형광 단백질 기반 접근 호스트 세포에 박테리아에 의해 은닉 하는 이펙터를 모니터링 하는 도전입니다. 형광 단백질 및 유형 III 분 비 시스템 간의 비 호환성 때문입니다. 여기, 최적화 된 분할 superfolder GFP 시스템 호스트 식물 세포에 박테리아에 의해 은닉 하는 이펙터의 시각화 사용 됩니다.
박테리아, 다양 한 식물 질병의 원인이 되는 가장 중요 한 에이전트 중 하나는 호스트 식물 세포 식물 면역 체계를 파괴에 effector 단백질의 집합을 분 비. 감염 시 세포질 이펙터 유형 III 분 비 시스템 (T3SS)를 통해 호스트 cytosol에 전달 됩니다. 식물 세포에 배달, 후에 effector(s) 생존 및 병원 체의 복제에 대 한 호스트 세포 프로세스를 변조 하는 것 특정 compartment(s) 대상. 비록 pathogenicity에 형광 단백질을 사용 하 여 그들의 기능을 이해 하는 호스트 셀에 effector 단백질의 subcellular 지역화의 박테리아에서 직접 주입 하는 이펙터의 역학 조사에서 일부 연구 하고있다 T3SS와 형광 단백질 간의 비 호환성으로 인해 도전 하고있다.
여기, 우리가 호스트 셀에서 세균 T3SS 통해 전달 하는 이펙터의 지역화를 시각화 하기 위해 최적화 된 분할 superfolder 녹색 형광 단백질 시스템 (sfGFPOPT)의 최근 우리의 방법을 설명 합니다. sfGFP11 (11번째 β 물가의 sfGFP)-태그 이펙터는 T3SS을 통해 분 비 사이트에서 형광 방출에 표적으로 하는 특정 세포 기관이 sfGFP1-10선택 (1-10번째 β 물가의 sfGFP) 행간 조립 될 수 있다. 이 프로토콜 애기 Nicotiana benthamiana 식물에 특정 세포 기관이에 슈 도모 나 스 syringae 에서 effector 단백질으로 재구성된 sfGFP 형광 신호를 시각화 하는 절차를 제공 합니다.
식물은 수많은 침입 병원 체 포함 박테리아, 곰 팡이, 바이러스, 곤충 및 nematodes 그들의 수명 주기 동안 발생 하는 착 유기 체. Phytopathogens, 중 녹 종 등 Ralstonia 종, 그램 음성 세균성 병원 체 상처 또는 stomata 및 hydathode 같은 자연 구멍을 통해 입력 하 여 그들의 호스트 식물을 감염1. 성공적으로 호스트 식물 식민지로 세균성 병원 균 독성 요인2의 다양 한 개발을 진화 했다. 박테리아는 기 주 식물을 침공, 그들은 일련의 독성 단백질 주사-이펙터로 알려진-그들의 pathogenicity 홍보를 식물 세포에 직접. 이 이펙터 억제 또는 공장 타고 난 면역을 조절 하 고 세균 생존3결과 호스트 세포 프로세스를 조작.
병원 성 박테리아는 주로 호스트 셀4에 직접 효과 기 단백질을 제공 하는 T3SS를 사용 합니다. T3SS는 호스트 셀5의 사출 사이트 내부와 외부 세균 막 비 계 단백질 구조에서 연결 바늘 같은 채널 분자 주사기를 유사 합니다. 이 이펙터 T3SS 중재 (T3E) 분 비 메커니즘은 인간 뿐만 아니라 식물의 다양 한 그램 음성 세균성 병원 체에 잘 보존. 대표적인 식물 병원 체, P. syringae pv 중 하나입니다. 토마토 DC3000 hrcC 돌연변이 일반적으로 결함이 있는 T3SS 완전히 억제 식물 면역 (effector 단백질을 주입)에 의해6에이 돌연변이의 무 능력으로 인해 식물에 성장을 제한 했다. 호스트 세포로 전, 시 이펙터 대상 다양 한 호스트 단백질 등 식물 방위 응답, 유전자 전사, 세포 죽음, 프로테아좀, 소포 매매, 호르몬 경로7 호스트 셀 시스템에 대 한 중요 한 , 8 , 9 , 10. 따라서, 추적 호스트 셀에 effector 단백질의 세포질 지 방화의 식물 면역의 변조에 관하여 그들의 기능을 이해 하는 매력적인 대상 이다.
