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Biochemistry

एक्स-रे क्रि और भौतिक तकनीकों द्वारा Immunoglobulin गुना के साथ नच का लक्षण वर्णन

Published: July 5, 2018 doi: 10.3791/57750
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1, 1,2,3
1Program in Molecular Medicine, The Hospital for Sick Children Research Institute, 2Department of Biochemistry, University of Toronto, 3Department of Immunology, University of Toronto
* These authors contributed equally

Summary

हम immunoglobulin के साथ नच के भौतिक और संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए दृष्टिकोण वर्तमान में interferometry, इज़ोटेर्माल अनुमापन calorimetry, और एक्स-रे क्रि द्वारा गुना ।

Abstract

कोशिकाओं की सतह पर नच संकेत, आसंजन और परिवहन सहित सेलुलर समारोह में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । ल्यूकोसाइट्स पर, इन नच अधिकारी immunoglobulin (़) परतों के कई और प्रतिरक्षा मांयता और विनियमन के लिए केंद्रीय रहे हैं । यहां, हम मानव बी सेल रिसेप्टर CD22 के extracellular डोमेन के डिजाइन, अभिव्यक्ति और भौतिक लक्षण वर्णन के लिए एक मंच मौजूद है । हम प्रस्ताव है कि इन दृष्टिकोण मोटे तौर पर स्तनधारी ग्लाइकोप्रोटीन ectodomains के लक्षण वर्णन के लिए लागू कर रहे है ़ डोमेन युक्त । दो सस्पेंशन मानव भ्रूण गुर्दा (HEK) सेल लाइनों, HEK293F और HEK293S, क्रमशः नच पोस कॉंप्लेक्स और उच्च mannose glycans व्यक्त करने के लिए उपयोग किया जाता है । ये रिकॉमबिनेंट नच अलग glycoforms के साथ ligand बाइंडिंग पर glycan साइज और बंदिशों के असर की जांच की अनुमति देते हैं । हम जैविक रूप से प्रासंगिक लाइगैंडों और चिकित्सीय एंटीबॉडी उंमीदवारों के लिए बाध्यकारी ग्लाइकोप्रोटीन के कैनेटीक्स और ऊष्मा का अध्ययन करने के लिए प्रोटोकॉल पर चर्चा करते हैं । रिकॉमबिनेंट HEK293S कोशिकाओं में उत्पादित नच glycan एकरूपता, कम लचीलापन और endoglycosidase एच उपचार के लिए संवेदनशीलता के कारण क्रिस्टलीकरण के लिए उत्तरदायी हैं. हम चरण निर्धारण और ligand बाध्यकारी, क्रमशः के विश्लेषण के लिए भारी परमाणुओं और छोटे अणुओं के साथ ग्लाइकोप्रोटीन क्रिस्टल भिगोने के लिए तरीके वर्तमान । प्रायोगिक प्रोटोकॉल यहां चर्चा की स्तनधारी नच के लक्षण वर्णन के लिए अपने समारोह में अंतर्दृष्टि दे और चिकित्सा की कार्रवाई के तंत्र की जांच के लिए वादा पकड़ो ।

Introduction

भूतल प्रोटीन सेलुलर समारोह में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । अपने extracellular डोमेन के माध्यम से, इन झिल्ली प्रोटीन सेल सेल बातचीत, आसंजन, परिवहन और संकेत1,2मिलाना कर सकते हैं । इन प्रोटीन का extracellular स्थानीयकरण उन्हें कैंसर और स्व-प्रतिरक्षित रोगों सहित रोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के उपचार के लिए चिकित्सकीय के विकास के लिए आकर्षक लक्ष्य बनाता है3,4,5 , 6 , 7. मानव झिल्ली प्रोटीन ectodomains की सबसे आम परतों में से एक immunoglobulin की तरह (़) गुना है, जो सात या अधिक β-दो β-चादरें8,9में व्यवस्थित किस्में द्वारा बनाई है । आमतौर पर, ़-युक्त नच बहु-डोमेन संरचनाएं ़ डोमेन के साथ कर रहे है क्रमिक रूप से झिल्ली प्रोटीन10के extracellular भाग पर व्यवस्था की । इन सेल-सरफेस प्रोटीन्स, खासतौर पर एन और ओ-लिंक्ड glycosylation के पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों में उनके रेगुलेशन, फोल्डिंग, स्राव और फंक्शन11में आवश्यक भूमिकाएँ निभाते हुए दिखाया गया है । अपने कार्य के बारे में हमारी समझ में सुधार करने के लिए और बेहतर चिकित्सकीय डिजाइन कि उंहें लक्षित कर सकते हैं, तकनीक की आवश्यकता है कि उनके विस्तृत आणविक लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देते हैं । यहां, हम तकनीकों का एक संयोजन है कि भौतिक (interferometry (BLI) और इज़ोटेर्माल अनुमापन calorimetry (आईटीसी)) और संरचनात्मक (एक्स-रे क्रि) ़-युक्त के extracellular डोमेन के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति पेश झिल्ली नच, अकेले और जटिल में उनके जैविक रूप से प्रासंगिक लाइगैंडों और चिकित्सीय अणुओं (चित्रा 1) के साथ ।

N-लिंक्ड glycosylation स्तनधारी प्रोटीन पर सबसे आम पोस्ट-अनुवाद संशोधनों में से एक है, और endoplasmic जालिका और Golgi12,13के भीतर प्रोटीन परिपक्वता के दौरान होता है । कोशिका लाइनों, जैसे मानव भ्रूण गुर्दे (HEK) २९३ कोशिकाओं, ग्लाइकोसिलेटेड स्तनधारी प्रोटीन की बड़ी मात्रा के रिकॉमबिनेंट अभिव्यक्ति के लिए विकसित किया गया है14,15. यह सेल लाइन एक निलंबन स्वरूप है, जो अनुयाई सेल लाइनों की तुलना में बड़ी मात्रा में प्रोटीन उत्पादन को स्केलिंग की आसानी के लिए अनुमति देता में विकसित किया गया है । यहां, हम दो HEK293 सेल लाइनों का उपयोग: HEK293F और HEK293 Gnt मैं-/ (HEK293S), जो एन के अभाव से अलग-acetylglucosaminyl ट्रांस्फ़्रेज़ मैं (Gnt) उत्तरार्द्ध में । बारी में, जटिल glycans का उत्पादन (के रूप में HEK293F में देखा) संभव नहीं है और इसके बजाय उच्च mannose-प्रकार glycans (मुख्य रूप से आदमी5GlcNAc2) N पर स्थित glycan साइटों18,19,20 . समानांतर में इन दो सेल लाइनों का उपयोग जैविक समारोह और चिकित्सीय लक्ष्यीकरण पर glycan आकार और जटिलता के प्रभाव का अध्ययन करने की अनुमति देता है । दरअसल, HEK293F कोशिकाओं में उत्पादित नच बड़े, HEK293S कोशिकाओं में उत्पादित एक ही ग्लाइकोप्रोटीन की तुलना में अधिक जटिल glycans होगा. HEK293S कोशिकाओं में उत्पादित नच अधिक क्रिस्टलीकरण के लिए उत्तरदायी हैं, क्योंकि कम रासायनिक और उनके एन से जुड़े glycans के गठन विविधता. आगे सघन सुधार करने के लिए, HEK293S (लेकिन नहीं HEK293F) कोशिकाओं में उत्पादित नच एंजाइम endoglycosidase एच (इंडो एच) के साथ इलाज किया जा सकता है, जो उच्च mannose के दरार में परिणाम glycans ऐसी है कि केवल एक एकल N-acetylglucosamine (GlcNAc) moiety प्रत्येक N-लिंक्ड glycosylation साइट21,22पर बनी हुई है । अंय विधियों का भी उपयोग किया जा सकता है सीमित करने के लिए N-glycan संसाधन, जैसे glycosyltransferase अवरोधकों के अतिरिक्त के रूप में ग्लाइकोप्रोटीन अभिव्यक्ति, kifunensine सहित23। वैकल्पिक दृष्टिकोण देशी नच की अभिव्यक्ति शामिल (HEK293F कोशिकाओं में) एंजाइमी deglycosylation का उपयोग कर पेप्टाइड एन-glycosidase एफ (PNGaseF) के बाद. हालांकि, PNGaseF के साथ deglycosylation को देशी परिस्थितियों के तहत कम प्रभावी और कुछ प्रोटीन में एकत्रीकरण बढ़ दिखाया गया है; मामलों में जब प्रोटीन उपचार के बाद घुलनशील रहता है, यह अपनी क्रिस्टलीकरण के लिए हानिकारक हो सकता है जो एसपारटिक एसिड24, के लिए asparagine अवशेषों के विछुटकारे के कारण इसकी सतह पर नकारात्मक शुल्क प्राप्त । भविष्यवाणी की n-glycosylation साइटों को भी, alanine या glutamine अवशेषों के लिए सबसे अधिक बार किया जा सकता है, इन साइटों पर n-लिंक्ड glycosylation को रोकने के लिए और उच्च सजातीयता के ग्लाइकोप्रोटीन नमूने उत्पंन करने के लिए । वैकल्पिक रूप से, नच अन्य eukaryotic सेल संस्कृतियों में उत्पादित किया जा सकता है, जिसमें खमीर, कीट, और संयंत्र प्रणालियों, या अन्य स्तनधारी सेल लाइनों जैसे चीनी हंसटर डिम्बग्रंथि (चो) कोशिकाओं16,17.

कई स्तनधारी अभिव्यक्ति वैक्टर, pHLsec सहित, सेल मीडियम25में रिकॉमबिनेंट ग्लाइकोप्रोटीन ectodomains के स्राव के लिए अनुमति देते हैं । HEK293 कोशिकाओं से नच का स्राव सेल lysis की आवश्यकता के बिना तेजी से और आसान शुद्धिकरण के लिए अनुमति देता है । शुद्धि टैग के अलावा (जैसे, अपने-टैग, Strep-टैग, झंडा-टैग, Myc-टैग, हा-टैग) को N या C लक्ष्य के टर्मिनस को ग्लाइकोप्रोटीन एक एकल कदम संबध क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्धि की अनुमति देता है । बाद में, आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी के लिए एक monodisperse नमूना उपज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है भौतिक और संरचनात्मक लक्षण वर्णन ।

उपयुक्त परिस्थितियों में एक अत्यंत शुद्ध और सजातीय ग्लाइकोप्रोटीन नमूना अच्छी तरह से diffracting क्रिस्टल में परिणाम कर सकते हैं । एक बार एक पूर्ण एक्स-रे विवर्तन डेटासेट ऐसे क्रिस्टल से प्राप्त किया गया है, प्रारंभिक चरणों ग्लाइकोप्रोटीन के इलेक्ट्रॉन घनत्व की गणना करने के लिए निर्धारित करने की आवश्यकता है. प्रोटीन डाटा बैंक (PDB), चरणबद्ध के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया विधि में संरचनाओं की बढ़ती संख्या के लिए धंयवाद अब तक आणविक प्रतिस्थापन (श्री), जो एक संबंधित प्रोटीन संरचना का उपयोग करता है प्रारंभिक चरणों26प्राप्त करने के लिए बन गया है । हालांकि, जब श्री चरण समस्या को हल करने के लिए विफल रहता है, के रूप में कभी-कभार बहु-आइजी डोमेन के लिए मामला रहा है नच27,28,29, वैकल्पिक तरीकों की आवश्यकता है । इस अनुच्छेद में, हम विस्तार एक विधि के लिए भारी परमाणुओं (हा) के साथ चरणबद्ध है, जो CD22 ectodomain28की संरचना को सुलझाने के लिए आवश्यक था के लिए क्रिस्टल सोख । चरणबद्ध के लिए सही हा की पहचान एक चलने प्रक्रिया है कि एक दिया क्रिस्टल जाली में ग्लाइकोप्रोटीन में हा जेट, उपलब्ध परमाणु पर निर्भर करता है, और सघन समाधान30,31। वैकल्पिक रूप से, cysteine और methionine अवशेषों में प्राकृतिक सल्फर परमाणुओं ग्लाइकोप्रोटीन में अन्य परमाणुओं के लिए एक उच्च पर्याप्त अनुपात में मौजूद है, तो चरणबद्ध के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और अगर एक्स-रे विवर्तन डेटा उच्च पर्याप्त अतिरेक३२के साथ एकत्र किया जा सकता है, ३३.

