Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Antimikrobielle karakteristikk av avanserte materialer for bioteknologi programmer

Published: August 4, 2018 doi: 10.3791/57710
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Facultad de Veterinaria y Ciencias Experimentales, Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir
* These authors contributed equally

Summary

Vi presenterer en protokoll for antimikrobielle karakterisering av avanserte materialer. Her, den antimikrobielle aktiviteten på materielle overflater er målt ved to metoder som utfyller hverandre: er basert på agar disk diffusjon test, og den andre er en standard prosedyre basert på ISO 22196:2007-norm.

Abstract

Utviklingen av nye avanserte materialer med utvidede egenskaper blir stadig viktigere i en rekke bioteknologi programmer. Dermed blir mange romanen biologisk materiale utviklet å etterligne miljø kreves for biomedisinsk programmer som tissue engineering og kontrollert stoff levering. Utviklingen av materialer med bedre egenskaper for immobilisering av celler eller enzymer er også en gjeldende emne for forskning i bioprocess engineering. En av de mest attraktive egenskapene til et materiale i disse programmene er imidlertid antimikrobielle kapasiteten til å unngå eventuelle uønskede infeksjoner. For dette presenterer vi lett-å-følge protokollene for antimikrobielle karakterisering basert på (i) agar disk diffusjon testen (diffusjon metode) og (ii) ISO 22196:2007-norm å måle den antimikrobielle aktiviteten på materielle overflater (kontakt metode). Denne protokollen må utføres ved hjelp av Gram-positive og Gram-negative bakterier og gjær for å dekke et bredt spekter av mikroorganismer. Eksempel testes 4 materialer med forskjellige kjemiske naturer etter denne protokollen mot Escherichia coliog Staphylococcus aureus, og Candida albicans. Resultatet av disse testene viser ikke-antimikrobielle aktivitet for første materialet og øke antibakteriell aktivitet mot Gram-positive og Gram-negative bakterier for de andre 3 materialene. Men er ingen av 4 stand til å hemme veksten av Candida albicans.

Introduction

Implantatet feil er ofte en konsekvens av mikrobielle infeksjoner som oppstår på tross av antimikrobielle profylakse og aseptiske arbeidsforhold. Dette problemet er forårsaker svært høy helsetjenester kostnader og sørgelig blant pasienter1. Viktig bakterier som Staphylococcus aureus anses nå å være veldig farlige patogener i nosokomiale infeksjoner knyttet katetre og andre medisinske implantater og er de viktigste forurensningene av medisinske instrumenter2. Derfor utviklingen av romanen antimikrobielle strategier er et presserende behov for både daglig og medisinsk bruker.

Antimikrobielle midler inkluderer antibiotika3, kvartære ammonium forbindelser4, ioner/metalloksider5og antimikrobielle peptider (ampere)6. Antibiotika er gradvis blir mindre effektiv på grunn av resistens7, som er en økning på grunn av antibiotika overforbruk8. Kvartære ammonium forbindelser er bare veldig effektivt en kortvarig bruk mikrobiell motstand9. Ioner/metalloksider har lenge vært benyttet som svært effektiv antimikrobielle midler og brukes i mange vanlige kommersielle produkter inkludert bandasjer, vann filtre, maling, etc.10,11,12. Imidlertid har det vært vist at disse typer forbindelser kan være giftig for enkelte typer pattedyrceller13.

Forsterkere viser utmerket antimikrobielle og immunmodulerende egenskaper14,15, og bakterier synes å finne det svært vanskelig å utvikle en motstand mot dem16. Men er prosessen for å produsere ren ampere dyrt; Derfor er en storstilt produksjon ikke levedyktig. Dermed utviklet strategier for å motvirke problemene i produsere forsterkere har vært (f.eks, små molekylære antibakterielle peptoid etterlikner17, peptoids18, α-peptider19 og β-peptider20). Methacrylate-slutt polypeptides og polypeptoids har blitt syntetisert for antimikrobielle og antifouling belegg21.

Utvikling av nye antimikrobielle midler som avanserte materialer i ren eller hybrid form, kunne forebygge og behandle multidrug-resistente infeksjoner, er stadig nødvendig. En rekke nye avanserte materialer for mange bioteknologi felt som vev og bioprocess utvikling har blitt utviklet med forbedret kjemiske og fysiske egenskaper i de siste tiårene gjennom flere metoder: plasma-polymerisasjon pode på en hydrofobe substrat22,23,24, skreddersy crosslinking tetthet25,26, polymerisasjon i løsningen27,28,29 , 30, porogen oppløsning31,32, og innlemmelse av nanomaterialer som Grafén oksid (gå)33,34,35,36 og Carbon nanofibers (CNFs)37.

Studiet av antimikrobielle kapasiteten på disse nye materialer eksponentielt kan øke deres potensielle bioteknologi anvendbarhet og har derfor blitt viktig. Vi presenterer en lett-å-følge protokollen for å kvantifisere den antimikrobielle aktiviteten av slike nye avanserte materialer. Her, etter eksempel utarbeidelse, to utfyllende metoder følges: først er basert på det agar disk diffusjon test38 (diffusjon metode) og andre er basert på ISO 22196:2007 normen39 å måle den antimikrobielle aktiviteten på materielle overflater (kontakt metode).

