Summary
Mäusen intraperitoneal LPs absondern exosomen in Broncho-alveoläre Lavage (BAL) Flüssigkeit, die mit MiRNAs verpackt sind. Ein Kokulturen-System verwenden, zeigen wir, dass exosomen veröffentlicht in der BAL-Flüssigkeit engen Kreuzung Proteinexpression in bronchialen Epithelzellen stören und Ausdruck von Pro-inflammatorischen Zytokinen, die Lungenschädigung betonen zu erhöhen.
Abstract
Akute Lungenschädigung (ALI) und akute Atemnotsyndrom (ARDS) repräsentieren eine heterogene Gruppe von Lungenkrankheiten, die nach wie vor eine hohe Morbidität und Mortalität haben. Die molekulare Pathogenese von ALI wird besser definiert; jedoch aufgrund der Komplexität der Krankheit müssen Molekulare Therapien erst noch entwickelt werden. Hier verwenden wir ein Lipopolysaccharid (LPS) induzierte Mausmodell der akuten septischen Lungenschädigung, um die Rolle der exosomen in der entzündlichen Reaktion zu beschreiben. Mit diesem Modell konnten wir zeigen, dass Mäuse, die intraperitoneale LPS ausgesetzt sind, exosomen in Broncho-alveoläre Lavage (BAL) Flüssigkeit aus der Lunge absondern, die verpackt sind, mit MiRNA und Zytokine die entzündliche Reaktion zu regulieren. Weiter mit kokultur Modellsystem, zeigen wir, dass exosomen veröffentlicht von Makrophagen engen Kreuzung Proteinexpression in bronchialen Epithelzellen stören. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass (1) Übersprechen zwischen angeborenen immun- und strukturelle Zellen durch die Exosomal pendelt beitragen, die entzündliche Reaktion und Störung der strukturelles Hindernis und (2) diese MiRNAs targeting kann eine neuartige Plattform zur Behandlung von ALI und ARDS.
Introduction
ALI und ARDS sind die lebensbedrohliche Formen der respiratorische Insuffizienz mit schweren Hypoxämie, verursacht durch nicht-kardiogenen Lungenödem betrifft etwa 1 Million Menschen weltweit pro Jahr1. Die Ätiologie des ARDS umfasst direkte Verletzung zu den Lungen von Infektionen oder Aspiration und eine Vielzahl von indirekten Beleidigungen. Im letzten Jahrzehnt gab es ein besseres Verständnis der molekularen Pathogenese des ARDS, gezielten Spezialbehandlungen für ARDS sind jedoch noch zu2,3entwickelt.
Verschiedenen Tiermodellen der akuten Lungenversagen sind entwickelt worden, die eine Brücke bieten, für die Übersetzung von experimentellen Therapien auf Studien am Menschen4,5. Häufigsten verwendeten Modelle verfügen über lokale Installation von Ölsäure, Bakterien, LPS und Bleomycin. Andere Ansätze sind Ischämie-Reperfusion, cecal Ligatur Punktion, mechanische Lüftung-induzierte Stretch Verletzungen, hyperoxie oder systemischen Verabreichung von Bakterien und LPS5. Diese Modelle bieten ein nützliches biologische System um klinische Hypothesen zu testen und für die Entwicklung von möglichen Therapien. Um menschliche ARDS zu simulieren, sollten Tiermodellen Entzündungen und akute Verletzung der epithelialen und endothelial Zellen mit defekten in Barriere-Funktion in der Lunge reproduzieren.
Exosomen sind membranvesikel mit 20-200 nm im Durchmesser, deren molekulare Inhalt Lipide, Proteine, DNA und RNA enthält, und Inter Mobilfunk in Gewebe Mikroumgebung über Molekulare Zusammensetzung Transfer erleichtern. Exosomen sind mehrere Arten von Zellen, wie endothelial Zellen, Epithelzellen, glatten Muskelzellen und Tumor-Zellen sezerniert und im menschlichen Körper Flüssigkeit vorhanden. Studien zeigen, dass exosomen Übersprechen zwischen Immunzellen und Stromazellen Zellen bei Infektions- und sterilen entzündlichen Erkrankungen regulieren und ihre abnorme Release erscheint durch die verschiedenen natürlichen und experimentellen Stimuli während physiologische geregelt werden und pathologische Prozesse6. Solchen Kommunikationsnetz kann eine wichtige Rolle in der Pathogenese von Lungenerkrankungen und pathophysiologischen Fortschreiten7,8beeinträchtigen. So 18-22 Nukleotid nicht-kodierende RNAs, MiRNAs vorhanden im Gewebe und Körperflüssigkeiten, Plasma, Serum und modulieren mRNA Expression am Post-translationalen Ebene9,10.
