Mäusen intraperitoneal LPs absondern exosomen in Broncho-alveoläre Lavage (BAL) Flüssigkeit, die mit MiRNAs verpackt sind. Ein Kokulturen-System verwenden, zeigen wir, dass exosomen veröffentlicht in der BAL-Flüssigkeit engen Kreuzung Proteinexpression in bronchialen Epithelzellen stören und Ausdruck von Pro-inflammatorischen Zytokinen, die Lungenschädigung betonen zu erhöhen.
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Methodenartikel
Alvéolaire Lavage Exosomen in Lipopolysaccharid-induzierte septischen Lungenschädigung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Akute Lungenschädigung (ALI) und akute Atemnotsyndrom (ARDS) repräsentieren eine heterogene Gruppe von Lungenkrankheiten, die nach wie vor eine hohe Morbidität und Mortalität haben. Die molekulare Pathogenese von ALI wird besser definiert; jedoch aufgrund der Komplexität der Krankheit müssen Molekulare Therapien erst noch entwickelt werden. Hier verwenden wir ein Lipopolysaccharid (LPS) induzierte Mausmodell der akuten septischen Lungenschädigung, um die Rolle der exosomen in der entzündlichen Reaktion zu beschreiben. Mit diesem Modell konnten wir zeigen, dass Mäuse, die intraperitoneale LPS ausgesetzt sind, exosomen in Broncho-alveoläre Lavage (BAL) Flüssigkeit aus der Lunge absondern, die verpackt sind, mit MiRNA und Zytokine die entzündliche Reaktion zu regulieren. Weiter mit kokultur Modellsystem, zeigen wir, dass exosomen veröffentlicht von Makrophagen engen Kreuzung Proteinexpression in bronchialen Epithelzellen stören. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass (1) Übersprechen zwischen angeborenen immun- und strukturelle Zellen durch die Exosomal pendelt beitragen, die entzündliche Reaktion und Störung der strukturelles Hindernis und (2) diese MiRNAs targeting kann eine neuartige Plattform zur Behandlung von ALI und ARDS.
Einleitung
ALI und ARDS sind die lebensbedrohliche Formen der respiratorische Insuffizienz mit schweren Hypoxämie, verursacht durch nicht-kardiogenen Lungenödem betrifft etwa 1 Million Menschen weltweit pro Jahr1. Die Ätiologie des ARDS umfasst direkte Verletzung zu den Lungen von Infektionen oder Aspiration und eine Vielzahl von indirekten Beleidigungen. Im letzten Jahrzehnt gab es ein besseres Verständnis der molekularen Pathogenese des ARDS, gezielten Spezialbehandlungen für ARDS sind jedoch noch zu2,3entwickelt.
Verschiedenen Tiermodellen der akuten Lungenversagen s....
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Protokoll
Das gesamte Protokoll erfordert 2 Tage, unter anderem am ersten Tag der Sepsis Induktion und Absonderung von BAL-Flüssigkeit aus der Tier- und am zweiten Tag exosomen Isolation von der Maus BALF. Alle Verfahren wurden überprüft und durch die institutionelle Animal Care and Use Committee an Atlanta VA medical Center genehmigt.
1. akute septische Lunge Verletzungen Mausmodell
- Verwenden Sie 6 bis 8 Wochen - alte männliche Wildtyp C57BL/6J Mäuse (20-22 g Gewicht) für das Tier zu modellieren, und führen Sie alle Verfahren mit aseptischen Techniken und Instrumente. Autoklav alle chirurgischen Instrumente, einschließlich Pinzetten und Sc....
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Ergebnisse
Septische Lungenschädigung induzieren, wurden Mäuse mit intraperitonealer LPS (15 mg/kg) behandelt. Innerhalb von 24 h LPS Verwaltung wurde neutrophile Zustrom in der Lunge gesehen, wie in Figur 1Adargestellt. Maus-BAL-Flüssigkeit wurde gezogen, gefolgt von Isolierung und Reinigung der exosomen. Morphologie der BALF exosomen bestätigte Transmissions-Elektronen-Mikroskopie (Abbildung 1 b).
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Diskussion
Mausmodelle von Krankheiten werden üblicherweise verwendet, um die physiologische Funktion bestimmter Gene bewerten und zur Reduzierung der Kosten des Experimentierens2. Die akute septische Lungenversagen beschrieben hier imitiert Entzündungsreaktion bei Menschen mit ARDS gesehen. Dieses Modell ist relevant, die molekulare Pathogenese, Entwicklung von Biomarkern zu untersuchen und mögliche neue Therapien5zu testen.
Kokultur Systeme sind relevant .......
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Offenlegungen
Diese Arbeit wurde von VA Verdienst Beitrag 2I01BX001786-06A1 Finanzierung RS unterstützt.
Danksagungen
Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt erklärt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Lipopolysaccharid | Sigma-Aldrich | Escherichia coli 055:B5 | |
| PBS pH7.2(1X) | Life technologies | 20012-027 | |
| mirVana miRNA Isolationskit | Thermo Fisher | 449774 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermo Fisher | 4369016 | |
| mmu-miR-155 (002571) Primer | Thermo Fisher | 4427975 | |
| has-miR-146a (000468) Primer | Thermo Fisher | 4427975 | |
| U6snRNA Primer | Thermo Fisher | 4427975 | |
| TNF-α( Mm00443258_m1 ) Grundierung | Thermo Fisher | 4331182 | |
| IL-6 (Mm00446190_m1 )Grundierung | Thermo Fisher | 4331182 | |
| ZO-1 (Mm00493699_m1 )Grundierung | Thermo Fisher | 4331182 | |
| minimal essentielles Medium (MEM) | Thermo Fisher | 11095-072 | |
| Trysin-EDTA-Lösung (0,05%) | Thermo Fisher | 25300054 | |
| Exosomen wurden mit PKH67 bis PKH67 grün fluoreszierender Zelllinker Mini-Kit markiert | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Exosomen-Spin-Säulen (MW3000) | Thermo Fisher | 4484449 | |
| Beckman Coulter Optima L-100XP Ultrazentrifuge | Beckman Coulter | L-100XP | |
| Ultraklare Zentrifugenröhrchen | Beckman Coulter | 344058 | |
| Applied Biosystems 7500 Schnelles Echtzeit-PCR-System | Thermo Fisher | ||
| Transmissionselektronenmikroskope (TEM) | JEOL Ltd | 120 kV TEM | |
| Olympus BX41 Mikroskop | Olympus | BX41 |
Referenzen
- Rubenfeld, G. D., Herridge, M. S. Epidemiology and outcomes of acute lung injury. Chest. 131, 554-562 (2007).
- Baron, R. M., Choi, A. J., Owen, C. A., Choi, A. M. Genetically manipulated mouse models of lung disease: potential and pitfalls.
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Nachdrucke und Genehmigungen
