在这里, 我们提出了一个协议, 以确认存在的点突变诊断遗传性 transthyretin 淀粉样变性, 使用 Ala97Ser, 最常见的地方性突变在台湾, 作为一个例子。
遗传检测是遗传性 transthyretin 相关淀粉样变性的最可靠的试验, 应在 transthyretin 淀粉样变性 (ATTR) 的大多数病例中进行。ATTR 是一种罕见的, 但致命的疾病与异构表型;因此, 诊断有时会延迟。因此, 随着对 ATTR 早期表现的关注和广泛的认识, 以及新的治疗方法, 适当的诊断研究, 包括 transthyretin (TTR) 基因检测, 以确认 ATTR 的类型和变种, 因此改善预后的基础。利用聚合酶链反应 (PCR) 方法进行遗传分析, 证实 TTR 点突变比传统方法 (如南方印迹) 的存在更为迅速和安全。在此, 我们展示了基因确认的 ATTR Ala97Ser 突变, 最常见的地方性突变在台湾。该协议包括四个主要步骤: 收集全血标本, dna 提取, 所有四 TTR 外显子的基因分析与 PCR, 和 DNA 测序。
Transthyretin (TTR) 淀粉样变性 (ATTR) 是遗传性系统性淀粉样变性1的最常见形式, 可由 Transthyretin (TTR) 基因2中的常染色体显性遗传突变引起。TTR 突变破坏 tetrameric 蛋白结构的稳定, 并导致其离解成单体, 重组成淀粉样纤维2。超过 100 amyloidogenic TTR 突变已被报告全球1。用聚合酶链反应 (PCR) 方法进行遗传分析, 证实了 TTR 点突变的存在, 具有避免放射性标记探针处理与南方印迹3相比较的优点。PCR 是一种快速、简便、廉价、可靠的技术, 已应用于现代科学的众多领域4。
由于其表型异质性, 早期诊断这一进步和致命的疾病是有挑战性的。随着对 ATTR 早期表现的关注和广泛的认识, 以及新出现的治疗方法5, 适当的诊断研究, 包括 TTR 基因检测, 对于改善预后至关重要。此外, 不同的突变与不同显性的特点, 发病年龄, 进展模式, 疾病严重性, 中位生存率, 肝移植的疗效, 或 TTR 稳定剂2,6, 和不同程度的神经和心脏参与, 这对基因咨询有很大的影响7,8,9。此外, 高度准确的基因检测是唯一的工具, 区分两种不同类型的 ATTR: 遗传性 (突变) 和野生类型 (非突变体, 老年系统性淀粉样变性, SSA)7。必须确认 ATTR 的类型, 因为治疗方法相差很大2。因此, TTR 遗传试验的逐步性协议的描述越来越有必要。
以台湾最常见的地方性突变 Ala97Ser 为例, 说明了检测突变的分子方法。dna 提取步骤的修改减少了三种溶液的用量, 并产生了足够数量的 dna。在该协议中, 对所有四 TTR 外显子进行了分析, 而包括 5 ‘ 上游、3 ‘ 下游、启动子、内含子和未翻译区域 (UTR) 的区域未进行排序。
协议中有两个关键步骤。首先, 为了有足够数量的白细胞, 应避免 hemodiluted 标本11。其次, 使用合适的 PCR 引物是取得可靠结果12的根本。我们使用的底漆爆破 web 工具设计引物4,13;在四 TTR 外显子的每一侧至少有40基对。我们还在 NCBI 上进行爆炸检查底漆的特异性。
在 DNA 提取步骤中进行了一些修改?…
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢新趣吴小姐在实验中的帮助。这项研究得到了长功夫医学研究计划 (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373) 和 100-4470A3, 104-2462A3, 台湾的资助。
EDTA-treated tubes | BD | ||
DNA Extraction Kit | Stratagen | 200600 | |
NanoDrop ND2000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | Kimtech Science Kimwipes | |
AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase kit | Applied Biosystems | 4398823 | |
TTR gene intronic primers | Exon1 | F: 5’-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3’ | |
Exon1 | R: 5’-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3’ | ||
Exon2 | F: 5’-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3’ | ||
Exon2 | R: 5’-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3’ | ||
Exon3 | F: 5’-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3’ | ||
Exon3 | R: 5’-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3’ | ||
Exon4 | F: 5’-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3’ | ||
Exon4 | R: 5’-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3’ | ||
thermocycler | Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
electrophoresis cell | ADVANCE | Mupid-2plus | |
DNA ladder | Protech | PT-M1-100 | |
dye | BioLabs | B7021 | |
AlphaImager EC | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
automatic sequencer | Applied Biosystems | 3730xl DNA Analyzer |