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Biology

भाजित ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन प्रणाली को संक्रमण के दौरान बैक्टीरिया से दिया प्रभाव कल्पना

doi: 10.3791/57719 Published: May 24, 2018

Summary

फ्लोरोसेंट प्रोटीन आधारित दृष्टिकोण मेजबान कोशिकाओं में बैक्टीरिया द्वारा स्रावित प्रभाव की निगरानी के लिए चुनौती दे रहे हैं । यह फ्लोरोसेंट प्रोटीन और प्रकार III स्राव प्रणाली के बीच असंगति के कारण है । यहां, एक अनुकूलित विभाजन superfolder GFP प्रणाली मेजबान संयंत्र सेल में बैक्टीरिया द्वारा स्रावित प्रभाव के दृश्य के लिए प्रयोग किया जाता है ।

Abstract

बैक्टीरिया, विभिन्न पादप रोगों का सबसे महत्वपूर्ण प्रेरणा एजेंटों में से एक, संयंत्र प्रतिरक्षा प्रणाली को विकृत करने के लिए मेजबान संयंत्र सेल में प्रभावक प्रोटीन का एक सेट स्रावित. संक्रमण के दौरान cytoplasmic प्रभाव एक प्रकार III स्राव प्रणाली (T3SS) के माध्यम से मेजबान cytosol के लिए वितरित कर रहे हैं. संयंत्र सेल में प्रसव के बाद, प्रभाव (ओं) के लिए विशिष्ट डिब्बे (ओं) लक्ष्य को जीवित रहने और रोगज़नक़ की प्रतिकृति के लिए मेजबान सेल प्रक्रियाओं का नियमन । हालांकि मेजबान कोशिकाओं में उपसेलुलर स्थानीयकरण पर कुछ शोध किया गया है pathogenicity में अपने समारोह को समझने के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग करके, प्रभाव की गतिशीलता की जांच सीधे बैक्टीरिया से इंजेक्शन T3SS और फ्लोरोसेंट प्रोटीन के बीच असंगति के कारण चुनौतीपूर्ण हो गया है ।

यहां, हम एक अनुकूलित विभाजन superfolder ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन प्रणाली (sfGFPऑप्ट) के हमारे हाल ही में विधि का वर्णन करने के लिए मेजबान सेल में बैक्टीरियल T3SS के माध्यम से दिया प्रभाव के स्थानीयकरण कल्पना । sfGFP11 (11th β-कतरा के sfGFP)-टैग T3SS के माध्यम से स्रावित प्रभाव एक विशिष्ट organelle लक्षित sfGFP1 के साथ इकट्ठे किया जा सकता है-10ऑप्ट (1-10गु β-sfGFP के कतरा) साइट पर प्रतिदीप्ति उत्सर्जन करने के लिए अग्रणी. यह प्रोटोकॉल organelle और Arabidopsis निकोटियाना संयंत्रों में एक विशेष benthamiana में Pseudomonas syringae से एक प्रभाव प्रोटीन के साथ पुनर्गठन sfGFP प्रतिदीप्ति संकेत कल्पना करने के लिए एक प्रक्रिया प्रदान करता है ।

Introduction

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पौधों sessile जीवों कि बैक्टीरिया, कवक, वायरस, कीड़ों सहित कई हमलावर रोगजनकों मुठभेड़ कर रहे हैं, और उनके जीवन चक्र में सूत्रकृमि । phytopathogens के बीच, ग्राम नकारात्मक बैक्टीरियल रोगजनकों जैसे कि Pseudomonas एसपीपी. and Ralstonia एसपीपी., घावों या प्राकृतिक उद्घाटन, जैसे stomata और hydathode1के माध्यम से प्रवेश करके अपने मेजबान पौधों को संक्रमित । पौधों को सफलतापूर्वक उपनिवेश करने के लिए, बैक्टीरियल रोगजनकों डाह कारकों की एक किस्म विकसित करने के लिए विकसित किया है2। जब बैक्टीरिया एक मेजबान संयंत्र पर आक्रमण, वे डाह प्रोटीन की एक श्रृंखला सुई — प्रभाव के रूप में जाना-सीधे संयंत्र कोशिकाओं में अपने pathogenicity को बढ़ावा देने के लिए । इन प्रभावों को दबाने या संयंत्र सहज प्रतिरक्षा मिलाना, और मेजबान सेलुलर प्रक्रियाओं में हेरफेर करने के लिए बैक्टीरियल अस्तित्व3में परिणाम ।

रोगजनक बैक्टीरिया मुख्य रूप से एक T3SS का उपयोग करने के लिए सीधे प्रभाव प्रोटीन होस्ट कोशिकाओं में4उद्धार । T3SS एक सुई की तरह चैनल के साथ एक आणविक सिरिंज जैसा दिखता है भीतरी और बाहरी जीवाणु झिल्ली में एक पाड़ प्रोटीन संरचना से जोड़ने के लिए मेजबान सेल के इंजेक्शन साइट5। इस T3SS मध्यस्थता प्रभाव (T3E) स्राव तंत्र अच्छी तरह से विभिन्न ग्राम में संरक्षित है-नकारात्मक जीवाणु संयंत्र के रोगजनकों के साथ ही मानव. प्रतिनिधि संयंत्र रोगजनकों में से एक, पी. syringae पीवी । टोमॅटो DC3000 hrcC उत्परिवर्ती जो आम तौर पर एक दोषपूर्ण T3SS है, पौधों में वृद्धि की संभावना इस उत्परिवर्ती की अक्षमता के कारण पूरी तरह से संयंत्र प्रतिरक्षा को दबाने के लिए सीमित है (प्रभाव प्रोटीन इंजेक्शन द्वारा)6। मेजबान कोशिकाओं में translocation पर, प्रभाव विभिंन मेजबान प्रोटीन है कि मेजबान सेल प्रणाली, संयंत्र रक्षा प्रतिक्रियाओं, जीन प्रतिलेखन, सेल मौत, proteasome, पुटिका के नलए, और हार्मोन रास्ते7 सहित के लिए महत्वपूर्ण है लक्ष्य , 8 , 9 , 10. इसलिए, मेजबान कोशिकाओं में प्रभाव प्रोटीन के सेलुलर स्थानीयकरण की ट्रैकिंग एक आकर्षक लक्ष्य संयंत्र उन्मुक्ति का मॉडुलन करने के लिए सम्मान के साथ उनके कार्यों को समझने के लिए है ।

