फ्लोरोसेंट प्रोटीन आधारित दृष्टिकोण मेजबान कोशिकाओं में बैक्टीरिया द्वारा स्रावित प्रभाव की निगरानी के लिए चुनौती दे रहे हैं । यह फ्लोरोसेंट प्रोटीन और प्रकार III स्राव प्रणाली के बीच असंगति के कारण है । यहां, एक अनुकूलित विभाजन superfolder GFP प्रणाली मेजबान संयंत्र सेल में बैक्टीरिया द्वारा स्रावित प्रभाव के दृश्य के लिए प्रयोग किया जाता है ।
बैक्टीरिया, विभिन्न पादप रोगों का सबसे महत्वपूर्ण प्रेरणा एजेंटों में से एक, संयंत्र प्रतिरक्षा प्रणाली को विकृत करने के लिए मेजबान संयंत्र सेल में प्रभावक प्रोटीन का एक सेट स्रावित. संक्रमण के दौरान cytoplasmic प्रभाव एक प्रकार III स्राव प्रणाली (T3SS) के माध्यम से मेजबान cytosol के लिए वितरित कर रहे हैं. संयंत्र सेल में प्रसव के बाद, प्रभाव (ओं) के लिए विशिष्ट डिब्बे (ओं) लक्ष्य को जीवित रहने और रोगज़नक़ की प्रतिकृति के लिए मेजबान सेल प्रक्रियाओं का नियमन । हालांकि मेजबान कोशिकाओं में उपसेलुलर स्थानीयकरण पर कुछ शोध किया गया है pathogenicity में अपने समारोह को समझने के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग करके, प्रभाव की गतिशीलता की जांच सीधे बैक्टीरिया से इंजेक्शन T3SS और फ्लोरोसेंट प्रोटीन के बीच असंगति के कारण चुनौतीपूर्ण हो गया है ।
यहां, हम एक अनुकूलित विभाजन superfolder ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन प्रणाली (sfGFPऑप्ट) के हमारे हाल ही में विधि का वर्णन करने के लिए मेजबान सेल में बैक्टीरियल T3SS के माध्यम से दिया प्रभाव के स्थानीयकरण कल्पना । sfGFP11 (11th β-कतरा के sfGFP)-टैग T3SS के माध्यम से स्रावित प्रभाव एक विशिष्ट organelle लक्षित sfGFP1 के साथ इकट्ठे किया जा सकता है-10ऑप्ट (1-10गु β-sfGFP के कतरा) साइट पर प्रतिदीप्ति उत्सर्जन करने के लिए अग्रणी. यह प्रोटोकॉल organelle और Arabidopsis निकोटियाना संयंत्रों में एक विशेष benthamiana में Pseudomonas syringae से एक प्रभाव प्रोटीन के साथ पुनर्गठन sfGFP प्रतिदीप्ति संकेत कल्पना करने के लिए एक प्रक्रिया प्रदान करता है ।
पौधों sessile जीवों कि बैक्टीरिया, कवक, वायरस, कीड़ों सहित कई हमलावर रोगजनकों मुठभेड़ कर रहे हैं, और उनके जीवन चक्र में सूत्रकृमि । phytopathogens के बीच, ग्राम नकारात्मक बैक्टीरियल रोगजनकों जैसे कि Pseudomonas एसपीपी. and Ralstonia एसपीपी., घावों या प्राकृतिक उद्घाटन, जैसे stomata और hydathode1के माध्यम से प्रवेश करके अपने मेजबान पौधों को संक्रमित । पौधों को सफलतापूर्वक उपनिवेश करने के लिए, बैक्टीरियल रोगजनकों डाह कारकों की एक किस्म विकसित करने के लिए विकसित किया है2। जब बैक्टीरिया एक मेजबान संयंत्र पर आक्रमण, वे डाह प्रोटीन की एक श्रृंखला सुई — प्रभाव के रूप में जाना-सीधे संयंत्र कोशिकाओं में अपने pathogenicity को बढ़ावा देने के लिए । इन प्रभावों को दबाने या संयंत्र सहज प्रतिरक्षा मिलाना, और मेजबान सेलुलर प्रक्रियाओं में हेरफेर करने के लिए बैक्टीरियल अस्तित्व3में परिणाम ।