Protocol

1. sample forberedelse

  1. Skjær materiale prøvene i 10 mm diameter disker med 10 mm diameter sylindriske punch.
    Merk: Sprø materialer kan myknet i egnet sterilt løsemidler 1t og skjær i disker. For eksempel hydrofile materialer som sink alginate ble testet etter denne protokollen og var fuktet i autoklaveres vann før klippe dem for å unngå eksempel bryte. Andre hydrofobe materialer som poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) trenger imidlertid ikke noen form for forrige hevelse for å bli riktig kuttet.
  2. Tørr sample materiale diskene på 60 ° C i vakuum ovn (< 10-2 Torr) for 24 timer.
    Merk: Noen materialer må høy tørking temperatur. Men er det viktig ikke å nå en temperatur som kan termisk fornedre materialet.
  3. Måle materiale filmen tykkelser med en digital tykkelse.
    Merk: Denne protokollen anbefaler utnyttelse av materialet filmer med konstant og lignende tykkelser sammenlignet den antimikrobielle aktiviteten av ulike materialer.
  4. Sterilisere hver prøven ved neddykkelse i etanol 70% for 10 min og påfølgende ultrafiolett (UV) stråling 1t per hver side.
    Merk: UV-stråling kan utføres plassere hver prøven i et sterilt Petriskål inne laminær strømning hette med 12,0 W lampe av UV-C stråling.
    FORSIKTIG: Forskere bør ikke utsette seg for UV-stråling, fordi det er mutagent.
  5. Utfør trinnene 1.1, 1.2, 1.3 og 1.4. med kontroll materiale disker.
    Merk: Polyetylentereftalat (PET) eller alternativ ikke-antimikrobielle materialer kan brukes som kontroll disker i metoden spredning og kontakt. Når karakterisere nanocomposites eller behandlet materiale, bør videre grunnmaterialet brukes som kontroll materiale.

2. anbefalte mikroorganismer

Merk: Vi anbefaler bruk av 3 forskjellige mikroorganismer å studere antimikrobielle kapasiteten av testet mot en rekke mikroorganismer.

  1. Bruk ren kulturer av 3 mikroorganismer: de Gram-positive bakteriene Staphylococcus aureus, Gram-negative bakterier Escherichia coliog gjær Candida albicans.
    Merk: Andre microorganism arter kan også testes med denne protokollen ved å endre inkubasjon betingelsene hvis nødvendig.
    FORSIKTIG: Nødvendig biosikkerhet målene må følges i henhold til microorganism ansatt i denne protokollen.
  2. Arbeide med pre sterilt autoklaveres materiale og bruk en Bunsen brenner under hele prosessen med mikrobiell manipulering eller biologiske sikkerhetskabinett regjering (om nødvendig) å sikre aseptiske forhold.
    Merk: Anbefalt autoklav forholdene er 121 ° C under 15 min kultur medier og 121 ° C under 20 min for arbeidstiden materialet og biologiske rester.

3. agar Disk Diffusion Test (Diffusion metode)

Merk: Når en flytende spredningen av antimikrobielle forbindelser kan være den viktigste antimikrobielle mekanismen av avanserte materialer, metoden diffusjon gi svært nyttig informasjon om antimikrobielle kapasiteten på materiellet. Materielle disken ligger i sentrum av agar platen kan danne en gjennomsiktig ring sone (halo) der en vekst hemming av mikroorganismer oppstår etter 24 h kultur (se figur 1).