Verpackte MiRNAs in exosomen zu beeinflussen, Differenzierung und Funktion von mehreren Arten von Zellen und übermässigem sind verbunden mit einer Vielzahl von Krankheiten, einschließlich Krebs, Lungenkrankheiten, Fettleibigkeit, Diabetes und Herz-Kreislauf-Erkrankungen11, 12,13,14,15,16. Einstieg in den empfängerzellen und pendelt von Exosomal MiRNAs erleichtern interzelluläre Kommunikation ändern die Blutstillung Mikroumgebung17,18. Akutes Lungenversagen ist eine komplexe Prozesse, bei denen mehrere Zelltypen mit umfangreichen interzelluläre Kommunikation durch exosomen8. MiR-155 und MiR-146a Teilen der gemeinsamen transkriptionelle Regulierungsmechanismus und dazu beitragen, die entzündliche Reaktion und die Immuntoleranz19,20. Aktuelle Studien zeigen, dass sowohl entzündliche Reaktion über Exosomal MiRNAs pendeln zwischen Immunzellen21modulieren. Jedoch die molekularen Mechanismen, die modulierende Effekte der Exosomal MiRNAs alveoläre Reaktion auf Endotoxin bleiben unklar, zweifellos die potenzielle klinische Relevanz und Translationale Implikation Verdienst weitere Untersuchungen.
Kokultur Modelle werden eingesetzt, um die Interaktion der spezifischen Zelltypen im komplexen Umfeld, wie Entzündungen und Krebs22,23zu definieren. Diese Plattformen bieten eine alternative Strategie zur Nebensprechen zwischen Zelltypen besonders für immun- und strukturelle Zellen zu befragen.
Intra-trachealen, Aerosol, intraperitoneal oder systemische Gabe von LPS sind weit verbreitet, experimentelle Lunge Verletzungen24,25,26zu induzieren und haben gezeigt, dass die Durchlässigkeit von epithelialen und endotheliale induzieren Mängel. Hier verwenden wir intraperitoneale LPS, um septische Modellcharakter für die akute Lungenschädigung bei Mäusen zu induzieren. Innerhalb 24 h nach intraperitonealer Gabe von LPS induziert werden Permeabilität Defekte in der Lunge bei der Einstellung von Entzündungszellen. Darüber hinaus zeigen wir, dass exosomen aus BAL MiRNA-155 und MiR-146a enthalten, und exosomen von BAL-Flüssigkeit Pro-inflammatorischen Zytokinen Ausdruck im Empfänger Epithelzellen induzieren, wie IL-6 und TNF-α. Diese Daten sind erstmals zeigen, dass Exosomal MiRNAs sind in diesem Modell der akuten septischen Lungenschädigung in BAL abgesondert.
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Protocol
Das gesamte Protokoll erfordert 2 Tage, unter anderem am ersten Tag der Sepsis Induktion und Absonderung von BAL-Flüssigkeit aus der Tier- und am zweiten Tag exosomen Isolation von der Maus BALF. Alle Verfahren wurden überprüft und durch die institutionelle Animal Care and Use Committee an Atlanta VA medical Center genehmigt.
1. akute septische Lunge Verletzungen Mausmodell
- Verwenden Sie 6 bis 8 Wochen - alte männliche Wildtyp C57BL/6J Mäuse (20-22 g Gewicht) für das Tier zu modellieren, und führen Sie alle Verfahren mit aseptischen Techniken und Instrumente. Autoklav alle chirurgischen Instrumente, einschließlich Pinzetten und Scheren für 20 min bei 121 ° C.
