R., Ramteke, P. W., Pandey, A. C. Controlled drug release characteristics and enhanced antibacterial effect of graphene nanosheets containing gentamicin sulfate. Nanoscale. 3 (10), 4104 (2011).
  4. Jia, Z., Shen, D., Xu, W. Synthesis and antibacterial activities of quaternary ammonium salt of chitosan. Carbohydr Res. 333 (1), 1-6 (2001).
  5. Liu, Y., Wang, X., Yang, F., Yang, X. Excellent antimicrobial properties of mesoporous anatase TiO2 and Ag/TiO2 composite films. Microporous Mesoporous Mater. 114 (1-3), 431-439 (2008).
  6. Wang, L., Chen, J., Shi, L., Shi, Z., Ren, L., Wang, Y. The promotion of antimicrobial activity on silicon substrates using a "click" immobilized short peptide. Chem Commun (Camb). 50 (8), Cambridge, England. 975-977 (2014).
  7. Kümmerer, K. Resistance in the environment. J Antimicrob Chemother. 54 (2), 311-320 (2004).
  8. Ng, V. W. L., et al. Antimicrobial hydrogels: A new weapon in the arsenal against multidrug-resistant infections. Adv Drug Deliv Rev. 78, 46-62 (2014).
  9. Hegstad, K., Langsrud, S., Lunestad, B. T., Scheie, A. A., Sunde, M., Yazdankhah, S. P. Does the Wide Use of Quaternary Ammonium Compounds Enhance the Selection and Spread of Antimicrobial Resistance and Thus Threaten Our Health? Microb Drug Resist. 16 (2), 91-104 (2010).
  10. Rana, D., Matsuura, T. Surface modifications for antifouling membranes. Chem Rev. 110 (4), 2448-2471 (2010).
  11. Lok, C. N., et al. Proteomic analysis of the mode of antibacterial action of silver nanoparticles. J Proteome Res. 5 (4), 916-924 (2006).
  12. Chen, X., Schluesener, H. J. Nanosilver: A nanoproduct in medical application. Toxicol Lett. 176 (1), 1-12 (2008).
  13. Ahamed, M., AlSalhi, M. S., Siddiqui, M. K. J. Silver nanoparticle applications and human health. Clin Chim Acta. 411 (23-24), 1841-1848 (2010).
  14. Yeaman, M. R. Mechanisms of Antimicrobial Peptide Action and Resistance. Pharmacol Rev. 55 (1), 27-55 (2003).
  15. McLean, D. T. F., Lundy, F. T., Timson, D. J. IQ-motif peptides as novel anti-microbial agents. Biochimie. 95 (4), 875-880 (2013).
  16. Brogden, K. A. Antimicrobial peptides: Pore formers or metabolic inhibitors in bacteria? Nat Rev Microbiol. 3 (3), 238-250 (2005).
  17. Ghosh, C., et al. Small molecular antibacterial peptoid mimics: The simpler the better! J Med Chem. 57 (4), 1428-1436 (2014).
  18. Chongsiriwatana, N. P., et al. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proc Natl Acad Sci. 105 (8), 2794-2799 (2008).
  19. Chen, Y., Mant, C. T., Farmer, S. W., Hancock, R. E. W., Vasil, M. L., Hodges, R. S. Rational design of alpha-helical antimicrobial peptides with enhanced activities and specificity/therapeutic index. J Biol Chem. 280 (13), 12316-12329 (2005).
  20. Porter, E. A., Wang, X., Lee, H. S., Weisblum, B., Gellman, S. H. Non-haemolytic beta-aminoacid oligomers. Nature. 404 (6778), 565 (2000).
  21. Gao, Q., Li, P., Zhao, H., Chen, Y., Jiang, L., Ma, P. X. Methacrylate-ended Polypeptides and Polypeptoids for Antimicrobial and Antifouling Coatings. Polym Chem. 8 (41), 6386-6397 (2017).
  22. Serrano-Aroca, Á, Gómez-Ribelles, J. L., Monleón-Pradas, M., Vidaurre-Garayo, A., Suay-Antón, J. Characterisation of macroporous poly(methyl methacrylate) coated with plasma-polymerised poly(2-hydroxyethyl acrylate). Eur Polym J. 43 (10), 4552-4564 (2007).
  23. Serrano-Aroca, Á, Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L. Plasma-induced polymerisation of hydrophilic coatings onto macroporous hydrophobic scaffolds. Polymer (Guildf). 48 (7), 2071-2078 (2007).
  24. Serrano-Aroca, Á, Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L., Rault, J. Thermal analysis of water in reinforced plasma-polymerised poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels. Eur Polym J. 72, 523-534 (2015).
  25. Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L., Serrano-Aroca, Á, Gallego-Ferrer, G., SuayAntón, J., Pissis, P. Interaction between water and polymer chains in poly(hydroxyethyl acrylate) hydrogels. Colloid Polym Sci. 279 (4), 323-330 (2001).