  1. Diffusjon testprosedyren
    1. Forberede og autoklav tryptic soya agar (TSA) følg produsentens instruksjoner.
    2. Hell TSA i sterilt Petri retter aseptiske vilkår bruker en Bunsen brenner eller laminær strømning hette.
      Merk: TSA platene må 4-6 mm tykk.
    3. Kultur forskjellige mikroorganismer skal testes din aerobt for 18 – 24 h i Petri retter med TSA i en inkubator på 37 ° C.
    4. Forberede og autoklav tryptic soya kjøttkraft (TSB) følg produsentens instruksjoner.
    5. Hell TSB i en 50 mL pre-sterilisert sentrifuge rør med en pre-sterilisert serologisk pipette aseptiske vilkår bruker en Bunsen brenner eller laminær strømning hette.
    6. Resuspend noen kolonier fra trinn 3.1.3 i 25 mL TSB i et sterilt sentrifuge rør med en steril bomull swab og vortex dem for 1 min å oppnå en enhetlig blanding.
    7. Justere absorbansen (på 540 nm) kultur med et spektrofotometer passende antall kolonien danner enheter (CFU) per mL: ca 1,5 x 108 CFU/mL for bakterier og 1 x 106 til 5 x 106 CFU/mL for gjær.
      Merk: Kultur og cuvette volumene måle absorbansen må velges i henhold til spektrofotometer utnyttet.
    8. Vortex mikrobiell suppen i 5 sekunder for å forbedre microorganism spredning og kort dukke en steril bomull swab i dette mikrobielle suspensjon. Fjerne overflødig væske ut av vattpinnen ved å trykke seg mot tube veggen som inneholder kulturen.
    9. Jevnt strek mikrobiell kjøttkraft suspensjon med sterilt bomullspinnen onto overflaten av TSA plater i 3 fly til å dekke deres hele overflaten med microorganism og la det tørke i 5 min etter inoculation.
      Merk: For å fjerne fuktighet, TSA platene må plasseres åpen i en invertert på 37 ° C i 10-15 minutter før inoculation.
    10. Sterilisere et par pinsett fordyper seg i et beaker med etanol 96% og deretter flammende dem med Bunsen brenner eller alkohol brenner.
    11. Plass prøven diskene å bli testet og kontrollere disken i sentrum av TSA platene med paret sterilt pinsett.
    12. Inkuber din aerobt TSA platene i invertert stilling ved 37 ° C i 24 timer.
      Merk: For å unngå smitte risiko, er det anbefalt å ruge TSA platene i en invertert. Men hvis prøven disken løsner fra TSA platene, må ikke utføre dette trinnet i en invertert. I dette tilfellet er det anbefalt å tørke plater i laminær strømning panseret. Denne antimikrobielle testen må utføres minst i quadriplicate på ulike dager å sikre reproduserbarhet.
  2. Kontroll av mikrobielle suspensjon konsentrasjon og renhet
    Merk: Følgende er nødvendig for å kontrollere at mikrobielle konsentrasjonen bestemt med spektrofotometer i trinn 3.1.7 er riktig og sikre at det var ingen mikrobiell miljøforurensning. En mikrobiell miljøforurensning kan enkelt oppdages av utseendet til ulike typer mikrobiell kolonier etter 24 h kultur. Videre må ingen mikrobiell forurensning av TSB mediet under sin manipulasjon i desimal føljetong fortynninger sikres med en negativ TSB kontroll plate.
    1. Dispensere sterilt TSB (forberedt i trinn 3.1.4) i sterilt microcentrifuge rør brønnene med egnet autoklaveres tips aseptiske forhold. En av dem vil bli benyttet som en negativ TSB.
    2. Utføre desimal føljetong fortynninger med mikrobiell kjøttkraft suspensjon utnyttet i trinn 3.1.9 i sterilt microcentrifuge rør som inneholder TSB.
    3. Spre 100 µL av hver fortynning på TSA plater ved hjelp av en pre-sterilisert Drigalski slikkepott eller et alternativ instrument. Også spredt 100 μL TSB medium uten microorganism (forberedt i trinn 3.2.1) på en TSA plate som en negativ TSB kontroll plate.
    4. Inkuber din aerobt TSA platene din aerobt ved 37 ° C i 24 timer.
    5. Telle antall koloniene til å kontrollere at den CFU/mL er lik som i trinn 3.1.7.
    6. Kontroller at det er ingen mikrobiell miljøforurensning på TSA plater med bare én type kolonier.
    7. Kontroller at det er ingen mikrobiell forurensning på TSB negativ kontroll platen viser ingen kolonier

4. mål av Antimicrobial aktivitet på materielle overflater (kontaktmetode)


Merk: Når overflaten kontakt kan være den viktigste antimikrobielle mekanismen av noen avanserte materialer, kontakt metoden gi svært nyttig informasjon om antimikrobielle kapasiteten på materiellet. I denne metoden mikroorganismer plasseres direkte på materialoverflaten og deres vekst hemming kan bestemmes etter en viss tid.

