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Genetics

Bronchoalveolar लेवेज Exosomes Lipopolysaccharide-प्रेरित सेप्टिक फेफड़ों में चोट

Published: May 21, 2018 doi: 10.3791/57737
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Department of Veterans Affairs, Atlanta VAMC, 2Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Department of Medicine, Emory University

Summary

चूहों के संपर्क में intraperitoneal एलपीएस स्रावित exosomes में ब्रॉन्को-वायुकोशीय लेवेज (बाल) द्रव है कि miRNAs के साथ पैक कर रहे हैं. एक सह संस्कृति प्रणाली का उपयोग कर, हम बताते है कि exosomes बाल द्रव में तंग जंक्शन प्रोटीन की अभिव्यक्ति में जारी बाधित उपकला कोशिकाओं और समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस की अभिव्यक्ति में वृद्धि कि फेफड़ों की चोट का दबाव का चिह्न ।

Abstract

एक्यूट फेफड़े की चोट (अली) और तीव्र श्वसन संकट सिंड्रोम (ARDS) फेफड़ों के रोगों जो एक उच्च रुग्णता और मृत्यु के लिए जारी है की एक विषम समूह का प्रतिनिधित्व करते हैं । अली की आणविक रोगजनन को बेहतर ढंग से परिभाषित किया जा रहा है; हालांकि, रोग आणविक चिकित्सा के जटिल प्रकृति के कारण अभी तक विकसित किया जाना है । यहाँ हम भड़काऊ प्रतिक्रिया में exosomes की भूमिका चित्रित करने के लिए तीव्र सेप्टिक फेफड़ों की चोट के एक lipopolysaccharide (एलपीएस) प्रेरित माउस मॉडल का उपयोग करें. इस मॉडल का उपयोग कर, हम कि चूहों कि वायुकोशीय और लेवेज जो भड़काऊ प्रतिक्रिया को विनियमित के साथ पैक कर रहे हैं फेफड़ों से ब्रॉन्को-miRNA साइटोकिंस (बाल) द्रव में intraperitoneal एलपीएस स्रावित exosomes उजागर कर रहे हैं दिखाने के लिए सक्षम थे. इसके अलावा एक सह संस्कृति मॉडल प्रणाली का उपयोग कर, हम बताते है कि exosomes से जारी मैक्रोफेज की अभिव्यक्ति में बाधा से तंग जंक्शन प्रोटीन के दमा उपकला कोशिकाओं. इन परिणामों का सुझाव है कि 1) exosomal गढ़शंकर के माध्यम से जंमजात प्रतिरक्षा और संरचनात्मक कोशिकाओं के बीच पार बात भड़काऊ प्रतिक्रिया और संरचनात्मक बाधा के विघटन और 2 के लिए योगदान) इन miRNAs लक्ष्यीकरण एक उपंयास मंच प्रदान करने के लिए इलाज कर सकते है अली आणि ARDS.

Introduction

अली और ARDS गंभीर hypoxemia गैर फुलाव फुफ्फुसीय शोफ जो लगभग १,०००,००० लोगों को दुनिया भर में प्रतिवर्ष1को प्रभावित करता है के कारण के साथ श्वसन विफलता के जीवन धमकी रूपों रहे हैं । ARDS के एटियलजि में संक्रमण या आकांक्षा और कई तरह के अप्रत्यक्ष अपमान से फेफड़ों में सीधी चोट भी शामिल है. पिछले दशक में वहां ARDS के आणविक रोगजनन की वृद्धि हुई समझ गया है, तथापि, ARDS के लिए विशिष्ट लक्षित उपचार अभी तक2,3विकसित किया जाना है ।

तीव्र फेफड़ों की चोट के कई पशु मॉडलों को विकसित किया गया है जो मानव अध्ययन4,5के लिए प्रयोगात्मक चिकित्सा के अनुवाद के लिए एक पुल प्रदान करते हैं । आमतौर पर इस्तेमाल किया मॉडल ओलिक एसिड, बैक्टीरिया, एलपीएस, और ब्लीयामीसिन के स्थानीय अधिष्ठापन शामिल हैं । अंय दृष्टिकोण ischemia-reperfusion, cecal बंधाव पंचर, यांत्रिक वेंटिलेशन-प्रेरित खिंचाव चोट, hyperoxia या बैक्टीरिया और एलपीएस के प्रणालीगत प्रशासन5शामिल हैं । ये मॉडल नैदानिक परिकल्पनाओं का परीक्षण करने के लिए और संभावित उपचारों के विकास के लिए एक उपयोगी जैविक प्रणाली प्रदान करते हैं । मानव ARDS अनुकरण करने के लिए, पशु मॉडलों फेफड़ों में बाधा समारोह में दोषों के साथ उपकला और endothelial कोशिकाओं को सूजन और तीव्र चोट पुन: पेश करना चाहिए ।