T3Es के स्थानीयकरण अध्ययन के अधिकांश मेजबान संयंत्र9में एक बड़े प्रतिदीप्ति प्रोटीन के साथ एग्रोबेक्टीरियम-मध्यस्थता एक्सप्रेस कार्यरत है । हालांकि, जीन के लिए heterologous अभिव्यक्ति विधि है कि अंय प्रजातियों में पेश कर रहे है दिखाया गया है गलत स्थानीयकृत या कभी कभार गैर कार्यात्मक11,12,13। इसके अलावा, कई अध्ययनों से पता चला है कि बैक्टीरियल प्रभाव मेजबान कोशिकाओं14,15,16,17में उचित लक्ष्यीकरण के लिए संशोधन से गुजरना । इसलिए, क्षणिक रूप से संयंत्र कोशिकाओं के cytosol में प्रभाव व्यक्त नहीं किया जा सकता है कार्यात्मक या मात्रात्मक जो रोगज़नक़ संक्रमण पर T3SS द्वारा वितरित कर रहे हैं के लिए समान है18. इसके अलावा, बड़े फ्लोरोसेंट टैग के फ्यूजन प्रोटीन के लिए उचित प्रभाव वितरण और दृश्य18,19को बाधित कर सकते हैं । इसलिए, इन दृष्टिकोण T3E समारोह परख करने के लिए पूरी तरह से T3SS स्रावित प्रभाव के मूल स्थानीयकरण प्रतिबिंबित नहीं हो सकता है ।

एक हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) एक 11-फंसे β-बैरल एक केंद्रीय किनारा है कि एक chromophore20शामिल है संलग्न से बना है । वाल्डो एट अल. एक उपंयास विभाजन GFP प्रणाली है कि एक छोटे घटक के होते है (GFP β किनारा 11 रिपोर्ट; GFP11) और एक बड़े पूरक टुकड़ा (GFP β कतरा 1-10; GFP1-10)21. टुकड़े अपने आप से fluoresce नहीं है लेकिन जब दोनों टुकड़े एक दूसरे के साथ करीब निकटता में है अपने स्वयं के संघ पर fluoresce । प्रोटीन तह दक्षता के अनुकूलन के लिए, GFP के मजबूत तह वेरिएंट, यानी, sfGFP और sfGFPऑप्ट, बाद में विभाजित GFP प्रणाली20,21,22के लिए विकसित किए गए । हाल ही में, sfGFP1 के एकल एमिनो एसिड रूपांतरित वेरिएंट-10ऑप्ट-sfYFP1-10ऑप्ट और sfCFP1-10ऑप्ट-कि एक sfGFP11 टुकड़ा के साथ पुनर्गठन कर सकते हैं, और पीले और सियान प्रतिदीप्ति क्रमशः दिखाने के लिए, उत्पन्न किया गया23 . इसके अलावा, sfCherry, mCherry के व्युत्पंन, sfCherry1 में विभाजित किया जा सकता है 10 और sfCherry11 टुकड़ों में sfGFP के रूप में एक ही तरीके से23

इस प्रणाली को लेबल और संक्रमण के दौरान हेला कोशिकाओं में T3SS प्रभाव को ट्रैक करने के लिए अनुकूलित किया गया है साल्मोनेला24से प्रभाव का उपयोग हालांकि, यह पहले मेजबान संयंत्र जीवाणु रोगज़नक़ प्रणाली के लिए अनुकूलित नहीं किया गया था । हाल ही में, हम विभाजित GFP प्रणाली अनुकूलित sfGFP1-10ऑप्ट के आधार पर संयंत्र कोशिकाओं25में पी. syringae से दिया T3Es के उपसेलुलर स्थानीयकरण की निगरानी के लिए । संयंत्र कोशिकाओं में विभिन्न उपसेलुलर डिब्बों को T3Es के स्थानीयकरण अध्ययन की सुविधा के लिए, विभिन्न उपसेलुलर डिब्बों में sfGFP1-10ऑप्ट एक्सप्रेस करने के लिए ट्रांसजेनिक Arabidopsis थालियाना संयंत्रों का एक सेट उत्पन्न किया गया 25. इसके अलावा, plasmids organelle-लक्षित sfGFP1-10 की एक किस्म ले जाने के लिए एग्रोबेक्टीरियम-मध्यस्थता क्षणिक एक्सप्रेस और sfGFP11-T3SS के लिए वैक्टर टैग-आधारित प्रभाव वितरण भी उत्पंन किया गया के लिएचुनते हैं । विभिन्न ट्रांसजेनिक Arabidopsis लाइनों के बीज और ब्याज की T3Es व्यक्त करने के लिए plasmids की सामग्री26,27 की तालिकामें उल्लिखित स्रोतों से प्राप्त की जा सकती है ।

निंनलिखित प्रोटोकॉल में, हम एक अनुकूलित प्रणाली का वर्णन करने के लिए विभाजन sfGFP प्रणाली का उपयोग कर मेजबान कोशिकाओं में बैक्टीरिया द्वारा दिया प्रभाव की गतिशीलता की निगरानी । sfGFP1 एक्सप्रेस पौधों का संक्रमण-10 ट्रांसजेनिक Pseudomonas ले जाने के साथऑप्ट रिकॉमबिनेंट sfGFP11 प्लाज्मिड से sfGFP11-tagged प्रभाव के एक वितरण में Pseudomonas मेजबान सेल में परिणाम । नतीजतन, इन प्रोटीन का पुनर्गठन कर रहे है और विशिष्ट प्रभाव लक्ष्य डिब्बे (ओं) को translocate । Pseudomonas syringae पीवी. टोमॅटो CUCPB5500 तनाव जिसमें 18 प्रभाव हटा दिया जाता है, क्योंकि यह तनाव कम या नहीं दोनों ए. थालियाना और benthamianaएस28में सेल मौत दिखाई इस्तेमाल किया गया । तथापि, सभी सामग्री और कदम यहां वर्णित की जगह या संशोधित किया जा सकता है अंय जैविक प्रश्न या दिया प्रयोगशाला की स्थिति में अनुकूलन की जांच के लिए विभाजन sfGFP प्रणाली अनुकूलित ।

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Protocol

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नोट: सभी कदम कमरे के तापमान पर प्रदर्शन कर रहे हैं, जब तक अंयथा कहा ।

1. संयंत्र सामग्री की तैयारी (4 सप्ताह)

  1. एन benthamiana संयंत्रों के लिए तैयारी
    1. प्रत्येक बर्तन की मिट्टी की सतह पर N. benthamiana के 2 बीज बोना, एक प्लास्टिक गुंबद के साथ ट्रे कवर, और बीज एक 25 डिग्री सेल्सियस में अंकुरित करने की अनुमति, ६०% आर्द्रता विकास कक्ष के साथ एक 16/
    2. दो सप्ताह के बाद, बाहर उठाओ और प्रत्येक बर्तन में सबसे छोटी अंकुर त्याग और 1.1.1 कदम में अंकुरण के लिए आवेदन के रूप में एक ही विकास की स्थिति के तहत पौधों को विकसित करने के लिए जारी है । हर दो दिन में ट्रे प्रति पानी की 1 एल जोड़ें ।
      नोट: संयंत्रों के लिए वृद्धि की स्थिति प्रयोगशालाओं में भिन्न हो सकते हैं. इसलिए, एक स्वस्थ हालत में संयंत्र विकसित करने के लिए नियमित रूप से पानी प्रोटोकॉल का पालन करें ।
    3. एक सप्ताह में, पौधों को एक नई ट्रे में स्थानांतरित करें और उन्हें आगे की वृद्धि के लिए पर्याप्त स्थान के साथ व्यवस्थित करें । जब तक वे 4 सप्ताह की उंर में घुसपैठ होने के लिए तैयार है 1.1.1 कदम में वर्णित शर्तों के तहत पौधों बढ़ते रहो ।
      नोट: संयंत्र विकास प्रयोगशालाओं में वृद्धि की स्थिति के आधार पर अलग हो सकता है । आमतौर पर, हम पाते है कि 4 सप्ताह पुराने एन benthamiana संयंत्रों के बारे में छह पत्तियों भालू ।
  2. अ. थालियाना ट्रांसजेनिक संयंत्रों के लिए तैयारी
    1. सामग्री की तालिका का संदर्भ लें और ट्रांसजेनिक Arabidopsis बीजों को ऑर्डर करें ।
    2. भिगोना ~ ५०-१०० ट्रांसजेनिक Arabidopsis बीज आसुत जल के 1 मिलीलीटर में और उंहें 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 3 दिनों के लिए अंकुरण की शुरुआत को सिंक्रनाइज़ करने के लिए दुकान ।
    3. एक प्लग संयंत्र की ट्रे की मिट्टी की सतह पर ~ 2-3 बीज बोना और एक प्लास्टिक गुंबद के साथ ट्रे कवर । बीजों को 23 डिग्री सेल्सियस पर अंकुरित करने की अनुमति दें, 10/14-h light/डार्क photoperiod चक्र के साथ ६०% आर्द्रता ।
      नोट: बीज homozygotes होना चाहिए । हालांकि, हम बैच में transgene की उपस्थिति की पुष्टि करने की सलाह देते हैं । इस मामले में, 2 मिनट, ५०% ब्लीच (के बारे में 2% हाइपोक्लोराइट) के लिए ७०% इथेनॉल के साथ धुलाई द्वारा बीज 5 मिनट के लिए ०.०५% ट्राइटन एक्स-१०० युक्त बंध्याकरण के लिए बाँझ डबल आसुत जल के साथ 5-6 बार धोने से पालन (ddH2 O) । नसबंदी के बाद, 3 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर stratify और उन्हें संयंत्र अंकुरण मीडिया पर प्लेट 25 µ g/L hygromycin B के ट्रांसजेनिक पौधों का चयन करने के लिए युक्त.
    4. एक सप्ताह के बाद, प्लग प्रति केवल एक संयंत्र छोड़ दो और कदम 1.2.3 के लिए इस्तेमाल किया समान विकास की स्थिति के तहत पौधों को जारी रखने के ।
      नोट: चार सप्ताह पुराने पौधों का उपयोग पी. syringae संक्रमण के लिए किया गया था । पौधों को स्वस्थ रखने के लिए हर दूसरे दिन जल पौधे लगाएं ।