  1. Første prosedyre
    1. Forberede og autoklav TSB følge instruksjonene fra produsenten.
    2. Hell TSB i en 50 mL pre-sterilisert sentrifuge rør med en pre-sterilisert serologisk pipette aseptiske vilkår bruker en Bunsen brenner eller laminær strømning hette.
    3. Kultur forskjellige mikroorganismer skal testes din aerobt overnatting i røret med TSB i en orbital shaker (140 rpm) på 37 ° C.
    4. Fortynne overnatting kulturen i 20 mL TSB i et 50 mL pre-sterilisert sentrifuge rør til en konsentrasjon av ca 106 CFU/mL (bestemt med et spektrofotometer på 540 nm).
      Merk: Kultur og cuvette volumene måle absorbansen må velges i henhold til spektrofotometer utnyttet.
    5. Utføre desimal føljetong fortynninger av denne kulturen i sterilt microcentrifuge rør som inneholder TSB. Spre 100 µL av kultur på TSA plater og ruge det din aerobt ved 37 ° C i 24 timer.
    6. Antall kolonier å sikre en første celle konsentrasjon av ca 1 x 106 CFU/mL
    7. Sted 4 kontroll disker for mikrobiell opptelling etter 24 timer og 4 eksempel disker av hver type testet materialer for mikrobiell opptelling etter 24 timer i skiller brønner av en steril 48-vel-plate.
    8. Pipetter 150 µL av mikrobielle suspensjon på hver disk overflate.
  2. Mikrobiell regner med kontroll og testet materialer (etter 24 timer)
    1. Etter trinn 4.1.6, din aerobt ruge 4 utvalg diskene i 48-vel platen ved 37 ° C i 24 timer.
      Merk: Denne 24-timers inkubasjon tiden kan endres for å studere vekst hemming til kortere eller lengre tid.
    2. Etter 24 timer med inkubering, Pipetter 850 µL av sterile PBS på overflaten av 4 utvalg diskene og bland det med den 150 µL av mikrobielle suspensjon.
    3. Samle PBS/mikrobiell suspensjon blandingen og hver disk fra 48-vel platen og overføre dem til et 10 mL pre-sterilisert rør.
    4. Vortex PBS/mikrobiell suspensjon blandingen og hver disk for 1 min, sonicate det på 50 Hz for 5 min og vortex det igjen for 1 min å sikre at ingen levedyktig mikroorganismer forblir overholdt materialoverflaten.
    5. Utføre desimal føljetong fortynninger av hver sonicated kultur i sterilt microcentrifuge rør som inneholder TSB og spre 100 µL av kultur på TSA plater og ruge det din aerobt ved 37 ° C i 24 timer.
    6. Telle antall kolonier, som er nummeret av levedyktig hver prøve og kontrollere diskoverflaten. Uttrykke dette antallet levedyktig celler i (CFU/mL).
    7. Ta et bilde av den endelige mikrobiell kulturen for eksempel og kontroll diskene.

5. antimikrobielle resultater analyse

Figure 1
Figur 1: målene for normalisert bredden av antimikrobielle "halo". Dette panelet viser diameteren på sonen hemming (diz) og disk diameter (d). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Diffusjon metoden resultater analyse
    1. Måle diameteren på sonen hemming (diz) og disk diameter (d) (se figur 1) med en digital tykkelse.
      Merk: Hemming sone eller antimikrobielle "halo" dannet ved at mikrobiell vekst hemming produsert av antimikrobielle materiale disken (se figur 1). Det er mulig å observere at det er en gjennomsiktig ring sone nær prøven med resten av platen hvor mikroorganismer har vokst riktig (ugjennomsiktig sone).
    2. Bestemme den normaliserte bredden på antimikrobielle "halo" (nwhalo) av hver disk ved å bruke formelen (1).
      (1)Equation 1
    3. Bestemme middelverdi og standardavvik av normalisert bredden av antimikrobielle "halo" med 4 bestemt nwhalo verdiene for hvert utvalg.
    4. Ta et bilde av siste mikrobiell kultur med materiale disken.
      Merk: Diameteren på sonen hemming (diz) og disk diameter (d) kan også måles fra fotografi tatt i trinn 5.1.4 ved hjelp av en passende bildebehandling.
  2. Kontaktmetode resultater analyse
    1. Bestemme antall levedyktig mikroorganismer gjenopprettet etter formelen (2).
      (2)Equation 2
      Merk: Her N er antall levedyktig mikroorganismer gjenopprettet per cm2 per test prøven; C er plate teller; D er fortynningsfaktoren; Er areal på test prøven i cm2 bestemt med eksempel disk diameter .
    2. Bestemme tap av levedyktighet (LV) å reflektere hemming av cellevekst ved å bruke formelen (3).
      (3)Equation 3
      Merk: Her C er gjennomsnittlig antall levedyktig mikroorganismer (N) i CFU/mL•cm2, utvinnes fra den kontroll prøver etter 24 timer; S er antall levedyktig mikroorganismer (N) i CFU/mL•cm2utvinnes fra prøvene etter 24 timer.
    3. Bestemme middelverdi og standardavvik av tapet av levedyktighet av 4 bestemt LV(%) verdiene til hvert utvalg.

Representative Results

Denne protokollen ble ansatt, som et eksempel, teste antimikrobielle kapasitet 4 materialer med forskjellige kjemiske naturer mot 3 anbefalt mikroorganismer: Escherichia coliog Staphylococcus aureus, og Candida albicans . Resultatene av agar disk diffusjon tester (diffusjon metode) viste ikke-antimikrobielle aktivitet for første materiale (M1) som det skjedde i kontroll-disk (C, bilde ikke vist) og øke antibakteriell aktivitet mot Gram-positive og Gram-negative bakterier for de andre 3 materialene M2, M3 og M4 (se figur 2).

Figure 2
Figur 2: antimikrobielle diffusjon metoden resultater. Dette panelet viser antimikrobielle diffusjon metoden for 4 materiale (M1, M2, M3 og M4) diskene (10 mm diameter x 1 mm tykkelse) mot S. aureus og E. coli etter 24 timer med inkubering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3 viser forskjellige normalisert kolonnebreddene antimikrobielle "halo" (nwhalo) for annet eksempel materialet M1, M2 og M3 M4 mot Gram-positive og Gram-negative bakterier beregnet med formel (1). Men var ingen av 4 stand til å hemme veksten av gjær Candida albicans (bilder ikke vises).