- Verteilen Sie Mäuse in experimentellen und Kontrollgruppe nach dem Zufallsprinzip. Mäuse auf eine chirurgische Board zurückhalten. Behandeln Sie Mäuse mit Escherichia coli Lipopolysaccharid (LPS, 15 mg/kg), intraperitoneale Weg. Verdünnen Sie nach dem individuellen Körpergewicht entsprechende LPS Dosierungen bis 0,1 mL PBS per Mausklick, dann injizieren Sie LPS-Lösung mit einer 1 mL Spritze mit 27 G Nadel und Spritzen Sie gleichwertigem Umfang von PBS zu Kontrolltieren.
- Halten Sie Mäuse in der tierischen BSL2-Anlage, bestehend aus sauberen Käfigen angemessene Raumtemperatur.
- 24 Stunden später einschläfern Mäuse mit CO2 Einatmen.
- Wählen Sie den OP-Bereich in der Mitte der Maus Hals. Machen Sie einen kleinen Schnitt (ca. 5 mm) und trennen Sie vorsichtig Muskeln für den Zugriff auf die Luftröhre mit stumpfen Pinzette, bis die Luftröhre ausgesetzt ist.
- Maus-BAL-Flüssigkeit mit 10 mL sterile Spritze mit einer 27 G Nadel zurückziehen. Zuerst sanft, Stechen Sie die Nadel in die Luftröhre und Spritzen Sie 1 mL sterile PBS langsam in die Luftröhre, dann ziehen Sie BALF in eine Einweg-Spritze 3 mL mit einer 27 G Nadel. Nach Abschluss des Verfahrens Spritzen und Nadeln im Biohazard Sharps Container entsorgen.
- Chirurgische Instrumente mit Chlordioxid, zu behandeln, wie zuvor beschrieben von Chauret Et al. 27, und Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente durch Autoklavieren für 20 min bei 121 ° C.
(2) Exosomen Isolation-seriell Ultra-Zentrifugation und Charakterisierung
- Maus-BAL-Flüssigkeit in 15 mL konische Röhrchen zu sammeln. Alveoläre Zellen ernten, Zentrifugieren Sie Proben für 10 min bei 1.000 g bei 4 ° C.
- Übertragen Sie den überstand auf neue 15 mL konische Röhrchen, dann Zentrifugieren Sie Proben für 30 min bei 4.000 x g bei 4 ° C, Zelle Ablagerungen zu entfernen.
- Sammeln des Überstands in Ultrazentrifuge Tuben und Zentrifuge Proben 60 min bei 10.000 x g bei 4 ° C, größere zelluläre Partikel zu entfernen.
- Den überstand auf neue konische Rohre übertragen, dann die Proben durch 0,2 µm Spritze-Filter zu entfernen, bleiben größere Partikel zu filtern.
- Proben in Ultrazentrifuge Rohre und Rohre zu balancieren. Zentrifugieren Sie Proben für 2 h bei 140.000 x g bei 4° C zu die exosomen Pellets.
Hinweis: Die Größe der exosomen variiert 20-200 nm. 0,2 µm-Filter dient zur Entfernung von größerer Partikeln, die mehr als 200 nm Größe. - Entsorgen Sie die Überstände sanft. Das Pellet mit 100 µL PBS oder Lyse-Lösung und Transfer exosomen Proben zu 1,5 mL Röhrchen lösen und bei-80 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.
Hinweis: Transmissions-Elektronenmikroskop wird empfohlen, um isolierte exosomen zu überprüfen. - Folgen Sie der Standardprobe TEM Verarbeitung Protokoll28. Analysieren von exosomen Proben mit Transmissions-Elektronenmikroskopie und nehmen Sie Bilder, Skala bar 200 nm.
3. Vorbereitung der MiRNA und darstellende MiRNA-Q-RT-PCR
Hinweis: MiRNA-Q-RT-PCR wird empfohlen, Ausdruck von MiRNAs analysieren.
- Folgen Sie standard-MiRNAs Isolierung Protokoll und achten Sie darauf, eine gleiche Menge von gereinigtem RNAs in Einzel-Strang reversen Transkription24.