2. Pseudomonas संस्कृति की तैयारी (~ 1 सप्ताह)

  1. Pseudomonas परिवर्तन के लिए प्लाज्मिड का निर्माण
    1. सामग्री की तालिका का संदर्भ लें और T3SS-आधारित प्रभाव वितरण प्रणाली वेक्टर25के वांछित वेक्टर (ओं) का आदेश ।
    2. प्रभाव वितरण में ब्याज की जीन डालें वेक्टर साइट-विशिष्ट पुनर्संयोजन का उपयोग कर25क्लोनिंग ।
      नोट: जब पूर्ण लंबाई प्रभाव प्रोटीन की उपसेलुलर स्थानीयकरण की निगरानी, pBK-गिनीकृमि-1-2 या भरना pbg-गिनीकृमि-1-2 में पूर्ण लंबाई जीन डाल दिया । यह भी pBK गिनीकृमि-1-4 या भरना pbg-गिनीकृमि-1-4 बढ़ती प्रतिदीप्ति संकेत के लिए 2x sfGFP11 युक्त का चयन करने के लिए संभव है । एक आंशिक प्रभाव के मामले में संकेत पेप्टाइड कमी, pBK-गिनीकृमि-2-2 या pBK-गिनीकृमि-2-4 का उपयोग करें । पार्क एट अल करने के लिए देखें । प्रभाव वितरण वैक्टर25के बारे में विस्तृत जानकारी के लिए ।
  2. प्लाज्मिड एक प्रभाव ले जाने के लिए sfGFP11 टैग करने के लिए P. syringae pv से जुड़े रूपांतरण । टोमॅटो (Pst) CUCPB5500 का उपयोग मानक electroporation29
    नोट: यदि आवश्यक हो तो अन्य Pseudomonas उपभेदों का उपयोग किया जा सकता है । sfGFP11 टैग प्रणाली के एक व्यापक रेंज के लिए निर्माण किया है30 वैक्टर और प्रभाव के जीन अभिव्यक्ति AvrRpm1 प्रमोटर, जो के साथ तुलनीय है द्वारा विनियमित है, जैसे, Pseudomonas fluorescens (एतान)31
  3. बदल जीवाणु कोशिकाओं धीरे राजा के बी आगर प्लेटों की सतह पर फैला १०० µ g/ml रिफैंपिसिन और 25 µ g/ml कनमीसिन या 25 µ g/एमएल गेन्तमयसीं । 2 दिनों के लिए 28 ° c पर मशीन ।
  4. Inoculate के लिए उपयुक्त एंटीबायोटिक दवाओं के साथ राजा के बी तरल मीडिया में एक कॉलोनी का इस्तेमाल किया, और २०० rpm पर झटकों के साथ 28 डिग्री सेल्सियस पर रात भर कोशिकाओं को विकसित ।
  5. एक ग्लिसरॉल शेयर करें । ५०% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए autoclaved ग्लिसरॉल जोड़ें और-८० डिग्री सेल्सियस पर दुकान ।

3. Organelle-लक्षित sfGFP1 के क्षणिक अभिव्यक्ति-10 N. benthamiana मेंऑप्ट (4 दिन)

  1. एग्रोबेक्टीरियम संस्कृति की तैयारी
    1. आदेश वांछित सदिश (ओं) के organelle-लक्षित sfGFP1-10ऑप्ट प्लाज्मिड (ओं) ( सामग्री की तालिकाको देखें) ।
    2. प्लाज्मिड (s) को एग्रोबेक्टीरियम tumefaciens तनाव GV3101 कक्षों३२में रूपांतरित करना । Luria पर कोशिकाओं को विकसित-Bertani (पौंड) आगर मध्यम पूरक के साथ ५० µ जी/एमएल कनमीसिन और ५० µ जी/एमएल रिफैंपिसिन 28 ° c पर 2 दिनों के लिए ।
    3. पौंड आगर मध्यम पर एक एकल कॉलोनी से, inoculate तरल पौंड मीडिया के 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं को ५० µ g/एमएल कनमीसिन और ५० µ g/एमएल रिफैंपिसिन के साथ पूरक है । २०० rpm पर झटकों के साथ 28 डिग्री सेल्सियस पर रात भर कोशिकाओं को बढ़ने ।
    4. 10 मिनट के लिए ३,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं हार्वेस्ट । बंद supernatant मीडिया डालो और हौसले से बनाया घुसपैठ बफर के 1 मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड ।
    5. ६०० एनएम (Abs ६०० एनएम) के एक अवशोषक पर ऑप्टिकल घनत्व (आयुध डिपो) मूल्य प्राप्त करने के द्वारा एग्रोबेक्टीरियम की मात्रा को मापने । घुसपैठ बफर के साथ ०.५ करने के लिए जीवाणुओं के६०० आयुध डिपो समायोजित करें ।
      नोट: दो स्थानों पर घुसपैठ करने के लिए 1 मिलीलीटर का निलंबन काफी है ।
    6. घुसपैठ से पहले 1-5 ज के लिए एक सज्जन झूली कुरसी पर कमरे के तापमान पर संस्कृति को छोड़ दें ।
    7. पत्तियों के केंद्र में एक छेद प्रहार करने के लिए एक 10 µ एल टिप के साथ घुसपैठ हो । एक 1-एमएल सुई का प्रयोग करें एग्रोबेक्टीरियम निलंबन घुसपैठ के लिए सिरिंज । ध्यान से और धीरे से 3.1.5 के माध्यम से पत्ती adaxial पक्ष में कदम से तैयार निलंबन के बारे में ५०० µ एल इंजेक्षन । प्रायोगिक दोहराने के लिए कम से कम तीन विभिन्न संयंत्रों पर घुसपैठ को दोहराएँ.
      नोट: स्वास्थ्य और सुरक्षा कारणों से, घुसपैठ के दौरान आंख की सुरक्षा पहनी जानी चाहिए ।
    8. पत्तियों पर बचे हुए बैक्टीरियल सस्पेंशन को पोंछें और घुसपैठी क्षेत्र की चारदीवारी को चिह्नित करें ।
    9. एक ही वृद्धि 2 दिनों के लिए 1.1.1 कदम के लिए इस्तेमाल की स्थिति के तहत घुसपैठ संयंत्रों रखो ।