रोगजनक बैक्टीरिया मुख्य रूप से एक T3SS का उपयोग करने के लिए सीधे प्रभाव प्रोटीन होस्ट कोशिकाओं में4उद्धार । T3SS एक सुई की तरह चैनल के साथ एक आणविक सिरिंज जैसा दिखता है भीतरी और बाहरी जीवाणु झिल्ली में एक पाड़ प्रोटीन संरचना से जोड़ने के लिए मेजबान सेल के इंजेक्शन साइट5। इस T3SS मध्यस्थता प्रभाव (T3E) स्राव तंत्र अच्छी तरह से विभिन्न ग्राम में संरक्षित है-नकारात्मक जीवाणु संयंत्र के रोगजनकों के साथ ही मानव. प्रतिनिधि संयंत्र रोगजनकों में से एक, पी. syringae पीवी । टोमॅटो DC3000 hrcC उत्परिवर्ती जो आम तौर पर एक दोषपूर्ण T3SS है, पौधों में वृद्धि की संभावना इस उत्परिवर्ती की अक्षमता के कारण पूरी तरह से संयंत्र प्रतिरक्षा को दबाने के लिए सीमित है (प्रभाव प्रोटीन इंजेक्शन द्वारा)6। मेजबान कोशिकाओं में translocation पर, प्रभाव विभिंन मेजबान प्रोटीन है कि मेजबान सेल प्रणाली, संयंत्र रक्षा प्रतिक्रियाओं, जीन प्रतिलेखन, सेल मौत, proteasome, पुटिका के नलए, और हार्मोन रास्ते7 सहित के लिए महत्वपूर्ण है लक्ष्य , 8 , 9 , 10. इसलिए, मेजबान कोशिकाओं में प्रभाव प्रोटीन के सेलुलर स्थानीयकरण की ट्रैकिंग एक आकर्षक लक्ष्य संयंत्र उन्मुक्ति का मॉडुलन करने के लिए सम्मान के साथ उनके कार्यों को समझने के लिए है ।
T3Es के स्थानीयकरण अध्ययन के अधिकांश मेजबान संयंत्र9में एक बड़े प्रतिदीप्ति प्रोटीन के साथ एग्रोबेक्टीरियम-मध्यस्थता एक्सप्रेस कार्यरत है । हालांकि, जीन के लिए heterologous अभिव्यक्ति विधि है कि अंय प्रजातियों में पेश कर रहे है दिखाया गया है गलत स्थानीयकृत या कभी कभार गैर कार्यात्मक11,12,13। इसके अलावा, कई अध्ययनों से पता चला है कि बैक्टीरियल प्रभाव मेजबान कोशिकाओं14,15,16,17में उचित लक्ष्यीकरण के लिए संशोधन से गुजरना । इसलिए, क्षणिक रूप से संयंत्र कोशिकाओं के cytosol में प्रभाव व्यक्त नहीं किया जा सकता है कार्यात्मक या मात्रात्मक जो रोगज़नक़ संक्रमण पर T3SS द्वारा वितरित कर रहे हैं के लिए समान है18. इसके अलावा, बड़े फ्लोरोसेंट टैग के फ्यूजन प्रोटीन के लिए उचित प्रभाव वितरण और दृश्य18,19को बाधित कर सकते हैं । इसलिए, इन दृष्टिकोण T3E समारोह परख करने के लिए पूरी तरह से T3SS स्रावित प्रभाव के मूल स्थानीयकरण प्रतिबिंबित नहीं हो सकता है ।
एक हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) एक 11-फंसे β-बैरल एक केंद्रीय किनारा है कि एक chromophore20शामिल है संलग्न से बना है । वाल्डो एट अल. एक उपंयास विभाजन GFP प्रणाली है कि एक छोटे घटक के होते है (GFP β किनारा 11 रिपोर्ट; GFP11) और एक बड़े पूरक टुकड़ा (GFP β कतरा 1-10; GFP1-10)21. टुकड़े अपने आप से fluoresce नहीं है लेकिन जब दोनों टुकड़े एक दूसरे के साथ करीब निकटता में है अपने स्वयं के संघ पर fluoresce । प्रोटीन तह दक्षता के अनुकूलन के लिए, GFP के मजबूत तह वेरिएंट, यानी, sfGFP और sfGFPऑप्ट, बाद में विभाजित GFP प्रणाली20,21,22के लिए विकसित किए गए । हाल ही में, sfGFP1 के एकल एमिनो एसिड रूपांतरित वेरिएंट-10ऑप्ट-sfYFP1-10ऑप्ट और sfCFP1-10ऑप्ट-कि एक sfGFP11 टुकड़ा के साथ पुनर्गठन कर सकते हैं, और पीले और सियान प्रतिदीप्ति क्रमशः दिखाने के लिए, उत्पन्न किया गया23 . इसके अलावा, sfCherry, mCherry के व्युत्पंन, sfCherry1 में विभाजित किया जा सकता है 10 और sfCherry11 टुकड़ों में sfGFP के रूप में एक ही तरीके से23।
इस प्रणाली को लेबल और संक्रमण के दौरान हेला कोशिकाओं में T3SS प्रभाव को ट्रैक करने के लिए अनुकूलित किया गया है साल्मोनेला24से प्रभाव का उपयोग। हालांकि, यह पहले मेजबान संयंत्र जीवाणु रोगज़नक़ प्रणाली के लिए अनुकूलित नहीं किया गया था । हाल ही में, हम विभाजित GFP प्रणाली अनुकूलित sfGFP1-10ऑप्ट के आधार पर संयंत्र कोशिकाओं25में पी. syringae से दिया T3Es के उपसेलुलर स्थानीयकरण की निगरानी के लिए । संयंत्र कोशिकाओं में विभिन्न उपसेलुलर डिब्बों को T3Es के स्थानीयकरण अध्ययन की सुविधा के लिए, विभिन्न उपसेलुलर डिब्बों में sfGFP1-10ऑप्ट एक्सप्रेस करने के लिए ट्रांसजेनिक Arabidopsis थालियाना संयंत्रों का एक सेट उत्पन्न किया गया 25. इसके अलावा, plasmids organelle-लक्षित sfGFP1-10 की एक किस्म ले जाने के लिए एग्रोबेक्टीरियम-मध्यस्थता क्षणिक एक्सप्रेस और sfGFP11-T3SS के लिए वैक्टर टैग-आधारित प्रभाव वितरण भी उत्पंन किया गया के लिएचुनते हैं । विभिन्न ट्रांसजेनिक Arabidopsis लाइनों के बीज और ब्याज की T3Es व्यक्त करने के लिए plasmids की सामग्री26,27 की तालिकामें उल्लिखित स्रोतों से प्राप्त की जा सकती है ।
निंनलिखित प्रोटोकॉल में, हम एक अनुकूलित प्रणाली का वर्णन करने के लिए विभाजन sfGFP प्रणाली का उपयोग कर मेजबान कोशिकाओं में बैक्टीरिया द्वारा दिया प्रभाव की गतिशीलता की निगरानी । sfGFP1 एक्सप्रेस पौधों का संक्रमण-10 ट्रांसजेनिक Pseudomonas ले जाने के साथऑप्ट रिकॉमबिनेंट sfGFP11 प्लाज्मिड से sfGFP11-tagged प्रभाव के एक वितरण में Pseudomonas मेजबान सेल में परिणाम । नतीजतन, इन प्रोटीन का पुनर्गठन कर रहे है और विशिष्ट प्रभाव लक्ष्य डिब्बे (ओं) को translocate । Pseudomonas syringae पीवी. टोमॅटो CUCPB5500 तनाव जिसमें 18 प्रभाव हटा दिया जाता है, क्योंकि यह तनाव कम या नहीं दोनों ए. थालियाना और benthamianaएस28में सेल मौत दिखाई इस्तेमाल किया गया । तथापि, सभी सामग्री और कदम यहां वर्णित की जगह या संशोधित किया जा सकता है अंय जैविक प्रश्न या दिया प्रयोगशाला की स्थिति में अनुकूलन की जांच के लिए विभाजन sfGFP प्रणाली अनुकूलित ।
प्रोटोकॉल यहां वर्णित प्रभाव प्रोटीन के सटीक स्थानीयकरण की निगरानी के लिए प्रयोग किया जाता है बैक्टीरिया T3SS द्वारा संक्रमण पर मेजबान संयंत्र सेल में इंजेक्शन । पहले, विभाजन GFP प्रणाली स्तनधारी प्रोटी…
The authors have nothing to disclose.
