Summary
在这里, 我们提出了一个阶段和解剖发展的嗅觉组织从果蝇物种的协议。解剖后的组织可用于分子分析, 如定量 rt-pcr (反向转录-聚合酶链反应) 或 RNA 测序 (RNAseq), 以及体内分析, 如免疫组化或原位杂交。
Abstract
果蝇嗅觉系统是发展神经生物学、神经系统神经系统学、神经生理学、行为学和行为进化等广泛应用的系统。果蝇嗅觉组织家的嗅觉受体神经元 (ORNs), 检测挥发性化学线索, 除了水力和热感官神经元。在本议定书中, 我们描述了发展成人果蝇周围嗅觉组织的解剖。我们首先描述如何分期和年龄果蝇幼虫, 其次是解剖的触角盘从早期蛹阶段, 其次是解剖的触角从中蛹阶段和成人。我们还展示了在分子技术中可以利用制剂的方法, 如 RNA 提取 qRT PCR、RNAseq 或免疫组化。这些方法也可以应用于其他果蝇物种后, 物种特定的蛹开发时间确定, 并为适当的老化计算各个阶段。
Introduction
果蝇嗅觉系统是发展神经生物学、神经系统神经系统学、神经生理学、行为研究和行为进化1、2、3的一种广泛应用的系统, 4。果蝇嗅觉组织家的嗅觉受体神经元 (ORNs), 检测挥发性化学线索除了水力和热感官神经元1,5,6。本手稿的总体目标是演示如何在果蝇物种中进行蛹和成人嗅觉组织的分期和解剖。这种技术的基本原理是从不同的蛹阶段生成样本, 用于对外围嗅觉系统进行分子和发展分析, 如 RNAseq 和定量 rt-pcr, 除了体内组织标记技术.这项技术对于识别发育中的成人嗅觉系统中非腹果蝇物种的转录剖面的动力学特别有用, 因为它没有所有的细胞类型特定的转基因试剂。标签和分析。在这篇手稿中, 我们演示如何解剖触角光盘和触角从蛹和成年果蝇物种。首先, 我们展示了如何识别果蝇0 h 的蛹壳形成 (APF, 白蛹或预蛹) 的发展分期和物种特定的衰老。接下来, 我们展示了如何解剖触角盘和第三触角段;具体来说, 如何将它们从眼盘和第二触角段中分离出来, 以 RNAseq 或 RT PCRs 所需的组织纯度。本协议中描述的D.触角的阶段大致对应于预阵列 (预蛹), 从触角盘 (8 h apf) 中选取前体, ORNs (40 h apf) 的终端分化开始, 以及成人天线。最后, 给出了用该方法分离成人触角的定量 rt-pcr 的例子, 并对体内免疫组化进行了研究。该方法可用于生成 RNA/DNA 分析样本和免疫组化技术, 用于开发不同果蝇物种的外周嗅觉组织。
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Protocol
以下议定书符合杜克大学研究伦理学委员会制定的道德准则。
1.果蝇蛹的组织制备及发育分期
- 首先, 确定解剖需要多少苍蝇。对于 RT PCR 和 RNAseq, 收集 100-200 触角光盘和触角的个人, 这是必要的 prepupal, 8 h apf, 40 h 有源电力, 和成人阶段。免疫组化, 解剖 10-20 个人。
- 清洁所有材料, 包括解剖垫和镊子, 使用70% 乙醇的湿巾。如果被解剖的材料用于 RNA 提取, 清洁所有与 RNase 中和剂并且使用无核酸酶或二乙基焦碳酸 (DEPC) 处理的水的所有解答。
注: 本协议使用硅胶夹层垫代替玻璃进行解剖。硅胶垫是友好的超细钳和促进快速和高质量的解剖。 - 在 0 h 型 APF/prepupal 阶段采集蛹。
- 为了确保最精确的分期, 监测幼虫在30分钟至1小时间隔。
注意: 在适度拥挤的瓶子里游荡的第三龄幼虫可能会在几个小时内蛹。 - 一旦幼虫变得不动, 被一个非常轻 (几乎是白色) 的彩色蛹壳所包围, 将它们转移到一个小的2在培养皿中, 带有湿润的滤纸。
- 继续 1-2 小时, 偶尔监视、识别和转移预蛹。
注: 另外, 清除一瓶所有蛹, 并允许幼虫发育2小时。所有2小时后收集的蛹将在 0-2 h APF 范围内。
- 为了确保最精确的分期, 监测幼虫在30分钟至1小时间隔。
- 立即移动到步骤 3.1, 以解剖 prepupal 触角盘为 0 h APF 阶段。如果预蛹需要老化, 把它们收集到盘子里, 盖上盘子, 在边缘周围放置一层石蜡膜, 以抑制干燥, 并将培养皿放在25摄氏度。
注: 蛹现在可以老化到羽化。 - 对于在2小时范围内收集的蛹, 年龄预蛹为2小时小于所需年龄, 以确保蛹不过剩。
- 使用超细钳 (55), 因为组织是非常小和脆弱的。
2. 其他果蝇品种的组织制备和蛹的发育分期
- 为了确定其他果蝇物种蛹发育的长度, 请将样品放在最佳温度下, 记录预蛹观察到的日期, 将它们分类为新鲜的小瓶, 并记录从预蛹到成年的天数。
- 记录非黑腹和蛹的发育时间比例. 将发育时间的比例乘以用于腹腹的小时数, 以获得非黑腹动物的年龄.