4. टीका के Pseudomonas (4 दिन)

  1. लकीर 2 दिनों के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ राजा के बी आगर मीडिया पर कदम २.५ में ग्लिसरॉल शेयर से बदल Pseudomonas तनाव ।
    नोट: Pseudomonas का स्वास्थ्य बहुत महत्वपूर्ण है । यदि कालोनियों अच्छी तरह से फार्म नहीं, कोशिकाओं फिर लकीर या राजा तरल मीडिया में कोशिकाओं का प्रचार करने से पहले आगे बढ़ने के लिए ।
  2. Inoculate Mannitol-ग्लूटामेट (मिलीग्राम) तरल मीडिया में 28 डिग्री सेल्सियस पर २०० rpm पर रातोंरात के लिए मिलाते के साथ एक Pseudomonas कोशिकाओं के looped ।
  3. 10 मिनट के लिए ३,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं फसल । supernatant मीडिया से डालो, 10 मिमी MgCl2में गोली reसस्पेंड, और आयुध डिपो६०० ०.०२ (1 x 107 cfu/एमएल) के लिए N. benthamiana के पत्ते और ०.००२ के लिए समायोजित (1 x 106 Arabidopsis के पत्तों के लिए cfu/
  4. एन. benthamianaके लिए, पत्तियों के क्षेत्र में Pseudomonas निलंबन घुसपैठ जहां एग्रोबेक्टीरियम sfGFP1 ले जाने-10ऑप्ट निर्माण 2 पहले दिन (के रूप में कदम 3.1.7 में) घुसपैठ की थी । sfGFP1-10ऑप्ट ट्रांसजेनिक Arabidopsisके लिए, दो 4-सप्ताह पुराने कम दिन पत्तियों में Pseudomonas निलंबन घुसपैठ ।
    नोट: प्रयोगात्मक प्रतिकृति के लिए कम से कम तीन संयंत्रों की जरूरत है ।

5. फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से sfGFP संकेत का अवलोकन (1 दिन)

  1. Pseudomonas-inoculated पत्तियों से लीफ डिस्क को काट लें । Pseudomonasके घुसपैठ के बाद विशिष्ट समय बिंदुओं पर, छवि दो 2-सेमी2 पत्ती डिस्क एक लेजर का उपयोग करके एक लेज़र 40X के साथ फोकल सिस्टम स्कैनिंग का प्रयोग/सी-Apochromat जल विसर्जन उद्देश्य या 63X/0.8 ना ग-Apochromat तेल विसर्जन उद्देश्य. घायल द्वारा मारे गए कोशिकाओं से बचने के लिए, घुसपैठ छेद से दूर कोशिकाओं का निरीक्षण ।
  2. ४८८-एनएम आर्गन लेजर की एक कम शक्ति की स्थापना पर अवलोकन शुरू करते हैं । sfGFP का पता लगाने के लिए लेजर पावर बढ़ाएं ।
    नोट: हम आमतौर पर लेजर तीव्रता का 2-15% का उपयोग करने के लिए प्रतिदीप्ति संकेत का पता लगाने । हालांकि, लेजर शक्ति और जांच सेटिंग उपयोगकर्ता के माइक्रोस्कोपिक सिस्टम पर आधारित समायोजित किया जाना चाहिए । यहां, उत्सर्जन फिल्टर ५२०-५५० एनएम के लिए निर्धारित किया गया । मृत कोशिकाओं अक्सर ४८८-एनएम लेजर उत्तेजना के तहत ऑटो प्रतिदीप्ति फेंकना । इसलिए, एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, sfGFP11 टैग के बिना एक ही प्रभाव घुसपैठ और एक ही अवलोकन शर्तों के तहत मनाया जाना चाहिए । इसके अलावा, उच्च लेजर उत्तेजना क्लोरोफिल autofluorescence पैदा कर सकते हैं । इसलिए, लेजर तीव्रता नियंत्रण संयंत्र कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए इतना के रूप में क्लोरोफिल autofluorescence प्रेरित नहीं समायोजित करें ।
    1. सेल दीवार की एक counterstaining के लिए, अवलोकन करने से पहले 5-10 मिनट पर पत्ती डिस्क में 20 मिमी propidium आयोडाइड (PI) घुसपैठ.
    2. नाभिक धुंधला के लिए, 5 मिनट के लिए ०.१% paraformaldehyde में पत्ती डिस्क जलमग्न पानी के साथ धुलाई के बाद । फिर, सूक्ष्म अवलोकन से पहले 5-10 मिनट पर पत्ती डिस्क में 10 मिमी PI घुसपैठ. प्रयोगों को कम से तीन बार दोहराएँ.
      नोट: यह कदम महत्वपूर्ण है लेकिन प्लाज्मा झिल्ली या नाभिक पर प्रभाव स्थानीयकरण को परिभाषित करने के लिए उपयोगी नहीं है । यदि ब्याज के प्रभाव एक विशिष्ट organelle में अपने स्थानीयकरण दिखाया, दी organelle के लिए एक मार्कर का उपयोग करने के लिए प्रभाव के स्थानीयकरण की पुष्टि ।