Exosomes व्यास, जिसका आणविक सामग्री में 20-200 एनएम के साथ झिल्ली बुलबुले प्रोटीन होते हैं, डीएनए, आरएनए, और लिपिड, और आणविक संरचना हस्तांतरण के माध्यम से ऊतक microenvironment में अंतर सेलुलर संचार की सुविधा. Exosomes कोशिकाओं के कई प्रकार, जैसे endothelial कोशिकाओं, उपकला कोशिकाओं, चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं और ट्यूमर कोशिकाओं के द्वारा स्रावित कर रहे हैं, और मानव शरीर द्रव में मौजूद हैं । अध्ययनों से संकेत मिलता है कि exosomes संक्रामक और बाँझ भड़काऊ रोगों के दौरान प्रतिरक्षा कोशिकाओं और stromal कोशिकाओं के बीच पार बात को विनियमित, और उनके असामान्य रिलीज शारीरिक के दौरान विभिन्न प्राकृतिक और प्रयोगात्मक उत्तेजनाओं द्वारा विनियमित किया जा करने के लिए प्रकट होता है और रोग प्रक्रियाओं6। इस तरह के संचार नेटवर्क फेफड़ों के रोगों के रोगजनन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है और pathophysiological प्रगति7,8को प्रभावित कर सकता है । के रूप में 18-22 न्यूक्लियोटाइड गैर कोडिंग RNAs, miRNAs ऊतक और शरीर के तरल पदार्थ, प्लाज्मा, सीरा, और पोस्ट-शोधोंस्तर9, 10 पर mRNA अभिव्यक्ति मिलाना में मौजूद हैं ।

डिब्बाबंद miRNAs में exosomes प्रभाव भेदभाव और कोशिकाओं के कई प्रकार के समारोह, और अत्यधिक स्तर रोगों की एक किस्म के साथ जुड़े रहे हैं, कैंसर सहित, फेफड़ों के रोगों, मोटापा, मधुमेह, और हृदय रोग11, 12,13,14,15,16. प्राप्तकर्ता कोशिकाओं में प्रवेश और गढ़शंकर exosomal miRNAs के microenvironment17,18के रक्तस्तम्भन को संशोधित करने के लिए सेलुलर संचार की सुविधा । एक्यूट फेफड़ों की चोट एक जटिल प्रक्रियाओं, exosomes8के माध्यम से व्यापक सेलुलर संचार के साथ कई सेल प्रकार शामिल है । मीर-१५५ और मीर-146a आम transcriptional विनियामक तंत्र साझा करें और भड़काऊ प्रतिक्रिया और प्रतिरक्षा सहिष्णुता के लिए योगदान19,20. हाल के अध्ययनों से संकेत मिलता है कि दोनों exosomal miRNAs गढ़शंकर प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच के माध्यम से भड़काऊ प्रतिक्रिया को21मॉडुलन । हालांकि, आणविक तंत्र exosomal miRNAs के वायुकोशीय प्रतिक्रिया पर modulatory अंतर्निहित endotoxin के लिए अस्पष्ट, निस्संदेह संभावित नैदानिक प्रासंगिकता और शोधों निहितार्थ आगे की जांच योग्यता रहते हैं ।

सह संस्कृति मॉडल जैसे कि सूजन और कैंसर22,23के रूप में जटिल वातावरण में विशिष्ट कोशिका प्रकार की बातचीत को परिभाषित करने के लिए नियोजित किया जा रहा है । इन प्लेटफार्मों विशेष रूप से प्रतिरक्षा और संरचनात्मक कोशिकाओं के लिए सेल प्रकार के बीच क्रॉस टॉक पूछताछ करने के लिए एक वैकल्पिक रणनीति प्रदान करते हैं ।