T3Es의 지역화 연구의 대부분 Agrobacterium-중재 overexpression 호스트 식물9큰 형광 단백질으로 고용 했다. 그러나, 다른 종에 도입 된 유전자의 분리 식 방법 잘못 지역화 된 또는 때때로 작동 하지11,,1213되도록 표시 되었습니다. 또한, 여러 연구 결과 세균성 이펙터는 호스트 셀14,15,,1617에서 적절 한 대상에 대 한 수정 받을 밝혔다. 따라서, 세포 기능 또는 양적 이펙터 병원 체 감염18시 T3SS에 의해 전달 되는 동일 하지 않을 수 있습니다 식물의 cytosol에서 이펙터 뚜렷이 표현. 또한, 대형 형광 태그 effector 단백질의 융합 적절 한 이펙터 배달 및 시각화18,19중단 될 수 있습니다. 따라서, T3E 함수 분석에이 접근 T3SS 분 비 이펙터의 네이티브 지역화를 완벽 하 게 반영 되지 않을 수 있습니다.
녹색 형광 단백질 (GFP)20발 색 단 포함 하는 중앙 물가 포함 하는 11-배가 좌초 하는 β-배럴의 구성 됩니다. Waldo 외. 작은 부품으로 구성 된 새로운 분할-GFP 시스템을 보고 (GFP β 물가 11; GFP11)와 대형 보완 조각 (GFP β 물가 1-10; GFP1-10)21. 조각을 스스로 형광 하지 않습니다 하지만 두 조각을 서로 가까운 근접에 있을 때 그들의 자기 협회에 형광. 단백질 접히는 효율성의 최적화에 대 한 강력한 접는 변종 GFP, 즉, sfGFP 및 sfGFP선택, 이후에 분할 GFP 시스템20,,2122개발 되었다. 최근, 단일 아미노산 돌연변이 sfGFP1-10선택-sfYFP1-10선택 및 sfCFP1-10선택-을 각각 sfGFP11 조각와 쇼 노란색과 청록색 형광 reconstitute 수, 생성 된23의 변형 . 또한, sfCherry, mCherry의 파생 분열 될 수 있다 sfGFP23와 같은 방식으로 sfCherry11와 sfCherry1-10 조각으로.
이 시스템은 고 살 모 넬 라24. 에서 이펙터를 사용 하 여 감염 동안 추적 하는 HeLa 세포에서 T3SS 이펙터에 맞게 되었습니다. 그러나, 그것은 이전 하지 최적화 호스트 식물 세균성 병원 체 시스템에 대 한. 최근에, 우리는 식물 세포25에 P. syringae 에서 전달 하는 T3Es의 subcellular 지 방화를 모니터링 하는 데 향상 된 sfGFP1-10선택 에 따라 분할 GFP 시스템 최적화. 식물 세포, 유전자 변형 애기 thaliana 집합에에서 다른 subcellular 구획을 T3Es의 지역화 연구를 촉진 하기 위하여 식물 다양 한 subcellular 구획 에서에서 sfGFP1-10OPT 를 표현 하기 위해 생성 된 25. 또한, 다양 한을 운반 하는 플라스 미드 세포 기관이 대상 sfGFP1-10선택 Agrobacterium에 대 한-중재 과도 overexpression 이펙터 T3SS 기반 배달에 대 한 sfGFP11 태그 벡터 또한 생성 했다. 다양 한 유전자 변형 애기 라인과 관심의 T3Es을 표현 하는 플라스 미드의 씨앗 테이블의 자료26,27에서 언급 한 소스에서 얻을 수 있습니다.
다음 프로토콜에서 우리는 분할 sfGFP 시스템을 사용 하 여 호스트 세포에 박테리아에 의해 전달 하는 이펙터의 역학을 모니터링 하는 최적화 된 시스템을 설명 합니다. SfGFP1-10선택 유전자 변형 녹 sfGFP11 재조합 플라스 미드를 들고와 표현 하는 식물의 감염 호스트 셀으로 모나 스 에서 sfGFP11 태그 이펙터의 전달 결과. 따라서, 이러한 단백질 재구성 되 고 특정 이펙터 대상 compartment(s)에 이동. 슈 도모 나 스 syringae pv입니다. 토마토 18 이펙터 삭제 됩니다, CUCPB5500 스트레인이이 스트레인 A. thaliana 및 북 아 일 benthamianas28에 낮은 또는 없음 세포 죽음을 보여주 때문에 사용 되었다. 그러나, 모든 자료와 여기에 설명 된 단계 교체 수 있습니다 또는 다른 생물학 질문 또는 지정 된 실험실 조건에서 최적화의 조사를 위해 분할 sfGFP 시스템에 맞게 수정.
여기에 설명 된 프로토콜 모니터링 호스트 식물 세포 감염 시 세균 T3SS에 의해 주입 하는 effector 단백질의 정확한 지역화에 사용 됩니다. 이전, 분할 GFP 시스템 포유류 단백질23,36의 subcellular 지 방화, 살 모 넬 라 T3E 지역화, Agrobacterium VirE2 납품에 T4SS 통해 공부 하는 도구로 사용 되었다는 식물 세포37. 식물 세포에서이 시스…
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 기초 과학 연구 프로그램을 통해 국가 연구 재단의 한국 (NRF) 사역의 과학, ICT 및 향후 계획 (NRF-2018R1A2A1A05019892) dc 및 식물 분자 번 식 센터 (에서 교부 금에 의해 투자에 의해 지원 되었다 PMBC) 에피소드를 농촌 개발 관리 (PJ013201)의 다음 세대 Biogreen 21 프로그램의 우리 confocal 현미경 촬영을 제공 하기 위해 환경 관리에 대 한 국립 계측 센터의 이미징 센터를 감사 합니다.
