Summary
여기, 우리는 예를 들어 Ala97Ser, 대만, 가장 일반적인 발병 변이 사용 하 여 유전 transthyretin amyloidosis의 진단에 대 한 점 돌연변이의 존재를 확인 하는 프로토콜 제시.
Abstract
유전자 검사 이며 유전 transthyretin에 대 한 가장 신뢰할 수 있는 테스트 관련 amyloidosis transthyretin amyloidosis (ATTR)의 대부분의 경우에서 수행 되어야 합니다. 속성은 유형이 다른 고기;와 희귀 하지만 치명적인 질병 따라서, 진단 때로는 지연 됩니다. 관심과 ATTR 신흥 치료의 초기 발현에 광범위 한 인식 증가 함께 transthyretin (TTR) 유전자를 포함 하 여 적절 한 진단 연구, 테스트, 종류를 확인 하 고 ATTR의 변종 따라서 예 후를 개선 하기 위해 근본적인. 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 방법으로 유전자 분석 TTR 점 돌연변이의 존재를 훨씬 더 신속 하 게 확인 하 고 남쪽 오 점 등 기존 방법 보다 안전. 여기, 우리가 ATTR Ala97Ser 돌연변이, 대만에서 가장 일반적인 발병 돌연변이의 유전자 확인을 보여 줍니다. 프로토콜 구성 4 가지 주요 단계: 수집 전 혈 견본, DNA 추출, PCR와 모든 4 개의 TTR exons의 유전자 분석 및 DNA 연속.
Introduction
Transthyretin (TTR) amyloidosis (ATTR) 조직의 유전 amyloidosis1, 가장 일반적인 형태 이며 transthyretin (TTR) 유전자2상 염색체 지배적 상속 된 돌연변이 의해 발생할 수 있습니다. TTR 돌연변이 tetrameric 단백질 구조를 불안정 하 게 하 고 녹말 체 소2로 재어셈블합니다 단위체로 그것의 분리 이어질. 100 amyloidogenic TTR 변이 보고 전세계1되었습니다. 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 방법으로 유전자 분석 TTR 점 돌연변이의 존재를 확인 하 고 피하는 남쪽 오 점3에 비해 방사성 레이블이 프로브의 처리를 포함 하는 장점이 있다. PCR은 현대 과학4에 수많은 분야에 적용 된, 쉽게, 저렴 한, 빠르고 신뢰할 수 있는 기술입니다.
이 진보 및 치명적인 질병의 조기 진단의 phenotypic이 주어진 도전 이다. 관심과 ATTR 신흥 치료5의 초기 발현에 광범위 한 인식 증가, TTR 유전자 검사를 포함 한 적절 한 진단 연구는 따라서 비판적으로 예 후를 개선 하기 위해 근본적인. 또한, 다른 변이 특성의 다른 penetrance, 발병 연령, 진행, 질병의 심각도, 메디아 생존, 간 이식, 또는 TTR 안정기2,6, 효능의 패턴에 연관 된 고 가변도 신경학 적인 참여의 유전 상담7,,89에 대 한 큰 의미를가지고. 게다가, 매우 정확한 유전자 검사는 두 가지 유형의 속성을 구분 하는 유일한 도구: 유전 (돌연변이) 및 야생 유형 (비 돌연변이 형태, 치 조직의 amyloidosis, 특수)7. 그것은 치료2넓게 변화 하기 때문에, 속성의 종류를 확인 하는 것이 필수적입니다. 그러므로, TTR 유전자 검사의 stepwise 프로토콜을 설명 하는 증가 필요는 없다.
돌연변이 검출 하는 분자 접근 방식은 예를 들어 Ala97Ser, 대만, 가장 일반적인 발병 변이 사용 하 여 그림 것입니다. 수정 DNA 추출 단계에서 사용 되는 세 가지 솔루션의 양을 줄일 하 고 충분 한 양의 DNA 생성 합니다. 이 프로토콜에서 모든 4 개의 TTR exons 지역 5' 상류 3' 하류, 발기인, introns를 포함 하 여 동안, 분석 되었다 그리고 번역 되지 않은 영역 (UTR) 시퀀싱 하지 했다.
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Protocol
임상 실험실 개선 개정 (CLIA) 1988 년의 기관 검토 위원회의 장 궁 메모 리얼 병원에서 승인 하는 규정 요구 사항에 따라 실시 되었다 테스트 실험실에서 수행 하 고 대학 (라이센스 번호 100-4470A3 및 104-2462A3). 동의 모든 환자에서 얻은 했다.
1. 혈액 표본 수집
- 상업적으로 사용할 수 있는 치료를 EDTA 튜브로 전체 혈액을 수집 합니다. 부드럽게 혼합 하 고 처리까지 4 ° C에서 혈액 샘플을 저장 합니다.
2. 말 초 혈액에서 DNA 추출
DNA 추출 키트를 사용 하 여 게놈 DNA 추출 ( 재료의 표참조).
- 4.0 mL 혈액 샘플을 솔루션 1의 10 mL를 추가 합니다. 10 분 동안 얼음에 샘플을 품 어.
- 4 ° c.에서 5 분 동안 2000 x g에서 샘플을 원심 제거 하 고 상쾌한을 신중 하 게 삭제. 솔루션 1의 3 mL에 펠 릿을 resuspend.
- 다시 4 ° C에서 5 분 동안 2000 x g에서 샘플을 원심 하 고 상쾌한 삭제. 솔루션 2의 3 mL에 펠 릿을 resuspend.
- 100 µ g/mL의 최종 농도 고 잘 섞어 나 재고 솔루션 (225 mg/mL)의 10 µ L를 추가 합니다. 37 ° C에서 밤새 품 어.
- 10 분 추가 0.8 mL 솔루션 3의 샘플에 대 한 얼음에 튜브를 진정 하 고 반전 3-5 번. 5 분 동안 얼음에 샘플을 놓습니다.
- 4 ° c.에 15 분 동안 3000 x g에서 샘플을 원심 조심 스럽게 15 mL 원뿔 메 마른 분리기 관에는 상쾌한 전송.
- 20 µ g/mL의 최종 농도를 RNase 재고 솔루션 (10 mg/mL)의 6 µ L를 추가 합니다. 15 분 동안 37 ° C에서 품 어.
- 부드럽게 여러 번 DNA를 침전을 반전 하 여 이소프로필 알코올과 혼합의 2.5 mL를 철저 하 게 추가 하는 방법 (흰색, 부드러운 재질의 가닥 형성). 큰 구멍 피펫으로 사용 하 여 새로운 1.5 mL 원심 분리기 튜브 DNA 비례적 전송.
- 4 ° c.에 3 분 동안 12000 x g에서 원심 분리기 상쾌한 신중 하 게 삭제 합니다. 씻어 DNA 펠 릿의 70% 에탄올 500 µ L을 추가 하 여.
- 1 분 동안 12000 x g에서 centrifuge 고 상쾌한 삭제. 공기 건조 실 온에서 DNA 펠 릿. DdH2O의 100 µ L을 추가 하 고 65 ° C 15 분 DNA resuspend에서 품 어.
3. 게놈 DNA 정량화
분 광 광도 계를 사용 하 여 ( 재료의 표참조) 게놈 DNA의 품질과 수량을 감지 하.
- 분 광 광도 계 컴퓨터에 연결 된 컴퓨터에 로그인 합니다. 소프트웨어를 엽니다.
- 분 광 광도 계 기계 초기화:
- 분 광 광도 계 소프트웨어에 "핵 산"을 클릭 합니다.
- 일회용 종이 지우기와 순화 된 물 받침대를 청소.
- 분 광 광도 계 빈:
- 주 춧 대에 순화 된 물의 2 µ L을 로드 합니다.
- 분 광 광도 계의 윗부분을 낮출 하 고 "빈" 보정을 클릭 합니다.
- 완료 되 면 위 팔을 들어올린 닦기와 받침대를 건조.
- 측정 샘플:
- 샘플 종류에 "DNA 50"을 클릭 합니다.
- 주 춧 대에 DNA 샘플의 2 µ L을 로드 합니다.
- 낮은 팔 위쪽을 A260/A280 비율과 샘플의 농도 측정 하기 위해 "측정"을 클릭 합니다.
- 지우기와 순화 된 물으로 각 실행 사이 받침대를 청소.
- "Print Screen" 데이터 수집을 클릭 합니다.
4. 유전자 돌연변이 분석
PCR4대상 DNA를 증폭. 25 µ L 반응에서 PCR을 수행 DNA 중 합 효소를 사용 하 여 혼합 키트 ( 재료의 표참조). 표 1 에서 intronic 뇌관 TTR 유전자를 보여준다.
| 유전자 | 뇌관 순서 |
| Exon1 | F: 5'-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3' R: 5'-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3' |
| Exon2 | F: 5'-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3' R: 5'-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3' |
| Exon3 | F: 5'-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3' R: 5'-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3' |
| Exon4 | F: 5'-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3' R: 5'-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3' |
표 1입니다. TTR 유전자 intronic 뇌관. (NCBI 참고 순서: NC_000018.10)
- 0.2 mL PCR 튜브를 표 2 에 시 약을 추가 합니다.
| 구성 요소 | 볼륨 (µ L) | 최종 농도 |
| 10 x 버퍼 | 2.5 | 1 x |
| MgCl2 (25 mM) | 1.5 | 1.5 m m |
| 360 GC 증강 | 1 | - |
| 360 DNA 중 합 효소 | 0.2 | 2 U/반응 |
| dNTP 믹스 (각 25 mM) | 2 | 2 m m |
| 뇌관 F (10 µ M) | 1 | 0.4 Μ M |
| 뇌관 R (10 µ M) | 1 | 0.4 Μ M |
| DNA (100 ng) | 2 | |
| PCR-등급 물 | 13.8 | - |
| 총 볼륨 | 25 | - |
표 2입니다. PCR 반응 조건입니다.
- 부드럽게 혼합 하 고 짧게 튜브의 하단에 모든 구성 요소를 수집 하는 벤치탑 원심 분리기에 원심. 튜브는 thermocycler 장소.
- 30 사이클에 대 한 PCR을 수행 합니다. 각 주기 30 변성 단계 이루어져 94 ° C, 30에 대 한 단련 하는 뇌관에서 s 58 ° C, 및 45에 대 한 중 합 효소 확장에서 s s 72 ° C에서 ( 표 3참조).
| 단계 | 온도 (° C) | 시간 | 사이클 |
| 초기 변성 | 95 | 5 분 | 1 |
| DNA 변성 단계 | 94 | 30 s | 30 사이클 |
| 뇌관 어 닐 링의 단계 | 58 | 30 s | 30 사이클 |
| 중 합 효소 확장 단계 | 72 | 45 s | 30 사이클 |
| 포스트 신장 단계 | 72 | 10 분 | 1 |
| PCR의 끝 자전거 | 4 | 무기한 |
표 3입니다. 사이클링 증폭 PCR 제품을 위한 조건.
- 젤 전기 이동 법으로 시각화 하 여 PCR 제품을 확인:
- 1.2 %agarose 젤 준비:
- 0.5의 100 mL의 agarose 분말 1.2 g 혼합 microwavable 플라스 크에 x TBE. 전자 레인지는 agarose는 완전히 용 해 될 때까지 2 분. 55 ° c agarose 혼합물을 진정
- Ethidium 평범한 사람 해결책 (10mg/mL)의 2 µ L agarose 혼합물에 추가 하 고 부드럽게 혼합. 약 5-7 m m 젤 트레이에 agarose 혼합물을 부 어 다음 장소에는 comb(s)를 추가 합니다. (적어도 30 분)을 공고히 하 고 comb(s)를 조심 스럽게 제거를 하실 수 있습니다.
- 샘플을 로드 하 고 실행 하는 agarose 젤:
- 트레이 젤 전기 이동 법 셀에 놓습니다. 0.5 전기 셀 채우기 x TBE 젤 커버까지.
- 신중 하 게 로드 2 µ L 100 bp DNA의 분자 크기 표식으로 젤의 한 차선에 ( 재료의 표참조) 사다리. 부하 염료/샘플 혼합 (5 µ L PCR 제품 믹스의 로드 염료 x 1 µ L 6와) 추가 차선에.
- 전원 공급 장치를 켭니다. 100 V에서 25 분 젤을 실행 합니다.
- 젤 전기 이동 법 셀에서 제거 합니다. 자외선 이미징 시스템에서에서 DNA 파편을 시각화.
- 1.2 %agarose 젤 준비:
5. DNA 시퀀싱
- 상업 키트를 사용 하 여 PCR 제품을 정화 하 고 상업적으로 또는 자동 시퀀서는 시퀀싱 ( 재료의 표참조).
- 뉴클레오티드 시퀀스 뉴클레오티드 데이터베이스10뉴클레오티드 쿼리를 비교 하는 NCBI 폭발 서버에 제출 합니다. 결과 표시 후 시퀀스 정렬을 수행 하 고 예상된 돌연변이 식별 합니다.
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Representative Results
Agarose 젤 전기 이동 법 두 환자와 exon TTR 유전자 (그림 1)의 4에 대 한 454 bp의 PCR 제품을 포함 한 예상된 크기에의 한 건강 한 개별 계시 밴드.
그림 1 . 젤 전기 이동 법 묘사 PCR 증폭 TTR 유전자. 일반: 건강 한 개인입니다. 분자 크기 표식으로 레인 m: 100 bp DNA 사다리. 레인 1: 246 bp (exon 1) 레인 2: 292 bp (exon 2) 레인 3: 299 bp (exon 3) 레인 4: 454 bp (exon 4) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
직접 시퀀싱 exon TTR 유전자의 4 G에 대 한 뉴클레오티드 T 대체 공개. 이 missense 돌연변이 결과 아미노산 위치 97 두 환자에서 알라닌 떠들고 대체. 이 두 환자와 건강 한 개인의 시퀀스 chromatograms는 그림 2에서 설명 했다.
그림 2 . 건강 한 개인 (야생-타입)와 heterozygous G의 시퀀싱 > TTR 유전자 (환자 1과 2)의 exon 4에서에서 T 돌연변이. 환자 1, 환자 2 chromatograms에 화살표는 서로 다른 색상의 두 개의 겹치는 봉우리를 나타냅니다. 두 봉우리는 시퀀스의 나머지의 절반 정도 높이. 이 heterozygous 대체 (G/T) 역방향 시퀀스 (개)에서 확인 된다. 이 그림의 부분 우리의 이전 게시5에 그림에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
프로토콜 내에서 두 가지 중요 한 단계가 있습니다. 첫째, 백혈구 세포의 충분 한 수를 위해, hemodiluted 견본 피할된11이어야 한다. 둘째, 적절 한 PCR 뇌관의 사용이 이다 신뢰할 수 있는 결과12를 기본. 디자인 뇌관4,13; 뇌관 폭발 웹 도구를 사용 하는 우리 4 개의 TTR exons의 각 측에 40의 기본적인 쌍의 최소 처리 되어야 합니다. 우리는 또한 뇌관의 특이성을 확인 하는 NCBI에 폭발을 실행 합니다.
일부 수정 DNA 추출 단계에서 만들어집니다. 첫째, 사용 하는 세 가지 솔루션의 양을 줄일 수 있습니다. 이 수정 또한 충분 한 양의 DNA 생성 하 고 솔루션을 저장 합니다. 둘째, 소 프로 파 놀 또는 100% 에탄올 DNA14,15의 강 수에 사용 하는 두 가지 대안이 있습니다. 에탄올에 비해, 소 프로 파 놀 실내 온도에, 소금15의 coprecipitation를 감소 시키는 DNA를 침전 시킨다. 또한, 냉장고 온도에서 더 이상 강 수 시간15DNA 수율 최대화 하기 위해 필요할 수 있습니다. 셋째, 두 배 증류수 (ddH2O) resuspend DNA를 테 버퍼 대체 됩니다. 이 프로토콜에서 DNA 준비 저장소에 보호 관심사 아니다 그래서 후속 PCR에 사용 됩니다. 또한, EDTA DNA PCR15에서 사용 될 때 효소 활동을 억제 합니다.
저렴 한 비용에 대 한 및 더 적은 대기 시간, PCR 제품 정화 및 시퀀싱과 생물 공학 회사에 의해 수행 했다. 이 프로토콜에 제한 반복된 원심 분리 단계를 포함 하 여 수동 방법 이어야 한다. 자동화 된 핵 산 추출 시스템 개발 되었습니다 하 고 작업 시간을 단축 하 고 결과16의 품질과 재현성을 증가에 도움이 됩니다.
모든 환자에서 아 밀 로이드 예금, 조직의 amyloidoses의 차동 진단 수행 되어야 한다. 질량 분석 (MS)는 단백질 소 단위 면역 글로불린 빛 사슬 amyloidosis (알, 메디아 생존 ATTR 열 등)으로 질병을 분류를 적용할 수 있습니다17 또는 transthyretin 관련 amyloidosis18, 19, 하류 유전자 테스트를 직접는 누구를 위해 유전 ATTR 하지 처음에 의심 되었다19그 환자를 위해 특히 할 수 없습니다.
질량 분석 기반 proteomic 분석은 검사 및 TTR amyloidosis19,,2021의 입력에 대 한 사용 되었습니다. 그럼에도 불구 하 고, MS 혼자 충분 하지 않습니다 유전 ATTR22, 환자에 병원 성 돌연변이 제외 불규칙 하거나 드문 TTR 변종 중 일부 수 있습니다 하지으로 구분 녹말 체 예금의 MS 기반 분석에서 표본 또는 혈 청 샘플 때문에 임상 실험실19,23. 또한, 가능한 샘플링 오류 및 아 밀 로이드 소는 거짓 부정적인 조직 생 검5,21,24, 이어질 수 있습니다의 고르지 못한 배급 다운스트림 proteomic 분석 어려운 만드는. 따라서, DNA 검사, ATTR에 대 한 가장 신뢰할 수 있는 테스트 수행 해야 속성5,22, 대부분의 경우에서 뿐만 아니라 어떤 특 발성 진보적인 axonal 주변 신경 병 또는 원심 대칭 고통 스러운 작은 섬유 신경 병 25 , 26.
와 수 있습니다 다른 요인 관련 속성에 대 한 phenotypic 변이 가이드 미래 방향 포스트 번역 상 수정 (PTMs) 변종 혈 청 및 ATTR fibril 구성27,28에 포함. 유전 ATTR monogenetic 질병 이지만, 그 같은 돌연변이 또는 동일한 제품군 중 에서도 상당한 가변성 관찰 되었습니다27. 유전이 성분 혼자 다양 한 발병 및 ATTR28의 병 리를 명료 하 게 실패 합니다. 따라서, 둘 다 유전자 때 이러한 요인을 고려 proteomics 방법을 활용 한다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리가 실험에서 그녀의 도움에 대 한 미스 신 재미 우 감사 하고자 합니다. 이 연구는 장 공 의학 연구 프로그램 (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373)와 IRB 100-4470A3, 104-2462A3, 대만에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA-treated tubes | BD | ||
| DNA Extraction Kit | Stratagen | 200600 | |
| NanoDrop ND2000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | Kimtech Science Kimwipes | |
| AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase kit | Applied Biosystems | 4398823 | |
| TTR gene intronic primers | Exon1 | F: 5’-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3’ | |
| Exon1 | R: 5’-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3’ | ||
| Exon2 | F: 5’-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3’ | ||
| Exon2 | R: 5’-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3’ | ||
| Exon3 | F: 5’-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3’ | ||
| Exon3 | R: 5’-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3’ | ||
| Exon4 | F: 5’-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3’ | ||
| Exon4 | R: 5’-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3’ | ||
| thermocycler | Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| electrophoresis cell | ADVANCE | Mupid-2plus | |
| DNA ladder | Protech | PT-M1-100 | |
| dye | BioLabs | B7021 | |
| AlphaImager EC | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| automatic sequencer | Applied Biosystems | 3730xl DNA Analyzer |
References
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