इंट्रा सांस, एयरोसोल, intraperitoneal या एलपीएस के प्रणालीगत प्रशासन व्यापक रूप से प्रयोगात्मक फेफड़ों की चोट24,25,26प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, और उपकला और endothelial पारगम्यता प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है दोष. यहां हम intraperitoneal एलपीएस का उपयोग करने के लिए चूहों में तीव्र फेफड़े की चोट के एक सेप्टिक मॉडल प्रेरित । एलपीएस के intraperitoneal प्रशासन के 24 ज के भीतर, पारगम्यता दोषों भड़काऊ कोशिकाओं की भर्ती के साथ फेफड़ों में प्रेरित कर रहे हैं । इसके अलावा, हम बताते है कि बाल से exosomes miRNA-१५५ और मीर-146a होते हैं, और बाल द्रव से exosomes, आईएल-6 और साइटोकिंस-TNF सहित प्राप्तकर्ता उपकला कोशिकाओं में समर्थक भड़काऊ α अभिव्यक्ति प्रेरित । इन आंकड़ों से पता चलता है कि पहले exosomal miRNAs बाल में तीव्र सेप्टिक फेफड़ों की चोट के इस मॉडल में स्रावित होते हैं.

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Protocol

समग्र प्रोटोकॉल पूति प्रेरण और पशु से बाल द्रव के अलगाव के पहले दिन सहित 2 दिन, की आवश्यकता है, और माउस BALF से exosomes अलगाव के लिए दूसरे दिन । सभी प्रक्रियाओं की समीक्षा की और अटलांटा VA चिकित्सा केंद्र में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. माउस तीव्र सेप्टिक फेफड़ों की चोट मॉडल

  1. 6-8 सप्ताह का उपयोग करें-पुराने पुरुष वंय-प्रकार C57BL/6J चूहों (वजन 20-22 ग्राम) पशु मॉडल के लिए, और अपूतित तकनीकों और उपकरणों का उपयोग कर सभी प्रक्रियाओं का प्रदर्शन । १२१ डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए संदंश और कैंची सहित सभी सर्जिकल उपकरणों, आटोक्लेव ।
  2. बेतरतीब ढंग से प्रयोगात्मक और नियंत्रण समूह में चूहों वितरित. एक शल्य चिकित्सा बोर्ड पर चूहों को नियंत्रित । intraperitoneal मार्ग से ई कोलाई lipopolysaccharide (एलपीएस, 15 मिलीग्राम/) के साथ चूहों का इलाज । व्यक्ति के शरीर के वजन के अनुसार, माउस प्रति ०.१ मिलीलीटर पंजाबियों के लिए उपयुक्त एलपीएस खुराकों पतला है, तो एलपीएस एक 1 एमएल के साथ सिरिंज का उपयोग कर समाधान सुई 27 जी सुई और पशुओं को नियंत्रित करने के लिए पंजाब के एक समकक्ष मात्रा इंजेक्षन.
  3. चूहों को पशु BSL2 सुविधा में रखें, जो उचित कमरे के तापमान पर स्वच्छ पिंजरों के होते हैं ।
  4. 24 ज बाद में, सह2 साँस लेना के साथ चूहों euthanize ।
  5. माउस गर्दन के केंद्र में सर्जिकल क्षेत्र का चयन करें । एक छोटा सा चीरा (लगभग 5 मिमी) बनाओ, और धीरे श्वासनली उजागर होता है जब तक कुंद संदंश का उपयोग श्वासनली के लिए उपयोग के लिए मांसपेशियों को अलग ।
  6. एक 27 जी सुई के साथ 10 मिलीलीटर बाँझ सिरिंज के साथ माउस बाल द्रव वापस ले लो. सबसे पहले, धीरे, श्वासनली में सुई डालें और श्वासनली में धीरे से बाँझ पंजाबियों के 1 मिलीलीटर सुई, तो एक 27 जी सुई के साथ एक 3 मिलीलीटर डिस्पोजेबल सिरिंज में BALF आकर्षित । प्रक्रिया के पूरा होने पर, सिरिंजों और sharps के लिए खतरा कंटेनर में सुई का निपटान.
  7. Chauret एट अल द्वारा पहले वर्णित के रूप में, क्लोरीन डाइऑक्साइड के साथ शल्य चिकित्सा उपकरणों का इलाज. 27, और फिर १२१ डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए autoclaving द्वारा सभी शल्य चिकित्सा उपकरणों को निष्फल ।

2. Exosomes अलगाव-धारावाहिक अल्ट्रा-केंद्रापसारक और लक्षण वर्णन

  1. 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में माउस बाल द्रव लीजिए । वायुकोशीय कोशिकाओं फसल के लिए, १,००० जी पर 10 मिनट के लिए नमूने केंद्रापसारक, 4 डिग्री सेल्सियस पर ।
  2. नई 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों के लिए supernatant स्थानांतरण, तो 30 मिनट के लिए नमूनों पर ४,००० x 4 डिग्री सेल्सियस से कम सेल मलबे को हटाने के लिए ।
  3. ultracentrifuge ट्यूबों में supernatant लीजिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर १०,००० एक्स जी में ६० मिनट के लिए नमूने केंद्रापसारक बड़ा सेलुलर कणों को दूर करने के लिए ।
  4. supernatant नए शंकु ट्यूबों के लिए स्थानांतरण, तो ०.२ µm सिरिंज के माध्यम से नमूनों फिल्टर शेष बड़ा कणों को हटाने के लिए फिल्टर.
  5. ultracentrifuge ट्यूबों, और संतुलन ट्यूबों में नमूने ले लीजिए । 4 डिग्री सेल्सियस पर १४०,००० x g पर 2 घंटे के लिए नमूने केंद्रापसारक exosomes गोली ।
    नोट: exosomes का आकार 20-200 एनएम बदलता है । ०.२ µm फ़िल्टर बड़े कणों कि आकार में २०० से अधिक एनएम है हटाने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
  6. supernatants को धीरे से त्यागें । १०० µ एल पंजाबियों या lysis समाधान के साथ गोली भंग, और १.५ मिलीलीटर ट्यूबों के लिए exosomes नमूने हस्तांतरण, और स्टोर पर-८० ° c उपयोग तक ।
    नोट: ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप अलग exosomes सत्यापित करने के लिए सिफारिश की है.
  7. मानक उनि नमूना प्रसंस्करण प्रोटोकॉल28का पालन करें । संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर exosomes नमूनों का विश्लेषण, और छवियों को ले, स्केल बार २०० एनएम.

3. miRNA की तैयारी और प्रदर्शन miRNA-q-RT-पीसीआर

नोट: miRNA-q-RT-पीसीआर miRNAs की अभिव्यक्ति स्तर का विश्लेषण करने के लिए सिफारिश की है ।

  1. मानक miRNAs आइसोलेशन प्रोटोकॉल का पालन करें और एकल-किनारा रिवर्स प्रतिलेखन24में शुद्ध RNAs की एक बराबर राशि का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें ।
  2. बाल द्रव में exosomal microRNA स्तर का पता लगाने के लिए मानक रीयल-टाइम पीसीआर प्रोटोकॉल का पालन करें । मीर-१५५, मीर-146a, और U6 SnRNA के खिलाफ विशिष्ट रीयल-टाइम पीसीआर प्राइमरों का उपयोग करें । मात्रात्मक पीसीआर उपकरण के साथ पीसीआर रिएक्शन चलाएं और आंतरिक नियंत्रण U6 snRNA के लिए अभिव्यक्ति मूल्यों को सामान्य ।
    नोट: प्रत्येक समूह में तपसिल नमूने24होते हैं ।

4. Exosomes लेबलिंग और शुद्धिकरण

  1. निलंबित exosomes गोली के साथ १०० µ l निलंबन समाधान में एक १.५ एमएल के के रूप में, तो exosomes डाई के ०.४ µ एल जोड़ें अंय ट्यूब में निलंबन समाधान के १०० µ एल के साथ ।
  2. जल्दी से डाई समाधान के समाधान में exosomes जोड़ने और इसे pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण । कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए नमूने रखें, प्रकाश से रक्षा ।
  3. एक १.५ मिलीलीटर रेफरेंस ट्यूब में एक exosome स्पिन कॉलम रखो । समाधान मिश्रण exosome स्पिन कॉलम के केंद्र के लिए स्थानांतरण ।
  4. कमरे के तापमान पर ८०० x g पर 2 मिनट के लिए कॉलम स्पिन ।
  5. स्तंभ को छोड़ें और उपयोग करने तक-20 ° c पर eluted नमूना संग्रहीत करें ।

5. प्राप्तकर्ता कोशिकाओं द्वारा उठाए गए Exosomes का सत्यापन

  1. बीज 1 x 104 MLE 12/cell एक 8-well चैंबर स्लाइड में, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति कोशिकाओं, 5% CO2.
  2. जोड़ें 10 µ एल फ्लोरोसेंट-exosomes कोशिकाओं को लेबल । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए मशीन ।
  3. संस्कृति मीडिया निकालें और पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धोने, तो कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 1% paraformaldehyde के साथ कोशिकाओं को ठीक ।
  4. माउंट DAPI के साथ मध्यम में स्लाइड माउंट ।
  5. एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के माध्यम से नमूनों का विश्लेषण और चित्र, 40X आवर्धन ले ।

6. Exosomes और प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के बीच बातचीत का सत्यापन

  1. बीज 2 x 105 MLE12/अच्छी तरह से एक 12-अच्छी संस्कृति में उपयुक्त संस्कृति माध्यम से युक्त प्लेट, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति कोशिकाओं, 5% सह2।
  2. माउस बाल द्रव से MLE12 कक्षों में 20 µ g exosomes जोड़ें और प्रायोगिक समूह प्रति प्रतिकृति सेट करें ।
  3. 24 ज बाद में, पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धो और ६०० µ एल lysis बफर में अच्छी तरह से जोड़ें । धीरे प्लेट हिला और पिपेट के साथ १.५ मिलीलीटर ट्यूब में lysis नमूने इकट्ठा ।
  4. मानक कुल आरएनए अलगाव प्रोटोकॉल और सीडीएनए रिवर्स प्रतिलेखन प्रोटोकॉल का पालन करें, एकल-किनारा सीडीएनए रिवर्स प्रतिलेखन29पूरा.
  5. प्राप्तकर्ता कक्ष29में mRNA व्यंजक स्तर का पता लगाने के लिए मानक रीयल-टाइम पीसीआर प्रोटोकॉल का पालन करें । TNF-α, आईएल-6, और ZO-1 के खिलाफ विशिष्ट रीयल-टाइम पीसीआर प्राइमरों का उपयोग करें । मात्रात्मक पीसीआर तंत्र के साथ पीसीआर प्रतिक्रियाओं चलाएँ और आंतरिक नियंत्रण GAPDH के लिए अभिव्यक्ति मूल्यों को सामान्य.
    नोट: प्रत्येक समूह में तपसिल नमूने होते हैं ।

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Representative Results

सेप्टिक फेफड़ों की चोट पैदा करने के लिए, चूहों intraperitoneal एलपीएस के साथ इलाज किया गया (15 मिलीग्राम/ एलपीएस प्रशासन के 24 घंटे के भीतर, neutrophilic आमद फेफड़ों में देखा गया था, के रूप में चित्र 1aमें दिखाया गया है । माउस बाल द्रव खींचा गया था, अलगाव और exosomes के शोधन के बाद । BALF exosomes की आकृति विज्ञान इलेक्ट्रॉन संचरण माइक्रोस्कोपी (आंकड़ा 1b) द्वारा पुष्टि की गई थी ।

चयनित समर्थक भड़काऊ miRNAs miRNA-१५५ और मीर-146a की अभिव्यक्ति क्यू-आरटी-पीसीआर से शुद्ध exosomes से पता लगाया गया था । मीर की अभिव्यक्ति का स्तर-१५५ और मीर-146a चूहों से बाल द्रव exosomes में काफी वृद्धि हुई कि एलपीएस के साथ इलाज किया गया, पंजाब के साथ इलाज चूहों पर नियंत्रण की तुलना में (मीर-१५५, 1 ± ०.१६ बनाम ११.६ ± ०.६; मीर-146a, 1 ± ०.१२ बनाम १३.५ ± १.१८६) (चित्रा 2) ।

exosomes के कार्यात्मक प्रभाव को परिभाषित करने के लिए, माउस दमा उपकला कोशिकाओं (MLE12 कोशिकाओं) एलपीएस या पंजाबियों, क्रमशः के साथ इलाज चूहों के बाल द्रव से निकाले गए शुद्ध exosomes के साथ इलाज किया गया. सबसे पहले, हम प्राप्तकर्ता उपकला कोशिकाओं में BALF exosomes के प्रवेश साबित कर दिया. BALF exosomes PKH-६७ के साथ लेबल थे, और MLE12 कोशिकाओं के साथ सह-संस्कृति, और फिर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप छवियों उपकला कोशिकाओं द्वारा exosomes के ऊपर दिखाने के लिए (चित्र 3ए) । समर्थक भड़काऊ मध्यस्थ की अभिव्यक्ति, TNF-α और IL-6 उपकला कोशिकाओं में काफी वृद्धि हुई थी कि एलपीएस इलाज चूहों से exosomes के साथ सह-संस्कृति थे, नियंत्रण समूह की तुलना में (TNF-α, 1 ± ०.१३ बनाम ५.०१ ± ०.२२; IL-6, 1 ± ०.०२ बनाम १.७२ ± ०.१७) (चित्र 3 बी) । हम भी उपकला अखंडता के लिए एक किराए के रूप में तंग जंक्शन प्रोटीन ZO-1 की अभिव्यक्ति निर्धारित किया है । कोशिकाओं है कि एलपीएस इलाज चूहों से exosomes के साथ इलाज किया गया ZO-1 की एक काफी तनु अभिव्यक्ति दिखाया, एलपीएस का इलाज नियंत्रण चूहों की तुलना में (ZO-1, 1 ± ०.१२ बनाम ०.६६ ± ०.१३) (चित्रा 3सी).

Figure 1
चित्रा 1: एलपीएस-इलाज चूहों के बाल द्रव से अलग exosomes के लक्षण वर्णन । C57BL/6J चूहों intraperitoneal एलपीएस (15mg/kg) इंजेक्शन (n = 5) के साथ इलाज किया गया, पंजाबियों नियंत्रण (n = 5) के रूप में प्रयुक्त हुआ था । 24 ज बाद में, चूहों euthanized थे, और बाल द्रव प्रदर्शन किया गया था । माउस फेफड़े के ऊतक के प्रतिनिधि छवियों एलपीएस और पंजाब तीव्र फेफड़ों की चोट, स्केल बार, ५० µm, A) दिखा के साथ इलाज किया । Exosomes बाल द्रव से निकाले गए. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) विश्लेषण दिखा रहा है exosomes, स्केल बार, २०० एनएम, बी). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: बाल द्रव में Exosomal miRNAs अभिव्यक्ति एलपीएस-इलाज चूहों से पृथक. C57BL/6J चूहों को intraperitoneal एलपीएस के साथ चुनौती दी गई. चुनिंदा microRNAs की अभिव्यक्ति q-RT-पीसीआर के माध्यम से विश्लेषण किया गया और U6 अभिव्यक्ति के लिए सामान्यीकृत। अ) मीर-१५५; ब) मीर-146a. n = प्रति समूह 5 चूहों । छात्र का परीक्षण, * P < 0.05. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: भड़काऊ साइटोकिंस और माउस उपकला कोशिकाओं exosomes के साथ इलाज में तंग जंक्शन प्रोटीन की अभिव्यक्ति. बाल द्रव-व्युत्पंन exosomes PKH के साथ लेबल थे-६७, और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप दिखा PKH67 लेबल exosomes (हरा), DAPI (नीला) और exosomes कोशिकाओं, स्केल बार, ५० MLE12, के रूप में दिखाया में µm के शो की छवियों का विलय एक) । माउस उपकला कोशिकाओं MLE12 एलपीएस या पंजाबियों के साथ इलाज चूहों से बाल द्रव से पृथक exosomes के साथ सह-संस्कृति थे. 24 ज बाद में, कोशिकाओं को काटा गया था, और कुल आरएनए अलग था । TNF-α और IL-6 की अभिव्यक्ति q-RT-पीसीआर, GAPDH आंतरिक नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत के साथ मापा गया था । बी) TNF-α और (ग) IL6; (घ) ZO-1 mRNA अभिव्यक्ति q-RT-पीसीआर के साथ मापा गया था । * P < 0.05, Student ' s test. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

रोगों के माउस मॉडल सामांयतः विशिष्ट जीन के शारीरिक समारोह का मूल्यांकन करने के लिए और प्रयोग2की लागत को कम करने के लिए प्रयोग किया जाता है । तीव्र सेप्टिक फेफड़ों की चोट यहाँ वर्णित भड़काऊ प्रतिक्रिया ARDS के साथ मनुष्यों में देखा नकल । इस मॉडल के लिए आणविक रोगजनन, के विकास की जांच करने के लिए प्रासंगिक है और संभावित नए उपचारों का परीक्षण5।

