Summary
Aquí, presentamos un protocolo para confirmar la presencia de la mutación de punto para la diagnosis del amyloidosis de transthyretin hereditario, con Ala97Ser, la mutación más común endémica de Taiwán, por ejemplo.
Abstract
Las pruebas genéticas están la prueba más fiable para hereditaria por transtiretina relacionada con amiloidosis y debe realizarse en la mayoría de los casos del amyloidosis de transthyretin (ATTR). ATR es una enfermedad rara pero fatal con fenotipos heterogéneos; por lo tanto, la diagnosis se retrasa a veces. Con el aumento de atención y el reconocimiento más amplio de manifestaciones tempranas de atributos, así como tratamientos emergentes, estudios diagnóstico apropiados, incluyendo el genética del transthyretin (TTR) de prueba, para confirmar los tipos y variantes del ATR son por lo tanto fundamental para mejorar el pronóstico. Análisis genéticos con métodos de reacción en cadena (PCR) polimerasa confirman la presencia de mutaciones puntuales TTR mucho más rápido y más seguro que los métodos convencionales como la mancha blanca /negra meridional. Aquí, demostramos la confirmación genética de la mutación Ala97Ser ATTR, la mutación más común endémica de Taiwán. El protocolo consta de cuatro pasos principales: recogiendo muestras de sangre entera, la extracción de ADN, el análisis genético de los cuatro exones TTR con PCR y secuenciación de ADN.
Introduction
Amyloidosis de transthyretin (TTR) (ATTR) es la forma más común de amiloidosis sistémica hereditaria1y puede ser causado por una mutación autosómica dominante heredada en la del gene del transthyretin (TTR)2. Mutaciones de TTR desestabilizan la estructura de la proteína tetramérica y conducen a su disociación en monómeros que vuelve a montar en2de las fibrillas amiloideas. Más de 100 mutaciones de TTR amyloidogenic han sido reportados en todo el mundo1. Análisis genéticos con métodos de reacción en cadena (PCR) polimerasa confirman la presencia de la mutación de punto TTR y tienen ventajas como evitar la manipulación de sondas marcadas radiactivamente en comparación con la mancha blanca /negra meridional3. PCR es una técnica rápida, fácil, barata y confiable que se ha aplicado a diversos campos de las ciencias modernas4.
El diagnóstico precoz de esta enfermedad progresiva y fatal es difícil dada su heterogeneidad fenotípica. Con el aumento de atención y el reconocimiento más amplio de las manifestaciones tempranas de atributos así como los emergentes de los tratamientos5, estudios diagnóstico apropiados incluyendo pruebas genéticas TTR son críticamente fundamentales para mejorar el pronóstico. Además, diversas mutaciones se asocian con diferentes penetrancia del rasgo, edad de inicio, patrones de evolución, severidad de la enfermedad, mediana de la supervivencia, eficacia del trasplante del hígado, o TTR estabilizadores2,6, y grados variables de la implicación neurológica y cardiológica, que tienen grandes implicaciones para el asesoramiento genético7,8,9. Además, una prueba genética altamente exacta es la única herramienta que distingue los dos tipos de atributos: hereditario (mutante) y tipo salvaje (no-mutante forma, amyloidosis systemic senil, SSA)7. Es imprescindible confirmar los tipos de atributos, porque los tratamientos varían ampliamente2. Por lo tanto, hay una creciente necesidad para describir el protocolo paso a paso de la prueba genética de TTR.
La aproximación molecular para detectar la mutación será ilustrada con Ala97Ser, la mutación más común endémica de Taiwán, por ejemplo. Modificaciones en el paso de extracción de ADN reducen la cantidad de las tres soluciones que utiliza y produce una cantidad suficiente de ADN. En este protocolo, se analizaron los cuatro exones TTR, mientras incluyendo 5' contra la corriente, 3' abajo, promotores, intrones, regiones y regiones sin traducir (UTR) no fueron ordenadas.
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Protocol
Las pruebas realizadas en el laboratorio se llevó a cabo conforme a las prescripciones de los clínicos laboratorio mejora enmiendas (CLIA) de 1988, las normas aprobadas por el institucional de Junta de Chang Gung Memorial Hospital y Universidad (licencia no. 100 - 4470A3 y 104-2462A3). Se obtuvo consentimiento informado de todos los pacientes.
1. sangre recogida
- Recoja la sangre en tubos de tratados con EDTA disponibles comercialmente. Mezclar suavemente y almacenar la muestra de sangre a 4 ° C hasta el procesamiento.
2. ADN extracción de sangre periférica
Utilice un Kit de extracción de ADN para la extracción de ADN genómica (véase Tabla de materiales).
