Summary
تفرز الفئران المعرضة للبس داخل اكسوسوميس في السنخية برونتشو الغسل (BAL) السوائل التي يتم حزمها مع ميرناس. باستخدام نظام ثقافة المشارك، نظهر أن اكسوسوميس صدر في السائل BAL عرقلة التعبير من مفرق ضيق البروتينات في الخلايا الظهارية الشعب الهوائية وزيادة التعبير عن السيتوكينات الموالية التحريضية التي تزيد من حدة الإصابة الرئوية.
Abstract
وتمثل إصابة الرئة الحاد (على) ومتلازمة الضائقة التنفسية الحادة (اردز) مجموعة غير متجانسة من أمراض الرئة التي تواصل ارتفاع معدلات الاعتلال والوفيات. ويجري المرضية الجزيئية على أفضل تعريف؛ ومع ذلك، بسبب الطبيعة المعقدة لهذا المرض لم توضع العلاجات الجزيئية. هنا نستخدم نموذج ماوس مستحث lipopolysaccharide (LPS) لإصابة الرئة الانتانية الحادة لتحدد دور اكسوسوميس في الاستجابة الالتهابية. باستخدام هذا النموذج، كنا قادرين على إظهار أن الفئران التي تتعرض للبس داخل تفرز اكسوسوميس في السنخية برونتشو الغسل (BAL) السائل من الرئتين التي يتم حزمها مع ميرنا والسيتوكينات التي تنظم الاستجابة الالتهابية. كذلك استخدام نظام نموذج ثقافة المشارك، نظهر أن اكسوسوميس صدر من الضامة عرقلة تعبير البروتينات مفرق ضيق في الشعب الهوائية الخلايا الظهارية. هذه النتائج تشير إلى أن الصليب الحديث 1) بين الخلايا المناعية والهيكلية الفطرية من خلال جولات مكوكية اكسوسومال المساهمة في الاستجابة الالتهابية وتمزق الجدار الهيكلي و 2) استهداف هذه ميرناس قد توفر منبرا جديداً لعلاج على والضائقة.
Introduction
على والضائقة هي الأشكال تهدد الحياة من فشل في الجهاز التنفسي مع نقص تاكسج الدم الحاد الناجم عن ذمة رئوية غير كارديوجينيك الذي يؤثر على ما يقرب من 1 مليون شخص في العالم سنوياً1. تشمل مسببات الضائقة الضرر المباشر إلى الرئتين من العدوى أو الطموح ومجموعة متنوعة من إهانات غير مباشرة. خلال العقد الماضي كان هناك زيادة فهم الآلية المرضية الجزيئية للضائقة، ولكن العلاجات المستهدفة المحددة للضائقة بعد أن وضعت2،3.
وقد وضعت عدة نماذج حيوانية لإصابة الرئة الحادة التي توفر جسراً لترجمة علاجات تجريبية للدراسات الإنسانية4،5. وتشمل نماذج شائعة التثبيت المحلي من حمض الأولييك والبكتيريا ولبس وبليوميسين. وتشمل النهج الأخرى الاسكيمية-الاكسجينيه، ثقب ربط سيكال، الإصابة تمتد الميكانيكية المستحثة بالتهوية أو هايبروكسيا أو الإدارة المنهجية للبكتيريا ولبس5. هذه النماذج توفر نظام بيولوجي مفيدة لاختبار فرضيات السريرية وتطوير العلاجات المحتملة. لمحاكاة الضائقة الإنسانية، ينبغي استنساخ نماذج حيوانية الالتهابات والإصابات الحادة للخلايا الظهارية وبطانية بعيوب في وظيفة الحاجز في الرئتين.