3. 蛹触角瓣的解剖
注: 所有老化时间和解剖协议都描述为果蝇.就所有其他物种而言, 如上文所述, 需要根据物种特定的发展时间点修改老化协议。
- 对于蛹触角椎间盘解剖, 收集 50-100 0-2 小时或 6-8 h 老蛹使用铲, 并把它们放在解剖垫上。
- 吸管150µL 的 RNA 隔离溶液成一个 RNase 自由1.5 毫升离心管使用200µL 吸管, 并把管放在冰上。
- 解剖蛹在 150-200 µL 1x PBS (磷酸盐缓冲盐水, 核酸酶)。在解剖垫上放置多滴 PBS (每滴 150-200 µL)。
- 在解剖垫上, 放置 0-2 小时或 6-8 小时的蛹 (一个蛹每滴) 被解剖在 1x PBS 水滴之一。用钳子一只手来稳定身体。
- 对于 0-2 小时的蛹, 使用镊子, 另一方面, 抓住最前面的部分 (口钩) 的预蛹, 并拉出它暴露的大脑和形象光盘附着在前蛹的情况下。
- 对于 8 h 型有源性蛹, 首先从蛹的最前节轻轻剥下蛹的外壳, 将头部暴露在身体周围的膜袋内。
注意: 身体, 在这个阶段, 看起来像一个退化的幼虫。 - 把头移到颈部关节上。
注意: 这确保了触角光盘不会丢失, 在这个阶段, 主要是连接到大脑的视神经裂片。 - 使用镊子或20µL 吸管将组织与大脑和形象盘转移到另一 1x PBS 液滴上。
- 识别与大脑在视神经裂片上连接的眼触角盘。使用镊子, 从大脑和蛹的情况下拔下眼触角盘。使用镊子或20µL 吸管将其转移到新的 1x PBS 液滴上。
注: prepupal 眼触角盘为扁平组织。然而, 在8小时的蛹, 眼球被旋转拔罐的触角盘, 它位于中央大脑前。 - 使用镊子, 切除眼睛和触角之间的连接部位的组织。使用20µL 吸管将解剖组织轻轻地转移到 RNA 隔离溶液试剂中。尽量减少吹打转移的液体数量。
- 重复, 直到所有的蛹被解剖。
4. 蛹和成人触角的解剖
注: 由 40 h 型 APF, 大多数变形是完整的, 成人结构变得明显, 但仍然是白色和无可名状的。在这个发展的时间点, 成年天线已经采取了它的最终形状, 但仍然是透明的, 大多数的嗅觉受体, 除了少数, 尚未开始表达。
- 对于蛹触角解剖, 收集 50-100 预蛹描述在步骤1和年龄他们为40小时在25°c。
- 吸管150µL 的 RNA 隔离溶液成一个 RNase 自由1.5 毫升离心管使用200µL 吸管, 并把管放在冰上。
- 在解剖垫上, 将蛹解剖成 1x PBS 液滴之一。用钳子一只手来稳定身体。另一方面, 使用镊子, 轻轻剥去从蛹的最前一季度蛹的情况下, 暴露头部内的膜袋, 周围的身体。
- 使用镊子, 小心地切断从其余的蛹身体的头部, 通过持有一组钳和撕裂头在颈部关节与另一套镊子。用镊子轻轻将头部转到另一 1x PBS 液滴上。用吸管向上和向下清理头部 (大脑等) 的内容, 以获得用于环绕显影果蝇头部的透明膜。
注: 在 40-50 h 型 APF 中, 触角连接到膜的最前面部分。当头部的内容与吹打清除时, 它们将变得明显。 - 使用镊子, 从膜上拔下蛹触角。将天线的 2 和段从 3路拔下, 用镊子在节段关节上切片, 因为只有 3路段将嗅到受体神经元。
- 使用20µL 吸管将解剖组织轻轻地转移到 RNA 隔离溶液试剂中。尽量减少吹打转移的液体数量。重复, 直到所有的蛹被解剖。
- 成人触角解剖, 收集大约50成人和年龄他们在羽化后一周。
注: 嗅觉受体基因和其他基因的表达在羽化后一周达到峰值。成年人的年龄为一周, 以确保生物学相关的基因与低丰度转录高于检测阈值。 - 对于 RNA 提取, 解剖苍蝇, 而他们仍然活在 CO2垫。用 RNase 抑制剂治疗 CO2垫。为共焦成像, 解剖在解剖垫上的苍蝇在 1x pbs 或 pbs + 0.2% 海卫一。
- 首先, 把成年人睡在 CO2站垫的解剖范围内。在 CO2站垫上, 一方面使用镊子来稳定身体, 另一方面用镊子轻轻拉/捏出第三个触角段。
- 将触角转移到 RNA 隔离溶液中, 用镊子将触角直接放进液体中。重复, 直到所有成年人被解剖。
注意: 确保天线被淹没在 RNA 隔离溶液中。天线可能会卡在管子的侧面。这将导致 rna 的退化增加, 降低 rna 的质量和数量。 - 直接进行 RNA 提取或放置在-80 摄氏度的管长期贮存。
5. RNA 分离从被解剖的组织
- 从-80 摄氏度的储藏中取出所有样品, 然后在冰上解冻。
- 简要地旋转 (5-6 s, ~ 6000 x g) 每个样品收集在管子的底部的材料。
- 在冰上使用蒸压塑料杵和一台电动机在十年代研磨每个样品。
- 重复步骤5.2 和 5.3 4。
- 使用商业上可用的套件执行 RNA 提取, 并按照制造商的协议获得最佳产量。
- 使用商业上可用的试剂和特定的引物对感兴趣的基因进行 qRT PCR, 并遵循制造商的协议。