सह संस्कृति प्रणालियों ऐसे आरएनए के रूप में जैविक अणुओं के हस्तांतरण के संभावित तंत्र की जांच के संदर्भ में vivo अध्ययन में के लिए प्रासंगिक हैं, डीएनए, लिपिड, और एक इन विट्रो सिस्टम में प्रोटीन23,30. इन प्लेटफार्मों में से कुछ जटिल रोगों के लिए यंत्रवत समझ और चिकित्सा के विकास के आकलन में महान उपयोगिता है22,23। के रूप में यहां दिखाया लेवेज कोशिकाओं से exosomes (मैक्रोफेज, न्यूट्रोफिल) exosomes के हस्तांतरण के माध्यम से संरचनात्मक उपकला कोशिकाओं की अखंडता को प्रभावित कर सकते हैं.

exosomes के pathobiological प्रभाव दोनों नैदानिक और चिकित्सीय दृष्टिकोण और समझ रोग रोगजनन31,३२से मानव रोगों में महत्वपूर्ण पहलू के रूप में उभर रहे हैं । जैविक तरल पदार्थ से exosomes को अलग करने के लिए, सबसे अधिक इस्तेमाल किया तकनीक अंतर केंद्रापसारक ultracentrifugation के साथ युग्मित के रूप में यहां वर्णित३३,३४शामिल हैं । इस तकनीक कई ताकत है, हालांकि तथ्य यह है कि यह समय लेने वाली और गैर exosomal प्रोटीन के साथ संदूषण का खतरा हो सकता है द्वारा सीमित है । इन सीमाओं को दूर करने के लिए उपन्यास दृष्टिकोणों का प्रस्ताव किया गया है, जैसे घनत्व के ढाल द्वारा exosome अलगाव या प्रतिरक्षा-संबध या आकार-निर्भर विधि३५. Exosomes निदान और पूर्वानुमान के लिए, और लक्षित चिकित्सा के विकास के लिए एक के रूप में नैदानिक अध्ययन में जांच की जा रही है ।

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Disclosures

यह काम वीए मेरिट रिव्यू 2I01BX001786-06A1 फंडिंग से रु.

Acknowledgments

लेखकों ने हितों का टकराव नहीं होने का ऐलान किया है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
lipopolysaccharide Sigma-Aldrich Escherichia coli 055:B5
PBS pH7.2(1X) Life technologies 20012-027
mirVana miRNA isolation kit Thermo Fisher 449774
TaqMan Gene Expression Master Mix Thermo Fisher 4369016
mmu-miR-155 (002571) primer Thermo Fisher 4427975
has-miR-146a (000468) primer Thermo Fisher 4427975
U6snRNA primer Thermo Fisher 4427975
TNF-α(Mm00443258_m1 ) primer Thermo Fisher 4331182
IL-6 (Mm00446190_m1   )primer Thermo Fisher 4331182
ZO-1 (Mm00493699_m1  )primer Thermo Fisher 4331182
minimal essential medium (MEM) Thermo Fisher 11095-072
Trysin-EDTA solution(0.05%) Thermo Fisher 25300054
Exosomes were labeled with PKH67 through PKH67 Green Fluorescent Cell linker Mini Kit  Sigma-Aldrich MINI67-1KT
Exosome Spin Columns (MW3000) Thermo Fisher 4484449
Beckman Coulter Optima L-100XP ultracentrifuge  Beckman Coulter L-100XP
Ultra-clear centrifuge tubes Beckman Coulter 344058
Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System Thermo Fisher
transmission electron microscopes (TEM) JEOL Ltd 120 kV TEM
Olympus BX41 microscope Olympus BX41

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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जेनेटिक्स इश्यू १३५ Exosomes microRNAs मीर-१५५ मीर-146a एलपीएस लंग पूति
Bronchoalveolar लेवेज Exosomes Lipopolysaccharide-प्रेरित सेप्टिक फेफड़ों में चोट
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Yuan, Z., Bedi, B., Sadikot, R. T.… More

Yuan, Z., Bedi, B., Sadikot, R. T. Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury. J. Vis. Exp. (135), e57737, doi:10.3791/57737 (2018).

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