Kalıtsal Transthyretin Ala97Ser genetik analizini amiloidoz ile ilgili
Summary
Burada, Ala97Ser, en yaygın endemik mutasyon Tayvan, örnek olarak kullanarak nokta mutasyon kalıtsal transthyretin amiloidoz tanısı için varlığını doğrulamak için bir protokol mevcut.
Abstract
Genetik test kalıtsal transthyretin en güvenilir sınava amiloidoz ilgili ve transthyretin Amiloidoz (ATTR) çoğu durumda yapılmalıdır olduğunu. ATTR heterojen fenotipleri ile nadir ama ölümcül bir hastalıktır; Bu nedenle, tanı bazen gecikir. İle artan ilgi ve erken belirtileri ATTR yanı sıra gelişmekte olan tedaviler üzerinde daha geniş tanıma, transthyretin (TTR) genetik de dahil olmak üzere uygun Diagnostik araştırmalar, türleri onaylamak için test etmek ve bu nedenle ATTR türevleri vardır prognoz geliştirmek için temel. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemleri ile Genetik analizlerle onaylamak TTR nokta mutasyonlar varlığı çok daha hızlı ve daha güvenli Güney leke gibi geleneksel yöntemleri. Burada, biz ATTR Ala97Ser mutasyon, Tayvan en yaygın endemik mutasyon genetik onay göstermek. Protokol dört ana adımları kapsar: toplama tüm kan örneklerini, DNA ekstraksiyon, PCR ile tüm 4 TTR ekzonlar Genetik Analizi ve DNA sıralamanın.
Introduction
Transthyretin (TTR) Amiloidoz (ATTR) kalıtsal sistemik amiloidoz1en sık görülen ve transthyretin (TTR) gen2‘ deki bir otozomal baskın devralınan mutasyon neden olabilir. TTR mutasyonlar tetrameric protein yapısı istikrarsızlaştırmak ve amiloid liflerinde2‘ ye yeniden monomerleri içine onun ayrılma için kurşun. 100’den fazla amyloidogenic TTR mutasyonlar bildirilen dünya çapında1olmuştur. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemleri ile Genetik analizlerle TTR nokta mutasyon varlığını doğrulamak ve radioactively etiketli probları southern blot3ile karşılaştırıldığında kullanımı kaçınarak dahil olmak üzere avantajlara sahip. PCR çok sayıda modern Bilimler4alanlara uygulanan hızlı, kolay, ucuz ve güvenilir bir tekniktir.
Bu ilerici ve ölümcül hastalığın erken tanı onun fenotipik heterojenite verilen zordur. Dikkat ve daha geniş tanıma ATTR yanı sıra gelişmekte olan tedaviler5erken belirtileri üzerinde artan ile TTR genetik testi de dahil olmak üzere uygun Diagnostik araştırmalar bu nedenle prognoz geliştirmek için kritik olan araçlardır. Ayrıca, farklı mutasyon özelliği farklı alellerle, yasi, ilerleme, hastalık şiddeti, medyan sağkalım karaciğer nakli veya TTR stabilizatörleri2,6, etkinliği kalıpları ile ilişkili olan ve genetik danışmanlık7,8,9büyük etkiler değişken derece tutulumu, nörolojik ve kardiyoloji. Ayrıca, son derece hassas bir genetik test ATTR iki farklı tür ayıran tek araçtır: kalıtsal (mutant) ve vahşi türü (mutant olmayan form, Senil sistemik amiloidoz, SSA)7. Terapiler yaygın olarak2farklı olduğundan ATTR, türleri onaylamak için zorunludur. Bu nedenle, TTR genetik test kademeli protokolü tanımlamak için artan bir zorunluluk yoktur.
Ala97Ser, Tayvan, en yaygın endemik mutasyon örnek olarak kullanarak mutasyon tespit etmek için moleküler yaklaşım ayr›ca gösterilecektir. Değişiklikleri DNA ekstraksiyon adımda kullanılan üç çözümleri azaltmak ve DNA yeterli miktarda verir. Bu iletişim kuralı, bölgeler de dahil olmak üzere 5′ akıntıya karşı 3′ aşağı, organizatör, intron, tüm 4 TTR ekzonlar analiz edildi ve çevrilmeyen bölgeler (UTR) değil sıralı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokol içinde iki önemli adım vardır. İlk olarak, beyaz kan hücreleri yeterli sayıda için hemodiluted numune kaçınılmalıdır11olmalıdır. İkinci olarak, uygun PCR astar kullanımı güvenilir sonuçlar12elde etmek için esastır. Primer-BLAST web aracı astar4,13tasarlamak için kullanılır; en az 40 baz çifti 4 TTR ekzonlar her tarafında örtülmelidir. Ayrıca astar özgüllük kontrol etmek iç…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bayan Shin-eğlenceli Wu deneylerde yardımları için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışmada Chang Gung tıbbi araştırma programı (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373) ve IRB 100-4470A3, 104-2462A3, Tayvan bir hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| EDTA-treated tubes | BD | ||
| DNA Extraction Kit | Stratagen | 200600 | |
| NanoDrop ND2000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | Kimtech Science Kimwipes | |
| AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase kit | Applied Biosystems | 4398823 | |
| TTR gene intronic primers | Exon1 | F: 5’-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3’ | |
| Exon1 | R: 5’-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3’ | ||
| Exon2 | F: 5’-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3’ | ||
| Exon2 | R: 5’-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3’ | ||
| Exon3 | F: 5’-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3’ | ||
| Exon3 | R: 5’-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3’ | ||
| Exon4 | F: 5’-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3’ | ||
| Exon4 | R: 5’-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3’ | ||
| thermocycler | Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| electrophoresis cell | ADVANCE | Mupid-2plus | |
| DNA ladder | Protech | PT-M1-100 | |
| dye | BioLabs | B7021 | |
| AlphaImager EC | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| automatic sequencer | Applied Biosystems | 3730xl DNA Analyzer |
References
- Planté-Bordeneuve, V., Said, G. Familial amyloid polyneuropathy. The Lancet Neurology. 10 (12), 1086-1097 (2011).
- Planté-Bordeneuve, V., et al. Long-term treatment of transthyretin familial amyloid polyneuropathy with tafamidis: a clinical and neurophysiological study. Journal of Neurology. 264 (2), 268-276 (2017).
- Nichols, W. C., Benson, M. D. Hereditary amyloidosis: detection of variant prealbumin genes by restriction enzyme analysis of amplified genomic DNA sequences. Clinical Genetics. 37 (1), 44-53 (1990).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Hsu, H. C., et al. Phenotypic expressions of hereditary Transthyretin Ala97Ser related Amyloidosis (ATTR) in Taiwanese. BMC Neurology. 17 (1), 178 (2017).
- Barroso, F. A., et al. Long-term safety and efficacy of tafamidis for the treatment of hereditary transthyretin amyloid polyneuropathy: results up to 6 years. Amyloid. 24 (3), 194-204 (2017).
- Rapezzi, C., et al. Disease profile and differential diagnosis of hereditary transthyretin-related amyloidosis with exclusively cardiac phenotype: an Italian perspective. European Heart Journal. 34 (7), 520-528 (2013).
- Mariani, L. L., et al. Genotype-phenotype correlation and course of transthyretin familial amyloid polyneuropathies in France. Annals of Neurology. 78 (6), 901-916 (2015).
- Hammarström, P., Jiang, X., Hurshman, A. R., Powers, E. T., Kelly, J. W. Sequence-dependent denaturation energetics: A major determinant in amyloid disease diversity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 16427-16432 (2002).
- Johnson, M., Zaretskaya, I., Raytselis, Y., Merezhuk, Y., McGinnis, S., Madden, T. L. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 36, 5-9 (2008).
- Fox, A. J., et al. Next generation sequencing for the detection of actionable mutations in solid and liquid tumors. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Date, Y., Nakazato, M., Kangawa, K., Shirieda, K., Fujimoto, T., Matsukura, S. Detection of three transthyretin gene mutations in familial amyloidotic polyneuropathy by analysis of DNA extracted from formalin-fixed and paraffin-embedded tissues. Journal of the Neurological Sciences. 150 (2), 143-148 (1997).
- Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning: A laboratory manual. , (2012).
- Buckingham, L., Flaws, M. L. . Molecular diagnostics: Fundamentals, methods, and clinical applications. , (2012).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and The Present. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009, (2009).
- Rapezzi, C., et al. Systemic cardiac amyloidoses: disease profiles and clinical courses of the 3 main types. Circulation. 120 (13), 1203-1212 (2009).
- Gertz, M. A., Dispenzieri, A., Sher, T. Pathophysiology and treatment of cardiac amyloidosis. Nature Reviews Cardiology. 12 (2), 91-102 (2015).
- Vrana, J. A., et al. Clinical diagnosis and typing of systemic amyloidosis in subcutaneous fat aspirates by mass spectrometry-based proteomics. Haematologica. 99 (7), 1239-1247 (2014).
- Nakamura, M., et al. Identification of a new transthyretin variant (Ile49) in familial amyloidotic polyneuropathy using electrospray ionization mass spectrometry and nonisotopic RNase cleavage assay. Human Heredity. 49 (4), 186-189 (1999).
- Ueda, M., Ando, Y. Recent advances in transthyretin amyloidosis therapy. Translational Neurodegeneration. 3, 19 (2014).
- Brown, E. E., et al. Genetic testing improves identification of transthyretin amyloid (ATTR) subtype in cardiac amyloidosis. Amyloid. 24 (2), 92-95 (2017).
- Tasaki, M., et al. Rapid detection of wild-type and mutated transthyretins. Annals of Clinical Biochemistry. 53 (4), 508-510 (2015).
- Plante-Bordeneuve, V., et al. Diagnostic pitfalls in sporadic transthyretin familial amyloid polyneuropathy (TTR-FAP). Neurology. 69 (7), 693-698 (2007).
- Hsu, J. L., et al. A prospective, observational study of patients with uncommon distal symmetric painful small-fiber neuropathy. PLoS ONE. 12 (9), 0183948 (2017).
- Salvi, F., Pastorelli, F., Plasmati, R., Bartolomei, I., Dall’Osso, D., Rapezzi, C. Genotypic and phenotypic correlation in an Italian population of hereditary amyloidosis TTR-related (HA-TTR): Clinical and neurophysiological aids to diagnosis and some reflections on misdiagnosis. Amyloid. 19, 58-60 (2012).
- Suhr, O. B., Lundgren, E., Westermark, P. One mutation, two distinct disease variants: Unravelling the impact of transthyretin amyloid fibril composition. Journal of Internal Medicine. 281 (4), 337-347 (2017).
- Vilà-Rico, M., et al. Quantitative analysis of post-translational modifications in human serum transthyretin associated with familial amyloidotic polyneuropathy by targeted LC-MS and intact protein MS. Journal of Proteomics. 127, 234-246 (2015).