Arabidopsis transgenic lines | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
CYTO-sfGFP1-10 | ABRC | CS69831 | |
NU-sfGFP1-10 | ABRC | CS69832 | |
PT-sfGFP1-10 | ABRC | CS69833 | |
MT-sfGFP1-10 | ABRC | CS69834 | |
PX-sfGFP1-10 | ABRC | CS69835 | |
ER-sfGFP1-10 | ABRC | CS69836 | |
GO-sfGFP1-10 | ABRC | CS69837 | |
PM-sfGFP1-10 | ABRC | CS69838 | |
Organelle-targeted sfGFP1-10OPT plasmid | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
CYTO-sfGFP1-10 | Addgene | 97387 | |
NU-sfGFP1-10 | Addgene | 97388 | |
PT-sfGFP1-10 | Addgene | 97389 | |
MT-sfGFP1-10 | Addgene | 97390 | |
PX-sfGFP1-10 | Addgene | 97391 | |
ER-sfGFP1-10 | Addgene | 97392 | |
GO-sfGFP1-10 | Addgene | 97393 | |
PM-sfGFP1-10 | Addgene | 97394 | |
ER-sfCherry1-10 | Addgene | 97403 | |
ER-sfYFP1-10 | Addgene | 97404 | |
CYTO-sfCFP1-10 | Addgene | 97405 | |
sfGFP11-tagged Gateway compatible vector for T3SS-based effector delivery system | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
pBK-GW-1-2 | Addgene | 98250 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
pBK-GW-1-4 | Addgene | 98251 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
pBK-GW-2-2 | Addgene | 98252 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
pBK-GW-2-4 | Addgene | 98253 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
pBG-GW-1-2 | Addgene | 98254 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
pBG-GW-1-4 | Addgene | 98255 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
pBG-GW-2-2 | Addgene | 98256 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
pBG-GW-2-4 | Addgene | 98257 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
Bacterial strains | |||
Agrobacterium tumefaciens GV3101 | Csaba Koncz and Jeff Schell, The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistant to gentamycin (50 ug/ml) and rifampicin (50 ug/ml) | ||
Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500 | Kvitko, B. H. et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistant to rifampicin (100 ug/ml) | ||
Media components | |||
Plant germination media | Add 2.165g/L Murashige & Skoog powder, 10 g/L sucrose to water. Adjust to pH 5.8 and add 2.2 g/L phytagel. Autocalve. | ||
Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | Store at 4 °C. |
Sucrose | Duchefa Biochemie | S0809 | |
Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
LB media | Add 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl to water. For solid media, add 15 g/L micro agar. Autoclave. Allow solution to cool to 55 °C, and add antibiotic if needed. | ||
Tryptone | BD Bioscience | 211705 | |
Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
NaCl | Duchefa Biochemie | S0520 | |
Micro agar | Duchefa Biochemie | M1002 | |
King's B media | 10 g/L protease peptone #2, 1.5 g/L anhydrous K2HPO4, 15 g/L of agar to water. Autoclave. Cool down to 55 °C and add sterile 15 ml/L glycerol, 5 ml/L MgSO4 to the medium. Add antibiotics if needed. | ||
Proteose peptone | BD Bioscience | 212120 | |
Anhydrous K2HPO4 | Sigma-Aldrich | 1551128 USP | |
Glycerol | Duchefa Biochemie | G1345 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
Bacto Agar | BD Bioscience | 214010 | |
Mannitol-Glutamate (MG) liquid media | Add 10 g/L of mannitol, 2 g/L of L-glutamic acid, 0.5 g/L of KH2PO4, 0.2 g/L of NaCl, and 0.2 g/L of MgSO4 to water. Adjust to pH 7 | ||
Mannitol | Duchefa Biochemie | M0803 | |
L-glutamic acid | Duchefa Biochemie | G0707 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | NIST200B | |
Infiltration buffer | 10 mM MES (2-(N-morpholino)-ethane sulfonic acid), 10 mM MgCl2, 150 µM acetosyringone. pH 5.6; Prepare a fresh buffer before use. | ||
MES | Duchefa Biochemie | M1503 | Prepare 100 mM (pH 5.6) stock in water. Filter sterilize. |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Prepare 100 mM stock in water. Autoclave. |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | Prepare 150 mM stock in DMSO. |
Confocal microscope equipments/materials | |||
710 laser scanning confocal system | Carl Zeiss | ||
Axio observer Z1 inverted microscope | Carl Zeiss | ||
Propidium iodide | ThermoFisher | P1304MP |