Figure 3
Figur 3: antimikrobielle diffusjon "halo" resultater. Dette panelet viser den normaliserte "halo" (nwhalo) for hver materiale (M1, M2, M3 og M4) disk (10 mm diameter x 1 mm tykkelse) mot S. aureus og E. coli etter 24 timer med inkubering. Forskjellene er statistisk signifikant (p < 0,01). Imidlertid utstilt prøve M1 ingen antimikrobielle aktivitet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Resultatene av metoden kontakt utstilt også ikke-antimikrobielle aktivitet for første materiale (M1) som det skjedde i kontroll diskett (C) og økende antibakteriell aktivitet mot Grampositive og Gram-negative bakterier for de andre 3 materialene (se Figur 4).

Figure 4
Figur 4: antimikrobielle kontakt metoden resultater. Dette panelet viser respektive 90 mm plater 4 materiale (M1, M2, M3 og M4) overflate antimikrobielle aktivitet analysen i henhold til ISO 22196:2007 etter 24 timer med inkubering for S. aureus og E. coli (fortynningsfaktoren for 10-4). C er levedyktig bakterier utvinnes fra kontroll disken etter 24 timer med inkubering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tap av levedyktighet (%) ble fastsatt likning (2) og (3) som angitt i denne protokollen (se figur 5).

Figure 5
Figur 5: tap av levedyktighet av kontaktmetode. Dette panelet viser tap av levedyktighet (%) for M1, M2, M3 og M4 mot S. aureus og E. coli på materielle overflater. Eksempel M1 utstilt ingen antimikrobielle aktivitet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Men var ingen av 4 stand til å hemme veksten av gjær Candida albicans av metoden kontakt enten (bilder ikke vises). Derfor 3 av disse 4 avanserte materialer viste positive antimikrobielle resultater mot Gram-positive og Gram-negative bakterier, og dermed kan være svært nyttig for mange bioteknologi programmer med høy antibakteriell aktivitetskrav. Men var ingen av 4 i stand til å hemme veksten gjær.

Discussion

Den antimikrobielle aktiviteten av nye avanserte materialer kan analyseres av denne lett-å-følge protokollen bestående av 2 komplementære prosedyrer basert på 2 eksisterende metoder: agar disk spredningen test38 og den antimikrobielle aktiviteten målt på materielle overflater i henhold til ISO 22196:2007 normen39.

I denne forskningsfelt er mange av de antimikrobielle testene rapportert i litteraturen svært analysen-avhengige. Derfor er det svært viktig å ha detaljert og konsekvent protokoller på plass over laboratorier. Denne artikkelen er et skritt i riktig retning. Videre, det kan være svært nyttig for mange forskere som er mindre erfarne i dette feltet og krever grundig, trinnvise fremgangsmåter du skal følge nøyaktige resultater.

Denne protokollen kan brukes med mange typer materialer kuttet i disk former av 10 mm diameter. Sprøtt materiale kan bli hovne i et egnet løsemiddel 1t gjengi kutte prosessen enklere. Dermed kan hydrofile materialer som alginater være hydrert i autoklaveres destillert vann. Andre løsemidler, for eksempel etanol og keton diklormetan, kan brukes til å svelle hydrofobe materialer 1t før klippe dem. Imidlertid noen materialer som poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) trenger ikke å være hovne og de kan bli kuttet direkte. Etter at er det svært viktig å tørke sample materiale diskene i et vakuum ovnen og sterilisere hver prøven med etanol og UV-stråling 1t for å unngå smitte risiko.

Denne protokollen anbefaler TSA og TSB som kultur medier og bruk av ren kulturer av 3 mikroorganismer å nå en rekke mikroorganismer: de Gram-positive bakteriene Staphylococcus aureus, Gram-negative bakterier Escherichia coli og gjær Candida albicans. Alternativ kultur medier og andre mikroorganismer trenger forskjellige inkubasjon forhold kan imidlertid også brukes med denne protokollen. Noen ganger er bare 1 microorganism testet for å ha en første idé om den antimikrobielle aktiviteten et nytt materiale.

Materialet viser sterke antimikrobielle aktivitet mot anbefalte 3 forskjellige typer mikroorganismer bør også testes mot antibiotika-resistente patogener som meticillinresistente Staphylococcus epidermidis (MRSE), som har vært vellykket benyttet med denne protokollen. Andre viktige narkotika-resistente mikroorganismer som forårsaker mye bekymring er de Gram-positive Meticillinresistente Staphylococcus aureus (MRSA) og vancomycin-resistente enterokokker (VRE) og Gram-negative Pseudomonas aeruginosa40,41.

Biofilm hemming og antimikrobielle aktiviteten av materialer mot andre typer mikroorganismer som virus og parasitter kan ikke testes med denne protokollen. Men gir denne protokollen svært nyttig utgangspunkt for en antimikrobiell studie av en ny avansert materiale.

