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Medicine

L'analisi genetica di ereditario Transthyretin Ala97Ser relative amiloidosi

doi: 10.3791/57743 Published: June 9, 2018

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per confermare la presenza di mutazione di punto per la diagnosi di amiloidosi ereditaria da transtiretina, utilizzando Ala97Ser, la mutazione più comune endemica in Taiwan, come esempio.

Abstract

Test genetici è la prova più affidabile per transthyretin ereditario legate amiloidosi e deve essere eseguita nella maggior parte dei casi di amiloidosi da transtiretina (ATTR). ATTR è una malattia rara ma fatale con fenotipi eterogenei; di conseguenza, la diagnosi a volte è in ritardo. Con l'aumento dell'attenzione e riconoscimento più ampio su manifestazioni iniziali di ATTR, nonché trattamenti emergenti, studi diagnostici appropriati, tra cui la transtiretina (TTR) genetica test, per confermare i tipi e varianti di ATTR sono pertanto fondamentale per migliorare la prognosi. Analisi genetiche con metodi di reazione a catena (PCR) polimerasi confermano la presenza di mutazioni puntiformi TTR molto più rapidamente e più sicuro rispetto ai metodi tradizionali come la macchia del sud. Qui, dimostriamo la conferma genetica della mutazione ATTR Ala97Ser, la mutazione più comune endemica in Taiwan. Il protocollo comprende quattro fasi principali: raccolta dei campioni di sangue intero, estrazione del DNA, l'analisi genetica di tutti e quattro gli essoni TTR con PCR e sequenziamento del DNA.

Introduction

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Amiloidosi da transtiretina (TTR) (ATTR) sono la forma più comune di amiloidosi sistemica1e possono essere causato da una mutazione dominante ereditata autosomal in gene transtiretina (TTR)2. Mutazioni di TTR destabilizzano la struttura della proteina tetramerica e portano alla sua dissociazione nei monomeri che ricompone in fibrille amiloidi2. Più di 100 mutazioni di TTR amiloidogeniche sono stati segnalati in tutto il mondo1. Analisi genetiche con metodi di reazione a catena (PCR) polimerasi confermano la presenza di mutazione di punto TTR e presentano vantaggi tra cui evitare la manipolazione della sonda marcata radioattivamente a rispetto del sud della macchia3. PCR è una tecnica veloce, facile, economico e affidabile che è stata applicata in numerosi campi in scienze moderne4.

La diagnosi precoce di questa malattia progressiva e fatale è impegnativa, data la sua eterogeneità fenotipica. Con l'aumento dell'attenzione e riconoscimento più ampio su manifestazioni iniziali di ATTR, nonché i trattamenti emergenti5, studi diagnostici adatti tra cui test genetico TTR sono quindi criticamente fondamentali per migliorare la prognosi. Inoltre, mutazioni differenti sono associate con diversa penetranza del tratto, l'età di esordio, i modelli di progressione, sopravvivenza mediana, la gravità della malattia e l'efficacia di trapianto del fegato, o TTR stabilizzatori2,6, e gradi variabili di coinvolgimento neurologico e cardiologico, che hanno grandi implicazioni per la consulenza genetica7,8,9. Inoltre, un accurato test genetico è l'unico strumento che differenzia i due tipi distinti di ATTR: ereditaria (mutante) e wild type (forma non mutante, amiloidosi sistemica senile, SSA)7. È indispensabile per confermare i tipi di ATTR, perché le terapie variano ampiamente2. Di conseguenza, c'è una crescente necessità di descrivere il protocollo graduale del test genetico TTR.

L'approccio molecolare per rilevare la mutazione sarà illustrato utilizzando Ala97Ser, la mutazione più comune endemica in Taiwan, come esempio. Modifiche in fase di estrazione di DNA ridurre la quantità delle tre soluzioni utilizzate e produce una quantità sufficiente di DNA. In questo protocollo, tutti e quattro gli essoni TTR sono stati analizzati, mentre le regioni tra cui 5' a Monte, 3' a valle, promotori, introni, e regioni non tradotte (UTR) non sono state sequenziate.