اكسوسوميس الحويصلات الغشاء مع 20-200 نانومتر في القطر، ومحتواه الجزيئي يحتوي على البروتينات والحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي، والدهون، وتيسير الاتصالات بين الخلوية في المكروية الأنسجة عن طريق نقل التركيب الجزيئي. اكسوسوميس التي يفرزها أنواع متعددة من الخلايا، مثل خلايا بطانية والخلايا الظهارية، وخلايا العضلات الملساء والخلايا السرطانية، وتوجد في السوائل في الجسم البشري. وتشير الدراسات إلى أن تنظيم اكسوسوميس عبر الحديث بين الخلايا المناعية والخلايا اللحمية أثناء أمراض الالتهابات المعدية والعقيمة، والإفراج عنهم غير طبيعي يظهر تنظمها مختلف المحفزات الطبيعية والتجريبية خلال الفسيولوجية والعمليات المرضية6. شبكة الاتصال من هذا القبيل قد تلعب دوراً هاما في الآلية المرضية لأمراض الرئة، وقد تؤثر على تطور الفيزيولوجية المرضية7،8. النوكليوتيدات، 18-22 غير الترميز الكشف، ميرناس الموجودة في الأنسجة وسوائل الجسم، البلازما، سيرا، وتعدل التعبير مرناً في مستوى بوستترانسلاشونال9،10.
ميرناس المعبأة في اكسوسوميس التأثير على التمايز والدالة لأنواع متعددة من الخلايا، والمستويات المفرطة المرتبطة بمجموعة متنوعة من الأمراض، بما في ذلك السرطان وأمراض الرئة، والسمنة، والسكري، والأمراض القلبية الوعائية11، 12،،من1314،،من1516. دخول الخلايا المتلقية ويتنقلون من ميرناس اكسوسومال تيسير الاتصالات بين الخلايا تعديل الأرقاء المكروية17،18. إصابة الرئة الحاد عمليات معقدة، التي تنطوي على العديد من أنواع الخلايا مع الاتصالات الواسعة النطاق بين الخلايا عن طريق اكسوسوميس8. مير-155 ومير-146a حصة الآلية التنظيمية النسخي المشتركة والمساهمة في الاستجابة الالتهابية و التسامح المناعي19،20. الدراسات الحديثة تشير إلى أن كلا تعدل الاستجابة الالتهابية عن طريق اكسوسومال ميرناس جولات مكوكية بين الخلايا المناعية21. ومع ذلك، الآليات الجزيئية الكامنة وراء آثار مودولاتوري ميرناس اكسوسومال على السنخية وردا على الذيفان لا تزال غير واضحة، وبلا شك أهميتها السريرية المحتملة وضمنا متعدية الجنسيات تستحق المزيد من التحقيق.
تستخدم نماذج الثقافة المشتركة لتحديد التفاعل بين أنواع خلية معينة في بيئة معقدة، مثل السرطان والتهاب،من2223. وتوفر هذه المنصات استراتيجية بديلة استجواب الصليب الحديث بين أنواع خلية خاصة بالنسبة للخلايا المناعية والهيكلية.
داخل الرغامى، الضبوبيه، داخل أو منهجية إدارة لبس تستخدم على نطاق واسع للحث على الرئة التجريبية إصابة24،،من2526، وأظهرت للحث على نفاذية الظهارية وبطانية العيوب. هنا نستخدم لبس داخل للحث على نموذج الصرف الصحي لإصابة الرئة الحاد في الفئران. خلال 24 ساعة داخل الإدارة للبس، هي التي يسببها العيوب النفاذية في الرئتين بتجنيد الخلايا التحريضية. علاوة على ذلك، نعرض أن يتضمن اكسوسوميس من بال ميرنا-155 ومير-146a، وحمل اكسوسوميس من السوائل BAL التعبير السيتوكينات برو-التهاب في الخلايا الظهارية المتلقي، بما في ذلك 6 إيل وتنف-α. هذه البيانات الأولى لإظهار أن ميرناس اكسوسومال يفرز في بال في هذا النموذج من الإصابة الحادة التهاب الرئة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ويتطلب البروتوكول العام أيام 2، بما في ذلك اليوم الأول من تحريض الانتان وعزله من السائل بال من الحيوان، وفي اليوم الثاني لعزل اكسوسوميس من الماوس بالف. تم استعراض جميع الإجراءات ووافقت عليها لجنة الاستخدام في مركز طبي خامسا أتلانتا ورعاية الحيوان المؤسسية.