  26. Serrano-Aroca, Á, Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L. Effect of crosslinking on porous poly(methyl methacrylate) produced by phase separation. Colloid Polym Sci. 286 (2), 209-216 (2008).
  27. Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L., Serrano-Aroca, Á, Gallego Ferrer, G., Suay Antón, J., Pissis, P. Porous poly (2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels. Polymer (Guildf). 42 (10), 4667-4674 (2001).
  28. Serrano-Aroca, Á, Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L. Macroporous poly(methyl methacrylate) produced by phase separation during polymerisation in solution. Colloid Polym Sci. 285 (7), 753-760 (2007).
  29. Serrano-Aroca, Á, Llorens-Gámez, M. Dynamic mechanical analysis and water vapour sorption of highly porous poly(methyl methacrylate). Polymer (Guildf). 125, 58-65 (2017).
  30. Serrano-Aroca, Á, Campillo-Fernández, A. J., Gómez-Ribelles, J. L., Monleón-Pradas, M., Gallego-Ferrer, G., Pissis, P. Porous poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels prepared by radical polymerisation with methanol as diluent. Polymer (Guildf). 45 (26), 8949-8955 (2004).
  31. Rodríguez-Hernández, J. C., Serrano-Aroca, Á, Gómez-Ribelles, J. L., Monleón-Pradas, M. Three-dimensional nanocomposite scaffolds with ordered cylindrical orthogonal pores. J Biomed Mater Res - Part B: Appl Biomater. 84 (2), 541-549 (2008).
  32. Brígido-Diego, R., et al. Acrylic scaffolds with interconnected spherical pores and controlled hydrophilicity for tissue engineering. J Mater Sci Mater Med. 40 (18), 4881-4887 (2005).
  33. Serrano-Aroca, Á, Ruiz-Pividal, J. F., Llorens-Gámez, M. Enhancement of water diffusion and compression performance of crosslinked alginate with a minuscule amount of graphene oxide. Sci Rep. 7, 11684 (2017).
  34. Serrano-Aroca, Á, Deb, S. Synthesis of irregular graphene oxide tubes using green chemistry and their potential use as reinforcement materials for biomedical applications. PLoS One. 12 (9), e0185235 (2017).
  35. Sánchez-Correa, F., Vidaurre-Agut, C., Serrano-Aroca, A., Campillo-Fernández, A. J. Poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels reinforced with graphene oxide: Remarkable improvement of water diffusion and mechanical properties. J Appl Polym Sci. , (2018).
  36. Serrano-Aroc, Á, Iskandar, L., Deb, S. Green synthetic routes to alginate-graphene oxide composite hydrogels with enhanced physical properties for bioengineering applications. Eur Polym J. 103, 198-206 (2018).
  37. Llorens-Gámez, M., Serrano-Aroca, Á Low-Cost Advanced Hydrogels of Calcium Alginate/Carbon Nanofibers with Enhanced Water Diffusion and Compression Properties. Polymers (Basel). 10 (4), 405 (2018).
  38. Bauer, A. W., Kirby, W. M. M., Sherris, J. C., Turck, A. M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. A J Clin Pathol. 45, 493-496 (1966).
  39. ISO Specification 22196: measurement of antibacterial activity on plastics surfaces. , 584 (2007).
  40. Taubes, G. The bacteria fight back. Science. 321 (5887), 356-361 (2008).
  41. Boucher, H. W., et al. 10 x '20 progress--development of new drugs active against Gram-negative bacilli: an update from the infectious diseases society of America. Clinical Infectious Diseases. 56 (12), 1685-1694 (2013).

Tags

Bioteknologi spørgsmålet 138 avancerede materialer antimikrobielle karakterisering disk diffusion overflademateriale bioteknologi
Antimikrobiel karakterisering af avancerede materialer til bioteknologi applikationer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martí, M., Frígols, B.,… More

Martí, M., Frígols, B., Serrano-Aroca, A. Antimicrobial Characterization of Advanced Materials for Bioengineering Applications. J. Vis. Exp. (138), e57710, doi:10.3791/57710 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter