Summary
マウス腹腔内組合は、miRNAs とパッケージ化された気管支肺胞洗浄 (BAL) 液のエクソソームを分泌します。共培養システムを用いて、BAL 液中リリース エクソソームの気管支上皮細胞におけるタイト結合蛋白質の表現を中断させ、肺損傷を強調する炎症性サイトカインの発現を示す.
Abstract
激しい肺傷害 (アリ) と急性呼吸窮迫症候群 (ARDS)、高い罹患率と死亡率を持ち続けている肺疾患の異種グループを表します。アリの病態は優れているが定義されます。しかし、病気の複雑な性質のため分子療法まだ開発されなければなりません。ここで炎症反応のエクソソームの役割を記述するのに急性敗血症性肺傷害のリポ多糖 (LPS) 誘発マウス モデルを使用します。このモデルを使用して、マウス腹腔内組合にさらされているが miRNA とサイトカインは、炎症反応を調節するとパッケージ化された肺から気管支肺胞洗浄 (BAL) 液のエクソソームを分泌することを表示することができました。気管支上皮細胞タイト結合蛋白質の発現するエクソソーム マクロファージからリリースが中断を示す共培養モデル システムを使用してさらに、.炎症性応答に貢献する exosomal を往復させる生得免疫構造と細胞間クロストーク 1)、構造壁と 2) これらの Mirna ターゲットの混乱を治療する新しいプラットフォームを提供することが示唆します。ALI および ARDS。
Introduction
ALI および ARDS は重度の低酸素血症の約 100 万人世界中に影響を与える非心原性肺水腫による呼吸不全の生命にかかわる形態毎年1。ARDS の病因には、感染症や吸引やさまざまな間接的な侮辱から肺に直接傷害が含まれています。最後のディケイドが ARDS の病態理解が増す、しかし、ARDS の特定のターゲットを絞った治療法がまだ2,3を開発します。
急性肺傷害のいくつかの動物モデルは人間の研究4,5実験療法を翻訳するためのブリッジを提供する開発されています。一般的に使用されるモデルには、オレイン酸や細菌、LP、ブレオマイシンのローカル インストールが含まれます。他のアプローチには、虚血再灌流、盲腸結紮穿刺、機械的換気誘発ストレッチ損傷、酸素または細菌の LPS5全身投与が含まれます。これらのモデルは臨床的仮説をテストする有用な生物学的システムを提供する、潜在的な治療法の開発。人間 ARDS をシミュレートするには、動物モデルは炎症や肺のバリア機能の欠陥と上皮と内皮細胞を急性障害を再現する必要があります。
エクソソームは分子の内容には、蛋白質、DNA、RNA および脂質が含まれています、直径 20-200 nm の膜小胞であり、分子組成振込組織微小環境で細胞間のコミュニケーションを円滑します。エクソソームは複数の種類の細胞、内皮細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、腫瘍細胞などから分泌されるが、人間の体液に存在します。研究を示すエクソソームは感染性と無菌の炎症性疾患時に免疫細胞と間質細胞間クロストークを規制し、生理中に様々 な自然と実験的刺激で規制するその異常なリリースが表示されます。および病理学プロセス6。このような通信ネットワークは肺疾患の病態に重要な役割を果たす可能性があり、病態生理学的進行7、8に影響を与える可能性があります。として 18-22 ヌクレオチド非コード Rna、miRNAs 組織と体液、血漿、血清に存在し、翻訳後修飾レベル9,10mRNA 発現を調節します。
エクソソーム パッケージ miRNAs 複数種類の細胞の分化と機能に影響を与えるし、様々 な病気、ガン、肺疾患、肥満、糖尿病、心血管疾患11を含む関連付けられている過剰なレベル 12,13,14,,1516。受信者の細胞と exosomal の miRNAs の往復への参入は、微小環境17,18の止血を変更する細胞間のコミュニケーションを促進します。急性肺傷害、エクソソーム8を通じて広範な細胞間コミュニケーションの種類の細胞を含む複雑なプロセスです。ミール 155 とミール 146a 一般的な転写調節機構を共有し、炎症反応や免疫寛容19,20に貢献。最近の研究では、両方が exosomal miRNAs の免疫細胞21間往復経由で炎症反応を調節することを示します。しかし、変調エンドトキシンに歯槽の応答に及ぼす exosomal Mirna の分子機構は不明、間違いなく潜在的な臨床的意義と並進含意メリット詳細な調査。
炎症とがんの22,23などの複雑な環境で特定の細胞型の相互作用を定義する共培養モデルを採用されています。これらのプラットフォームは、特に構造と免疫細胞の種類の細胞間クロストークを尋問する代替方法を提供します。
内気管、LPS の噴霧、腹腔内投与または全身投与、実験的肺傷害24,25,26を誘導するために広く使用され上皮と内皮細胞の透過性を誘導するために示されています。欠陥があります。ここで敗血症モデル マウスにおける急性肺傷害を誘発するのに腹腔内の LP を使用します。LPS の腹腔内投与の 24 時間以内の炎症細胞と肺の透過性欠陥が誘導されます。さらに、バルからエクソソーム含ま miRNA 155 とミール-146a と BAL 液からエクソソームは il-6, TNF-α を含む受信者の上皮細胞で炎症性サイトカイン発現を誘導することを示す.これらのデータは、その exosomal の Mirna を示す第 1、急性敗血症性肺傷害のこのモデルのバルで分泌されるが。
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Protocol
総合的なプロトコルには、敗血症の誘導の最初の日と、動物とマウス BALF からエクソソーム隔離のため 2 日目から BAL 液の分離を含む 2 日が必要です。すべての手順が検討されており、機関動物ケアおよびアトランタ VA メディカル センターで使用委員会によって承認されました。
1. マウス急性敗血症性肺傷害モデル
- 6-8 週間-を使用して古い男性野生型 c57bl/6 j マウス (重量 20 22 g) 動物のモデル、および無菌技術と機器を使用してすべての手順を実行します。オートクレーブすべて手術器具、鉗子、はさみ、121 ° C で 20 分用を含む
- 実験的にマウスとコントロール グループをランダムに配布します。手術用ボード上でマウスを抑制します。腹腔内のルートによる大腸菌リポポリサッカライド (LPS、15 mg/kg) を持つマウスを扱います。個人体重別に適切な LPS 投与量は 0.1 mL PBS マウスあたりに希釈し、27 G の針を用いて 1 mL 注射器を使用して LPS 溶液を注入して、対照動物に PBS の相当量を注入します。
- 適切な室温できれいなケージから成っている動物の BSL2 施設にマウスをしてください。
- 24 h 後、CO2吸入マウスを安楽死させます。
- マウスの首のセンターで外科の領域を選択します。(約 5 mm) の小切開を行い、気管、気管を露出するまで鈍い鉗子を使用してへのアクセスのための筋肉を優しきます。
- 27 G 針付きマウス BAL 液 10 mL 滅菌注射器とを撤回します。まず、優しくと気管に針を挿入、気管に 1 mL の滅菌 PBS をゆっくりと注入し、27 G 針付き 3 mL シリンジに BALF を描画します。プロシージャが完了したら、注射器や針バイオハザード シャープス コンテナーの処分します。
- Chauretらによって前述のように塩素、二酸化炭素、手術器具を扱う27、121 ° C で 20 分間のオートクレーブによるすべての手術器具を滅菌、
2. エクソソーム分離シリアル超遠心分離とキャラクタリゼーション
- 15 mL の円錐管にマウス BAL 液を収集します。肺胞細胞を収穫するには、遠心分離機の 4 ° C での 1,000 g で 10 分間のサンプル
- 上清を新しい 15 mL コニカル チューブに転送し、4,000 x g 細胞の残骸を削除する 4 ° C で 30 分間試料を遠心分離します。
- 超遠心機チューブと大きい細胞の粒子を除去する 4 ° C で 10,000 x g で 60 分間遠心分離機サンプルの上澄みを収集します。
- 上清を新しい円錐管に転送し、試料の残りのより大きい粒子を削除する 0.2 μ m シリンジ フィルターを通して。
- 超遠心機チューブ内のサンプルを収集し、管のバランスをとる。遠心分離機のサンプル、エクソソームのペレットへの 4 ° C で 140,000 x g で 2 時間。
注: エクソソームのサイズは 20-200 nm を異なります。200 よりも大きな粒子を除去するため 0.2 μ m フィルターを使用サイズの nm。 - 優しく培養上清を捨てます。100 μ L の PBS または溶解・ ソリューション、1.5 mL チューブに転送エクソソーム サンプルとペレットを溶解し、使用するまで-80 ° C で保存します。
メモ: 分離エクソソームを確認するには、透過型電子顕微鏡の使用をお勧めします。 - 処理プロトコル28標準 TEM サンプルに従ってください。エクソソーム サンプルの透過型電子顕微鏡と取るイメージ スケール 200 バーを使用して分析 nm。
3. miRNA と舞台 miRNA-q-RT-PCR の準備
注: Mirna の発現レベルを分析するには、miRNA q RT-PCR 法の使用をお勧めします。
- 標準 miRNAs の隔離のプロトコルに従うし、一本鎖逆転写24で浄化された Rna の同量を使用することを確認します。
- BAL 液中 exosomal マイクロ Rna レベルを検出する標準のリアルタイム PCR のプロトコルに従ってください。ミール 155 やミール-146a U6 SnRNA に対する特定のリアルタイム PCR のプライマーを使用します。定量的 PCR 装置と PCR の反作用を実行し、内部統制 U6 snRNA に式の値を正規化します。
注: 各グループは、帳票サンプル24で構成されています。
4. エクソソームのラベリングと浄化
- 1.5 mL ポリプロピレン チューブに 100 μ L 懸濁液ソリューション エクソソーム ペレットを中断し、懸濁液溶液 100 μ L を他の管へエクソソームの染料の 0.4 μ L を追加します。
- すぐに色素ソリューションにソリューションのエクソソームを追加し、ピペッティングでそれを徹底的にミックスします。室温で 5 分間のサンプルを維持、光から保護します。
- エキソソーム スピン列を 1.5 mL 溶出チューブに入れてください。エキソソーム スピン列のセンターにソリューションの混合物を転送します。
- 室温で 800 x g で 2 分間列をスピンします。
- 列を破棄し、使用するまで-20 ° C で溶出サンプルを格納します。
5. エクソソームを受信者の細胞によって撮影の検証
- 1 x 10 の4 8 もチェンバー スライド、37 ° c、5% CO2培養細胞で MLE 12/cell の種子します。
- 10 μ L の蛍光ラベル エクソソームをセルに追加します。37 ° C で 1 時間インキュベートします。
- 文化メディアを削除し、pbs セルを洗う、室温で 10 分間の 1% パラホルムアルデヒドとセルを修正します。
- DAPI をマウント中のスライドをマウントします。
- 蛍光顕微鏡でサンプルを分析し、画像、40 倍の倍率がかかります。
6. エクソソームと受信者の細胞間の相互作用の検証
- 種子 2 x 105 MLE12/ウェルおよび 5% CO237 ° C で培養細胞を適切な培地を含む 12 ウェル培養プレート。
- MLE12 セルにマウス BAL 液 20 μ g エクソソームを追加し、実験グループごとの複製を設定します。
- 24 h はその後、PBS のセルを洗浄し、ウェルに 600 μ L 換散バッファーを追加します。優しくプレートを振るし、ピペットと 1.5 mL チューブで溶解サンプルを収集します。
- 標準の総 RNA の隔離のプロトコルおよび cDNA 逆のトランスクリプション プロトコルに従う、一本鎖 cDNA の逆のトランスクリプション29を完了します。
- 受信者セル29の mRNA 発現レベルを検出する標準のリアルタイム PCR のプロトコルに従ってください。TNF α、イルに対して特定のリアルタイム PCR のプライマーを使用して-6、および ZO 1。定量的 PCR 装置との PCR の反作用を実行し、GAPDH の内部のコントロールに式の値を正規化します。
注: 各グループは、帳票のサンプルで構成されています。
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Representative Results
敗血症性肺傷害を誘導して、マウスは、腹腔内の LPS (15 mg/kg) と扱われました。LPS 投与 24 時間以内は、図 1 aに示すように、好中球の流入が肺に見られました。エクソソームの隔離そして浄化に続いてマウス BAL 液が描かれました。BALF エクソソームの形態は、電子顕微鏡観察 (図 1 b) によって確認されました。
選択的プロ炎症性 miRNAs miRNA 155 およびミール 146a 発現精製エクソソームから q RT-PCR 法により検出されました。PBS (ミール 155、1 ± 0.16 vs 11.6 ± 0.6; 1 ± 0.12 対 13.5 ± 1.186、ミール 146a) とコントロール マウスと比較して、組合で処理したマウスから BAL 液エクソソームのミール 155 とミール 146a の発現レベルが有意に増加 (図 2)。
エクソソームの機能の効果を定義するには、マウスの気道上皮細胞 (MLE12 細胞) はそれぞれ LP または PBS を投与したマウスの BAL 液から抽出精製されたエクソソームと扱われました。最初に、受信者の上皮細胞に BALF エクソソームのエントリを証明しました。BALF エクソソーム PKH-67、ラベルの付いた、MLE12 細胞と共培養し、蛍光顕微鏡像を示す上皮細胞 (図 3 a) エクソソームの取り込み。(TNF α、1 ± 0.13 vs 5.01 ± 0.22; 制御グループと比較して、処理組合マウスからエクソソームとの共培養上皮細胞における炎症性メディエーター、TNF α, il-6 の発現が有意に増加IL-6、1 ± 0.02 vs 1.72 ± 0.17) (図 3 b)。上皮の完全性のための代理としてタイト結合蛋白 ZO 1 式も決定。組合からエクソソームと扱われた細胞投与マウスの LPS 処理制御マウス (ZO-1、対 0.66 式 1 ± 0.12 ± 0.13) と比較して、zo-1 の大幅減衰式を示した(図 3)。
図 1: LPS 投与マウスの BAL 液から分離されたエクソソームのキャラクタリゼーション。C57bl/6 j マウスの LPS (15 mg/kg の腹腔内注入症例 (N = 5)、コントロールとして使用された PBS (N = 5)。24 h 後、マウスを安楽死させ、BAL 液を行った。マウス肺組織の代表的な画像処理と LPS 急性肺傷害、スケール バー、50 μ m、A PBS)。エクソソームを BAL 液から抽出しました。透過電子顕微鏡 (TEM) 解析表示エクソソーム、スケール バー、200 nm、B)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: LPS 投与マウスから分離した BAL 液中 Exosomal miRNAs 式。C57bl/6 j マウスの腹腔内組合で挑戦しました。選択的マイクロ Rna の発現は、q-RT-PCR および U6 式.に正規化されたを通じて分析しました。A) ミール-155。B) ミール-日本。n = グループあたり 5 マウス。学生のテスト * P < 0.05。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:エクソソームと炎症性サイトカインとマウス上皮細胞におけるタイト結合蛋白の発現が扱われます。BAL 液由来エクソソームは PKH-67 で標識したし、蛍光顕微鏡 PKH67 を示すラベル エクソソーム (緑)、DAPI(Blue)、MLE12 セル、スケール バー、50 μ m、エクソソームのショー取り込みのマージされた画像 A に示すように)。マウス上皮細胞 MLE12 された LPS または PBS を投与したマウスから BAL 液から分離されたエクソソームと共培養。24 h 後、セルが収穫された、および総 RNA を分離しました。TNF α, il-6 の発現は、q-RT-PCR で測定した GAPDH 内部統制に正規化します。(B)TNF-α および (C) IL6;(D) ZO 1 mRNA 発現は、q-RT-PCR で測定しました。* P < 0.05、学生のテスト。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