झिल्ली के जैविक समारोह नच अक्सर प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन या प्रोटीन-ligand इंटरैक्शन से मध्यस्थता करते हैं, जैसे कार्बोहाइड्रेट के साथ. ligand क्रिस्टल जाली में ग्लाइकोप्रोटीन बंधन साइट के समाधान से फैलाना करने के लिए काफी छोटा है, जब बेहतर ligand मान्यता को समझने के लिए एक ग्लाइकोप्रोटीन-ligand सह-क्रिस्टल संरचना प्राप्त करने के लिए, प्रयोगों को भिगोने के लिए सफल हो सकते हैं.

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल सिंथेटिक चिकित्सीय लाइगैंडों३४,३५ और एंटीबॉडी चिकित्सीय के साथ३६,३७सतह नच की बातचीत को समझने के लिए भी प्रासंगिक हैं । जब संरचनात्मक जानकारी के साथ संयुक्त, बाध्यकारी कैनेटीक्स और ऊष्मा को समझने और कार्रवाई के अपने तंत्र में सुधार करने के लिए शक्तिशाली हो सकता है । एक तकनीक है कि एक ग्लाइकोप्रोटीन के लिए बाध्यकारी चिकित्सीय एंटीबॉडी के काइनेटिक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है BLI३८,३९है । BLI एक मैटीरियल ligand के साथ एक बाध्यकारी साथी के साथ संघ और पृथक्करण कैनेटीक्स को मापने के लिए, अंततः एक संतुलन पृथक्करण स्थिर (KD) का निर्धारण करने के लिए उपयोग करता है । BLI एक आकर्षक दृष्टिकोण है क्योंकि नच की छोटी मात्रा (< 100 µ g) की आवश्यकता होती है, प्रयोग का समय तेज (~ 10-15 min प्रति रन) होता है, और यह स्वचालित हो सकता है । आईटीसी नच व बाइंडिंग पार्टनर्स४०,४१,४२,४३के बीच समानताएं की पढ़ाई के लिए भी उपयोगी है । जबकि आईटीसी अधिक समय और प्रतिएजेंट है, बहुमूल्य जानकारी बातचीत की ऊष्मा के बारे में प्राप्त किया जा सकता है (ΔG, ΔH, ΔS, और stoichiometry) । आईटीसी कमजोर बातचीत का अध्ययन करने के लिए भी बहुत उपयोगी है जो प्रायः सतह नच के क्षणिक बाइंडिंग से लाइगैंडों से जुड़े होते हैं. इसके अलावा, इन तकनीकों विभिंन निर्माणों के बंधन का मूल्यांकन करने के लिए संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है और अलग N-लिंक अलग सेल लाइनों में ग्लाइकोप्रोटीन व्यक्त से प्राप्त glycoforms के प्रभाव का आकलन । HEK293F में उत्पादित नच के साथ BLI और आईटीसी का प्रदर्शन, HEK293S और इंडो एच के साथ इलाज जैविक गतिविधि और चिकित्सीय सगाई में glycans की भूमिका का एक में गहराई से दृश्य प्रदान कर सकते हैं.

हम सफलतापूर्वक इन प्रोटोकॉल लागू करने के लिए extracellular डोमेन (ECD) मानव CD2228, sialic एसिड बाध्यकारी ़ के एक ग्लाइकोप्रोटीन सदस्य की तरह lectins (Siglecs) परिवार की विशेषता है कि बी सेल को बनाए रखने के लिए आवश्यक है homeostasis४४ . हम में प्रदर्शन गहराई निर्माण डिजाइन क्रिस्टलीकरण की सुविधा के लिए और एक्स-रे डेटासेट पारा के साथ भिगोने के द्वारा चरणबद्ध । हम भी अपने ligand sialic एसिड के साथ CD22 क्रिस्टल लथपथ (α 2-6 sialyllactose) प्रतिरक्षा रिसेप्टर की एक संरचना-ligand जटिल प्राप्त करने के लिए और इस प्रकार glycan mimetics४५,४६की संरचना-निर्देशित डिजाइन के लिए खाका प्रदान की । इसके अलावा, हम विरोधी CD22 चिकित्सीय एंटीबॉडी epratuzumab के अंश प्रतिजन बंधन (फैब) उत्पंन-एक चिकित्सकीय उंमीदवार के लिए चरण III नैदानिक परीक्षणों में वर्तमान में गैर है Hodgkin लिंफोमा४७-BLI द्वारा अपनी बाध्यकारी समानता निर्धारित करने के लिए और आईटीसी ते अंतर ग्लाइकोसिलेटेड CD22 ECD गावातील. ये अध्ययन epratuzumab सगाई में N-लिंक्ड glycosylation के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका से पता चला, बेकार बी कोशिकाओं पर CD22 मांयता के लिए संभावित प्रभाव के साथ ।

Protocol

1. ग्लाइकोप्रोटीन ECD के लिए डिजाइन का निर्माण

  1. मानव CD22 के एमिनो एसिड अनुक्रम का मूल्यांकन (Uniprot) InterPro और Phyre2 सर्वर का उपयोग करने की भविष्यवाणी की पहचान डोमेन तत्वों और सीमाओं के भीतर स्थित प्रोटीन४८,४९।
  2. मानव CD22 के अनुक्रम क्लोन, सिग्नल पेप्टाइड की कमी, transmembrane और cytosolic डोमेन (अवशेषों 20-687, इसके बाद CD22 extracellular डोमेन, CD22 ECD) में pHLsec स्तनधारी अभिव्यक्ति वेक्टर25 का उपयोग प्रतिबंध एंजाइमों AgeI और KpnI ( चित्रा 2 क) ५०.
    नोट: pHLsec वेक्टर स्तनधारी कोशिकाओं25में घुलनशील, स्रावित प्रोटीन के इजहार के लिए अनुकूलित है । इस वेक्टर में घुलनशील नच के extracellular स्राव के लिए अनुमति देने के लिए एक स्रावी संकेत होता है । pHLsec में एक सी-टर्मिनल (His)6x टैग होता है जो मैटीरियल मेटल संबधी क्रोमैटोग्राफी तरीकों के प्रयोग से कोशिका supernatants से संबध शुद्धि को सुगम बनाता है ।
  3. क्लोन C-टर्मिनल ़ डोमेन के क्रमिक विलोपन के साथ CD22 ECD का निर्माण कटा हुआ: डोमेन 1-6 (अवशेषों 20-687), डोमेन 1-5 (अवशेषों 20-592), डोमेन 1-4 (अवशेषों 20-504), और डोमेन 1-3 (अवशेषों 20-330) (आंकड़े 2 बी और 2c)५० .
  4. CD22 ECD के प्राथमिक अनुक्रम का मूल्यांकन NetNGlyc सर्वर का उपयोग करने के लिए भविष्यवाणी की पहचान N-लिंक्ड glycosylation५१निर्माण में मौजूद साइटों ।
  5. साइट का उपयोग कर mutagenesis, मानक प्रोटोकॉल५२ द्वारा या ओवरलैपिंग पीसीआर५३द्वारा, एक भविष्यवाणी की N-लिंक्ड glycosylation साइट (Asn करने के लिए Gln और/या Asn ाला) के रूप में CD22 ECD है कि या तो एक या कई शामिल का निर्माण बनाने के लिए बदलना N-glycosylation उत्परिवर्तनों से जुड़े ।
  6. क्लोन निर्माण के अनुक्रम सत्यापन के बाद, सक्षम ई. कोलाई DH5α कोशिकाओं५४ और मैक्सी में बदलने-तैयारी डीएनए (निर्माता के निर्देशों के अनुसार) अभिकर्मक के लिए तैयार करने के लिए ।

2. HEK293F और HEK293S सेल की स्थापना

नोट: आवश्यक रिएजेंट और उपकरणों के साथ HEK293F या HEK293S कोशिकाओं के सभी हेरफेर एक उपसुरक्षा स्तर एक उपयुक्त सुरक्षा कैबिनेट में 2 सुविधा में किया जाना चाहिए । सभी मदों की बाहरी सतह एक ७०% इथेनॉल समाधान या समकक्ष रिएजेंट के साथ निष्फल होना चाहिए ।

  1. प्राप्त HEK293F और HEK293S निलंबन कोशिकाओं ( सामग्री की तालिकादेखें) और स्टोर पर-८० ° c उपयोग के लिए तैयार है जब तक ।
  2. गर्म मीडिया ( सामग्री की तालिकादेखें) 1 के लिए एक ३७ डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में एच । स्थानांतरण 24 एक १२५ मिलीलीटर के लिए गर्म मीडिया के मिलीलीटर एक वेंट टोपी के साथ सेल संस्कृति कुप्पी चकित ।
  3. -८० डिग्री सेल्सियस और बर्फ के हस्तांतरण से 1 मिलीलीटर सेल aliquot प्राप्त करें ।
  4. लगभग 1 मिनट के लिए एक ३७ ° c जल स्नान में कोशिकाओं की मशीन, आंशिक रूप से गल कोशिकाओं को । शीशी से १२५ मिलीलीटर चकित सेल संस्कृति मीडिया युक्त कुप्पी के लिए कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर स्थानांतरण ।
  5. एक शेखर में वेंट टोपी और जगह कुप्पी के साथ सेल संस्कृति कुप्पी बंद ३७ डिग्री सेल्सियस, १३० rpm, ७०% आर्द्रता, और 8% सह2के लिए सेट ।

3. HEK293 सेल रखरखाव

नोट: कोशिका घनत्व और कोशिकाओं की व्यवहार्यता लगभग 24 h गल के बाद जांच की जानी चाहिए । यह चरण सुनिश्चित करता है कि कक्ष निंन टीका को पुनर्प्राप्त कर रहे हैं; प्रारंभिक व्यवहार्यता > 80% होना चाहिए ।