I antimikrobielle agar disk diffusjon testen oppstår en kritisk trinn når eksempel disken har å bli plassert i midten av tallerkenen fordi noen materialer brett så snart de kommer i kontakt med agar media. I dette tilfellet anbefales det å bruke et sterilt par pinsett til å nøye brette prøven. På den annen side, i kontakt metoden, er det avgjørende å vaske kontrollen og eksempel disker godt med PBS av pipettering dem fire ganger etterfulgt av en kraftig vortexing og sonication for å sikre at ingen levedyktig mikroorganismer forblir adhered til materialet overflaten.

Denne video protokollen kan brukes i mange bioteknologi-programmer, for eksempel bioprocess engineering, vev engineering, kontrollerte stoffet levering, emballasje, avløpsvann og landbruk, som bruker biologisk materiale med en høyt ønskelig antimikrobielle kapasitet.

Resultatene med denne protokollen er kvalitativ (bilder) og kvantitativ (normalisert bredden på den antibakterielle "halo" og tap av levedyktighet) med en god analyse av sin reproduserbarhet (gjennomsnittlig ± standardavvik). Når du sammenligner ulike materialer, må disse mener verdier hentet med spredning og kontakt metoden resultater analyse analyseres av enveis ANOVA, etterfulgt av Tyrkias legge hoc analyse, for å studere hvis de er statistisk signifikant forskjellige (p < 0,01).

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å erkjenne Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir for økonomisk støtte for dette gjennom 2017-231-001UCV og 2018-231-001UCV gir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cylindrical punch  10 mm diameter
Petri dishes soria genlab P101 90 mm diameter, sterile
Tryptic soy agar (TSA) Liofilchem 610052 Dehydrated medium 500 g (powder)
Tryptic soy broth (TSB) Liofilchem 610053 Dehydrated medium 500 g (powder)
Sterile cotton swab EUTOTUBO 300200
Centrifuge tubes VIDRA FOC, SA 429900 50 mL, sterile
Ethanol VWR 83813360 Absolute ethanol
Sterile 48-wells plate COSTAR 3548 Flat bottom with lid, tissue culture treated, non-pyrogenic, polystyrene
A pair of tweezers BRAUN 24612036 Toothless
Sterile phosphate buffered saline (PBS). VWR E404-100TAPBS
Vaccum oven with a connected vacuum pump JP Selecta, SA 5900620
Laminar flow hood TELSTAR Technologies, SL TELSTAR AH-100 12.0 W lamp of UV-C radiation
Class II Biological safety cabinet LABOGENE MARS 1200
Incubator ASTEC CO, LTD SCA-165DR
Vortex mixer Biosan V-1 Plus
Spectrophotometer Macherey-Nagel, Germany Nanocolor UV/VIS II
Bunsen burner JP Selecta, SA 7001539
Alcohol burner VIDRA FOC, SA 1658/20 In case sterilisation is necessary to be performed inside class II biological safety cabinet
Orbital shaker sartorius stedim 8864845
Sonicator SELECTA 3000617 50/60 Hz
Digital calliper ACHA 17-260 0-150 mm
Serological pipette Fisherbrand 13-678-11 25 mL, sterile
Serological pipette VWR 612-4950 5 mL, sterile
Serological pipette VWR 612-5541 10 mL, sterile
Micropipette GILSON FA10005P Pipetman L P200L, plastic 20-200 µL
Micropipette GILSON F123602 Pipetman P1000, 200-1000 µL
Micropipette  GILSON FA10016 Pipetman L P12X300L, 20-300 µL
Micropipette tips LABBOX TIBP-200-960 2-200 µL
Micropipette tips LABBOX TIBP-1K0-480 100-1000 µL
Pre-sterilized tube  INSULAB 301402 10 mL 
Photo camera Canon EOS 5D Any camera with high resolution can also be utilized
Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus  strain V329 Cucarella et al. J Bacteriol 183 (9),  2888–2896 (2001)
Gram-negative bacteria Escherichia coli Colección Española de Cultivos Tipo CECT CECT 101
Yeast Candida albicans Colección Española de Cultivos Tipo CECT CECT 1394
Microcentrifuge tubes  DASLAB 175508 1,5 mL
Autoclave JP Selecta, SA 4002136
Spectrophotometer-cuvettes UVAT Bio CB F-0902-02 4,5 mL
Drigalski spatula LABBOX SPRP-L05-1K0 Sterile, disposable 
glass balls (2 mm diameter) Hecht Karl 1401/2 Autoclavable, alternative device to the Drigalski spatula
Autoclave bags DELTALAB 200318 To sterilize microbiological residues or contaminated material
Electronic pipette filling device JetPip JET BIOFIL
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 LABBOX SBG3-100-010 100 mL, for autoclaving culture media
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 LABBOX SBG3-250-010 250 mL, for autoclaving culture media
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 LABBOX SBG3-500-010 500 mL, for autoclaving culture media
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 LABBOX SBG3-1K0-010 1000 mL, for autoclaving culture media
Latex gloves DENIA 2278000000
Indicator tape for sterilization LABBOX STAP-A55-001 Self-adhesive tape with impregnated paper turning to colour when exposed to sterilization process.
Universal test tube rack LABBOX MTSP-001-001 To hold centrifuge tubes
Microcentrifuge tube rack VWR 211-0210 To hold microcentrifuge tubes
Sterile loop ACEFE S.A. 100140055 10 µL of capacity for microbial culture 
Material M1 Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) Material type 1 
Material M2 Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) Material type 2 
Material M3 Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) Material type3
Material M4 Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) Material type 4 
Material C Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) Control material