इस शोध को नेशनल रिसर्च फाउंडेशन ऑफ कोरिया (एनआरएफ) द्वारा वित्त पोषित विज्ञान, आईसीटी और फ्यूचर प्लानिंग (एनआरएफ-2018R1A2A1A05019892) डीसी के माध्यम से और एक अनुदान द्वारा संयंत्र आणविक प्रजनन केंद्र ( PMBC) के अगली पीढ़ी के ग्रीन 21 ग्रामीण विकास प्रशासन (PJ013201) के कार्यक्रम EP करने के लिए । हम पर्यावरण प्रबंधन के लिए राष्ट्रीय इंस्ट्रूमेंटेशन केंद्र के इमेजिंग केंद्र को फिल्माने के लिए एक फोकल माइक्रोस्कोप प्रदान करने के लिए धंयवाद ।
Arabidopsis transgenic lines | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
CYTO-sfGFP1-10 | ABRC | CS69831 | |
NU-sfGFP1-10 | ABRC | CS69832 | |
PT-sfGFP1-10 | ABRC | CS69833 | |
MT-sfGFP1-10 | ABRC | CS69834 | |
PX-sfGFP1-10 | ABRC | CS69835 | |
ER-sfGFP1-10 | ABRC | CS69836 | |
GO-sfGFP1-10 | ABRC | CS69837 | |
PM-sfGFP1-10 | ABRC | CS69838 | |
Organelle-targeted sfGFP1-10OPT plasmid | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
CYTO-sfGFP1-10 | Addgene | 97387 | |
NU-sfGFP1-10 | Addgene | 97388 | |
PT-sfGFP1-10 | Addgene | 97389 | |
MT-sfGFP1-10 | Addgene | 97390 | |
PX-sfGFP1-10 | Addgene | 97391 | |
ER-sfGFP1-10 | Addgene | 97392 | |
GO-sfGFP1-10 | Addgene | 97393 | |
PM-sfGFP1-10 | Addgene | 97394 | |
ER-sfCherry1-10 | Addgene | 97403 | |
ER-sfYFP1-10 | Addgene | 97404 | |
CYTO-sfCFP1-10 | Addgene | 97405 | |
sfGFP11-tagged Gateway compatible vector for T3SS-based effector delivery system | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
pBK-GW-1-2 | Addgene | 98250 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
pBK-GW-1-4 | Addgene | 98251 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
pBK-GW-2-2 | Addgene | 98252 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
pBK-GW-2-4 | Addgene | 98253 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
pBG-GW-1-2 | Addgene | 98254 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
pBG-GW-1-4 | Addgene | 98255 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
pBG-GW-2-2 | Addgene | 98256 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
pBG-GW-2-4 | Addgene | 98257 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
Bacterial strains | |||
Agrobacterium tumefaciens GV3101 | Csaba Koncz and Jeff Schell, The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistant to gentamycin (50 ug/ml) and rifampicin (50 ug/ml) | ||
Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500 | Kvitko, B. H. et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistant to rifampicin (100 ug/ml) | ||
Media components | |||
Plant germination media | Add 2.165g/L Murashige & Skoog powder, 10 g/L sucrose to water. Adjust to pH 5.8 and add 2.2 g/L phytagel. Autocalve. | ||
Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | Store at 4 °C. |
Sucrose | Duchefa Biochemie | S0809 | |
Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
LB media | Add 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl to water. For solid media, add 15 g/L micro agar. Autoclave. Allow solution to cool to 55 °C, and add antibiotic if needed. | ||
Tryptone | BD Bioscience | 211705 | |
Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
NaCl | Duchefa Biochemie | S0520 | |
Micro agar | Duchefa Biochemie | M1002 | |
King's B media | 10 g/L protease peptone #2, 1.5 g/L anhydrous K2HPO4, 15 g/L of agar to water. Autoclave. Cool down to 55 °C and add sterile 15 ml/L glycerol, 5 ml/L MgSO4 to the medium. Add antibiotics if needed. | ||
Proteose peptone | BD Bioscience | 212120 | |
Anhydrous K2HPO4 | Sigma-Aldrich | 1551128 USP | |
Glycerol | Duchefa Biochemie | G1345 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
Bacto Agar | BD Bioscience | 214010 | |
Mannitol-Glutamate (MG) liquid media | Add 10 g/L of mannitol, 2 g/L of L-glutamic acid, 0.5 g/L of KH2PO4, 0.2 g/L of NaCl, and 0.2 g/L of MgSO4 to water. Adjust to pH 7 | ||
Mannitol | Duchefa Biochemie | M0803 | |
L-glutamic acid | Duchefa Biochemie | G0707 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | NIST200B | |
Infiltration buffer | 10 mM MES (2-(N-morpholino)-ethane sulfonic acid), 10 mM MgCl2, 150 µM acetosyringone. pH 5.6; Prepare a fresh buffer before use. | ||
MES | Duchefa Biochemie | M1503 | Prepare 100 mM (pH 5.6) stock in water. Filter sterilize. |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Prepare 100 mM stock in water. Autoclave. |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | Prepare 150 mM stock in DMSO. |
Confocal microscope equipments/materials | |||
710 laser scanning confocal system | Carl Zeiss | ||
Axio observer Z1 inverted microscope | Carl Zeiss | ||
Propidium iodide | ThermoFisher | P1304MP |