- 使用以下条件进行所有 PCR 反应:95 °c 变性为10分钟其次40个周期95°c 为十五年代, 55 °c 三十年代和60°c 为三十年代。
注: 在表 1中列出了浸出和休斯敦基因的底漆对, 并列出了嗅觉受体基因的引物 。8。
- 使用以下条件进行所有 PCR 反应:95 °c 变性为10分钟其次40个周期95°c 为十五年代, 55 °c 三十年代和60°c 为三十年代。
6. 蛹触角盘和触角的免疫组化治疗
注: 从 10-20 人的批次中固定组织, 以确保组织在同一时间内修复。将样品停留在 PBT (PBS 和洗涤剂) 的时间减到最小, 然后将其转移到固定件, 以最大限度地提高组织的完整性。
- 在200µL 0.2% PBT 的 200-µL pcr 管中收集解剖触角盘或蛹天线, 以保持组织完整性, 并避免样品粘附在 200-µL pcr 管壁上, 从而导致不完整的固定。
注意: 蛹天线和触角光盘可能很难看到, 因为它们是相当半透明的。最好使用解剖范围的所有洗涤步骤, 以防止任何损失的组织。另外, 96 井 Terasaki 板可用于固定和染色, 以最佳跟踪组织。 - 在室温下, 将大约200µL 4% 粉煤灰 (多聚甲醛) 的蛹中的解剖触角盘和触角标本固定在30分钟内。对于此和后续步骤, 请将管道与 nutator 上的示例保持在一起, 以便正确地混合解决方案中的示例。步骤6.7 的进度。
- 对于成人天线, 首先解剖整个头部, 并在室温下将其固定在大约200µL 4% 粉煤灰 (多聚甲醛) 中1小时。
- 洗涤3x 与200µL 0.2% PBT 为10分钟每。在孵化过程中, 将样品保存在 nutator 上。
- 回到解剖显微镜, 以更好的解剖第二触角段从固定头。使用镊子稳定头部, 轻轻拉/捏出第三触角段从第二。
- 将解剖后的第三触角段转移到大约200µL 4% 粉煤灰 (多聚甲醛) 中, 并在室温下将其固定30分钟。
- 洗涤3x 与200µL 0.2% PBT 为10分钟每。在孵化过程中, 将样品保存在 nutator 上。
- 将样品保存在4摄氏度或直接与整个芒特免疫组化。
注意: 当使用抗体时, 染色效果可能会改变。这种方法应该适合于不太丰富的蛋白质标签或较弱的抗体。然而, 有时, 它可能需要优化的协议 (无论是身份或数量的固定器或的时间)。
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Representative Results
经解剖开发的嗅觉组织可用于 RNA 提取, 其次是 rt-pcr 评估基因表达, 或通过免疫组化协议, 以确定其表达模式, 以及基因的亚细胞定位兴趣。在本节中, 我们从任一议定书中提出代表的结果。图 1是典型的定量 rt-pcr, 显示了野生型成人触角中细胞表面受体和嗅觉受体基因的转录。图 2显示了染色 (1:1000) 和抗 lamin 抗体 (1:100) (图 2A和2B) 的 EGFP 转基因苍蝇上的 6-8 h 和 12 h APF 触角盘。EGFP 在触角光盘的早期蛹阶段标记特定区域。我们还显示了 40 h APF 蛹触角抗 GFP 抗体染色Or67d-GAL4 UAS-CD8GFP转基因苍蝇和成人触角抗 elav (1:100) 抗体染色 ORNs (图 2)。其他例子也可以在文献7、8、9、10中找到。
图 1.从野生型成体触角 RNA 样品中提取不同基因的定量 rt-pcr。这些面板显示定量 rt-pcr 的结果 (A)倾角α, 倾角, dpr5, dpr8, kug, beatIIIb (为底漆对见表 1), 和 (B) 嗅觉和离子型受体 (或/Ir)基因从成人触角 RNA 样品。误差线显示平均值 (SEM) 的标准误差。或/Ir基因是低丰度 rna, 仍然可以检测到 qRT PCR。对各基因的表达进行了三种分析。Ct 值被用来计算每个基因的稀释因子根据为每个基因创建的标准曲线。稀释因子然后规范化为每个基因到平均表达所有基因测量了在8之前描述。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2.免疫组化在开发嗅觉组织中使用不同的抗体.这些面板显示抗 GFP (绿色) 和抗 lamin (红色) 抗体染色 (A) 6 h apf 蛹触角光盘和(B) 12 h apf 蛹触角光盘。(C) 此面板显示了一个 40 h APF 天线从Or67d GAL4 UAS-CD8GFP转基因染色兔抗 GFP (绿色) 抗体。(D) 本小组显示有 anti-CD2 抗体染色的成人触角, 标签为Or47b-CD2阳性 ORNs (洋红)。请单击此处查看此图的较大版本.
| 前进底漆 | 反向底漆 | 长度 |
| CGGAGAGGAGGTTATGAGCA | GGAAGTGCACAACTAGCGTT | 143 |
| CGCGAATCGTTGTGTCAGTA | TGTCGATAGCGTGAACCTGA | 129 |
| AGGAGTGGACGTTGAGTTACA | CAATCATGTCCTCGTGACCG | 146 |
| TAGAGTCCGAGCAGCAGATG | GTCAGAATTCGAGTTGTCCGC | 104 |
| GGCGCTAAGTAGCAGGACG | GGCCAAGTCTGTTTGTGAGG | 215 |
| TAAGACCCTAGCGCCCTCTT | AGGGAGATGCGCTTTGAGAC | 129 |
表1。pcr 引物在 qRT pcr 中的应用。
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Discussion
该协议是一个有用的资源, 实验室有兴趣确定的基因和转录程序在开发果蝇嗅觉组织, 以及对这些项目的比较分析果蝇物种。如果需要从不同发育阶段的系统级转录剖面作为未来研究的入门资料, 则特别有用。这里描述的协议演示了如何分期和隔离开发果蝇的嗅觉组织, 从从前阵列到末端分化的四个关键阶段从嗅觉系统开发中获取样本, 用于分子和免疫组织学研究。解剖果蝇触角盘和触角在不同的蛹阶段可以用来识别基因表达谱在系统水平上的嗅觉系统的发展中的 RNA 序列, 或在个别基因水平的定量 rt-pcr。样品也可用于免疫组化和原位杂交, 以确定组织特异基因表达的体内模式。该协议的另一个优点是, 解剖样本可以进一步分离使用标准方法, 并为获得一个纯化细胞群体 (或单细胞) 细胞类型特异的分子分析, 如定量rt-pcr 或 RNAseq。
尽管该协议显示了从蛹 (在0小时/预蛹, 8 小时, 40 h APF) 和成人阶段的触角光盘和天线的解剖, 它可以适应其他蛹时间点。同样值得一提的是, 学习这些解剖需要时间和实践。专家应该能够每小时解剖50个样本。重要的是不要过度的蛹。因此, 在开始解剖前一个小时, 确保没有蛹比所需年龄大。解剖可以花时间学习, 所以在开始实验之前, 每个阶段都需要一段练习期。由于形态学的改变, 解剖变得更加困难从 9-12 h APF。在收集预蛹时, 可以按年龄对蛹进行排序 (按身体颜色, 深色颜色较旧)。最初排序预蛹允许解剖的年龄顺序, 以防止过时效。
上述协议可应用于其他果蝇种类。其他物种的蛹解剖的时间可以根据一个特定物种的蛹发展比例在25摄氏度到D.腹腹和在解剖期间触角/触角盘形态的比较观察, 与优先考虑形态学考虑, 以尽可能相同。对于果蝇, 蛹阶段需要大约4天。sechellia和 d.万寿菊蛹发育分期与腹腹相似;然而, D. 年礼蛹的发展是1.3x 更长的11,12。当其他物种准备进行解剖时, 分期应根据蛹期的时间和阶段特定的触角/触角盘形态的比较观察, 以形态学相似性为最高优先。首先, 确定你感兴趣的物种的最佳处理温度。许多物种的生长良好, 在摄氏25摄氏度, 但有关维修条件的详细信息, 可从加州大学圣地亚哥果蝇物种中心获得。
该议定书最关键的步骤是正确的分期和适当的解剖, 适当的数量来自不同物种的利益组织。一旦这些措施到位, 该议定书为这种分析提供了一种有效的组织收集方法, 并可实际适应任何果蝇物种在蛹阶段的任何发展中的形象椎间盘组织。
此协议的一个限制是它不提供单元格类型特定的示例。对细胞功能和形态学的更详细的了解需要在系统层面上对转录进行细胞类型特异性的分析, 除了诸如定量 rt-pcr 或免疫组化等标准分子程序。细胞类型特异性的分析是困难的, 特别是鉴于缺乏细胞类型特定的记者转基因在非黑腹物种。随着目前的细胞分析, 转基因和 CRISPR-Cas9 介导的基因组编辑在非黑腹物种, 现在可以标记和整理出一个感兴趣的单细胞转录13。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了国家科学基金会对 Pelin c 沃尔坎·武拉尔 (DEB-1457690) 的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Phosphate-buffered Saline | Gibco | 70011-044 | Dilute to 1X in RNase free water |
| CO2 tank | Air Gas | CD R200 | |
| Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | RNA isolation solutions |
| Dissecting Microscope | |||
| Small bucket with ice | |||
| P20 and P200 micropipettes and tips | |||