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sydnor, E. R. M., Perl, T. M. Hospital epidemiology and infection control in acute-care settings. Clin Microbiol Rev. 24 (1), 141-173 (2011).
  2. Chessa, D., et al. Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis Virulence Strains as Causative Agents of Persistent Infections in Breast Implants. PLoS One. 11 (1), e0146668 (2016).
  3. Pandey, H., Parashar, V., Parashar, R., Prakash, R., Ramteke, P. W., Pandey, A. C. Controlled drug release characteristics and enhanced antibacterial effect of graphene nanosheets containing gentamicin sulfate. Nanoscale. 3 (10), 4104 (2011).
  4. Jia, Z., Shen, D., Xu, W. Synthesis and antibacterial activities of quaternary ammonium salt of chitosan. Carbohydr Res. 333 (1), 1-6 (2001).
  5. Liu, Y., Wang, X., Yang, F., Yang, X. Excellent antimicrobial properties of mesoporous anatase TiO2 and Ag/TiO2 composite films. Microporous Mesoporous Mater. 114 (1-3), 431-439 (2008).
  6. Wang, L., Chen, J., Shi, L., Shi, Z., Ren, L., Wang, Y. The promotion of antimicrobial activity on silicon substrates using a "click" immobilized short peptide. Chem Commun (Camb). 50 (8), Cambridge, England. 975-977 (2014).
  7. Kümmerer, K. Resistance in the environment. J Antimicrob Chemother. 54 (2), 311-320 (2004).
  8. Ng, V. W. L., et al. Antimicrobial hydrogels: A new weapon in the arsenal against multidrug-resistant infections. Adv Drug Deliv Rev. 78, 46-62 (2014).
  9. Hegstad, K., Langsrud, S., Lunestad, B. T., Scheie, A. A., Sunde, M., Yazdankhah, S. P. Does the Wide Use of Quaternary Ammonium Compounds Enhance the Selection and Spread of Antimicrobial Resistance and Thus Threaten Our Health? Microb Drug Resist. 16 (2), 91-104 (2010).
  10. Rana, D., Matsuura, T. Surface modifications for antifouling membranes. Chem Rev. 110 (4), 2448-2471 (2010).
  11. Lok, C. N., et al. Proteomic analysis of the mode of antibacterial action of silver nanoparticles. J Proteome Res. 5 (4), 916-924 (2006).
  12. Chen, X., Schluesener, H. J. Nanosilver: A nanoproduct in medical application. Toxicol Lett. 176 (1), 1-12 (2008).
  13. Ahamed, M., AlSalhi, M. S., Siddiqui, M. K. J. Silver nanoparticle applications and human health. Clin Chim Acta. 411 (23-24), 1841-1848 (2010).
  14. Yeaman, M. R. Mechanisms of Antimicrobial Peptide Action and Resistance. Pharmacol Rev. 55 (1), 27-55 (2003).
  15. McLean, D. T. F., Lundy, F. T., Timson, D. J. IQ-motif peptides as novel anti-microbial agents. Biochimie. 95 (4), 875-880 (2013).
  16. Brogden, K. A. Antimicrobial peptides: Pore formers or metabolic inhibitors in bacteria? Nat Rev Microbiol. 3 (3), 238-250 (2005).
  17. Ghosh, C., et al. Small molecular antibacterial peptoid mimics: The simpler the better! J Med Chem. 57 (4), 1428-1436 (2014).
  18. Chongsiriwatana, N. P., et al. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proc Natl Acad Sci. 105 (8), 2794-2799 (2008).
  19. Chen, Y., Mant, C. T., Farmer, S. W., Hancock, R. E. W., Vasil, M. L., Hodges, R. S. Rational design of alpha-helical antimicrobial peptides with enhanced activities and specificity/therapeutic index. J Biol Chem. 280 (13), 12316-12329 (2005).
  20. Porter, E. A., Wang, X., Lee, H. S., Weisblum, B., Gellman, S. H. Non-haemolytic beta-aminoacid oligomers. Nature. 404 (6778), 565 (2000).
  21. Gao, Q., Li, P., Zhao, H., Chen, Y., Jiang, L., Ma, P. X. Methacrylate-ended Polypeptides and Polypeptoids for Antimicrobial and Antifouling Coatings. Polym Chem. 8 (41), 6386-6397 (2017).
  22. Serrano-Aroca, Á, Gómez-Ribelles, J. L., Monleón-Pradas, M., Vidaurre-Garayo, A., Suay-Antón, J. Characterisation of macroporous poly(methyl methacrylate) coated with plasma-polymerised poly(2-hydroxyethyl acrylate). Eur Polym J. 43 (10), 4552-4564 (2007).
  23. Serrano-Aroca, Á, Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L. Plasma-induced polymerisation of hydrophilic coatings onto macroporous hydrophobic scaffolds. Polymer (Guildf). 48 (7), 2071-2078 (2007).
  24. Serrano-Aroca, Á, Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L., Rault, J. Thermal analysis of water in reinforced plasma-polymerised poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels. Eur Polym J. 72, 523-534 (2015).