1-الماوس الحاد التهاب الرئة الإصابة النموذجي
- استخدام 6-8 أسابيع-القديمة البرية من نوع C57BL/6J الفئران الذكور (وزن ز 20-22) للحيوان النموذجية، وتنفيذ جميع الإجراءات باستخدام تقنيات العقيم والصكوك. اﻷوتوكﻻف جميع الأدوات الجراحية، بما في ذلك ملقط ومقص لمدة 20 دقيقة في 121 درجة مئوية.
- توزيع عشوائي الفئران إلى التجريبية ومجموعة المراقبة. كبح جماح الفئران على لوحة العمليات جراحية. علاج الفئران مع lipopolysaccharide الإشريكيّة القولونية (لبس، 15 مغ/كغ) بداخل المسار. استناداً إلى وزن الجسم الفردية، تخفف جرعات لبس المناسبة إلى 0.1 مل برنامج تلفزيوني في الماوس، ثم حل لبس استخدام المحاقن 1 مل مع ز 27 إبرة حقن وحقن بما يعادل حجم برنامج تلفزيوني لمراقبة الحيوانات.
- الحفاظ على الفئران في مرفق BSL2 الحيوانية، التي تتألف من أقفاص النظيف في درجة حرارة الغرفة مناسبة.
- 24 ساعة في وقت لاحق، euthanize الفئران مع استنشاق أول أكسيد الكربون2 .
- حدد منطقة الجراحية في وسط الرقبة الماوس. إجراء شق صغير (حوالي 5 ملم)، وفصل برفق العضلات للوصول إلى القصبة الهوائية باستخدام الملقط حادة حتى يتم كشفها في القصبة الهوائية.
- سحب الماوس بال السائل مع 10 مل المحاقن المعقمة بإبرة ز 27. أولاً، بلطف، أدخل الإبرة في القصبة الهوائية وحقن 1 مل PBS العقيمة ببطء في القصبة الهوائية، ثم رسم بالف في محقن 3 مللي المتاح بإبرة ز 27. عند انتهاء الإجراء، التخلص من المحاقن والإبر في حاوية الأدوات الحادة واقية.
- التعامل مع الأدوات الجراحية مع ثاني أكسيد الكلور، كما هو موضح مسبقاً قبل شاريت et al. 27، وثم تعقيم جميع الأدوات الجراحية بالتعقيم لمدة 20 دقيقة في 121 درجة مئوية.
2-اكسوسوميس العزلة-مسلسل الترا-الطرد المركزي وتوصيف
- جمع الماوس BAL السوائل في الأنابيب المخروطية 15 مل. حصاد الخلايا السنخية، وعينات للطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في ز 1,000، في 4 درجات مئوية.
- نقل المادة طافية على أنابيب مخروطية الشكل 15 مل جديدة، ثم الطرد المركزي عينات لمدة 30 دقيقة في 4,000 س ز عند 4 درجة مئوية لإزالة الحطام خلية.
- جمع المادة طافية في أنابيب ultracentrifuge وعينات للطرد المركزي لمدة 60 دقيقة في 10,000 ز x عند 4 درجة مئوية لإزالة الجسيمات الأكبر حجماً الخلوية.
- نقل المادة طافية على أنابيب مخروطية الشكل الجديد، ثم تصفية العينات من خلال 0.2 ميكرون حقنه-تصفية لإزالة المتبقي الجسيمات الأكبر حجماً.
- جمع العينات في أنابيب أولتراسينتريفوجي، وتحقيق التوازن بين الأنابيب. الطرد المركزي عينات ح 2 في 140,000 س ز عند 4 درجة مئوية بيليه اكسوسوميس.
ملاحظة: يختلف حجم اكسوسوميس 20-200 نانومتر. 0.2 ميكرون فلتر يستخدم لإزالة الجسيمات الأكبر حجماً التي هي أكثر من 200 نانومتر في الحجم. - تجاهل سوبيرناتانتس برفق. حل بيليه مع 100 ميليلتر PBS أو حل تحلل، ونقل اكسوسوميس عينات لأنابيب 1.5 مل، وتخزينها في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
ملاحظة: يوصي بالمجهر الإلكتروني انتقال للتحقق من اكسوسوميس معزولة. - اتبع العينة تيم القياسية تجهيز بروتوكول28. تحليل عينات اكسوسوميس باستخدام مقياس مجهر إلكتروني، والتقاط الصور وشريط 200 نانومتر.
3-إعداد ميرنا والمسرحية ميرنا--RT-PCR
ملاحظة: من المستحسن ميرنا--RT-PCR لتحليل مستوى التعبير ميرناس.
- اتبع ميرناس القياسية البروتوكول العزلة وتأكد من استخدام مبلغ مساو من الكشف المنقاة في النسخ العكسي حبلا واحد24.
- يتبع البروتوكول PCR الوقت الحقيقي القياسية للكشف عن مستوى ميكرورنا اكسوسومال في بال السائل. استخدام محددة الإشعال PCR الوقت الحقيقي ضد مير-155 ومير-146a سنرنا U6. تشغيل [بكر] رد فعل مع جهاز PCR الكمي وتطبيع قيم التعبير للرقابة الداخلية U6 سنرنا.
ملاحظة: كل فريق يتكون من ثلاث عينات24.
4-اكسوسوميس وسم وتنقية
- تعليق بيليه اكسوسوميس مع 100 ميليلتر تعليق الحل في أنبوب البولي بروبلين 1.5 مل، ثم إضافة ميليلتر 0.4 من صبغة اكسوسوميس في الأنبوبة الأخرى مع 100 ميليلتر من الحل تعليق.
- بسرعة إضافة اكسوسوميس في الحل إلى الحل صبغ ومزجها جيدا قبل بيبيتينج. الاحتفاظ بعينات لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وحماية من الضوء.
- وضع عمود الدوران اكسوسومي واحد في أنبوب شطف 1.5 مل. نقل الخليط الحل إلى مركز العمود تدور اكسوسومي.
- تدور في عمود 2 دقيقة في 800 x ز في درجة حرارة الغرفة.
- تجاهل العمود وتخزين العينة التيد في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
5-التحقق من اكسوسوميس حتى تتخذها الخلايا المتلقية
- البذور 1 × 104 /MLE 12 الخليوي في شريحة دائرة 8-جيدا، وخلايا الثقافة في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
- إضافة 10 ميليلتر نيون المسمى اكسوسوميس للخلايا. احتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية.
- قم بإزالة وسائط الثقافة وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني، ثم إصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد 1% لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- جبل الشريحة في جبل المتوسطة مع DAPI.
- تحليل عينات من خلال مجهر الأسفار والتقاط صور، 40 X التكبير.
6-تحقق تفاعل بين اكسوسوميس والخلايا المتلقية
- البذور 2 × 105 MLE12/بئر في صفيحة ثقافة 12-كذلك يتضمن مناسبة الثقافة المتوسطة، وخلايا الثقافة في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
- إضافة 20 ميكروغرام اكسوسوميس من الماوس بال السائل إلى خلايا MLE12 وإعداد replicates كل مجموعة تجريبية.
- 24 ساعة في وقت لاحق، تغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني وإضافة 600 ميليلتر تحلل العازلة في البئر. بلطف يهز اللوحة وجمع عينات تحلل في أنبوب 1.5 مل مع الماصة.
- اتبع معيار مجموع الجيش الملكي النيبالي العزلة وبروتوكول كدنا النسخ العكسي، وإكمال النسخ العكسي كدنا حبلا واحد29.
- يتبع البروتوكول PCR الوقت الحقيقي القياسية للكشف عن مستوى التعبير مرناً في الخلايا المتلقية29. استخدام محددة الإشعال PCR الوقت الحقيقي ضد تنف-α، وايل-6، وزوى--1. تشغيل PCR ردود الفعل مع جهاز PCR الكمي وتطبيع قيم التعبير للرقابة الداخلية جابده.
ملاحظة: كل فريق يتكون من ثلاث عينات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
للحث على إصابة الرئة التفسخ، يعاملون الفئران مع لبس داخل (15 مغ/كغ). خلال 24 ساعة إدارة لبس، شهدت تدفق بالعدلات الرئتين، كما هو مبين في الشكل 1 ألف. ووجه السائل BAL الماوس، متبوعاً بعزل وتنقية اكسوسوميس. وأكد مورفولوجية اكسوسوميس بالف انتقال الميكروسكوب الإلكتروني (الشكل 1B).
تم الكشف عن التعبير عن ميرناس برو--التهابات انتقائية ميرنا-155 ومير-146a من-RT-PCR من اكسوسوميس المنقي. مستويات التعبير مير-155 ومير-146a قد زادت كثيرا في اكسوسوميس بال السائل من الفئران التي كانت تعامل مع لبس، مقارنة بالفئران تحكم تعامل مع برنامج تلفزيوني (مير-155، 1 ± 0.16 مقابل 11.6 ± 0.6؛ مير-146a، 1 ± 0.12 مقابل 13.5 ± 1.186) (الشكل 2).
لتحديد آثار اكسوسوميس الوظيفية، يعاملون الماوس الخلايا الظهارية الشعب الهوائية (الخلايا MLE12) مع اكسوسوميس المنقي المستخرج من السوائل BAL الفئران تعامل مع لبس أو برنامج تلفزيوني، على التوالي. أولاً، لقد أثبتنا دخول اكسوسوميس بالف في الخلايا الظهارية المتلقية. اكسوسوميس بالف المسمى مع بخ-67، ومثقف يشترك مع خلايا MLE12، وثم إظهار صور المجهر fluorescence امتصاص اكسوسوميس بالخلايا الظهارية (الشكل 3A). التعبير الوسيط برو التحريضية، تنف-α، وايل-6 وقد زادت كثيرا في الخلايا الظهارية التي كانت مثقف يشترك مع اكسوسوميس من لبس يعامل الفئران، مقارنة بمجموعة المراقبة (تنف-α، ± 1 مقابل 0.13 5.01 ± 0.22؛ IL-6، مقابل 1.72 1 ± 0.02 ± 0.17) (الشكل 3). عقدنا العزم أيضا على التعبير عن البروتين مفرق ضيق زوي-1 كبديل لسلامة الظهارية. الخلايا التي كانت تعامل مع اكسوسوميس من لبس يعامل الفئران أظهرت تعبير كبيرة الموهن من زوي-1، مقارنة بلبس معاملة مكافحة الفئران (زوي--1، 1 ± 0.12 مقابل 0.66 ± 0.13) (الشكل 3).
الشكل 1: وصف اكسوسوميس المعزولة من السوائل BAL الفئران المعالجة بلبس- C57BL/6J الفئران كانت تعالج بالحقن داخل بلبس (15 مغ/كغ) (N = 5)، برنامج تلفزيوني كان يستخدم كعنصر تحكم (N = 5). ح في وقت لاحق، قد euthanized الفئران، وقد أنجز السائل بال 24. الصور التمثيلية لانسجة الرئة الماوس تعامل مع لبس وبرنامج تلفزيوني يظهر الإصابة الرئوية الحادة، ومقياس بار، 50 ميكرومتر، A.) تم استخراج اكسوسوميس من السوائل بال. مقياس انتقال الميكروسكوب الإلكتروني (TEM) التحليل إظهار اكسوسوميس، بار، 200 نانومتر، ب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: اكسوسومال ميرناس التعبير في السوائل BAL المعزولة من الفئران المعالجة بلبس- وقد تحدي الفئران C57BL/6J مع لبس داخل. تم تحليل التعبير عن ميكرورناس انتقائية عن طريق-RT-PCR وتم تسويتها للتعبير U6. A) مير-155؛ ب) مير-146a. n = 5 الفئران في كل مجموعة. اختبار الطالب، * P < 0.05. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: التعبير عن السيتوكينات الالتهابية ومفرق ضيق البروتين في الخلايا الظهارية الماوس تعامل مع اكسوسوميس- كانت المسمى بال اكسوسوميس المستمدة من السوائل مع بخ-67، ومجهر الأسفار عرض PKH67 المسمى اكسوسوميس (الأخضر)، و DAPI(Blue)، والصور المدمجة من الإقبال على إظهار اكسوسوميس في الخلايا MLE12، شريط مقياس 50 ميكرومتر، كما هو مبين في A). الخلايا الظهارية الماوس MLE12 كانت مثقف يشترك مع اكسوسوميس معزولة عن بال السائل من الفئران تعامل مع لبس أو برنامج تلفزيوني. 24 ح في وقت لاحق، تم حصاد الخلايا، ومجموع الجيش الملكي النيبالي كانت معزولة. وتم قياس التعبير تنف-α وايل-6 مع-RT-PCR، تطبيع للرقابة الداخلية جابده. (ب) (ج) IL6؛ وتنف-α (د) وتم قياس التعبير مرناً زوي-1 مع-RT-PCR. * ف < 0.05، اختبار الطالب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نماذج الماوس من الأمراض تستخدم عادة لتقييم الوظيفة الفسيولوجية لجينات محددة وخفض تكلفة التجريب2. إصابة الرئة الانتانية الحادة الموصوفة هنا يحاكي الاستجابة الالتهابية في البشر مع الضائقة. هذا النموذج ذات الصلة بالتحقيق في الآلية المرضية الجزيئية، تطوير المؤشرات الحيوية واختبار علاجات جديدة محتملة5.
نظم الثقافة المشتركة ذات الصلة للدراسات في فيفو في سياق التحقيق في الآليات المحتملة لنقل الجزيئات البيولوجية مثل الحمض النووي الريبي والحمض النووي والدهون والبروتينات في23،نظام في المختبر30. بعض من هذه المنصات لها فائدة كبيرة في تقييم فهم الميكانيكية وتطوير علاجات للأمراض المعقدة،من2223. كما هو موضح هنا اكسوسوميس من الخلايا الغسل (الضامة، العَدلات) يمكن أن يؤثر على سلامة الخلايا الظهارية الهيكلية من خلال نقل اكسوسوميس.
آثار باثوبيولوجيكال من اكسوسوميس الناشئة باعتبارها الجانب الحاسم في الأمراض التي تصيب الإنسان سواء من الناحية العلاجية والتشخيص وفهم المرض المرضية31،32. لعزل اكسوسوميس من السوائل البيولوجية، يشمل هذا الأسلوب الأكثر استخداماً الطرد المركزي التفاضلي يقترن تنبيذ فائق كما هو موضح هنا33،34. هذا الأسلوب له عدة نقاط القوة، على الرغم من أن ينحصر بحقيقة أنه يمكن أن تستغرق وقتاً طويلاً، وخطر التلوث مع البروتينات غير اكسوسومال. واقترحت نهجاً مبتكرة للتغلب على هذه القيود، مثل عزل اكسوسومي بالتدرج الكثافة أو المناعة-التقارب الأسلوب تعتمد على حجم35. ويجري التحقيق في الدراسات السريرية اكسوسوميس كالمؤشرات الحيوية للتشخيص، والتشخيص، وتطوير العلاجات المستهدفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وأيد هذا العمل "استعراض الجدارة خامسا" التمويل 2I01BX001786-06A1 لجمهورية صربسكا.
Acknowledgments
وقد أعلنت المؤلفون لا تضارب في المصالح.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | Escherichia coli 055:B5 | |
| PBS pH7.2(1X) | Life technologies | 20012-027 | |
| mirVana miRNA isolation kit | Thermo Fisher | 449774 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermo Fisher | 4369016 | |
| mmu-miR-155 (002571) primer | Thermo Fisher | 4427975 | |
| has-miR-146a (000468) primer | Thermo Fisher | 4427975 | |
| U6snRNA primer | Thermo Fisher | 4427975 | |
| TNF-α(Mm00443258_m1 ) primer | Thermo Fisher | 4331182 | |
| IL-6 (Mm00446190_m1 )primer | Thermo Fisher | 4331182 | |
| ZO-1 (Mm00493699_m1 )primer | Thermo Fisher | 4331182 | |
| minimal essential medium (MEM) | Thermo Fisher | 11095-072 | |
| Trysin-EDTA solution(0.05%) | Thermo Fisher | 25300054 | |
| Exosomes were labeled with PKH67 through PKH67 Green Fluorescent Cell linker Mini Kit | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Exosome Spin Columns (MW3000) | Thermo Fisher | 4484449 | |
| Beckman Coulter Optima L-100XP ultracentrifuge | Beckman Coulter | L-100XP | |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher | ||
| transmission electron microscopes (TEM) | JEOL Ltd | 120 kV TEM | |
| Olympus BX41 microscope | Olympus | BX41 |
References
- Rubenfeld, G. D., Herridge, M. S. Epidemiology and outcomes of acute lung injury. Chest. 131, 554-562 (2007).
- Baron, R. M., Choi, A. J., Owen, C. A., Choi, A. M. Genetically manipulated mouse models of lung disease: potential and pitfalls. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L485-L497 (2012).
- Han, S., Mallampalli, R. K. The acute respiratory distress syndrome: from mechanism to translation. Journal of immunology. , Baltimore, Md. 855-860 (1950).
- Aeffner, F., Bolon, B., Davis, I. C. Mouse Models of Acute Respiratory Distress Syndrome: A Review of Analytical Approaches, Pathologic Features, and Common Measurements. Toxicologic pathology. 43, 1074-1092 (2015).
- Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L379-L399 (2008).
- Terrasini, N., Lionetti, V. Exosomes in Critical Illness. Critical care medicine. , (2017).
- Fujita, Y., Kadota, T., Araya, J., Ochiya, T., Kuwano, K. Extracellular Vesicles: New Players in Lung Immunity. American journal of respiratory cell and molecular biology. , (2017).
- Kubo, H. Extracellular Vesicles in Lung Disease. Chest. 153, 210-216 (2018).
- Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nature reviews. Genetics. 11, 597-610 (2010).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
- Fanini, F., Fabbri, M. CANCER-DERIVED EXOSOMIC microRNAs SHAPE THE IMMUNE SYSTEM WITHIN THE TUMOR MICROENVIRONMENT: STATE OF THE ART. Seminars in cell & developmental biology. , (2016).
- Agarwal, U., et al. Experimental, Systems, and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients. Circulation research. 120, 701-712 (2017).
- Prattichizzo, F., et al. Extracellular microRNAs and endothelial hyperglycaemic memory: a therapeutic opportunity? Diabetes, obesity & metabolism. 18, 855-867 (2016).
- Huang-Doran, I., Zhang, C. Y., Vidal-Puig, A. Extracellular Vesicles: Novel Mediators of Cell Communication In Metabolic Disease. Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 28, 3-18 (2017).
- Khalyfa, A., et al. Circulating Plasma Extracellular Microvesicle MicroRNA Cargo and Endothelial Dysfunction in Children with Obstructive Sleep Apnea. American journal of respiratory and critical care medicine. 194, 1116-1126 (2016).
- Thomou, T., et al. Adipose-derived circulating miRNAs regulate gene expression in other tissues. Nature. 542, 450-455 (2017).
- Gregson, A. L., et al. Altered Exosomal RNA Profiles in Bronchoalveolar Lavage from Lung Transplants with Acute Rejection. American journal of respiratory and critical care medicine. 192, 1490-1503 (2015).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature cell biology. 9, 654-659 (2007).
- Doxaki, C., Kampranis, S. C., Eliopoulos, A. G., Spilianakis, C., Tsatsanis, C. Coordinated Regulation of miR-155 and miR-146a Genes during Induction of Endotoxin Tolerance in Macrophages. Journal of immunology. , Baltimore, Md. 5750-5761 (2015).
- Schulte, L. N., Westermann, A. J., Vogel, J. Differential activation and functional specialization of miR-146 and miR-155 in innate immune sensing. Nucleic acids research. 41, 542-553 (2013).
- Alexander, M., et al. Exosome-delivered microRNAs modulate the inflammatory response to endotoxin. Nature communications. 6, 7321 (2015).
- Yuan, Z., et al. TREM-1 is induced in tumor associated macrophages by cyclo-oxygenase pathway in human non-small cell lung cancer. PloS one. 9, e94241 (2014).
- Xu, R., Richards, F. M. Development of In Vitro Co-Culture Model in Anti-Cancer Drug Development Cascade. Combinatorial chemistry & high throughput screening. 20, 451-457 (2017).
- Yuan, Z., et al. TREM-1-accentuated lung injury via miR-155 is inhibited by LP17 nanomedicine. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L426-L438 (2016).
- Sadikot, R. T., et al. High-dose dexamethasone accentuates nuclear factor-kappa b activation in endotoxin-treated mice. American journal of respiratory and critical care medicine. 164, 873-878 (2001).
- Yuan, Z., et al. Curcumin mediated epigenetic modulation inhibits TREM-1 expression in response to lipopolysaccharide. The international journal of biochemistry & cell biology. 44, 2032-2043 (2012).
- Chauret, C. P., et al. Chlorine dioxide inactivation of Cryptosporidium parvum oocysts and bacterial spore indicators. Applied and environmental microbiology. 67, 2993-3001 (2001).
- Cizmar, P., Yuana, Y. Detection and Characterization of Extracellular Vesicles by Transmission and Cryo-Transmission Electron Microscopy. Methods in molecular biology. , Clifton, N.J. 221-232 (2017).
- Yuan, Z., et al. HIV-related proteins prolong macrophage survival through induction of Triggering receptor expressed on myeloid cells-1. Scientific reports. 7, 42028 (2017).
- Jackson, M. V., et al. Analysis of Mitochondrial Transfer in Direct Co-cultures of Human Monocyte-derived Macrophages (MDM) and Mesenchymal Stem Cells (MSC). Bio-protocol. 7, (2017).
- Fujita, Y., et al. Extracellular Vesicles: New Players in Lung Immunity. American journal of respiratory cell and molecular biology. 17, 474-484 (2017).
- Gunasekaran, M., et al. Donor-Derived Exosomes With Lung Self-Antigens in Human Lung Allograft Rejection. American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 17, 474-484 (2017).
- Kalra, H., et al. Comparative proteomics evaluation of plasma exosome isolation techniques and assessment of the stability of exosomes in normal human blood plasma. Proteomics. 13, 3354-3364 (2013).
- Baranyai, T., et al. Isolation of Exosomes from Blood Plasma: Qualitative and Quantitative Comparison of Ultracentrifugation and Size Exclusion Chromatography Methods. PloS one. 10, e0145686 (2015).
- Nordin, J. Z., et al. Ultrafiltration with size-exclusion liquid chromatography for high yield isolation of extracellular vesicles preserving intact biophysical and functional properties. Nanomedicine : nanotechnology, biology, and medicine. 11, 879-883 (2015).