病気のマウス ・ モデルは、特定の遺伝子の生理機能を評価し、実験2のコストを削減する通常使用されます。急性敗血症性肺傷害を説明ここで ARDS の人間に見られる炎症性応答を模倣しています。このモデルは分子病態研究、バイオ マーカーの開発を調査し、潜在的な新しい治療法5をテストするものです。
共培養系研究生体内RNA、DNA、脂質、および in vitro システム23,30蛋白質など生体分子の移動の潜在的なメカニズムの調査のコンテキストで関連しています。機械的な理解の評価および複雑な病気22,23治療法の開発に偉大なユーティリティがこれらのプラットフォームのいくつかあります。ここで示すように、洗浄の細胞 (マクロファージ, 好中球) からエクソソーム エクソソームの移転により上皮細胞の構造の整合性に影響します。
エクソソームの病態の影響は人間の病気の診断と治療の観点の両方からの重要な側面として浮上して、疾患病因31,32を理解します。体液からエクソソームを分離、最も一般的に使用される手法には、差動遠心分離遠心33,34をここで説明されているように結合が含まれています。時間がかかることができるという事実および非 exosomal 蛋白質による汚染のリスクによって制限されますが、この手法はいくつかの強みを持っています。斬新なアプローチは、35サイズ依存法または免疫親和性密度勾配によるエキソソームの分離など、これらの制限を克服するために提案されている.エクソソームは診断と予後、およびターゲットを絞った治療法の開発のためのバイオ マーカーとしての臨床試験で検討されています。
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Disclosures
この作品は、RS に VA メリット レビュー 2I01BX001786 06A1 資金によって支えられました。
Acknowledgments
著者から、利益相反の宣言されていません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | Escherichia coli 055:B5 | |
| PBS pH7.2(1X) | Life technologies | 20012-027 | |
| mirVana miRNA isolation kit | Thermo Fisher | 449774 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermo Fisher | 4369016 | |
| mmu-miR-155 (002571) primer | Thermo Fisher | 4427975 | |
| has-miR-146a (000468) primer | Thermo Fisher | 4427975 | |
| U6snRNA primer | Thermo Fisher | 4427975 | |
| TNF-α(Mm00443258_m1 ) primer | Thermo Fisher | 4331182 | |
| IL-6 (Mm00446190_m1 )primer | Thermo Fisher | 4331182 | |
| ZO-1 (Mm00493699_m1 )primer | Thermo Fisher | 4331182 | |
| minimal essential medium (MEM) | Thermo Fisher | 11095-072 | |
| Trysin-EDTA solution(0.05%) | Thermo Fisher | 25300054 | |
| Exosomes were labeled with PKH67 through PKH67 Green Fluorescent Cell linker Mini Kit | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Exosome Spin Columns (MW3000) | Thermo Fisher | 4484449 | |
| Beckman Coulter Optima L-100XP ultracentrifuge | Beckman Coulter | L-100XP | |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher | ||
| transmission electron microscopes (TEM) | JEOL Ltd | 120 kV TEM | |
| Olympus BX41 microscope | Olympus | BX41 |
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