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Protocol

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I test eseguiti in laboratorio è stato effettuato in conformità con i requisiti della clinica laboratorio miglioramento emendamenti (CLIA) del 1988, il regolamento, approvato dal Consiglio di revisione istituzionale di Chang Gung Memorial Hospital e Università (licenza n. 100 - 4470A3 e 104-2462A3). Consenso informato è stato ottenuto da tutti i pazienti.

1. raccolta di campioni di sangue

  1. Prelevare il sangue intero in provette EDTA-trattati commercialmente disponibili. Mescolare delicatamente e conservare il campione di sangue a 4 ° C fino al trattamento.

2. DNA estrazione da sangue periferico

Utilizzare un Kit di estrazione del DNA per l'estrazione del DNA genomico (Vedi Tabella materiali).

  1. Aggiungere 10 mL di soluzione 1 per il campione di sangue di 4,0 mL. Incubare il campione in ghiaccio per 10 min.
  2. Centrifugare il campione a 2.000 x g per 5 min a 4 ° C. Rimuovere e gettare il surnatante con attenzione. Risospendere il pellet in 3 mL di soluzione 1.
  3. Centrifugare il campione a 2.000 x g per 5 min a 4 ° C nuovo ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet in 3 mL di soluzione 2.
  4. Aggiungere 10 µ l di soluzione madre pronase (225 mg/mL) per ottenere una concentrazione finale di 100 µ g/mL e mescolare bene. Incubare a 37 ° C durante la notte.
  5. Raffreddare il tubo sul ghiaccio per 10 min Aggiungi 0,8 mL di soluzione 3 al campione e capovolgere 3 - 5 volte. Collocare il campione in ghiaccio per 5 min.
  6. Centrifugare il campione a 3.000 x g per 15 min a 4 ° C. Trasferire con cautela il surnatante in una provetta sterile conica per centrifuga 15 mL.
  7. 6 µ l di soluzione madre di RNAsi (10 mg/mL) per ottenere una concentrazione finale di 20 µ g/mL. Incubare a 37 ° C per 15 min.
  8. Aggiungere 2,5 mL di alcool isopropilico e mescolare accuratamente capovolgendo più volte per precipitare il DNA (fili di materiale bianco e fioccoso formerà). Utilizzando una pipetta di grosso calibro, trasferire il precipitante di DNA in una nuova provetta da centrifuga da 1,5 mL.
  9. Centrifugare a 12.000 x g per 3 min a 4 ° C. Gettare il surnatante con attenzione. Pellet di DNA lavare aggiungendo 500 µ l di etanolo al 70%.
  10. Centrifugare a 12.000 x g per 1 min ed eliminare il surnatante. Asciugare all'aria a pellet di DNA a temperatura ambiente. Aggiungere 100 µ l di ddH2O e incubare a 65 ° C per 15 min risospendere il DNA.

3. quantificazione del DNA genomica

Utilizzare uno spettrofotometro (Vedi Tabella materiali) per rilevare la quantità e la qualità del DNA genomic.

  1. Accedere al computer collegato alla macchina spettrofotometro. Aprire il software.
  2. Inizializzare la macchina spettrofotometro:
    1. Fare clic su "Acido nucleico" sul software spettrofotometro.
    2. Pulire il piedistallo con una salvietta USA e getta carta e acqua purificata.
  3. Lo spettrofotometro in bianco:
    1. Caricare 2 µ l di acqua purificata sul piedistallo.
    2. Abbassare il braccio superiore dello spettrofotometro e fare clic su "Vuoto" per calibrarlo.
    3. Quando è fatto, sollevare il braccio superiore e asciugare il piedistallo con un panno.
  4. Misura il campione:
    1. Fare clic su tipo di campione "DNA-50".
    2. Caricare 2 µ l di campione di DNA sul piedistallo.
    3. Abbassare il braccio superiore e fare clic su "Misura" per misurare il rapporto A260/A280 e la concentrazione del campione.
    4. Pulire il piedistallo tra ogni esecuzione con un panno e acqua purificata.
  5. Fare clic su "Print Screen" per raccogliere i dati.