  25. Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L., Serrano-Aroca, Á, Gallego-Ferrer, G., SuayAntón, J., Pissis, P. Interaction between water and polymer chains in poly(hydroxyethyl acrylate) hydrogels. Colloid Polym Sci. 279 (4), 323-330 (2001).
  26. Serrano-Aroca, Á, Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L. Effect of crosslinking on porous poly(methyl methacrylate) produced by phase separation. Colloid Polym Sci. 286 (2), 209-216 (2008).
  27. Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L., Serrano-Aroca, Á, Gallego Ferrer, G., Suay Antón, J., Pissis, P. Porous poly (2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels. Polymer (Guildf). 42 (10), 4667-4674 (2001).
  28. Serrano-Aroca, Á, Monleón-Pradas, M., Gómez-Ribelles, J. L. Macroporous poly(methyl methacrylate) produced by phase separation during polymerisation in solution. Colloid Polym Sci. 285 (7), 753-760 (2007).
  29. Serrano-Aroca, Á, Llorens-Gámez, M. Dynamic mechanical analysis and water vapour sorption of highly porous poly(methyl methacrylate). Polymer (Guildf). 125, 58-65 (2017).
  30. Serrano-Aroca, Á, Campillo-Fernández, A. J., Gómez-Ribelles, J. L., Monleón-Pradas, M., Gallego-Ferrer, G., Pissis, P. Porous poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels prepared by radical polymerisation with methanol as diluent. Polymer (Guildf). 45 (26), 8949-8955 (2004).
  31. Rodríguez-Hernández, J. C., Serrano-Aroca, Á, Gómez-Ribelles, J. L., Monleón-Pradas, M. Three-dimensional nanocomposite scaffolds with ordered cylindrical orthogonal pores. J Biomed Mater Res - Part B: Appl Biomater. 84 (2), 541-549 (2008).
  32. Brígido-Diego, R., et al. Acrylic scaffolds with interconnected spherical pores and controlled hydrophilicity for tissue engineering. J Mater Sci Mater Med. 40 (18), 4881-4887 (2005).
  33. Serrano-Aroca, Á, Ruiz-Pividal, J. F., Llorens-Gámez, M. Enhancement of water diffusion and compression performance of crosslinked alginate with a minuscule amount of graphene oxide. Sci Rep. 7, 11684 (2017).
  34. Serrano-Aroca, Á, Deb, S. Synthesis of irregular graphene oxide tubes using green chemistry and their potential use as reinforcement materials for biomedical applications. PLoS One. 12 (9), e0185235 (2017).
  35. Sánchez-Correa, F., Vidaurre-Agut, C., Serrano-Aroca, A., Campillo-Fernández, A. J. Poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels reinforced with graphene oxide: Remarkable improvement of water diffusion and mechanical properties. J Appl Polym Sci. , (2018).
  36. Serrano-Aroc, Á, Iskandar, L., Deb, S. Green synthetic routes to alginate-graphene oxide composite hydrogels with enhanced physical properties for bioengineering applications. Eur Polym J. 103, 198-206 (2018).
  37. Llorens-Gámez, M., Serrano-Aroca, Á Low-Cost Advanced Hydrogels of Calcium Alginate/Carbon Nanofibers with Enhanced Water Diffusion and Compression Properties. Polymers (Basel). 10 (4), 405 (2018).
  38. Bauer, A. W., Kirby, W. M. M., Sherris, J. C., Turck, A. M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. A J Clin Pathol. 45, 493-496 (1966).
  39. ISO Specification 22196: measurement of antibacterial activity on plastics surfaces. , 584 (2007).
  40. Taubes, G. The bacteria fight back. Science. 321 (5887), 356-361 (2008).
  41. Boucher, H. W., et al. 10 x '20 progress--development of new drugs active against Gram-negative bacilli: an update from the infectious diseases society of America. Clinical Infectious Diseases. 56 (12), 1685-1694 (2013).

Tags

Bioteknologi problemet 138 avanserte materialer antimikrobiell karakterisering disk diffusjon overflate bioteknologi
Antimikrobielle karakteristikk av avanserte materialer for bioteknologi programmer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martí, M., Frígols, B.,… More

Martí, M., Frígols, B., Serrano-Aroca, A. Antimicrobial Characterization of Advanced Materials for Bioengineering Applications. J. Vis. Exp. (138), e57710, doi:10.3791/57710 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter