Summary

L'analisi genetica di ereditario Transthyretin Ala97Ser relative amiloidosi

Published: June 09, 2018
doi:

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per confermare la presenza di mutazione di punto per la diagnosi di amiloidosi ereditaria da transtiretina, utilizzando Ala97Ser, la mutazione più comune endemica in Taiwan, come esempio.

Abstract

Test genetici è la prova più affidabile per transthyretin ereditario legate amiloidosi e deve essere eseguita nella maggior parte dei casi di amiloidosi da transtiretina (ATTR). ATTR è una malattia rara ma fatale con fenotipi eterogenei; di conseguenza, la diagnosi a volte è in ritardo. Con l’aumento dell’attenzione e riconoscimento più ampio su manifestazioni iniziali di ATTR, nonché trattamenti emergenti, studi diagnostici appropriati, tra cui la transtiretina (TTR) genetica test, per confermare i tipi e varianti di ATTR sono pertanto fondamentale per migliorare la prognosi. Analisi genetiche con metodi di reazione a catena (PCR) polimerasi confermano la presenza di mutazioni puntiformi TTR molto più rapidamente e più sicuro rispetto ai metodi tradizionali come la macchia del sud. Qui, dimostriamo la conferma genetica della mutazione ATTR Ala97Ser, la mutazione più comune endemica in Taiwan. Il protocollo comprende quattro fasi principali: raccolta dei campioni di sangue intero, estrazione del DNA, l’analisi genetica di tutti e quattro gli essoni TTR con PCR e sequenziamento del DNA.

Introduction

Amiloidosi da transtiretina (TTR) (ATTR) sono la forma più comune di amiloidosi sistemica1e possono essere causato da una mutazione dominante ereditata autosomal in gene transtiretina (TTR)2. Mutazioni di TTR destabilizzano la struttura della proteina tetramerica e portano alla sua dissociazione nei monomeri che ricompone in fibrille amiloidi2. Più di 100 mutazioni di TTR amiloidogeniche sono stati segnalati in tutto il mondo1. Analisi genetiche con metodi di reazione a catena (PCR) polimerasi confermano la presenza di mutazione di punto TTR e presentano vantaggi tra cui evitare la manipolazione della sonda marcata radioattivamente a rispetto del sud della macchia3. PCR è una tecnica veloce, facile, economico e affidabile che è stata applicata in numerosi campi in scienze moderne4.

La diagnosi precoce di questa malattia progressiva e fatale è impegnativa, data la sua eterogeneità fenotipica. Con l’aumento dell’attenzione e riconoscimento più ampio su manifestazioni iniziali di ATTR, nonché i trattamenti emergenti5, studi diagnostici adatti tra cui test genetico TTR sono quindi criticamente fondamentali per migliorare la prognosi. Inoltre, mutazioni differenti sono associate con diversa penetranza del tratto, l’età di esordio, i modelli di progressione, sopravvivenza mediana, la gravità della malattia e l’efficacia di trapianto del fegato, o TTR stabilizzatori2,6, e gradi variabili di coinvolgimento neurologico e cardiologico, che hanno grandi implicazioni per la consulenza genetica7,8,9. Inoltre, un accurato test genetico è l’unico strumento che differenzia i due tipi distinti di ATTR: ereditaria (mutante) e wild type (forma non mutante, amiloidosi sistemica senile, SSA)7. È indispensabile per confermare i tipi di ATTR, perché le terapie variano ampiamente2. Di conseguenza, c’è una crescente necessità di descrivere il protocollo graduale del test genetico TTR.

L’approccio molecolare per rilevare la mutazione sarà illustrato utilizzando Ala97Ser, la mutazione più comune endemica in Taiwan, come esempio. Modifiche in fase di estrazione di DNA ridurre la quantità delle tre soluzioni utilizzate e produce una quantità sufficiente di DNA. In questo protocollo, tutti e quattro gli essoni TTR sono stati analizzati, mentre le regioni tra cui 5′ a Monte, 3′ a valle, promotori, introni, e regioni non tradotte (UTR) non sono state sequenziate.

Protocol

I test eseguiti in laboratorio è stato effettuato in conformità con i requisiti della clinica laboratorio miglioramento emendamenti (CLIA) del 1988, il regolamento, approvato dal Consiglio di revisione istituzionale di Chang Gung Memorial Hospital e Università (licenza n. 100 – 4470A3 e 104-2462A3). Consenso informato è stato ottenuto da tutti i pazienti. 1. raccolta di campioni di sangue Prelevare il sangue intero in provette EDTA-trattati commercialmente disponibili. Mescolare …

Representative Results

Elettroforesi del gel dell’agarosi di due pazienti e un sano singole bande ha rivelato delle dimensioni previste, tra cui un prodotto PCR di bp 454 per esone 4 del gene TTR (Figura 1). Figura 1 . Elettroforesi del gel raffigurante PCR amplificato gene TTR. Normale: un in…

Discussion

Ci sono due passaggi critici all’interno del protocollo. In primo luogo, al fine di avere un numero sufficiente di cellule bianche del sangue, un esemplare di hemodiluted dovrebbe essere evitato11. In secondo luogo, l’uso appropriati degli iniettori di PCR è fondamentale per ottenere risultati affidabili12. Abbiamo utilizzato lo strumento web di Primer-BLAST per progettare il primer4,13; un minimo di 40 paia di bas…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Desideriamo ringraziare Miss Shin-Fun Wu per il suo aiuto negli esperimenti. Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione dal programma di ricerca medica di Chang Gung (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373) e IRB 100-4470A3, 104-2462A3, Taiwan.

Materials

EDTA-treated tubes BD
DNA Extraction Kit Stratagen 200600
NanoDrop ND2000 spectrophotometer  Thermo Fisher Scientific NanoDrop 2000
Delicate Task Wipers Kimberly-Clark Kimtech Science Kimwipes
AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase kit Applied Biosystems 4398823
TTR gene intronic primers  Exon1 F: 5’-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3’
Exon1 R: 5’-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3’
Exon2 F: 5’-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3’
Exon2 R: 5’-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3’
Exon3 F: 5’-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3’
Exon3 R: 5’-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3’
Exon4 F: 5’-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3’
Exon4 R: 5’-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3’
thermocycler Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700
electrophoresis cell  ADVANCE Mupid-2plus
DNA ladder Protech PT-M1-100
dye BioLabs B7021
AlphaImager EC Alpha Innotech AlphaImager EC
automatic sequencer  Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer

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Cite This Article
Hsu, H., Liao, M., Hsu, J., Lee, Y., Ro, L. Genetic Analysis of Hereditary Transthyretin Ala97Ser Related Amyloidosis. J. Vis. Exp. (136), e57743, doi:10.3791/57743 (2018).

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