4. genetiche analisi delle mutazioni

Amplificare il DNA dell'obiettivo con la PCR4. Eseguire PCR in una reazione a 25 µ l miscela utilizzando una DNA polimerasi kit (Vedi Tabella materiali). La tabella 1 Mostra il gene TTR intronic primer.

gene Sequenza più superelegante
Exon1 F: 5'-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3'
R: 5'-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3'
Exon2 F: 5'-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3'
R: 5'-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3'
Exon3 F: 5'-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3'
R: 5'-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3'
Exon4 F: 5'-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3'
R: 5'-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3'

Tabella 1. Gli iniettori introniche del gene TTR. (Sequenza di Riferimento NCBI: NC_000018.10)

  1. Aggiungere i reagenti nella tabella 2 in una provetta PCR 0,2 mL.
Componenti Volume (µ l) Concentrazione finale
10 x Buffer 2.5 1 x
MgCl2 (25 mM) 1.5 1,5 mM
360 GC Enhancer 1 -
Polimerasi del DNA 360 0.2 2 U/reazione
dNTP Mix (25 mM) 2 2 mM ogni
Primer F (10 µM) 1 0,4 ΜM
Primer R (10 µM) 1 0,4 ΜM
DNA (100 ng) 2
Acqua di PCR-grado 13,8 -
Volume totale 25 -

Tabella 2. Condizioni di reazione di PCR.

  1. Mescolare delicatamente e centrifugare brevemente su una centrifuga da banco per raccogliere tutti i componenti alla parte inferiore del tubo. Posizionare il tubo in un termociclatore.
  2. Eseguire PCR per 30 cicli. Ogni ciclo è costituito da una fase di denaturazione per 30 s a 94 ° C, primer di ricottura per 30 s a 58 ° C e l'estensione della polimerasi per 45 s a 72 ° C (Vedi tabella 3).
Passo Temperatura (° C) Tempo ciclo
Denaturazione iniziale 95 5 min 1
Denaturazione del DNA 94 30 s 30 cicli
Punto di ricottura di primer 58 30 s 30 cicli
Passaggio di estensione della polimerasi 72 45 s 30 cicli
Passo di allungamento post 72 10 min 1
Fine della PCR in bicicletta 4 Tempo indeterminato

Tabella 3. Ciclismo condizioni per amplificare i prodotti di PCR.

  1. Convalidare il prodotto PCR visualizzando con elettroforesi su gel:
    1. Preparare un gel di agarosio all'1.2%:
      1. Mescolare 1,2 g di agarosio in polvere con 100 mL di 0.5 x TBE in un fiasco di microwavable. Forno a microonde per 2 minuti fino a quando l'agarosio è completamente sciolto. Raffreddare la miscela di agarosio a 55 ° C.
      2. Aggiungere 2 µ l di una soluzione di bromuro di etidio (10 mg/mL) alla miscela di agarosio e mescolare delicatamente. Versare il composto di agarosio in un cassetto del gel per circa 5-7 mm, quindi aggiungere il comb(s) luogo. Lasciare solidificare (almeno 30 min) e rimuovere con attenzione comb(s).
    2. Campioni di caricare ed eseguire un gel dell'agarosi:
      1. Inserire la cella di elettroforesi su gel e vassoio. Riempire la cella di elettroforesi con 0,5 x TBE fino a quando il gel è coperto.
      2. Accuratamente caricare 2 µ l di una 100 bp DNA ladder (Vedi Tabella materiali) in una corsia del gel come marcatore molecolare. Miscela di tintura/campione di carico (5 µ l di miscela del prodotto di PCR con 1 µ l 6 x caricamento tintura) nelle corsie aggiuntive.
      3. Accendere l'alimentazione. Esegua il gel per 25 min a 100 V.
      4. Rimuovere il gel dalla cella elettroforesi. Visualizzare i frammenti di DNA sotto UV luce in un sistema di imaging.

5. sequenziamento

  1. Purificare i prodotti di PCR utilizzando un kit commerciale e commercialmente o con un sequenziatore automatico di sequenza (Vedi Tabella materiali).
  2. Inviare sequenze nucleotidiche al server NCBI BLAST per confrontare la query del nucleotide al nucleotide database10. Dopo i risultati vengono visualizzati, eseguire allineamenti di sequenza e identificare la mutazione prevista.

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Representative Results

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Elettroforesi del gel dell'agarosi di due pazienti e un sano singole bande ha rivelato delle dimensioni previste, tra cui un prodotto PCR di bp 454 per esone 4 del gene TTR (Figura 1).

Figure 1
Figura 1 . Elettroforesi del gel raffigurante PCR amplificato gene TTR. Normale: un individuo sano. 100 m: Lane scaletta del DNA di bp come marcatore molecolare. Corsie 1:246 bp (esone 1). Corsie 2:292 bp (esone 2). Corsie 3:299 bp (esone 3). Corsia 4:454 bp (esone 4). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L'ordinamento diretto ha rilevato una sostituzione di T del nucleotide per G in essone 4 del gene di TTR. Questa mutazione di senso sbagliato ha provocato una sostituzione dell'alanina-di-serina a aminoacido posizione 97 in due pazienti. Cromatogrammi di sequenza di questi due pazienti e un individuo sano sono illustrati nella Figura 2.

Figure 2
Figura 2 . Sequenziamento di un individuo sano (selvaggio-tipo) e un G eterozigotico > mutazione di T in essone 4 del gene TTR (pazienti 1 e 2). Frecce nei cromatogrammi 1 paziente e paziente 2 indicano due picchi sovrapposti di diversi colori. Le due cime sono circa metà dell'altezza del resto della sequenza. Questa sostituzione eterozigotica, (G/T) è confermata nella sequenza inversa, (c/a). Parti di questa figura sono stati modificati da una figura nella nostra precedente pubblicazione5. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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Ci sono due passaggi critici all'interno del protocollo. In primo luogo, al fine di avere un numero sufficiente di cellule bianche del sangue, un esemplare di hemodiluted dovrebbe essere evitato11. In secondo luogo, l'uso appropriati degli iniettori di PCR è fondamentale per ottenere risultati affidabili12. Abbiamo utilizzato lo strumento web di Primer-BLAST per progettare il primer4,13; un minimo di 40 paia di basi su ogni lato degli esoni TTR quattro dovrebbe essere coperti. Abbiamo anche eseguito BLAST su NCBI per verificare la specificità dei primer.

Vengono apportate alcune modifiche in fase di estrazione del DNA. In primo luogo, l'importo delle tre soluzioni usate sono ridotti. Questa modifica, inoltre, produce una quantità sufficiente di DNA e Salva soluzioni. In secondo luogo, isopropanolo o 100% etanolo sono le due alternative impiegate nella precipitazione del DNA14,15. Confrontato con etanolo, isopropanolo precipita il DNA a temperatura ambiente, che riduce coprecipitazione di sale15. Inoltre, tempi di precipitazione più lunghi a temperature congelatore è necessario per massimizzare il rendimento del DNA15. In terzo luogo, il buffer di TE viene sostituita per doppia acqua distillata (ddH2O) Risospendere il DNA. La preparazione di DNA in questo protocollo viene utilizzata per successive PCR quindi protezione il deposito non è una preoccupazione. Inoltre, EDTA inibisce l'attività enzimatica quando il DNA è usato in PCR15.

Per un costo inferiore e meno tempi di attesa, sequenziamento e purificazione del prodotto PCR sono stati effettuati da una società di biotecnologia. La limitazione in questo protocollo dovrebbe essere i metodi manuali, compresi i passaggi ripetuti di centrifugazione. Un sistema di estrazione dell'acido nucleico automatizzato è stato sviluppato ed è utile per ridurre il tempo di lavoro e aumentando la riproducibilità e la qualità dei risultati16.

In tutti i pazienti con i giacimenti di amiloide, diagnosi differenziale delle amiloidosi sistemica deve essere eseguita. Spettrometria di massa (MS) può essere applicata per determinare la subunità proteica e classificare la malattia come amyloidosis di luce-catena dell'immunoglobulina (AL, con una sopravvivenza mediana inferiore a ATTR)17 o amiloidosi correlata alla transtiretina18, 19, che dirigono i test genetici a valle non può fare, soprattutto per quei pazienti per i quali ATTR ereditario non era inizialmente sospettato il19.

Analisi proteomica basati sulla spettrometria di massa sono stato utilizzato per lo screening e la tipizzazione di TTR amiloidosi19,20,21. Tuttavia, MS da sola non è sufficiente ad escludere una mutazione patogena in pazienti con ereditario ATTR22, perché alcune delle varianti atipiche o rare TTR non possono essere separate dall'analisi MS-basata di depositi di amiloide campioni campione o del siero in un laboratorio clinico19,23. Inoltre, gli errori di campionamento possibile e la distribuzione diseguale di amiloide fibrille possono condurre a un falso negativo tessuto biopsie5,21,24, rendendo l'analisi proteomica a valle difficile. Di conseguenza, test del DNA, il test più affidabile per ATTR, deve essere eseguita nella maggior parte dei casi di ATTR5,22, così come in qualsiasi neuropatia periferica assonale progressiva idiopatica o neuropatia della piccolo-fibra simmetrica distale dolorosa 25 , 26.

Altri fattori che possono legate alla variazione fenotipica per ATTR e direzioni future guida includono varianti di modificazione post-traduzionale (PTM) presenti nel siero e ATTR fibrilla composizione27,28. Anche se ATTR ereditaria è una malattia monogenetica, considerevole variabilità anche tra quelli con la stessa mutazione o all'interno della stessa famiglia è stata osservata27. Eterogeneità genetica da sola non riesce a delucidare l'inizio diversificata e patologia della ATTR28. Di conseguenza, entrambi di genetica e proteomica metodi dovrebbero essere utilizzati quando questi fattori sono presi in considerazione.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Desideriamo ringraziare Miss Shin-Fun Wu per il suo aiuto negli esperimenti. Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione dal programma di ricerca medica di Chang Gung (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373) e IRB 100-4470A3, 104-2462A3, Taiwan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EDTA-treated tubes BD
DNA Extraction Kit Stratagen 200600
NanoDrop ND2000 spectrophotometer  Thermo Fisher Scientific NanoDrop 2000
Delicate Task Wipers Kimberly-Clark Kimtech Science Kimwipes
AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase kit Applied Biosystems 4398823
TTR gene intronic primers  Exon1 F: 5’-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3’
Exon1 R: 5’-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3’
Exon2 F: 5’-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3’
Exon2 R: 5’-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3’
Exon3 F: 5’-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3’
Exon3 R: 5’-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3’
Exon4 F: 5’-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3’
Exon4 R: 5’-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3’
thermocycler Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700
electrophoresis cell  ADVANCE Mupid-2plus
DNA ladder Protech PT-M1-100
dye BioLabs B7021
AlphaImager EC Alpha Innotech AlphaImager EC
automatic sequencer  Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer

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References

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Hsu, H. C., Liao, M. F., Hsu, J. L., Lee, Y. L., Ro, L. S. Genetic Analysis of Hereditary Transthyretin Ala97Ser Related Amyloidosis. J. Vis. Exp. (136), e57743, doi:10.3791/57743 (2018).More

Hsu, H. C., Liao, M. F., Hsu, J. L., Lee, Y. L., Ro, L. S. Genetic Analysis of Hereditary Transthyretin Ala97Ser Related Amyloidosis. J. Vis. Exp. (136), e57743, doi:10.3791/57743 (2018).

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