| 1.7 mL Microfuge tubes | Purchase nuclease free for best results | ||
| 0.2 mL PCR tubes | |||
| Paraformaldehyde powder | Polysciences | 380 | |
| 10% Triton X-100 | Teknova | T1105 | Dilute to 0.2% v/v in 1X PBS |
| 2" petri dishes | |||
| 55mm filter paper | Whatman | 1001-055 | Wet with water and place in a petri dish to keep pupae moist |
| 25 C incubator | |||
| deionized H2O | Purchase nuclease free or treat with DEPC | ||
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | to be used for making dissection pads from Terizaki plate covers. | |
| MicroWell Mini Trays with lids | Nunc | 438733 | Lids can be used to make silicone dissection pads |
| Rabbit anti-GFP antibody | MBL international corpor | PM005 | primary antibody |
| Mouse anti RAT CD2 | AbD seroTec | MCA154RHDL | primary antibody |
| ADL195 (anti lamin, mouse) | Dev studies hydoma ban | ADL195-s | primary antibody |
| Alexa Fluor® 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | invitrogen | A11008 | Secondary antibody |
| Cy3 Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-166-003 | Secondary antibody |
| Triton X-100, Protein Grade Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered | CALBIOCHEM | 648463 | detergent |
| Lab Rotator | Thermo scientific | Rotator | |
| Nuclease Free Water | Growcells.com | NUPW-0125 | Water |
| Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | For cleaning dissection supplies |
| Superscript II | invitrogen | 18064014 | Reverse Transcriptase |
| QIAshredder (50) | RNA extraction | QIAGEN | 79654 |
| Oligo(dT)12-18 Primer | RT | life technologies | 18418012 |
| RNeasy MinElute Cleanup Kit (50) | RNA extraction | QIAGEN | 74204 |
| FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN) | qPCR | Roche | 04913850001 |
| FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER | qPCR | Roche | 06402712001 |
| LIGHTCYCLER 480 - MULTIWELL PLATE 96 | qPCR | Roche | 04729692001 |
| NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix | qPCR | NEB | M0541S |
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