- Folgen Sie das Echtzeit-PCR Standardprotokoll zur Erkennung von Exosomal RNA Ebene in BAL-Flüssigkeit. Verwenden Sie spezifische Echtzeit-PCR-Primer vor MiR-155, MiR-146a und U6 SnRNA. Laufen Sie PCR-Reaktion mit dem quantitativen PCR-Gerät und Normalisieren Sie die Ausdruckswerte zur internen Kontrolle U6 SnRNA.
Hinweis: Jede Gruppe besteht aus dreifacher Proben24.
4. Exosomen Etikettier- und Reinigung
- Aussetzen Sie exosomen Pellet mit 100 µL Aussetzung Lösung in einem 1,5 mL Polypropylen Röhrchen, dann fügen Sie 0.4 µL der exosomen Farbstoff in das andere Rohr mit 100 µL der Aussetzung-Lösung.
- Schnell die Farbstofflösung exosomen in der Lösung hinzu und mischen Sie es gründlich durch pipettieren. Beispiele für 5 min bei Zimmertemperatur aufbewahren, vor Licht schützen.
- Setzen Sie eine exosom Spin Spalte in einem 1,5 mL Elution Rohr. Übertragen Sie die Lösung-Mischung in die Mitte der Spalte exosom Spin.
- Drehen Sie die Spalte für 2 min bei 800 X g bei Raumtemperatur.
- Verwerfen Sie die Spalte und speichern Sie die eluierten Probe bei-20 ° C bis zu seiner Verwendung zu.
5. Validierung von Exosomen Up Empfängerzellen getroffenen
- Samen Sie 1 x 104 MLE 12 /cell in einem 8-Well-Kammer-Folie und Zellkulturen bei 37 ° C, 5 % CO2.
- Fügen Sie 10 µL Leuchtstoff-Label exosomen zu den Zellen. 1 h bei 37 ° c inkubieren
- Entfernen Sie, Kultur, Medien und waschen Sie Zellen mit PBS, dann befestigen Sie Zellen mit 1 % Paraformaldehyd für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
- Montieren Sie die Folie in Mount Medium mit DAPI.
- Analysieren Sie Proben durch ein Fluoreszenzmikroskop und nehmen Sie Bilder, 40 X Vergrößerung.
6. Überprüfung der Interaktion zwischen Exosomen und Empfängerzellen
- Samen 2 x 105 MLE12/Brunnen in einer Kultur 12-Well-Platte mit geeigneten Nährmedium und Zellkulturen bei 37 ° C, 5 % CO2.
- MLE12 Zellen 20 µg exosomen aus Maus BAL Flüssigkeit hinzufügen und Einrichten von Wiederholungen pro Versuchsgruppe.
- 24 h später Zellen mit PBS waschen und Hinzufügen von 600 µL Lyse Puffer in Brunnen. Schütteln Sie die Platte und Lyse Proben in 1,5 mL-Tube mit der Pipette.
- Folgen Sie den gesamten RNA Isolierung Standardprotokoll und cDNA reversen Transkription Protokoll, vervollständigen Sie die Einzel-Strang cDNA reversen Transkription29.
- Folgen Sie Real-Time PCR Standardprotokoll zur Erkennung von mRNA Ausdruck Ebene in empfängerzellen29. Verwenden Sie spezifische Echtzeit-PCR-Primer gegen TNF-α, IL-6 und ZO-1. Laufen Sie PCR-Reaktionen mit dem quantitativen PCR-Gerät und Normalisieren Sie die Ausdruckswerte der internen Kontrolle GAPDH.
Hinweis: Jede Gruppe besteht aus dreifacher Proben.
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Representative Results
Septische Lungenschädigung induzieren, wurden Mäuse mit intraperitonealer LPS (15 mg/kg) behandelt. Innerhalb von 24 h LPS Verwaltung wurde neutrophile Zustrom in der Lunge gesehen, wie in Figur 1Adargestellt. Maus-BAL-Flüssigkeit wurde gezogen, gefolgt von Isolierung und Reinigung der exosomen. Morphologie der BALF exosomen bestätigte Transmissions-Elektronen-Mikroskopie (Abbildung 1 b).