  1. सावधानी से कोशिकाओं के 10 µ l को निकालने १२५ मिलीलीटर कुप्पी ताजा निलंबन कोशिकाओं युक्त और यह एक बाँझ १.५ मिलीलीटर microtube में स्थानांतरण. कुप्पी बंद करें और यह मशीन के लिए वापस ।
  2. पिपेट 10 µ l के Trypan ब्लू सॉल्यूशन के १.५ एमएल microtube युक्त कोशिकाओं में अच्छी तरह से मिलाएं और 10 µ l को गिनते हुए स्लाइड के चैंबर में ट्रांसफर कर दें ।
  3. एक स्वचालित सेल काउंटर में गिनती स्लाइड रखो और कोशिका घनत्व के लिए मूल्यों को प्राप्त (एमएल-1कोशिकाओं की इकाइयों में) और सेल व्यवहार्यता (प्रतिशत में) ।
  4. कोशिकाओं है कि एक अंतिम घनत्व पर एक ताजा २०० मिलीलीटर संस्कृति inoculate करने के लिए आवश्यक होगा की मात्रा की गणना ~ ०.८ x 106 कोशिकाओं एमएल-1 निम्नलिखित समीकरणों का उपयोग कर:
    Equation 11
    Equation 22
    नोट: यह लग सकता है ~ 5 डी एक २०० मिलीलीटर संस्कृति में टीका के लिए एक उपयुक्त कोशिका घनत्व प्राप्त करने के लिए ।
  5. एक बार सेल घनत्व एक २०० मिलीलीटर संस्कृति के टीका के लिए पर्याप्त है, एक ३७ डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 1 ज के लिए गर्म अप मीडिया और सुरक्षा कैबिनेट में गर्म मीडिया हस्तांतरण ।
  6. एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का प्रयोग, ध्यान से मीडिया के लिए आवश्यक मात्रा में स्थानांतरण (के रूप में 2 समीकरण में गणना) में एक ५०० मिलीलीटर एक वेंट टोपी के साथ सेल संस्कृति कुप्पी चकित ।
  7. एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का प्रयोग, निलंबन कोशिकाओं की आवश्यक मात्रा हस्तांतरण (1 समीकरण में गणना) में ५०० मिलीलीटर चकित सेल संस्कृति मीडिया युक्त कुप्पी ।
  8. नई २०० मिलीलीटर रखरखाव स्टॉक कैप और यह मशीन के लिए वापस । लगभग 3 x 106 कोशिकाओं एमएल-1के घनत्व के लिए कोशिकाओं को विकसित । ०.८ x 106 कोशिकाओं एमएल-1 के घनत्व पर सेल पारित हर 2-3 कोशिकाओं की एक स्थिर संस्कृति को बनाए रखने के लिए डी (के रूप में धारा 3.4-3.7 में वर्णित) । कोशिकाओं की एक घनत्व से अधिक करने की अनुमति न दें ~ 4 x 106 कोशिकाओं एमएल-1.

4. ग्लाइकोप्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए HEK293 कोशिकाओं का अभिकर्मक

  1. अभिकर्मक के लिए २०० मिलीलीटर संस्कृति के लिए आवश्यक है कि कोशिकाओं और मीडिया की मात्रा की गणना ०.८ x 106 कोशिकाओं एमएल-1 (समीकरण 1 और 2 से धारा ३.४) का उपयोग कर ।
    नोट: २०० मिलीलीटर transfections की संख्या है कि किया जा सकता है रखरखाव स्टॉक के सेल घनत्व पर निर्भर करता है ।
  2. अभिकर्मक के लिए एक नई ५०० मिलीलीटर सेल संस्कृति कुप्पी में एक वेंट टोपी के साथ मीडिया और कोशिकाओं की आवश्यक मात्रा स्थानांतरण और मशीन के लिए सेल शेयर वापसी ।
  3. अभिकर्मक से पहले 1 एच के लिए कोशिकाओं की मशीन विभाजन के बाद acclimatize करने के लिए कोशिकाओं की अनुमति के लिए ।
  4. एक बाँझ ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में डीएनए के ५० µ जी स्थानांतरण और मीडिया के 5 मिलीलीटर के साथ पतला । वैक्यूम फ़िल्टर पतला डीएनए एक और बाँझ ट्यूब में एक ०.२२ µm निस्पंदन प्रणाली का उपयोग.
  5. मिश्रण पतला, एक 1:1 मास में फ़िल्टर डीएनए: अभिकर्मक रिएजेंट के साथ मात्रा अनुपात । धीरे डीएनए भंवर: अभिकर्मक एजेंट समाधान मिश्रण करने के लिए और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर समाधान मशीन ।
  6. डीएनए जोड़ें: अभिकर्मक एजेंट समाधान सीधे कोशिकाओं के लिए । ३७ ° c, १३० rpm, ७०% आर्द्रता, और 8% CO2 में 5-7 d के लिए एक शेखर में transfected कोशिकाओं की मशीन ।

5. सेल अभिकर्मक स्थितियों का अनुकूलन

नोट: अधिकतम ग्लाइकोप्रोटीन उपज के लिए सेल अभिकर्मक शर्तों का अनुकूलन करने के लिए, आरंभिक सेल घनत्व की एक किस्म पर transfect कोशिकाओं और समय (चित्रा 3ए) के साथ प्रोटीन यील्ड का आकलन करें । Transfect कोशिकाओं के रूप में वर्णित खंड 4 में, प्रारंभिक सेल घनत्व से लेकर ०.५ x 106 से 2 एक्स 106 कोशिकाओं एमएल-1 ५५। परीक्षण transfections 25 मिलीलीटर कुल मात्रा (१२५ मिलीलीटर चकित सेल संस्कृति कुप्पी में) डीएनए के 6 µ जी के साथ अंतरिक्ष और रिएजेंट को बचाने के लिए नीचे स्केल किया जा सकता है । डीएनए की मात्रा भी५५अनुकूलित किया जा सकता है ।

  1. हर दिन पोस्ट-अभिकर्मक (दिन 1-7), हस्तांतरण एक ५०० µ l aliquot सेल संस्कृति से बाँझ १.५ मिलीलीटर microtube (में सुरक्षा कैबिनेट).
  2. एक microcentrifuge में 5 मिनट के लिए १२,००० x g पर aliquoted कोशिकाओं को तुरंत संग्रह के बाद स्पिन । स्थानांतरण supernatant एक नया १.५ एमएल microtube करने के लिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर जब तक सभी नमूनों प्राप्त कर रहे हैं ।
  3. Quantitate स्रावित ग्लाइकोप्रोटीन द्वारा densitometry
    1. एक बार सभी नमूनों प्राप्त कर रहे हैं, aliquot एक नया १.५ मिलीलीटर microtube में प्रत्येक नमूने के 20 µ एल और गैर-कम 4x Laemmli नमूना बफर के 6 µ एल के साथ मिश्रण.
    2. एक थर्मामीटरों-ब्लॉक में ९५ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए नमूने उबाल लें । एक microcentrifuge में १२,००० x g पर 1 मिनट के लिए नमूने स्पिन ।
    3. एक 10-well 4-15% ढाल एसडीएस में प्रति अच्छी तरह से प्रत्येक नमूने के 20 µ एल लोड-पृष्ठ जेल । प्रोटीन आकार मार्करों के लिए एक लेन शामिल करें । चलाने के लिए २५० वी में 20 मिनट के लिए एक Tris/Glycine/एसडीएस बफर में जेल ।
    4. चलाने के पूरा होने के बाद, Coomassie दाग ( सामग्री की तालिकादेखें) के लिए स्थानांतरण जेल ddH2में 20 min. Image जेल के लिए ओ-दाग जेल ।
    5. ImageJ के साथ densitometry प्रदर्शन, मानक प्रोटोकॉल५७,५८के बाद ।
    6. संकलित करें और Y-अक्ष (चित्रा 3A) पर ' दिनों के बाद-अभिकर्मक ' X-अक्ष पर और ' densitometry मान ' के साथ डेटा प्लॉट करें ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, यदि प्रोटीन अभिव्यक्ति एसडीएस द्वारा दृश्य के लिए अपर्याप्त है-पृष्ठ, पश्चिमी सोख्ता के रूप में तकनीक५६इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  4. Quantitate स्रावित ग्लाइकोप्रोटीन द्वारा BLI
    1. Ni-ंत् के प्रयोग से quantitate BLI५९का उपयोग करके स्रावित ग्लाइकोप्रोटीन की मात्रा का उपयोग करते हैं ।
    2. संकलित करें और Y-अक्ष (चित्रा 3ए) पर ' दिनों के बाद अभिकर्मक ' X-अक्ष पर और ' प्रोटीन एकाग्रता (µ g/mL) ' के साथ डेटा प्लॉट करें ।

6. HEK293 Supernatant से घुलनशील ग्लाइकोप्रोटीन का शुद्धिकरण

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए ६,३७१ x g पर केंद्रापसारक द्वारा फसल कोशिकाओं । गुप्त CD22 ECD और फिल्टर एक ०.२२ µm फिल्टर का उपयोग कर युक्त supernatant बनाए रखने.
  2. एक पूर्व equilibrated (20 मिमी Tris पीएच ९.०, १५० मिमी NaCl, 5 मिमी imidazole) Ni-ंत् कॉलम (5 मिलीलीटर मात्रा) एक benchtop क्रोमैटोग्राफी प्रणाली का उपयोग कर पर 4 मिलीलीटर मिनट-1 पर लोड supernatant ।
    नोट: अंय समानता-आधारित शुद्धि तकनीकों का उपयोग किया जा सकता है, अनुभाग 1 में डिज़ाइन डिजाइन में शामिल संबध टैग के आधार पर ।
  3. निंनलिखित supernatant लोड हो रहा है, धो बफर (20 मिमी Tris पीएच ९.०, १५० mm NaCl, 5 मिमी imidazole) के 3-4 कॉलम खंड (CV) के साथ संबंध कॉलम धोने ।
  4. Elute एक 4-100% ढाल (रेफरेंस बफर के 4 सीवी) (20 मिमी Tris पीएच ९.०, १५० मिमी NaCl, ५०० मिमी imidazole) जबकि भिन्न इकट्ठा (चित्रा 3बी) का उपयोग कर कॉलम से ग्लाइकोप्रोटीन शुद्ध ।
  5. पूल एक केंद्रापसारक निस्पंदन डिवाइस में eluted चोटी से युक्त एक 10 केडीए नाममात्र आणविक वजन सीमा (NMWL) और 15 मिनट के लिए 4 ° c पर ४,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा ध्यान केंद्रित करने या नमूना ५०० µ एल की एक मात्रा तक पहुंचता है ।
  6. एक ५०० µ एल नमूना पाश में केंद्रित ग्लाइकोप्रोटीन इंजेक्षन और ०.५ मिलीलीटर मिनट-1 पर एक पूर्व equilibrated पर लोड (20 मिमी Tris, पीएच ९.०, १५० मिमी NaCl) उच्च प्रदर्शन आकार बहिष्करण स्तंभ (लगभग 24 मिलीलीटर मात्रा) पर एक तेजी से प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी (FPLC) 4 डिग्री सेल्सियस पर सिस्टम जबकि भागों इकट्ठा (चित्रा 3सी) ।
  7. भागो एसडीएस-पृष्ठ जेल eluted अंशों के ग्लाइकोप्रोटीन युक्त भागों की पहचान करने के लिए, और पूल इसी भिन्न । एसडीएस-पृष्ठ जेल खंड 5६०में वर्णित के रूप में चलाया जा सकता है ।

7. Deglycosylation की शुद्धि ग्लाइकोप्रोटीन

  1. शुद्ध प्रोटीन की एकाग्रता माप विलुप्त होने गुणांक द्वारा विभाजित २८० एनएम पर अवशोषक का उपयोग करके आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी निंनलिखित (जैसे, १.४१८ एम-1 CD22 ECD के लिए सेमी-1 ) ।
    नोट: ब्याज के प्रोटीन के सैद्धांतिक विलुप्त होने गुणांक ऐसे ExPASy ProtParam६१के रूप में सर्वर का उपयोग कर की गणना की जा सकती है ।
  2. ३७ ° c पर 1 एच के लिए इंडो एच के साथ शुद्ध प्रोटीन की मशीन, 1 के अनुपात में शुद्ध प्रोटीन की मिलीग्राम 1x इंडो एच बफर में वाणिज्यिक एंजाइम के 10 µ एल के लिए (निर्माता के निर्देशों के अनुसार) ।
    नोट: इंडो H सट हाई mannose glycans HEK293S में उत्पादित एक एकल GlcNAc moiety21साइट पर जा रहा है । इंडो एच HEK293F कोशिकाओं22में उत्पादित प्रोटीन पर glycans सट नहीं करता है, लेकिन अन्य एंजाइमों इस प्रयोजन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता (जैसे,PNGaseF24).
  3. ५०० µ एल के लिए deglycosylated ECD ध्यान केंद्रित करने और एक उच्च प्रदर्शन आकार अपवर्जन कॉलम (लगभग 24 मिलीलीटर मात्रा) पर ०.५ मिलीलीटर मिनट-1 पर एक FPLC इंडो एच निकालने के लिए और किसी भी परिणामी समुच्चय को अलग करने पर जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी चलाते हैं ।
  4. बहाव प्रयोगों में उपयोग करने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर deglycosylated प्रोटीन की दुकान ।

8. नच का क्रिस्टलीकरण

नोट: व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्क्रीन का उपयोग कर क्रिस्टलीकरण परीक्षण प्रदर्शन और एक क्रिस्टलीकरण रोबोट का उपयोग कर बैठे ड्रॉप प्रयोगों की स्थापना की.

  1. शुद्ध ध्यान केंद्रित, deglycosylated ECD को 10 मिलीग्राम मिलीलीटर-1 ४,००० x g (4 डिग्री सेल्सियस) जब तक वांछित एकाग्रता प्राप्त की है पर 10 केडीए NMWL के साथ एक केंद्रापसारक निस्पंदन डिवाइस का उपयोग कर ।
  2. २८० एनएम पर अवशोषक का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण और विलुप्त होने गुणांक द्वारा विभाजित ।
  3. 4 ° c पर 5 मिनट के लिए १२,००० x g पर नमूना केंद्रापसारक से पहले क्रिस्टल परीक्षण के लिए नमूना से अवांछित धूल या अंय दूषित पदार्थों को दूर करने के लिए ।
  4. ९६ के जलाशय कुओं भरें-अच्छी तरह से बैठे एक वाणिज्यिक क्रिस्टलीकरण स्क्रीन से क्रिस्टलीकरण समाधान के ८० µ एल के साथ छोड़ क्रिस्टलीकरण प्लेटें ।
    नोट: हम स्पार्स-मैट्रिक्स वाणिज्यिक स्क्रीन है कि PDB में जमा संरचनाओं के संबंध में सबसे सफल क्रिस्टलीकरण की स्थिति के आधार पर डिजाइन किया गया है का उपयोग करें ।
  5. एक क्रिस्टलीकरण रोबोट का प्रयोग, शुद्ध प्रोटीन के अनुपात में २०० nL की कुल गिरावट की मात्रा के साथ क्रिस्टलीकरण थाली के कुआं में बूंदें वितरण: 1:1 के क्रिस्टलीकरण समाधान ।
  6. एक बार पूरी थाली तिरस्कृत किया गया है, टेप के साथ प्लेट सील और दृश्य और पराबैंगनी प्रकाश द्वारा निरीक्षण के लिए एक थाली imager में जगह ।
  7. निरीक्षण क्रिस्टलीकरण प्लेटें तुरंत सेटअप के बाद, और निंनलिखित हफ्तों में, दोनों दृश्य और पराबैंगनी प्रकाश का उपयोग करने की स्थिति की पहचान है कि प्रारंभिक ग्लाइकोप्रोटीन क्रिस्टल हिट दे ।
  8. इसके अलावा अनुकूलित क्रिस्टल प्रारंभिक सघन हिट से प्राप्त क्रिस्टल हिट या यादृच्छिक मैट्रिक्स माइक्रो-सीडिंग विधियों६२,६३,६४,६५की स्थिति के आधार पर ठीक स्क्रीन का उपयोग कर ।
  9. क्रायो-की रक्षा के किसी भी क्रिस्टल के लिए पर्याप्त क्रायो-रक्षा में क्रिस्टल भिगोना मां शराब समाधान के साथ पूरक 20% (v/v) ग्लिसरॉल समाधान (या समकक्ष क्रायो-संरक्षक, जैसे ईथीलीन ग्लाइकोल या पॉलीथीन ग्लाइकोल ४००) ।
  10. cryoloops में माउंट क्रिस्टल और फ्लैश उंहें तरल नाइट्रोजन में एक घर स्रोत डिफफ्रक्टोमीटर पर डेटा संग्रह करने से पहले या सिंक्रोट्रॉन विकिरण का उपयोग कर फ्रीज ।

9. भारी एटम Derivatization का उपयोग चरणबद्ध

नोट: हा यौगिकों के किसी भी हेरफेर से पहले, सुरक्षा पहलुओं पर विचार किया जाना चाहिए । हा प्रोटीन क्रि में प्रयुक्त यौगिकों उनके जैविक अणुओं को मजबूत संबंध के लिए चयनित और लंबे समय तक जोखिम से मानव स्वास्थ्य के लिए जोखिम पैदा कर रहे हैं । उनके सामग्री सुरक्षा डाटा शीट में उल्लेख के रूप में हा यौगिकों के लिए उचित सुरक्षा कदम उठाएं ।

  1. विभिंन हा यौगिकों, सांद्रता, और मशीन समय का परीक्षण करने के लिए, अच्छी तरह से diffracting क्रिस्टल एक 24-अच्छी तरह से क्रिस्टलीकरण प्लेट में धारा 8 में प्राप्त फांसी-ड्रॉप वाष्प प्रसार विधि६६का उपयोग कर पुन: पेश ।
  2. तय है जो हा क्रिस्टल derivatization के लिए इस्तेमाल किया जाएगा । सर्वर (उदाहरण के लिए, भारी एटम डाटाबेस प्रणाली६७) हा यौगिक चयन के साथ सहायता कर सकते हैं, यह सुनिश्चित करने के वे प्रोटीन और क्रिस्टलीकरण हालत के लिए उपयुक्त हैं ।
    नोट: हा स्क्रीन भी चरणबद्ध के लिए सबसे प्रभावी हा यौगिकों के आसान स्क्रीनिंग के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं । "सात जादू" हा यौगिकों का एक सेट पहले से हा derivatization६८के लिए सफलता की उच्च संभावना है वर्णित किया गया है ।
  3. (चित्रा 4ए) भिगोने के लिए कार्यस्थान सेट अप करें । एक cryoloop का प्रयोग, तेजी से एक 22 मिमी कवर पर्ची पर एक ०.२ µ एल ड्रॉप करने के लिए क्रिस्टल स्थानांतरण युक्त हा समाधान सघन हालत में पतला ऐसा है कि अंतिम एकाग्रता से हा पर्वतमाला की 1-20 mm. सील ड्रॉप और समय के विभिंन लंबाई के लिए गर्मी (चित्रा 4बी) । एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु 5, 10, ६०, और ९० मिनट और रातोंरात है ।
  4. नेत्रहीन ग्लाइकोप्रोटीन क्रिस्टल या क्रिस्टल derivatization के लिए प्रतिकूल प्रभाव का संकेत कर सकते हैं, जो रंग में संभावित दरारें या परिवर्तन की पहचान करने के लिए एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ क्रिस्टल का निरीक्षण किया ।
  5. cryoloops में माउंट क्रिस्टल और वापस-तीन लगातार ०.२ में 30 एस के लिए क्रिस्टल सोख µ एल बूंदें युक्त मां शराब समाधान 20% के साथ पूरक (v/v) ग्लिसरॉल (या वैकल्पिक क्रायो-protection)६९। वापस क्रिस्टल भिगोने हा यौगिक है कि गैर विशेष रूप से बाध्य किया गया था और आंशिक कमजोर हा बंधन की वजह से अधिभोग को कम कर देता है । फ्लैश तरल नाइट्रोजन में क्रिस्टल फ्रीज (चित्रा 4बी) ।
  6. डेटा संग्रह, संसाधन, संरचना समाधान, और शोधन के लिए, पहले वर्णित प्रोटोकॉल26,७०,७१,७२का उपयोग करें ।

10. भिगोने ग्लाइकोप्रोटीन क्रिस्टल इसके Ligand के साथ

  1. अच्छी तरह से diffracting क्रिस्टल एक 24 में धारा 8 में प्राप्त-अच्छी तरह से क्रिस्टलीकरण प्लेट फांसी-बूंद भाप प्रसार विधि का उपयोग कर प्रतिलिपि ।
  2. 20 mm Tris, pH ९.०, १५० mm NaCl में ५० mm ligand का स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें ।
    नोट: ligand की एकाग्रता अपने ग्लाइकोप्रोटीन को अपनत्व के अनुसार तैयार करनी चाहिए । यदि संबध अज्ञात है, तो यह एक विधि का उपयोग करने की आवश्यकता हो सकती है जैसे आईटीसी (अनुभाग १२.२) को भिगोने वाले प्रयोगों को आरंभ करने से पहले अपनत्व का निर्धारण करना. सुनिश्चित करें कि ligand आवश्यक बफर में वांछित एकाग्रता में घुलनशील है ।
  3. ECD क्रिस्टल युक्त ड्रॉप करने के लिए ligand के अलग सांद्रता जोड़ें और 5 मिनट 5 डी के बीच लेकर समय लंबाई में गर्मी के लिए ड्रॉप सील ।
  4. नेत्रहीन आकृति विज्ञान में संभावित परिवर्तन की पहचान करने के लिए एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ क्रिस्टल ट्रैक.
  5. cryoloops और क्रायो में माउंट क्रिस्टल-उंहें मां शराब में रक्षा समाधान 20% (v/v) ग्लिसरॉल (या अंय क्रायो-रक्षा जैसे ईथीलीन ग्लाइकोल या कम आणविक वजन पॉलीथीन ग्लाइकोल ४००)६९के साथ पूरक ।
  6. डेटा संग्रह, संसाधन, संरचना समाधान और शोधन के लिए, पहले वर्णित प्रोटोकॉल७३,७४,७५का उपयोग करें ।

11. टुकड़ा प्रतिजन बंधन का उत्पादन (फैब)

  1. उप क्लोन जीन है कि फैब भारी श्रृंखला (कोर्ट) और प्रकाश श्रृंखला (नियंत्रण रेखा) विरोधी ECD एंटीबॉडी, जैसे,epratuzumab के अनुक्रम के अनुरूप है ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, आईजीजी७६फैब टुकड़े उत्पन्न करने के लिए एंजाइम papain से सट जा सकता है.
  2. अनुभाग 4 में बताए अनुसार Transfect कक्ष, निंन संशोधनों के साथ:
    1. संस्कृति के २०० मिलीलीटर प्रति ९० µ जी के फैब टुकड़े के अभिकर्मक के लिए डीएनए के कुल द्रव्यमान का प्रयोग करें ।
    2. Transfect एचसी और lc plasmids एक 2:1 अनुपात में नियंत्रण रेखा डिमर गठन की मात्रा को कम करने के लिए ।
  3. मशीन, फसल कोशिकाओं के 7 डी के बाद, एक ०.२२ µm वैक्यूम चालित निस्पंदन डिवाइस के साथ supernatant और फिल्टर बनाए रखने ।
  4. Equilibrate विरोधी नियंत्रण रेखा (कापा या लैंब्डा) पंजाब में एक benchtop क्रोमैटोग्राफी प्रणाली का उपयोग बफर के संबंध कॉलम ।
    नोट: यदि LC डिमर गठन शुद्धि के दौरान एक मुद्दा है, प्रोटीन जी संबध क्रोमैटोग्राफी कापा के लिए एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता/लैंब्डा नियंत्रण रेखा संबध शुद्धि ।
  5. 4 एमएल मिनट-1पर संबध कॉलम पर supernatant लोड । निंनलिखित नमूना लदान, पंजाब के 3-4 सीवी के साथ कॉलम धो लो ।
  6. १०० mM glycine के साथ एक isocratic रेफरेंस का उपयोग कॉलम से Elute प्रोटीन, पीएच २.२, तुरंत 10% के साथ eluted भागों को बेअसर (v/v) 1 M Tris, प्रत्येक अंश में पीएच ९.० ।
    नोट: eluted फैब आगे आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी और/या आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी 4 डिग्री सेल्सियस पर एक FPLC का उपयोग करके शुद्ध किया जा सकता है ।

12. फैब और छोटे ग्लाइकोप्रोटीन के लिए बाध्यकारी अणु का लक्षण वर्णन

  1. परत interferometry
    1. 1x कैनेटीक्स बफर के ५० मिलीलीटर (1x पंजाब, ०.००२% (वी/वी) के बीच-20, ०.०१% (डब्ल्यू/वी) BSA) तैयार करें ।
    2. एक पूर्व गीला प्लेट में 10 मिनट के लिए 1x कैनेटीक्स बफर के २०० µ एल में छह Ni-ंत् को हाइड्रेटेड ।
    3. अपने-पतला 25 एनजी µ एल के एक अंतिम एकाग्रता पर 1x कैनेटीक्स बफर के 1 मिलीलीटर में टैग ECD-1। पिपेट कैनेटीक्स बफर के २०० µ एल में शुद्ध फैब के धारावाहिक कमजोर पड़ने, ५०० एनएम के एक उच्च एकाग्रता के साथ, और २५० एनएम, १२५ एनएम के बाद धारावाहिक कमजोर पड़ने, और ६२.५ एनएम ।
    4. काले फ्लैट नीचे ९६ में Aliquot रिएजेंट-अच्छी तरह से microplate के रूप में चित्रा 5ए, में दिखाया जहां एक अच्छी तरह से संकेत समाधान के २०० µ एल शामिल हैं ।
    5. डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में कैनेटीक्स परख का उपयोग कर डेटा इकट्ठा, के रूप में पहले वर्णित३८,३९,७७ (चित्रा 5ए) ।
      1. संक्षेप में, २४० एस के लिए ग्लाइकोप्रोटीन के 25 एनजी µ एल-1 लदान से पहले ६० s के लिए आधार रेखा को 1x कैनेटीक्स बफर से युक्त कुओं में है (या १.० एनएम की दहलीज तक पहुंच गया है) १,००० rpm पर ।
      2. ६० का एक दूसरा आधार रेखा 1x कैनेटीक्स बफर में एस के बाद, फैब के धारावाहिक कमजोर पड़ने वाले कुओं में एक साथ स्थानांतरण । १८० s संबद्धता चरण बाद में 1x कैनेटीक्स बफ़र में १८० s पृथक्करण चरण के बाद है ।
        नोट: अगर इसके बाद के संस्करण प्रोटोकॉल एक पुनर्जनन कदम है, जो अलग करना बफर (५०० mM imidazole के साथ पंजाब के साथ) 5 एस के लिए 5 s द्वारा पीछा में एक के तीन चक्रों के होते है के बाद किया जा सकता है का उपयोग करें 1x कैनेटीक्स बफर में बेअसर के लिए । एक ही दिन में, या जब तक गरीब डेटा गुणवत्ता मनाया जाता है के दौरान एक ही समय में ~ 10-20 बार के लिए उपयोग किया जा सकता है ।
    6. विश्लेषण सॉफ़्टवेयर (चित्रा 5A) का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण करें:
      1. टैब 1 के अंतर्गत, आयात करें और डेटा चुनें.
      2. टैब 2, चरण 1: डेटा चयन के अंतर्गत, ' सेंसर चयन ' का चयन करें और संदर्भ कुओं को हाइलाइट करें (पंक्तियों ई और एफ, चित्रा 5ए), ठीक क्लिक और संदर्भ अच्छी तरह से सेट. चरण 2: घटाव के तहत, ' संदर्भ कुओं ' का चयन करें । चरण 3: के अंतर्गत संरेखित करें Y-अक्ष, चुनें ' आधार रेखा ' समय श्रेणी से ०.१ के लिए ५९.८ s । चरण 4: अंतर-चरण सुधार के अंतर्गत, ' पृथक्करण के लिए संरेखित करें ' चुनें । चरण 5: प्रक्रिया के अंतर्गत, ' Savitzky-Golay फ़िल्टरिंग ' का चयन करें और प्रक्रिया डेटा दबाएँ.
      3. टैब 3 के अंतर्गत, एक 1:1 मॉडल के साथ विश्लेषण करने के लिए चरण के अंतर्गत ' संबद्धता और पृथक्करण ' चुनें. ' ग्लोबल फिटिंग ' और ' रंग से समूह ' का चयन करें । दायां क्लिक करें curves, चुनें ' रंग बदलें ', अपने को चुनने के रंग के लिए सभी curves सेट । ' फिट घटता ' का चयन करें । यदि डेटा अच्छी तरह फिट हैं, तो रिपोर्ट को चुनकर ' रिपोर्ट सहेजें ' का निर्यात किया जा सकता है.
    7. HEK293F और HEK293S कोशिकाओं (खंड 5) में उत्पादित ग्लाइकोप्रोटीन के साथ प्रयोग दोहराएँ और इंडो एच उपचार निम्नलिखित (धारा 7) फैब मान्यता पर विभिन्न glycoforms के, यदि कोई हो, प्रभाव का आकलन करने के लिए. इसके अलावा, ECD के साथ प्रयोग को दोहराने के लिए डोमेन (ओं) में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए फैब से बंधे ।
  2. फैब-ग्लाइकोप्रोटीन इंटरेक्शन के इज़ोटेर्माल अनुमापन calorimetry
    नोट: आईटीसी प्रयोगों यहां वर्णित एक स्वचालित आईटीसी साधन का उपयोग कर प्रदर्शन कर रहे हैं । प्रयोगों में एक 1 मिलीलीटर दौर नीचे ९६-अच्छी तरह से ब्लॉक में किया जाता है ।
    1. Dialyze ECD और एक एकल 4 एल चोंच में फैब 20 मिमी Tris, पीएच ८.०, १५० मिमी NaCl 4 ° c पर एक बार हलचल के साथ रातोंरात ।
    2. 5 µ एम और ५० µ एम के लिए dialyzed ECD और फैब ध्यान केंद्रित, क्रमशः, 10 केडीए NMWL के साथ एक केंद्रापसारक फिल्टर का उपयोग, के लिए ४,००० x जी पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर डायलिसिस बफर के 5 मिलीलीटर के साथ तीन बार ध्यानी झिल्ली धोने सुनिश्चित करने से पहले का उपयोग करने के लिए ।
      नोट: किसी भी बेमेल में नमूने के बीच सेल और सिरिंज में अवांछित गर्मी का कारण आईटीसी प्रयोग के दौरान जारी किया जा सकता है और परिणाम खराब गुणवत्ता के डेटा में.
    3. प्रयोग 1 के लिए: सेल में लोड करने के लिए A1 के लिए ECD के ४०० µ एल जोड़ें, और अच्छी तरह से करने के लिए फैब के १२० µ एल सिरिंज में लोड किया जा करने के लिए. खैर A3 प्रयोग पूरा होने के बाद मिश्रित नमूना वापस करने के लिए खाली छोड़ दिया है । प्रत्येक अनुवर्ती प्रयोग थाली में एक ही क्रम में जोड़ा जा सकता है (यानी, प्रयोग 2: सेल-A4, सिरिंज-A5, खाली अच्छी तरह से-A6; चित्रा 5 ख).
      नोट: बफर नियंत्रण में बफर शामिल (उपकरण अच्छी तरह से बर्ताव कर रहा है की पुष्टि करने के लिए) प्रत्येक रन की शुरुआत और अंत में, साथ ही ligand (सिरिंज में) बफर में (सेल में) में नमूना के लिए कमजोर पड़ने की गर्मी की गणना करने के लिए नियंत्रण सिरिंज. कमजोर पड़ने की यह गणना की गर्मी तो डेटा विश्लेषण (चित्रा 5बी) के दौरान कच्चे प्रयोगात्मक डेटा से घटाया जाना चाहिए ।
    4. प्रत्येक इंजेक्शन के लिए २.५ μL की एक मात्रा के साथ 16 इंजेक्शन की कुल भागो । इंजेक्शन की अवधि 5 एस, इंजेक्शन के बीच १८० एस रिक्ति के साथ है । 25 डिग्री सेल्सियस के लिए सेल तापमान सेट, ७५० rpm की एक सरगर्मी गति और 5 एस की एक फिल्टर अवधि के साथ ।
      नोट: ECD के संबध और ऊष्मा के आधार पर: फैब बातचीत, यह नमूना एकाग्रता, इंजेक्शन या सेल के तापमान की संख्या को बदलने के लिए आवश्यक हो सकता है ।
    5. विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ डेटा का विश्लेषण, जैसा कि पहले वर्णित४०,४१,४३ (चित्रा 5बी) ।
    6. डुप्लिकेट में प्रयोग को दोहराएं, मतलब KD मान और मानक त्रुटियां गिनाना । अलग glycoforms (वर्गों 5 और 6) के ECD के साथ प्रयोग दोहराने के प्रभाव का आकलन करने के लिए, यदि कोई हो, glycoforms के फैब: ग्लाइकोप्रोटीन बातचीत की ऊष्मा पर ।
  3. ligand-ग्लाइकोप्रोटीन इंटरैक्शन के इज़ोटेर्माल अनुमापन calorimetry के लिए, निम्न परिवर्तनों के साथ, अनुभाग १२.२ में बताए गए अनुसार आईटीसी प्रयोग सेट करें:
    1. डायलिसिस बफर के 4 एल में रात भर Dialyze ECD । डायलिसिस के पूरा होने के बाद डायलिसिस बफर का उपयोग कर ligand भंग.
    2. कम अपनत्व वाली बातचीत का पता लगाने में सक्षम होने के लिए काफी अधिक सांद्रता पर आईटीसी प्रयोगों का प्रदर्शन करें । ECD और ligand बातचीत के लिए, सेल में ECD के १०० µ मीटर और सिरिंज में ligand के 1 मिमी की सांद्रता पर आईटीसी प्रयोग करते हैं ।

Representative Results

CD22 ECD के कई निर्माण सफलतापूर्वक pHLsec अभिव्यक्ति वेक्टर में क्लोन और स्तनधारी HEK293F और HEK293S सेल लाइनों (चित्रा 2 और 3ए) में व्यक्त किया गया । सभी निर्माण आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी द्वारा आकार सजातीयता को शुद्ध किया गया और सघन अध्ययन के लिए एक उच्च शुद्ध नमूना उपज (3बी और 3सी) । CD22 निर्माण कि अच्छी तरह से diffracting क्रिस्टल के नेतृत्व में d1-d3 जनचेतना (अवशेषों 20-330) था, के साथ पांच की भविष्यवाणी की छह N-जुड़ा हुआ glycosylation Asn से अला (N67A, N112A, N135A, N164A और N231A) में रूपांतरित साइटों, HEK293S कोशिकाओं में उत्पादित, ऐसी है कि केवल स्थिति N101 पर glycosylation साइट रखी गई थी (इस निर्माण का नाम CD2220-330, 5 ए) है । क्रिस्टल MCSG-1 विरल-मैट्रिक्स स्क्रीन के कई स्थितियों में प्राप्त किए गए थे, लेकिन सबसे अच्छा क्रिस्टल 30% (डब्ल्यू/वी) पॉलीथीन ग्लाइकोल ४०००, ०.२ एम लिथियम क्लोराइड और ०.१ मीटर Tris, पीएच ८.५ युक्त एक शर्त से थे । इन देशी क्रिस्टल २.१ Å संकल्प को diffracted; संबंधित Siglec प्रोटीन के ़ डोमेन के ज्ञात संरचनाओं का उपयोग श्री खोजों में कोई समाधान उपज नहीं था ।

चरणबद्ध जानकारी प्राप्त करने के लिए, हम हा यौगिकों का एक पैनल है कि पारा, पीटी, ओएस, टा, और बीआर 5 मिनट से 1 डी के लिए एक मशीन समय के लिए हा यौगिक के 1-20 mM से लेकर सांद्रता में शामिल के साथ देशी क्रिस्टल लथपथ (चित्रा 4) । हम आकृति विज्ञान में परिवर्तन के लिए क्रिस्टल पर नजर रखी, और पाया कि क्रिस्टल 20 मिमी तेजी से खुर और क्रिस्टल के भंग में परिणाम में हा यौगिक के साथ भिगोया । हम ६३ क्रिस्टल है कि टैंटलम ब्रोमाइड क्लस्टर, प्लेटिनम क्लोराइड, mercuric एसीटेट और mercuric क्लोराइड के साथ लथपथ थे सेट गर्मी के बाद उनके आकार बनाए रखा की कुल जम गया । क्रिस्टल 30 मिनट के लिए mercuric क्लोराइड के 7 मिमी के साथ लथपथ कनाडा के प्रकाश स्रोत (CLS) 08-बीएम beamline (सास्काटून, कनाडा) में एक प्रतिदीप्ति स्कैन पर विषम संकेत दिखाया और बहु-तरंग दैर्ध्य विषम फैलाव एक्स-रे डेटा संग्रह के लिए अनुमति दी एक भी क्रिस्टल. इन डेटासेट हमें CD2220-330, 5, जो एक भी पारा एटम स्थिति C308 में एक मुक्त cysteine से बंधे का पता चला के पारा उपसंरचना को हल करने की अनुमति दी है और अंत में हमें CD2220-330, 5 की संरचना में चरणबद्ध में बनाने के लिए अनुमति दी इलेक्ट्रॉन घनत्व नक्शा७८का उपयोग कर ।

एक बार unliganded संरचना हल किया गया था, हम अपनी ligand, α 2-6 siallylactose के लिए बाध्य CD22 की संरचना को सुलझाने में रुचि रखते थे । हम पहले α 2-6 sialyllactose के प्रति CD22 के संबंध की गणना आईटीसी का उपयोग करने के लिए बातचीत के बंधन ऊष्मा विशेषताएं । हम का एक संबंध मनाया ~ २८० µ m और इस जानकारी का इस्तेमाल किया एक प्रारंभिक एकाग्रता की पहचान करने के लिए (~ १०० x KD) ligand के हमारे देशी CD22 के भिगोने के लिए उपयोग करने के लिए20-330, 5 ए क्रिस्टल. हम CD2220-330, 5 मिनट, 2 एच, 14 एच, ४० एच और 5 डी और क्रिस्टल आकृति विज्ञान में परिवर्तन के लिए निगरानी के लिए 25 मिमी siallylactose के साथ धारा 3 क्रिस्टल लथपथ । की कुल ~ ७५ क्रिस्टल विभिंन समय अंक से जमे हुए थे और CLS सिंक्रोट्रॉन beamline 08 आईडी (सास्काटून, कनाडा) दूरदराज के डेटा संग्रह के लिए भेजा है । कुल छह एक्स-रे डेटासेट अच्छी तरह से diffracting क्रिस्टल से एकत्र किए गए थे । प्रत्येक एक्स-रे डेटासेट से संरचना श्री unliganded CD22 20-330, एक प्रारंभिक खोज मॉडल के रूप में5 ए संरचना का उपयोग करके हल किया गया था. सभी डेटासेट के लिए परिणामी इलेक्ट्रॉन घनत्व तो फो-एफसी नक्शा है कि CD22 के बंधन साइट के भीतर बाध्य α 2-6 sialyllactose के अनुरूप होगा में सकारात्मक घनत्व के लिए निरीक्षण किया गया । उल्लेखनीय है, सभी डेटासेट एकत्र, यहां तक कि क्रिस्टल से उन मशीन समय के केवल 5 मिनट के बाद लथपथ, समाहित सकारात्मक घनत्व बाध्यकारी साइट में ligand के लिए इसी । unliganded और liganded CD22 के समग्र संरचनाओं अत्यधिक ंयूनतम गठन परिवर्तन है, जो α 2-6 sialyllactose के साथ प्रयोग भिगोने की सफलता की व्याख्या हो सकती है के साथ समान थे ।

हम अगले BLI और आईटीसी प्रयोगों में चिकित्सीय एंटीबॉडी epratuzumab द्वारा मांयता प्राप्त CD22 की प्रतिजनी सतह की विशेषता (चित्रा 5) । कैनेटीक्स और ऊष्मा epratuzumab फैब बाध्यकारी के CD22 अलग glycoforms के साथ निर्माण करने के लिए एक बढ़ती समानता के साथ कम N-लिंक्ड CD22 आकार के साथ glycan का पता चलता है, छोटे glycans के लिए संबध में एक 14 गुना सुधार करने के लिए (३२७ एनएम बनाम 24 एनएम BLI में; १८८ एनएम बनाम आईटीसी में ५८ एनएम). CD22 N-लिंक्ड glycan एंटीबॉडी का उपयोग सीमित अपने epitope करने के लिए BLI द्वारा म्यूटेंट के एकल बिंदु CD22 का उपयोग करके और epratuzumab फैब-CD22 d1-d3 सह क्रिस्टल संरचना28को हल करके पहचाना गया था ।

Figure 1
चित्रा 1 . भौतिक और संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए डिजाइन के निर्माण से ग्लाइकोप्रोटीन लक्षण वर्णन का अवलोकन । (१) प्रतिनिधि ग्लाइकोप्रोटीन का प्राथमिक अनुक्रम विश्लेषण. धूसर में, extracellular डोमेन (ECD); हरे रंग में, transmembrane (TM) खंड; और नीले रंग में, ग्लाइकोप्रोटीन के cytosolic डोमेन । अनुमानित N-लिंक्ड glycans लेबल किए गए हैं । (२) ECD construction की क्लोनिंग. (३) स्तनधारी कोशिकाओं में ECD के निर्माण की अभिव्यक्ति. (४) ग्लाइकोप्रोटीन शुद्धि. जबकि प्रोटीन HEK293F में व्यक्त जटिल glycans शामिल होंगे, HEK293S में व्यक्त प्रोटीन उच्च mannose glycans होगा । N-लिंक्ड moiety साइट्स पर केवल एक GlcNAc glycosylation के साथ नच में इंडो H result के साथ HEK293S कोशिकाओं में उत्पादित नच का एंजाइमी ट्रीटमेंट. (5 ए) नच को-लेयर interferometry (BLI) और इज़ोटेर्माल अनुमापन calorimetry (आईटीसी) द्वारा एंटीबॉडी के लिए उनके बाइंडिंग के लिए परीक्षण किया जाता है । छोटे लाइगैंडों को अपनत्व भी आईटीसी से मापा जा सकता है. (5b) सजातीय n-लिंक्ड glycans के साथ नच का सघन परीक्षण, जैसे HEK293S में व्यक्त और deglycosylated के साथ इंडो ज. (6) कुछ मामलों में, N-लिंक्ड glycosylation साइटों के उत्परिवर्तन क्रिस्टल प्राप्त करने के लिए आवश्यक है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 . स्तनधारी कोशिकाओं में अभिव्यक्ति के लिए CD22 ectodomain डीएनए के डिजाइन का निर्माण । A) CD22 ECD construction के क्षणिक अभिकर्मक के लिए प्रयुक्त pHLsec प्लाज्मिड का निरूपण । क्लोनिंग के लिए इस्तेमाल AgeI और KpnI साइटों लाल बक्से के साथ संकेत दिया जाता है । B) CD22 ECD में सात ़ डोमेन (d1-d7) और 12 अनुमानित N-लिंक्ड glycosylation साइटें (नीले रंग में) शामिल हैं । CD22 ECD से चार भवन रचे गए । ग) 1% agarose जेल दिखाती है पीसीआर amplicons ऑफ CD22 ECD का निर्माण pHLsec स्तनधारी अभिव्यक्ति वेक्टर में क्लोनिंग के लिए । पहली लेन 1 केबी डीएनए मार्कर शामिल हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 3
चित्रा 3 . नच की अभिव्यक्ति और शुद्धि । A) अभिव्यक्ति पैदावार पर कोशिका घनत्व का प्रभाव । छोटे पैमाने में ग्लाइकोप्रोटीन अभिव्यक्ति 25 मिलीलीटर HEK293F की संस्कृति कोशिकाओं के तीन अलग शुरू घनत्व का उपयोग transfected कोशिकाओं (०.५ x 106 कोशिकाओं एमएल-1, १.० एक्स 10 6 कोशिकाओं एमएल-1, और १.५ x 10 6 कोशिकाओं एमएल -1). ठहराव बाएं पैनल में एसडीएस पृष्ठ से densitometry द्वारा प्रदर्शन किया और मात्रात्मक BLI द्वारा सही पैनल में । मान एक ग्लाइकोप्रोटीन तैयारी के प्रतिनिधि हैं । B) वर्णलेख के निर्माण के लिए प्रथम शुद्धिकरण चरण के CD2220-330, 5 . एक नी-ंत् संबध कॉलम का उपयोग कर supernatant के ६०० मिलीलीटर से । ग्लाइकोप्रोटीन imidazole (ग्रे लाइन), जहां १००% रेफरेंस बफर, जो ५०० मिमी imidazole शामिल करने के लिए संगत के एक ढाल का उपयोग eluted था । परित भागों ऊर्ध्वाधर लाइनों के साथ चित्रित कर रहे हैं । ग) आकार-अपवर्जन वर्णलेख के निर्माण के लिए CD2220-330, 5 ए उच्च प्रदर्शन जेल निस्पंदन कॉलम का उपयोग कर । रेफरेंस पीक से परित अंशों को अनुलंब रेखाओं के साथ दर्शाया गया है । इनसेट: Coomassie-सना एसडीएस-पेज जेल की पवित्रता दिखाती ग्लाइकोप्रोटीन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 . भारी परमाणुओं के साथ भिगोने क्रिस्टल । क) हा यौगिकों के साथ देशी क्रिस्टल भिगोने के लिए नमूना कार्य केंद्र । सभी आवश्यक उपकरण लेबल हैं । ख) का निर्माण CD2220-330, 5 हेक्टेयर यौगिकों के साथ क्रिस्टल सोख करने के लिए पीछा कदम । चरण 1, अच्छी तरह से क्रिस्टल से युक्त खुला है, और स्थानांतरण क्रिस्टल एक कवर पर्ची पर एक ०.२ µ एल ड्रॉप करने के लिए एक पाश का उपयोग युक्त हा समाधान क्रिस्टलीय हालत में पतला ऐसा है कि अंतिम एकाग्रता हा पर्वतमाला से 1-10 mM । चरण 2, क्रिस्टलीकरण प्लेट में छोड़ सील और समय के विभिन्न अवधि के लिए हा यौगिक के साथ क्रिस्टल की मशीन । चरण 3, पाश में लथपथ क्रिस्टल माउंट और वापस-तीन लगातार ०.२ µ एल बूंदों में 30 एस के लिए भिगोना युक्त मां शराब समाधान 20% के साथ पूरक (v/v) एक कवर पर्ची पर ग्लिसरॉल तिरस्कृत । चरण 4, फ्लैश क्रिस्टल फ्रीज तरल नाइट्रोजन के साथ एक पाश पर घुड़सवार और यह सिंक्रोट्रॉन beamline को लदान के लिए एक पक में जगह है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 . परत interferometry आणि इज़ोटेर्माल अनुमापन calorimetry माप. क) प्रतिनिधि BLI प्रयोग । शीर्ष पैनल: एक कैनेटीक्स प्रयोग के लिए प्लेट सेटअप का उदाहरण है, जहां निंनलिखित लेबल हैं: 1x कैनेटीक्स बफर (ख), अपने6x-टैग ग्लाइकोप्रोटीन लोडिंग (एल), प्रतिनिधि फैब सांद्रता (५००, २५०, १२५, ६२.५ एनएम), पंजाबियों + ५०० मिमी पुनर्जनन बफ़र (R), और 1x कैनेटीक्स बेअसर बफ़र (B) । प्रत्येक अच्छी तरह से समाधान के २०० µ एल शामिल हैं । कैनेटीक्स प्रयोग के लिए कदम संख्या प्लेट के शीर्ष पर संकेत दिया है । मध्य पैनल: BLI प्रयोग के प्रतिनिधि रॉ डेटा Ni-ंत् और शीर्ष पैनल में वर्णित प्लेट का उपयोग कर प्रदर्शन किया । चरण संख्या आधारभूत (1) के अनुरूप है, उसकी6x ग्लाइकोप्रोटीन लोडिंग (2), आधारभूत (3), फैब (4) और पृथक्करण (5) के धारावाहिक कमजोर पड़ने में सहयोग । पुनर्जनन चरण (चरण 6-7) का प्रतिनिधित्व नहीं कर रहे हैं । नीचे पैनल: प्रतिनिधि विश्लेषण कच्चे एसोसिएशन और इसी 1:1 फिट (लाल रेखा) के साथ पृथक्करण (नीली लाइन) दिखा डेटा । ख) शीर्ष पैनल: एक ९६-अच्छी तरह से गोल नीचे ब्लॉक में सात प्रयोगों के साथ एक स्वचालित आईटीसी साधन पर एक एकल आईटीसी चलाने के लिए प्रतिनिधि प्लेट सेटअप । प्रत्येक प्रयोग में तीन कुओं का समावेश है. पहले अच्छी तरह से (लाल) सेल (४०० µ एल) के लिए नमूने के अनुरूप है, दूसरी अच्छी तरह से (हरी) सिरिंज (१२० µ एल) के लिए नमूना से मेल खाती है. तीसरी अच्छी तरह से खाली छोड़ दिया है, और मिश्रित नमूनों यह अच्छी तरह से प्रयोग पूरा होने के बाद वापस आ जाएगा । प्रयोग 1, 2, और 7 बफर नियंत्रण में बफर हैं । प्रयोगों 3-5 सेल में ग्लाइकोप्रोटीन (पी) के साथ तपसिल प्रयोगों का प्रतिनिधित्व करते हैं और सिरिंज में फैब या ligand (एल). प्रयोग 6 कमजोर पड़ने नियंत्रण की एक ligand गर्मी का प्रतिनिधित्व करता है और डेटा विश्लेषण के दौरान 3-5 प्रयोगों से घटाया जाना चाहिए. नीचे पैनल: प्रतिनिधि रॉ (ऊपर) और संसाधित (नीचे) आईटीसी डेटा HEK293F कोशिकाओं में उत्पादित CD22 ECD करने के लिए फैब (epratuzumab) बाध्यकारी दिखा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

झिल्ली लंगर नच सेल समारोह के लिए महत्वपूर्ण है और आकर्षक चिकित्सीय लक्ष्य हैं । यहां, हम दोनों अकेले और छोटे अणु लाइगैंडों और फैब टुकड़े के साथ जटिल में झिल्ली नच के ECD के संरचनात्मक और भौतिक लक्षण वर्णन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । हम सफलतापूर्वक तीन एन टर्मिनल के क्रिस्टल संरचना का निर्धारण करने के लिए इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है-मानव CD2228के extracellular भाग के सबसे ़ डोमेन, बी कोशिकाओं पर एक महत्वपूर्ण सह रिसेप्टर जांच७९में विनोदी प्रतिरक्षा रखने में शामिल. हम भी अपनी प्राकृतिक ligand α 2-6 sialyllactose के साथ CD22 के बंधन साइट की विशेषता है, और मानव एंटीबॉडी के प्रति एक चिकित्सीय CD22 की मांयता की विधा परिभाषित । इन परिणामों Siglecs परिवार के एक प्रमुख सदस्य है कि बी कोशिकाओं पर अभिव्यक्ति प्रतिबंधित है की संरचना-समारोह संबंध में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं, और नए CD22 लक्षित छोटे अणु और एंटीबॉडी आधारित के विकास की दिशा में एक आणविक रोडमैप चिकित्सा विज्ञान. हालांकि इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक एक आइजी युक्त बी सेल रिसेप्टर के लिए इस्तेमाल किया गया था, हम प्रस्ताव है कि हमारे दृष्टिकोण एक विशिष्ट डोमेन संगठन के साथ किसी भी झिल्ली ग्लाइकोप्रोटीन के संरचनात्मक और भौतिक लक्षण वर्णन के लिए लागू किया जा सकता है । ऐसे मामलों में, डिजाइन और मिश्रित N-लिंक्ड glycan उत्परिवर्तनों का निर्माण (या तो Gln या ाला) के लिए एक क्रिस्टल विकास और उच्च संकल्प विवर्तन के लिए उपयुक्त निर्माण खोजने के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है ।

एक सजातीय और शुद्ध ग्लाइकोप्रोटीन नमूना प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण महत्व का है क्रिस्टल विकास और एक्स-रे विवर्तन, के रूप में अच्छी तरह के रूप में बहाव के लिए भौतिक लक्षण वर्णन । N-नच पर वर्तमान से जुड़े glycans स्वाभाविक विषम हैं, और ग्लाइकोप्रोटीन है कि क्रिस्टल गठन रोकते कर सकते है के भीतर और एक और रासायनिक विविधता पैदा कर सकता है । इस माइक्रो-विविधता, रणनीति है कि बिंदु उत्परिवर्तनों को हटाने के लिए बंदरगाह एन से जुड़े glycans, या उत्परिवर्ती सेल लाइनों (जैसे HEK293S के रूप में) का उपयोग endoglycosidases के साथ उपचार के बाद (जैसे EndoH) काफी कर सकते है की भविष्यवाणी के अवशेषों को कम करने के लिए सुधार क्रिस्टलीकरण सफलता15,21,22। इस प्रोटोकॉल में हम घुलनशील नच और Fabs की शुद्धि की चर्चा करते हैं जो कोशिका supernatant में स्रावित होते हैं । ग्लाइकोप्रोटीन स्राव, कोशिका lysis या कठोर रसायनों या डिटर्जेंट के अलावा की आवश्यकता के बिना शुद्धता की दिशा में एक अपेक्षाकृत सरल मार्ग प्रदान करता है । सेल supernatant, सेल संचयन निंनलिखित प्राप्त तो सीधे एक कॉलम है कि ब्याज के प्रोटीन के लिए अपनत्व है पर चला जाता है (जैसे, Ni-ंत् के लिए अपने-टैग नच के लिए, या नियंत्रण रेखा फैब टुकड़े के लिए समानता) । हालांकि, उपयोग के कॉलम और सेल supernatant (जैसे, पीएच) की शर्तों के आधार पर, स्तंभ के लिए ब्याज की प्रोटीन की बाध्यकारी क्षमता प्रभावित हो सकता है । यदि यह मामला है, यह ध्यान केंद्रित करने के लिए आवश्यक हो सकता है और स्तंभ के लिए बाइंडिंग में सुधार करने के लिए कक्ष supernatant exchange बफ़र । इसके अलावा, यह दृढ़ता से सिफारिश की है कि शुद्धीकरण के दौरान गुणवत्ता नियंत्रण कदम प्रोटीन शुद्धता का आकलन करने में मदद करने के लिए कार्यरत है । एक एसडीएस-पृष्ठ जेल या सभी नमूनों के पश्चिमी दाग (पहले, के दौरान और शुद्धिकरण कदम के बाद) चल रहा है कि प्रस्तावित शुद्धिकरण योजना ब्याज के प्रोटीन के लिए उपयुक्त है में अंतर्दृष्टि उपज सकते हैं । यदि दूषित बैंड एसडीएस पर दिखाई दे रहे हैं-पृष्ठ, या यदि कई प्रजातियों शुद्धि के दौरान प्राप्त कर रहे हैं (जैसे, आकार अपवर्जन पर कई चोटियों), अतिरिक्त शुद्धि कदम माना जाना चाहिए, जैसे, आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी, लाभ के लिए पवित्रता में और बहाव क्रिस्टलीकरण८०की संभावना में वृद्धि ।

macromolecular क्रिस्टलीकरण के लिए, यह अक्सर ब्याज की उच्च पैदावार प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है उच्च प्रोटीन सांद्रता में संभावित क्रिस्टलीकरण की स्थिति की एक बड़ी संख्या की स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देने के लिए उपयुक्त क्रिस्टल हिट लगता है । आम तौर पर, HEK293 सेल लाइनों यहां चर्चा की (HEK293F और HEK293S) मजबूत अभिव्यक्ति प्रणालियों रहे हैं, और आसानी से किया जा सकता है के लिए आवश्यक के रूप में अधिक नमूना उत्पादन । हालांकि, यह संभव है कि ब्याज की प्रोटीन इन सेल लाइनों के भीतर पर्याप्त व्यक्त नहीं कर सकते हैं । इन मामलों में, अन्य सेल लाइनों, जैसे Expi293 कोशिकाओं८१,८२, प्रोटीन अभिव्यक्ति के बेहतर स्तर दिखाने के लिए पाया गया है और एक विकल्प के रूप में माना जाना चाहिए.