- Añadir 10 mL de solución 1 para la muestra de sangre de 4,0 mL. Incubar la muestra en hielo durante 10 minutos.
- Centrifugar la muestra a 2.000 x g durante 5 min a 4 ° C. Retire y descarte el sobrenadante cuidadosamente. Resuspender el precipitado en 3 mL de solución 1.
- Centrifugar la muestra a 2.000 x g durante 5 min a 4 ° C otra vez y descartar el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 3 mL de solución 2.
- Añadir 10 μl de la solución madre de pronasa (225 mg/mL) para obtener una concentración final de 100 μg/mL y mezclar bien. Incubar a 37 ° C durante la noche.
- Enfriar el tubo en hielo durante 10 minutos agregar 0,8 mL de solución 3 a la muestra e invertir 3 - 5 veces. Coloque la muestra en hielo durante 5 minutos.
- Centrifugar la muestra a 3.000 x g durante 15 min a 4 ° C. Cuidadosamente transfiera el sobrenadante a un tubo de centrifugadores cónicos estériles de 15 mL.
- Añadir 6 μl de solución stock de Rnasa (10 mg/mL) para obtener una concentración final de 20 μg/mL. Incubar a 37 ° C durante 15 minutos.
- Añadir 2,5 mL de alcohol isopropílico y mezclar bien invirtiendo suavemente varias veces para precipitar DNA (se forman filamentos de material blanco, floculante). Utilizando una pipeta de gran diámetro, transferir el precipitado de ADN a un nuevo tubo de centrífuga de 1.5 mL.
- Centrifugar a 12.000 x g durante 3 min a 4 ° C. Descartar el sobrenadante cuidadosamente. Pellet de ADN lavar añadiendo 500 μl de etanol al 70%.
- Centrifugar a 12.000 x g durante 1 min y descartar el sobrenadante. Secar el pellet de ADN a temperatura ambiente. Añada 100 μl de ddH2O e incubar a 65 ° C por 15 min a Resuspender el ADN.
3. cuantificación de ADN genómica
Use un espectrofotómetro (véase Tabla de materiales) para detectar la cantidad y calidad de la DNA genomic.
- Inicie sesión en el ordenador conectado a la máquina de espectrofotómetro. Abrir el software.
- Inicializar la máquina del espectrofotómetro:
- Haga clic en "Ácidos nucleicos" en el software de espectrofotómetro.
- Limpie el pedestal con una toallita de papel desechable y agua purificada.
- En blanco el espectrofotómetro:
- 2 μl de agua purificada en el pedestal de la carga.
- Baje el brazo superior del espectrofotómetro y haga clic en "En blanco" para calibrarlo.
- Cuando esté hecho, levante el brazo y seque el pedestal con una toallita.
- Medida de la muestra:
- Haga clic en "ADN-50" en el tipo de muestra.
- 2 μl de muestra de ADN en el pedestal de la carga.
- Baje el brazo y haga clic en "Medida" para medir el cociente A260/A280 y la concentración de la muestra.
- Limpie el pedestal entre cada serie con un trapo y agua purificada.
- Haga clic en "Imprimir pantalla" para recoger los datos.
4. genéticos análisis de mutaciones
Amplificar el ADN diana con el PCR4. Realizar PCR en una reacción de 25 μl mezcla utilizando una polimerasa de la DNA kit (véase Tabla de materiales). La tabla 1 muestra el gen TTR intronic cartillas.
| gene | Secuencia de primer |
| Exon1 | F: 5'-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3' R: 5'-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3' |
| Exon2 | F: 5'-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3' R: 5'-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3' |
| Exon3 | F: 5'-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3' R: 5'-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3' |
| Exon4 | F: 5'-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3' R: 5'-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3' |
Tabla 1. Cebadores intronic del gene de TTR. (Secuencia NCBI referencia: NC_000018.10)
- Añadir los reactivos en la tabla 2 a un tubo PCR de 0.2 mL.
| Componentes | Volumen (μL) | Concentración final |
| 10 x Buffer | 2.5 | 1 x |
| MgCl2 (25 mM) | 1.5 | 1,5 mM |
| Potenciador de GC 360 | 1 | - |
| Polimerasa de la DNA 360 | 0.2 | 2 reacción U |
| dNTP Mix (25 mM) | 2 | 2 mM |
| Primer F (10 μm) | 1 | 0.4 ΜM |
| Primer R (10 μm) | 1 | 0.4 ΜM |
| ADN (100 ng) | 2 | |
| Agua grado PCR | 13.8 | - |
| Volumen total | 25 | - |
Tabla 2. Condiciones de reacción de PCR.
- Mezclar suavemente y centrifugar brevemente en una centrífuga de mesa para recoger todos los componentes en la parte inferior del tubo. Coloque el tubo en un termociclador.
- Realizar PCR para 30 ciclos. Cada ciclo consiste en un paso de desnaturalización durante 30 s a 94 ° C, primer recocido durante 30 s a 58 ° C y la extensión de la polimerasa para 45 s a 72 ° C (ver tabla 3).
| Paso | Temperatura (° C) | Tiempo | ciclo |
| Desnaturalización inicial | 95 | 5 min | 1 |
| Paso de la desnaturalización de ADN | 94 | 30 s | 30 ciclos |
| Paso de recocido de la cartilla | 58 | 30 s | 30 ciclos |
| Paso de extensión de polimerasa | 72 | 45 s | 30 ciclos |
| Paso de elongación post | 72 | 10 min | 1 |
| Final de la polimerización en cadena bicicleta | 4 | Indefinida |
Tabla 3. Condiciones para la amplificación de productos de la PCR en bicicleta.
- Validar el producto PCR visualizando con electroforesis en gel:
- Preparar un gel de agarosa al 1.2%:
- 1.2 g de agarosa en polvo se mezclan con 100 mL de 0.5 x TBE en una mufla para microondas. Microondas durante 2 minutos hasta que la agarosa se disuelva completamente. Enfríe la mezcla de agarosa a 55 ° C.
- Añadir 2 μl de una solución de bromuro de etidio (10 mg/mL) a la mezcla de agarosa y mezclar suavemente. Vierta la mezcla de agarosa en una bandeja de gel a 5-7 mm, luego añadir la comb(s) en lugar. Deje que se solidifique (por lo menos 30 minutos) y retire con cuidado la comb(s).
- Las muestras de la carga y ejecuta un gel de agarosa:
- Coloque el gel y bandeja en la célula de electroforesis. Llenar la célula de electroforesis con 0.5 x TBE hasta cubre el gel.
- Cuidadosamente la carga 2 μl de 100 bp ADN ladder (véase Tabla de materiales) en el otro carril del gel como marcador de tamaño molecular. Mezcla de tinte/muestra de carga (5 μl de mezcla de productos PCR con 1 μl 6 x tinte de carga) en los carriles adicionales.
- Encienda la fuente de alimentación. Correr el gel durante 25 minutos a 100 V.
- Retirar el gel de la célula de electroforesis. Visualizar los fragmentos de ADN bajo luz de un sistema de proyección de imagen UV.
- Preparar un gel de agarosa al 1.2%:
5. secuencia de ADN
- Purificar productos PCR utilizando un kit comercial y secuencia comercialmente o con un secuenciador automático (véase Tabla de materiales).
- Enviar secuencias de nucleótidos en el servidor de NCBI BLAST para comparar la consulta nucleótidos los nucleótidos bases de datos10. Después de que los resultados se muestran, realizar alineaciones de la secuencia e identificar la mutación esperada.
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Representative Results
Electroforesis en agarosa de dos pacientes y bandas reveló individuales saludables uno de los tamaños previstos, incluyendo un producto PCR bp 454 para el exón 4 del gene de TTR (figura 1).
Figura 1 . Electroforesis en gel con PCR amplificaron el gen TTR. Normal: un individuo sano. Carril M: 100 escalera de DNA de bp como marcador de tamaño molecular. Carriles 1:246 bp (exón 1). Carril 2:292 bp (exón 2). Carriles 3:299 bp (exón 3). Carril 4:454 bp (exón 4). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La secuencia directa divulgó una substitución del nucleótido T para G en el exón 4 del gene de TTR. Esta mutación sin sentido dio lugar a una sustitución de alanina-serina en el aminoácido posición 97 en pacientes. Cromatogramas de la secuencia de estos dos pacientes y una persona sana se demuestran en la figura 2.
Figura 2 . Secuenciación de un individuo sano (tipo salvaje) y un heterocigoto G > mutación de T en el exón 4 del gene de TTR (pacientes 1 y 2). Las flechas en los cromatogramas de paciente 1 y 2 del paciente indican dos picos superpuestos de diferentes colores. Los dos picos son aproximadamente la mitad de la altura del resto de la secuencia. Esta substitución heterozigótica (G/T) se confirma en la secuencia inversa, (C/A). Partes de esta se han modificado de una figura en nuestra anterior publicación5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hay dos pasos críticos en el protocolo. En primer lugar, para tener el suficiente número de glóbulos blancos, un espécimen de hemodiluted debe ser evitada11. En segundo lugar, el uso de adecuados primers PCR es fundamental para obtener resultados fiables12. Utilizamos la herramienta de la web de cartilla-BLAST para diseñar los primers4,13; debe cubrir un mínimo de 40 pares de bases en cada lado de los cuatro exones TTR. También ejecutamos BLAST en NCBI para comprobar la especificidad de los cebadores.
Se hacen algunas modificaciones en el paso de extracción de ADN. En primer lugar, se reduce la cantidad de las tres soluciones utilizadas. Esta modificación también produce una cantidad suficiente de ADN y ahorra soluciones. En segundo lugar, isopropanol o 100% etanol son las dos alternativas que se utiliza para la precipitación de ADN14,15. Comparado con el etanol, isopropanol precipita ADN a temperatura ambiente, lo que reduce la coprecipitación de sal15. Además, tiempos más largos de la precipitación en las temperaturas del congelador pueden ser necesaria para maximizar el rendimiento de ADN15. En tercer lugar, el tampón TE se sustituye por agua bidestilada (ddH2O) Resuspender el ADN. La preparación de ADN en este protocolo se utiliza para la posterior PCR para que protección en almacenamiento de información no es una preocupación. También, EDTA inhibe la actividad enzimática cuando el ADN se utiliza en la polimerización en cadena15.
Para un menor costo y menos tiempo de espera, secuenciación y purificación de productos PCR fueron realizadas por una empresa de biotecnología. La limitación en este protocolo debe ser los métodos manuales, incluyendo pasos de centrifugación repetida. Un sistema de extracción automática de ácidos nucleicos ha sido desarrollado y es beneficioso para reducir el tiempo de trabajo y aumentar la reproducibilidad y la calidad de los resultados16.
En todos los pacientes con depósitos de amiloide, se debe realizar diagnóstico diferencial de la amiloidosis sistémica. Espectrometría de masas (MS) puede ser aplicado para determinar la subunidad de la proteína y clasificar la enfermedad como amiloidosis de cadena ligera de inmunoglobulina (AL, con una supervivencia media inferior a ATTR)17 o amiloidosis18, no 19, que las pruebas genéticas posteriores, especialmente para aquellos pacientes para quienes ATTR hereditario no fue sospechado inicialmente19.
Análisis proteómico basados en espectrometría de masa se ha utilizado para la selección y tipificación de TTR amyloidosis19,20,21. Sin embargo, MS solo no es suficiente para excluir una mutación patogénica en pacientes con ATTR hereditario22, porque algunas de las variantes TTR anormales o raras pueden no ser separadas por análisis basado en MS de depósitos amiloideos muestras de suero o muestra en un laboratorio clínico19,23. Además, errores de muestreo posibles y la distribución desigual de amiloide fibrillas pueden conducir a un falso negativo tejido biopsias5,21,24, dificultando el análisis proteómico aguas abajo. Por lo tanto, pruebas de ADN, la prueba más fiable para ATTR, debe realizarse en la mayoría de los casos de ATR5,22, así como en la neuropatía periférica axonal progresiva idiopática o distal neuropatía de fibra pequeña dolorosa simétrica 25 , 26.
Otros factores que pueden relacionadas con variación fenotípica para ATTR y direcciones futuras de la guía incluyen variantes de modificación poste-de translación (PTMs) presentes en el suero y ATTR fibrilla composición27,28. Aunque ATTR hereditaria es una enfermedad monogenética, ha observado una considerable variabilidad incluso entre aquellos con la misma mutación o dentro de la misma familia de27. Heterogeneidad genética solo es incapaz de aclarar el inicio diversos y patología de los atributos28. Por lo tanto, ambos genética y proteómica métodos deben ser utilizados cuando se tienen en cuenta estos factores.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Deseamos agradecer a Miss Shin-Fun Wu por su ayuda en los experimentos. Este estudio fue apoyado por una beca del programa de investigación médica Chang Gung (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373) y 100-4470A3 de la IRB, 104-2462A3, Taiwán.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA-treated tubes | BD | ||
| DNA Extraction Kit | Stratagen | 200600 | |
| NanoDrop ND2000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | Kimtech Science Kimwipes | |
| AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase kit | Applied Biosystems | 4398823 | |
| TTR gene intronic primers | Exon1 | F: 5’-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3’ | |
| Exon1 | R: 5’-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3’ | ||
| Exon2 | F: 5’-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3’ | ||
| Exon2 | R: 5’-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3’ | ||
| Exon3 | F: 5’-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3’ | ||
| Exon3 | R: 5’-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3’ | ||
| Exon4 | F: 5’-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3’ | ||
| Exon4 | R: 5’-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3’ | ||
| thermocycler | Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| electrophoresis cell | ADVANCE | Mupid-2plus | |
| DNA ladder | Protech | PT-M1-100 | |
| dye | BioLabs | B7021 | |
| AlphaImager EC | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| automatic sequencer | Applied Biosystems | 3730xl DNA Analyzer |
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