Ausdruck der selektiven Pro-inflammatorischen MiRNAs MiRNA-155 und MiR-146a wurden von Q-RT-PCR aus der gereinigten exosomen erkannt. Ausdruck von MiR-155 und MiR-146a wurden deutlich erhöht in BAL Flüssigkeit exosomen von Mäusen, die mit LPS, im Vergleich zu Kontroll-Mäusen behandelt mit PBS (MiR-155, 1 ± 0,16 Vs 11,6 ± 0,6; MiR-146a, 1 ± 0,12 Vs 13,5 ± 1.186) behandelt wurden (Abbildung 2).
Um die funktionellen Auswirkungen der exosomen zu definieren, wurden mit gereinigten exosomen extrahiert aus BAL-Flüssigkeit von Mäusen mit LPS oder PBS, behandelt bzw. Maus bronchiale epithelialen Zellen (MLE12) behandelt. Erstens haben wir in epithelialen empfängerzellen Eintrag von BALF exosomen bewiesen. BALF exosomen wurden beschriftet mit PKH-67, zusammen mit MLE12 Zellen kultiviert und Fluoreszenz-Mikroskop-Bilder zeigen dann die Aufnahme von exosomen von Epithelzellen (Abb. 3A). Ausdruck von Pro-inflammatorischen Mediator, TNF-α und IL-6 wurden in epithelialen Zellen, die mit exosomen von LPS behandelt Mäusen, im Vergleich zur Kontrollgruppe (TNF-α, 1 ± 0,13 Vs 5.01 ± 0,22; Co kultiviert wurden erheblich gestiegen IL-6, 1 ± 0,02 Vs 1,72 ± 0,17) (Abb. 3 b). Wir bestimmt auch den Ausdruck des tight Junction Proteins ZO-1 als Ersatz für epitheliale Integrität. Zellen, die mit exosomen, von LPS behandelt wurden behandelten Mäuse zeigten einen deutlich abgeschwächten Ausdruck der ZO-1, im Vergleich zu LPS behandelt kontrollmäusen (ZO-1, 1 ± 0,12 Vs 0,66 ± 0,13) (Abbildung 3).
Abbildung 1: Charakterisierung von exosomen von BAL-Flüssigkeit von LPS-behandelten Mäusen isoliert. C57BL/6J Mäuse mit intraperitonealer Injektion von LPS (15mg/kg) behandelt wurden (N = 5), PBS diente als Kontrolle (N = 5). 24 Stunden später Mäuse wurden eingeschläfert, und BAL-Flüssigkeit wurde durchgeführt. Repräsentative Bilder der Maus Lungengewebe mit LPS und zeigt akute Lungenversagen, Maßstabsleiste, 50 µm, A PBS behandelt). Exosomen waren BAL Flüssigkeit entzogen. Übertragung Elektronenmikroskopie (TEM) Analyse zeigt exosomen, skalieren, bar, 200 nm, B). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Exosomal MiRNAs Ausdruck in BAL-Flüssigkeit von LPS-behandelten Mäusen isoliert. C57BL/6J Mäuse wurden mit intraperitonealer LPS in Frage gestellt. Ausdruck der selektiven MicroRNAs wurden analysiert, durch Q-RT-PCR und normalisierte U6 Ausdruck. (A) MiR-155; (B) MiR-146a. n = 5 Mäusen pro Gruppe. Studenten Test * P < 0,05. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Expression von inflammatorischen Zytokinen und tight Junction Proteins in Maus Epithelzellen behandelt mit exosomen. BAL Flüssigkeit abgeleitet exosomen wurden mit PKH-67, und Fluoreszenzmikroskop zeigt PKH67 mit der Bezeichnung exosomen (grün), DAPI(Blue) und fusionierten Bilder der Show Aufnahme von exosomen in MLE12 Zellen, Maßstabsleiste, 50 µm, wie in A gezeigt). Maus Epithelzellen MLE12 wurden mit exosomen isoliert von BAL-Flüssigkeit von Mäusen mit LPS oder PBS behandelt Co kultiviert. 24 Stunden später wurden die Zellen geerntet, und Gesamt-RNS isoliert. Expression von TNF-α und IL-6 wurde gemessen mit Q-RT-PCR, zur internen Kontrolle GAPDH normalisiert. (B) TNF-α und (C) IL6; (D) ZO-1 mRNA Expression wurde mit Q-RT-PCR gemessen. * P < 0,05, Studenten Test. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Mausmodelle von Krankheiten werden üblicherweise verwendet, um die physiologische Funktion bestimmter Gene bewerten und zur Reduzierung der Kosten des Experimentierens2. Die akute septische Lungenversagen beschrieben hier imitiert Entzündungsreaktion bei Menschen mit ARDS gesehen. Dieses Modell ist relevant, die molekulare Pathogenese, Entwicklung von Biomarkern zu untersuchen und mögliche neue Therapien5zu testen.