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Representative Results

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GFP की β बैरल संरचना ग्यारह β किस्में से बना है और दो टुकड़ों में विभाजित किया जा सकता है, 1-10 वें किनारा (GFP1-10ऑप्ट) और11 वें (GFP11) किनारा. हालांकि न तो दो टुकड़े खुद के द्वारा फ्लोरोसेंट, स्वयं इकट्ठे sfGFP प्रतिदीप्ति फेंकना कर सकते हैं जब दो टुकड़े बंद निकटता में मौजूद (चित्र 1a) । इस प्रणाली में, sfGFP1-10ऑप्टव्यक्त Arabidopsis या एन benthamiana संयंत्रों के साथ एक Pseudomonas टैग प्रभाव ले sfGFP11 के साथ inoculated हैं । मेजबान सेल के cytosol में Pseudomonas द्वारा दिया sfGFP11 टैग प्रभाव sfGFP1 के लिए पुनर्गठन किया जाता है-10ऑप्ट cytosol में व्यक्त की है और फिर एक साथ लक्ष्य डिब्बे में translocate (आंकड़ा 1b) । चित्रा 2 संयंत्र के सेल में प्रतिदीप्ति संकेत का पता लगाने के लिए संयंत्र सामग्री और पीएसटी की तैयारी से, समग्र प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है ।

हमारे विधि का एक उदाहरण के रूप में, हम पी syringae प्रभाव प्रोटीन, AvrB, जो मेजबान संयंत्र कोशिकाओं में संक्रमण के दौरान T3SS पूरी तरह से दिया जाता है इस्तेमाल किया । Arabidopsisमें, AvrB एक इसी प्रतिरोध प्रोटीन द्वारा मांयता प्राप्त है, RPM1, और अनुभुत सेल मौत३३सहित प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं चलाता है । पिछले अध्ययन में, GFP रिपोर्टर परख और जैव रासायनिक परख से पता चला कि AvrB और RPM1 संयंत्र सेल३३,३४,३५के प्लाज्मा झिल्ली में स्थानीयकृत रहे हैं । हमारे विधि का उपयोग कर AvrB के स्थानीयकरण की जांच करने के लिए, एग्रोबेक्टीरियम बंदरगाह CYTO sfGFP1-10ऑप्ट जीन एन benthamianaमें घुसपैठ की थी । दो दिनों में AvrB-sfGFP11-रूपांतरित Pseudomonas कोशिकाओं को एग्रोबेक्टीरियम-घुसपैठ क्षेत्र में inoculated गया. पूरक sfGFP प्रतिदीप्ति संकेतों में देखा गया पीएसटी CUCPB5500 युक्त AvrB-sfGFP11 में प्लाज्मा झिल्ली (चित्र बी) । इसके विपरीत, कोई संकेत संक्रमित कोशिका में पीएसटी देशी AvrB (चित्रा 3) ले जाने से पाया गया ।

Figure 1
चित्र 1. अनुकूलित विभाजन GFP प्रणाली । () GFP के β बैरल संरचना ग्यारह β-किस्में से बना है और 1-10th β-कतरा (GFP1-10) और 11th β-कतरा (GFP11) में विभाजित किया जा सकता है । () इस विधि में, sfGFP1-10ऑप्ट टुकड़े संयंत्र कोशिकाओं में व्यक्त किए गए थे, जबकि sfGFP11 कतरा AvrB के लिए आपस में जुड़े हुए थे और Pseudomonasमें तब्दील हो गया । केवल sfGFP11 युक्त Pseudomonas से संक्रमित पौधों सेल sfGFP प्रतिदीप्ति (जहां प्रभाव स्थानीयकरण) दिखाएगा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. कार्यविधि का ओवरव्यू । ट्रांसजेनिक Arabidopsis या sfGFP1-10ऑप्ट-घुसपैठ एन benthamiana संयंत्र पीएसटी से संक्रमित है CUCPB5500 सिरिंज के माध्यम से एक sfGFP11-टैग की घुसपैठ ले जाने । इकट्ठे sfGFP के प्रतिदीप्ति प्रभाव स्थानीयकरण की साइट पर एक फोकल माइक्रोस्कोपी प्रणाली के माध्यम से पता लगाया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. AvrB-sfGFP पर पता लगाना N. benthamiana संक्रमण के बाद 3 ज छोड़ देता है । पीएसटी CUCPB5500 एक sfGFP11 बंदरगाह AvrB जीन के 5वें या 6 एन benthamianaकेगु पत्ती, जो एग्रोबेक्टीरियम द्वारा घुसपैठ के sfGFP1 ले जा रहा था पर घुसपैठ की थी-10ऑप्ट 2 दिन पहले । सेल की दीवार propidium आयोडाइड से सना हुआ था । जबकि AvrB के साथ sfGFP1-10 ऑप्ट एक्सप्रेस कोशिकाओं-केवल किसी भी प्रतिदीप्ति संकेत () नहीं दिखा । GFP संकेतों (पीला तीर) संक्रमित कोशिकाओं पर मनाया गया पीएसटी से युक्त AvrB-sfGFP11 जीन 3 एच के बाद में घुसपैठ (बी) । इस परिणाम का प्रतिनिधित्व करता है कि केवल AvrB-sfGFP11, नहीं AvrB, sfGFP1 के साथ पुनर्गठन किया जाता है-10 cytosol मेंऑप्ट और फिर इकट्ठे sfGFP प्लाज्मा झिल्ली को translocated है । रानी छद्म रंग सेल दीवार और क्लोरोफिल autofluorescence का प्रतिनिधित्व करता है । हरे इकट्ठे sfGFP प्रतिदीप्ति का प्रतिनिधित्व करता है । स्केल बार्स = ४० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

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प्रोटोकॉल यहां वर्णित प्रभाव प्रोटीन के सटीक स्थानीयकरण की निगरानी के लिए प्रयोग किया जाता है बैक्टीरिया T3SS द्वारा संक्रमण पर मेजबान संयंत्र सेल में इंजेक्शन । पहले, विभाजन GFP प्रणाली स्तनधारी प्रोटीन23,३६, साल्मोनेला T3E स्थानीयकरण, और एग्रोबेक्टीरियम VirE2 के माध्यम से T4SS प्रसव के उपसेलुलर स्थानीयकरण का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया गया था संयंत्र कक्ष३७। संयंत्र कोशिकाओं में इस प्रणाली को लागू करने के लिए, पिछले अध्ययनों एक ट्रांसजेनिक मक्का संयंत्र का इस्तेमाल किया है कि constitutively cytoplasmic GFP1-10 और ट्रांसजेनिक कवक, Ustilago मेडिसव्यक्त, कि GFP11-टैग प्रभाव प्रोटीन व्यक्त करता है । हालांकि, मक्का-उ. मेडिस प्रणाली सफल नहीं हुई है क्योंकि translocated प्रभावक प्रोटीन की अभिव्यक्ति का स्तर कमजोर थे और उच्च स्तर की पृष्ठभूमि autofluorescence ने गठित GFP सिग्नल३८का पता लगाने में बाधा उत्पन्न की । इस समस्या के उपचार के लिए, हम एक sfGFP1-10 संस्करण, sfGFP1-10ऑप्ट, कि काफी घुलनशीलता और प्रतिदीप्ति तीव्रता में सुधार करते थे21,22.

विभाजन sfGFP प्रणाली के लाभों के बावजूद, वहां प्रभाव स्थानीयकरण और गतिशीलता के अध्ययन के लिए कुछ सीमाएं हैं । सबसे पहले, मनाया पुनर्गठन sfGFP फ्लोरोसेंट संकेत अपेक्षाकृत कमजोर है । यह प्रभाव सीधे पी syringaeसे दिया अणुओं की एक छोटी राशि के कारण हो सकता है । इस कमजोर संकेत multimerizing sfGFP11 टैग का उपयोग करके सुधार किया जा सकता है । 2x sfGFP11 टैग ले जाने वैक्टर भी सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध स्रोतों से उपलब्ध हैं । दूसरा, cytosolic sfGFP1-10 ऑप्ट Golgi, एर, और plastid25को लक्षित sfGFP11 के साथ पुनर्गठन किया जाना विफल । mitochondria की सह-अभिव्यक्ति लक्षित sfGFP11 और cytosolic sfGFP1-10ऑप्ट sfGFP और नाभिक25के लिए पुन: गठित cytosol के स्थानीयकरण के परिणामस्वरूप । इसलिए, उचित organelle-लक्षित sfGFP1-10ऑप्टलागू करके ब्याज की स्थानीयकरण के प्रभाव को पुन: मांय किया जाना चाहिए । जब संक्रमित कोशिकाओं में किसी भी GFP संकेत नहीं पाया जाता है cytosolic sfGFP1 एक्सप्रेस-10ऑप्ट, हम अनुशंसा करते हैं का उपयोग कर N. benth व्यक्त Golgi, एर, और plastid लक्षित sfGFP1-10ऑप्ट या इसी organelle लक्षित का उपयोग sfGFP1-10ऑप् ट्रांसजेनिक Arabidopsis25.

इस विधि एक उपयोगी उपकरण के रूप में विभाजित फ्लोरोसेंट प्रोटीन प्रणाली के उपयोग के लिए मेजबान पौधों में प्रभावी रूप से लौकिक और स्थानिक गतिशीलता की जांच का प्रदर्शन25। भविष्य के अनुसंधान एकल अणु इमेजिंग, जो प्लाज्मा झिल्ली स्थानीयकृत प्रभाव की गतिशीलता का विस्तृत अध्ययन सक्षम हो सकता है में अग्रिमों पर ध्यान केंद्रित करेंगे । इसके अलावा, एक स्राव परख एक जीवाणु प्रणाली का उपयोग करने के लिए कवक प्रभाव के स्थानीयकरण का अध्ययन करने के लिए उपयोगी विकल्प हो सकता है; यह फंगल पैठ साइट पर प्रभाव और उच्च autofluorescence के एकत्रीकरण को रोकता है ।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस विधि में कुछ प्रमुख बिंदु हैं । सबसे पहले, संयंत्र सामग्री और बैक्टीरिया दोनों स्वस्थ और ताजा होना चाहिए । प्रभाव संकेत के दृश्य को सुनिश्चित करने के लिए, दोनों sfGFP1-10 पौधों सेऑप्ट और Pseudomonas से sfGFP11 दृढ़ता से व्यक्त किया जाना चाहिए । इसलिए, यह इष्टतम विकास की स्थिति के तहत पौधों को विकसित करने और उंहें पर्यावरण तनाव से बचाने के लिए महत्वपूर्ण है, ऐसे कीट के रूप में । हम यह भी अनुशंसा करते हैं कि घुसपैठ के लिए इस्तेमाल किए गए सभी जीवाणुओं को आगर प्लेट्स पर 2 दिन के बड़े सेल से लिया जाए और ग्लिसरॉल स्टॉक्स से नहीं । दूसरे, एन benthamianaमें क्षणिक अभिव्यक्ति के मामले में, organelle के परिपक्वता के लिए आवश्यक समय की लंबाई-लक्षित sfGFP1-10ऑप्ट प्रत्येक organelle मार्कर प्रोटीन के लिए भिन्न हो सकते हैं. उदाहरण के लिए, पीएम की परिपक्वता-sfGFP1-10ऑप्ट में घुसपैठ के बाद अधिक से अधिक ४८ ज की आवश्यकता है । अंत में, समय बिंदु और पुनर्गठन sfGFP संकेतों की अभिव्यक्ति का स्तर प्रभाव प्रोटीन है कि कुछ प्रयोगात्मक शर्तों का अनुकूलन करने के लिए आवश्यक है के प्रकार पर निर्भर करते हैं ।

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Disclosures

लेखकों के हित का खुलासा करने का कोई टकराव नहीं है.

Acknowledgments

इस शोध को नेशनल रिसर्च फाउंडेशन ऑफ कोरिया (एनआरएफ) द्वारा वित्त पोषित विज्ञान, आईसीटी और फ्यूचर प्लानिंग (एनआरएफ-2018R1A2A1A05019892) डीसी के माध्यम से और एक अनुदान द्वारा संयंत्र आणविक प्रजनन केंद्र ( PMBC) के अगली पीढ़ी के ग्रीन 21 ग्रामीण विकास प्रशासन (PJ013201) के कार्यक्रम EP करने के लिए । हम पर्यावरण प्रबंधन के लिए राष्ट्रीय इंस्ट्रूमेंटेशन केंद्र के इमेजिंग केंद्र को फिल्माने के लिए एक फोकल माइक्रोस्कोप प्रदान करने के लिए धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Arabidopsis transgenic lines Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10 ABRC CS69831
NU-sfGFP1-10 ABRC CS69832
PT-sfGFP1-10 ABRC CS69833
MT-sfGFP1-10 ABRC CS69834
PX-sfGFP1-10 ABRC CS69835
ER-sfGFP1-10 ABRC CS69836
GO-sfGFP1-10 ABRC CS69837
PM-sfGFP1-10 ABRC CS69838
Organelle-targeted sfGFP1-10OPT plasmid Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10 Addgene 97387
NU-sfGFP1-10 Addgene 97388
PT-sfGFP1-10 Addgene 97389
MT-sfGFP1-10 Addgene 97390
PX-sfGFP1-10 Addgene 97391
ER-sfGFP1-10 Addgene 97392
GO-sfGFP1-10 Addgene 97393
PM-sfGFP1-10 Addgene 97394
ER-sfCherry1-10 Addgene 97403
ER-sfYFP1-10 Addgene 97404
CYTO-sfCFP1-10 Addgene 97405
sfGFP11-tagged Gateway compatible vector for T3SS-based effector delivery system Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
pBK-GW-1-2 Addgene 98250 pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBK-GW-1-4 Addgene 98251 pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBK-GW-2-2 Addgene 98252 pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBK-GW-2-4 Addgene 98253 pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-1-2 Addgene 98254 pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-1-4 Addgene 98255 pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-2-2 Addgene 98256 pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-2-4 Addgene 98257 pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
Bacterial strains
Agrobacterium tumefaciens GV3101 Csaba Koncz and Jeff Schell, The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistant to gentamycin (50 ug/ml) and rifampicin (50 ug/ml)
Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500 Kvitko, B. H. et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistant to rifampicin (100 ug/ml)
Media components
Plant germination media Add 2.165g/L Murashige & Skoog powder, 10 g/L sucrose to water. Adjust to pH 5.8 and add 2.2 g/L phytagel. Autocalve.
Murashige & Skoog medium including vitamins Duchefa Biochemie M0222 Store at 4 °C.
Sucrose Duchefa Biochemie S0809
Phytagel Sigma-Aldrich P8169
LB media Add 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl to water. For solid media, add 15 g/L micro agar. Autoclave.  Allow solution to cool to 55 °C, and add antibiotic if needed.
Tryptone BD Bioscience 211705
Yeast extract BD Bioscience 212750
NaCl Duchefa Biochemie S0520
Micro agar Duchefa Biochemie M1002
King's B media 10 g/L protease peptone #2, 1.5 g/L anhydrous K2HPO4, 15 g/L of agar to water. Autoclave. Cool down to 55 °C and add sterile 15 ml/L glycerol, 5 ml/L MgSO4 to the medium. Add antibiotics if needed.
Proteose peptone BD Bioscience 212120
Anhydrous K2HPO4 Sigma-Aldrich 1551128 USP
Glycerol Duchefa Biochemie G1345
MgSO4 Sigma-Aldrich M7506
Bacto Agar BD Bioscience 214010
Mannitol-Glutamate (MG) liquid media Add 10 g/L of mannitol, 2 g/L of L-glutamic acid, 0.5 g/L of KH2PO4, 0.2 g/L of NaCl, and 0.2 g/L of MgSO4 to water. Adjust to pH 7
Mannitol Duchefa Biochemie M0803
L-glutamic acid Duchefa Biochemie G0707
KH2PO4 Sigma-Aldrich NIST200B
Infiltration buffer 10 mM MES (2-(N-morpholino)-ethane sulfonic acid), 10 mM MgCl2, 150 µM acetosyringone. pH 5.6; Prepare a fresh buffer before use.
MES Duchefa Biochemie M1503 Prepare 100 mM (pH 5.6) stock in water. Filter sterilize.
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 Prepare 100 mM stock in water. Autoclave.
Acetosyringone Sigma-Aldrich D134406 Prepare 150 mM stock in DMSO.
Confocal microscope equipments/materials
710 laser scanning confocal system Carl Zeiss
Axio observer Z1 inverted microscope Carl Zeiss
Propidium iodide ThermoFisher P1304MP

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References

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Lee, H. Y., Lee, S. E., Woo, J., Choi, D., Park, E. Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection. J. Vis. Exp. (135), e57719, doi:10.3791/57719 (2018).More

Lee, H. Y., Lee, S. E., Woo, J., Choi, D., Park, E. Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection. J. Vis. Exp. (135), e57719, doi:10.3791/57719 (2018).

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