यदि अच्छी तरह से आदेश दिया, diffracting क्रिस्टल उच्च शुद्धता के बावजूद ब्याज की प्रोटीन के कई निर्माण के परीक्षण के बाद प्राप्त नहीं कर रहे हैं, यह क्रिस्टलीकरण तकनीक का विस्तार करने के लिए आवश्यक हो सकता है करने के लिए क्रिस्टल गठन को बढ़ावा देने । यह दिखाया गया है कि एंटीबॉडी और nanobodies के फैब टुकड़े उत्कृष्ट क्रिस्टलीकरण बढ़ाने हो सकता है, और अच्छी तरह से बढ़ावा देने के क्रिस्टल पैकिंग८३,८४,८५का आदेश दिया । इन टुकड़ों को व्यक्त किया जा सकता है और सजातीयता को शुद्ध, और ब्याज की प्रोटीन के साथ एक जटिल में इस्तेमाल के लिए क्रिस्टलीकरण को बढ़ावा देने के । महत्वपूर्ण बात, खंड 10 में वर्णित के रूप में फैब टुकड़े का उत्पादन गैर कार्यात्मक नियंत्रण रेखा dimers८६के रूप में एक प्रवृत्ति हो सकती है । ये dimers हैं तथा शुद्धिकरण के दौरान इन्हें हटाया जाना चाहिए. हमारे अनुभव में, LC dimers अक्सर आकार अपवर्जन पर एक अलग प्रतिधारण मात्रा है, या आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी पर एक अलग चोटी के रूप में elute, और इस तरह फैब शुद्धि से हटाया जा सकता है-लेकिन यह हमेशा मामला नहीं है । यदि इन तकनीकों को फैब शुद्धि से LC dimers को दूर करने के लिए अपर्याप्त हैं, अतिरिक्त शोधन विधियों, जैसे प्रोटीन G संबध शुद्धि, पवित्रता में सुधार करने के लिए नियोजित किया जा सकता है ।

फैब टुकड़े के साथ सह के लिए वैकल्पिक, अच्छी तरह से प्रलेखित तकनीक जैसे यादृच्छिक मैट्रिक्स microseeding प्राप्त करने की संभावना में सुधार कर सकते है अच्छी तरह से आदेश दिया क्रिस्टल६३,७०। इस विधि क्रिस्टलीकरण हालत में कुचल, उपइष्टतम क्रिस्टल की छोटी मात्रा के अलावा शामिल है, एक क्रिस्टल nucleate प्रदान करने के लिए क्रिस्टल विकास को बढ़ावा देने के । यह ब्याज, या समान डोमेन वास्तुकला और तृतीयक संरचना के साथ लोगों के प्रोटीन के क्रिस्टल का उपयोग किया जा सकता है । इसके अलावा, यादृच्छिक मैट्रिक्स microseeding के प्रयास में प्रदर्शन किया जा सकता है अकेले प्रोटीन सघन, या जटिल में एक फैब टुकड़ा या ब्याज की छोटी अणु के साथ । क्रायो में हाल ही में अग्रिम-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी भी इस तकनीक को उपयुक्त सुविधाओं के साथ अणुओं के लिए उच्च संकल्प संरचनात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए एक्स-रे क्रि के लिए एक आकर्षक विकल्प८७,८८, ८९,९०,९१.

जब एक्स-रे विवर्तन डेटासेट के चरणबद्ध श्री द्वारा विफल रहता है, हा भिगोने के लिए विषम फैलाव या isomorphous प्रतिस्थापन द्वारा चरण समस्या को हल करने की आवश्यकता हो सकती है । प्रोटीन के अमीनो एसिड अनुक्रम का निरीक्षण बाध्यकारी के लिए इष्टतम पीएच सहित हा derivatization, के लिए रणनीति के बारे में सुराग प्रदान कर सकते हैं । विशेष रूप से, प्रोटीन के भीतर ख़राब cysteines विशेष रूप से बांध कर सकते है हा यौगिकों कि पारा होते हैं । हा यौगिकों के साथ देशी क्रिस्टल भिगोने इष्टतम हा यौगिक की पहचान निर्धारित करने के लिए एक चलने प्रक्रिया है, अपनी एकाग्रता, और आवश्यक मशीन समय. प्रारंभिक भिगोने का प्रयास अच्छी तरह से उपज नहीं है, तो diffracting क्रिस्टल चरणबद्ध के लिए उपयुक्त एक हा युक्त, यह अमीनो एसिड प्रतिस्थापन की संभावना में सुधार करने के लिए लागू करने के लिए आवश्यक हो सकता है हा बाध्यकारी और विषम संकेत में सुधार होगा । उदाहरण के लिए एक मुक्त cysteine अवशेषों को कुशलता से पारा, Au, पीटी या पंजाब में बांध शामिल उत्परिवर्तनों शामिल हैं । ई. कोलाई में एक seleno-methionine पूरक मीडिया में विषम चरणबद्ध के लिए प्रोटीन की अभिव्यक्ति बड़े पैमाने पर विषम चरणबद्ध के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन एक बराबर प्रणाली है कि मज़बूती से seleno-methionine निलंबन९२,९३में स्तनधारी कोशिकाओं के लिए आसानी से उपलब्ध नहीं है, और भविष्य के विकास का एक क्षेत्र है शामिल हैं ।

एक बार ब्याज की ग्लाइकोप्रोटीन की unliganded संरचना प्राप्त की है, छोटे अणु लाइगैंडों के साथ क्रिस्टल भिगोने प्रतिरक्षा रिसेप्टर की एक संरचना-ligand परिसर प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है । इन आंकड़ों के तर्कसंगत डिजाइन के लिए एक खाका प्रदान करते है और अधिक विशिष्ट और उच्च अपनत्व लाइगैंडों कि छोटे अणु चिकित्सीय उपचार के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में अच्छी तरह के रूप में ग्लाइकोप्रोटीन के जैविक समारोह में उच्च संकल्प अंतर्दृष्टि प्रदान करता है । जब ब्याज की छोटी अणु लाइगैंडों के साथ ग्लाइकोप्रोटीन क्रिस्टल सोख करने का प्रयास, unliganded क्रिस्टल संरचना के निरीक्षण से संकेत मिलता है कि भिगोना संभव होना चाहिए सकते हैं । यदि बंद क्रिस्टल पैकिंग संपर्क ligand-बाध्यकारी साइट या आसपास ligand बंधन पर गठन के परिवर्तन से गुजरना की उंमीद क्षेत्रों के आसपास पाया जाता है, भिगोने की संभावना समस्याग्रस्त हो जाएगा । इस मामले में, प्रोटीन-ligand परिसर के सह-क्रिस्टलीकरण जैसे अन्य तरीकों का प्रदर्शन किया जाना चाहिए ।

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी रुचि नहीं घोषित करते हैं ।

Acknowledgments

एक्स-रे विवर्तन प्रयोगों के इस पत्र में वर्णित 08 beamlines का उपयोग प्रदर्शन किया गया आईडी और 08-बी एम के लिए कनाडा के प्रकाश स्रोत है, जो कनाडा के नवाचार के लिए फाउंडेशन, प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद द्वारा समर्थित है पर कनाडा, Saskatchewan विश्वविद्यालय, Saskatchewan की सरकार, पश्चिमी आर्थिक विविधीकरण कनाडा, राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद कनाडा, और स्वास्थ्य अनुसंधान के कनाडाई संस्थानों । हम संरचनात्मक और भौतिक कोर सुविधा, बीमार बच्चों के लिए अस्पताल, आईटीसी और BLI उपकरणों के लिए उपयोग के लिए स्वीकार करना चाहते हैं । J.E.O. स्वास्थ्य अनुसंधान के कनाडाई संस्थानों से बंटिंग Postdoctoral फैलोशिप BPF-१४४४८३ द्वारा समर्थित किया गया था । T.S. एक कनाडा स्नातक छात्रवृत्ति है मास्टर पुरस्कार और एक वाणी कनाडा स्वास्थ्य अनुसंधान के कनाडा के संस्थानों से स्नातक छात्रवृत्ति के एक प्राप्तकर्ता है । यह काम स्वास्थ्य अनुसंधान के कनाडाई संस्थानों से ऑपरेटिंग ग्रांट PJT-१४८८११ (जे.-पीजे) द्वारा समर्थित किया गया था । यह शोध शुरू किया गया था, भाग में, कनाडा अनुसंधान कुर्सियों कार्यक्रम (जे-पीजे)से धन के लिए धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm Steritop filter EMD Millipore SCGPS02RE
10 well 4-15% gradient SDS-PAGE gel Bio-Rad 4561084
10x glycobuffer 3 New England Biolabs P0702S Comes with Endo H reagent
10x Kinetics Buffer PALL FortéBio 18-1092
10x Tris/Glycine/SDS Buffer Bio-Rad 1610732
1 mL round bottom 96 well block ThermoFisher 260251
22 mm cover slip Hampton research HR3-231
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747
96-3 well INTELLIPLATE  low volume reservior Art Robbins Instruments 102-0001-03
AgeI New England Biolabs R0552S
ÄKTA Pure GE Healthcare
ÄKTA Start  GE Healthcare
Amicon Ultra 15 centrifugal filtration device 10KDa MWCO Millipore UFC901008
Amicon Ultra 4 centrifugal filtration device 10KDa MWCO Millipore UFC801008
Auto-iTC200 Malvern
Axygen MaxyClear Snaplock 1.5 mL microtubes Fisher Scientific MCT150C
Countess Cell Counting Chamber Slides Thermo Fisher Scientific C10228
CryoLoop 18 x 0.05-0.1 mm Hampton research HR4-945
CryoLoop 18 x 0.1-0.2 mm Hampton research HR4-947
CryoLoop 18 x 0.2-0.3 mm Hampton research HR4-970
Digital Dry Bath Bio-Rad 1660562EDU
E. coli DH5α Invitrogen 18258012
Endo H New England Biolabs P0702S
Erlenmeyer flask (baffled base), polycarbonate, sterile, 500 mL, DuoCAP TriForest Labware FBC05000S
Erlenmeyer flask 125 mL (baffled base), polycarbonate, sterile, 125 mL with vented cap VWR 89095-258
Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 10 mL Greiner Bio-One 607180
Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 25 mL Greiner Bio-One 760180
Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 5 mL Greiner Bio-One 606180
Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 50 mL Greiner Bio-One 768180
FectoPRO DNA Transfection Reagent, Polyplus VWR 10118-842
Freestyle 293F cells Thermo Fisher Scientific R79007
Freestyle Expression medium Thermo Fisher Scientific 12338001
Heavy Atom Screens Au Hampton research HR2-444
Heavy Atom Screens Hg Hampton research HR2-446
Heavy Atom Screens M1 Hampton research HR2-448
Heavy Atom Screens M2 Hampton research HR2-450
Heavy Atom Screens Pt Hampton research HR2-442
HEK 293S ATCC ATCC CRL-3022
HisTrap Affinity Column GE Healthcare 17525501
HiTrap KappaSelect Affinity Columns GE Healthcare 17545811
HiTrap LambdaSelect Affinity Columns GE Healthcare 17548211
KpnI New England Biolabs R0142S
MCSG-1 Crystal Screen 1.7 mL block Anatrace MCSG-1
MCSG-2 Crystal Screen 1.7 mL block Anatrace MCSG-2
MCSG-3 Crystal Screen 1.7 mL block Anatrace MCSG-3
MCSG-4 Crystal Screen 1.7 mL block Anatrace MCSG-4
Mercuric chloride Sigma 1044170100
Microplate, 96 well, polypropelene, flat bottom, black  Greiner Bio-One 655209
Minstrel DT UV Formulatrix
Multitron Pro shaker Infors HT MP25-TA-CO2HB
Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-2000
Nanosep 3K Omega centrifugal device PALL Life Science OD003C33
Ni-NTA biosensors PALL FortéBio 18-5102
Octet RED96 PALL ForteBio
Oryx 4 crystallizaiton robot Douglas Instrument ORY-4/1
Platinum chloride Sigma 520632-1g
Precision Plus Protein Standard Bio-Rad 161-0374
PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit Invitrogen K210006
Quick Coomassie Stain Protein Ark GEN-QC-STAIN-1L
Steriflip Sterile 50 mL Disposable Vacuum Filtration System 0.22 µm Millipore Express EMD Millipore SCGP00525
Superdex 200 Increase 10/300 GL GE Healthcare 28990944
Superose 6 10/300 GL GE Healthcare 17517201
Tantalum bromide cluster Jena bioscience PK-103
Top96 Crystallization Screen Rigaku Reagents 1009846
Tryphan Blue Thermo Fisher Scientific T10282
VDX 24-well with sealant Hampton research HR3-172
α2-6 sialyllactose Sigma Aldrich A8556-1mg

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References

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Ereño-Orbea, J., Sicard, T., Cui, H., Akula, I., Julien, J. P. Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques. J. Vis. Exp. (137), e57750, doi:10.3791/57750 (2018).

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