Kokultur Systeme sind relevant für in Vivo Studien im Zusammenhang mit der Untersuchung möglicher Mechanismen der Übertragung von biologischen Molekülen wie RNA, DNA, Lipide und Proteine in einer in-vitro-System23,30. Einige dieser Plattformen haben großen Nutzen in der Beurteilung der mechanistischen Verständnis und Entwicklung von Therapien für komplexe Krankheiten22,23. Wie hier gezeigt, dass die exosomen von Lavage Zellen (Makrophagen, neutrophile) die Integrität der strukturellen Epithelzellen durch Übertragung von exosomen auswirken können.
Die pathobiological Wirkung von exosomen entstehen als kritischer Aspekt bei menschlichen Erkrankungen sowohl aus der diagnostischen und therapeutischen Sicht und Verständnis von Krankheit Pathogenese31,32. Um exosomen aus biologischen Flüssigkeiten zu isolieren, enthält die am häufigsten verwendeten Technik Differentielle Zentrifugation gepaart mit Ultrazentrifugation wie hier beschrieben33,34. Diese Technik hat mehrere stärken, obwohl durch die Tatsache, dass es zeitaufwendig sein kann und das Risiko einer Kontamination mit nicht Exosomal Proteine begrenzt ist. Neue Ansätze sind vorgeschlagen worden, um diese Einschränkungen, z. B. die exosom Isolation durch die größenabhängige Methode35, der dichtegradient oder immun-Affinität zu überwinden. Exosomen werden als Biomarker für die Diagnose und Prognose und Entwicklung zielgerichteter Therapien in klinischen Studien untersucht.
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Disclosures
Diese Arbeit wurde von VA Verdienst Beitrag 2I01BX001786-06A1 Finanzierung RS unterstützt.
Acknowledgments
Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt erklärt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | Escherichia coli 055:B5 | |
| PBS pH7.2(1X) | Life technologies | 20012-027 | |
| mirVana miRNA isolation kit | Thermo Fisher | 449774 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermo Fisher | 4369016 | |
| mmu-miR-155 (002571) primer | Thermo Fisher | 4427975 | |
| has-miR-146a (000468) primer | Thermo Fisher | 4427975 | |
| U6snRNA primer | Thermo Fisher | 4427975 | |
| TNF-α(Mm00443258_m1 ) primer | Thermo Fisher | 4331182 | |
| IL-6 (Mm00446190_m1 )primer | Thermo Fisher | 4331182 | |
| ZO-1 (Mm00493699_m1 )primer | Thermo Fisher | 4331182 | |
| minimal essential medium (MEM) | Thermo Fisher | 11095-072 | |
| Trysin-EDTA solution(0.05%) | Thermo Fisher | 25300054 | |
| Exosomes were labeled with PKH67 through PKH67 Green Fluorescent Cell linker Mini Kit | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Exosome Spin Columns (MW3000) | Thermo Fisher | 4484449 | |
| Beckman Coulter Optima L-100XP ultracentrifuge | Beckman Coulter | L-100XP | |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher | ||
| transmission electron microscopes (TEM) | JEOL Ltd | 120 kV TEM | |
| Olympus BX41 microscope | Olympus | BX41 |
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