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Biochemistry

X 선 결정학 및 생물 기술에 의해 면역 글로불린 겹와 Glycoproteins의 특성

Published: July 5, 2018 doi: 10.3791/57750
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1, 1,2,3
1Program in Molecular Medicine, The Hospital for Sick Children Research Institute, 2Department of Biochemistry, University of Toronto, 3Department of Immunology, University of Toronto
* These authors contributed equally

Summary

우리 면역 글로불린 겹 biolayer 간섭계, 등온선 적정 열 량, 및 x-선 결정학에 의해 glycoproteins의 생물 및 구조적 특성에 대 한 접근 방법 제시.

Abstract

Glycoproteins 세포의 표면에 접착 및 전송 신호를 포함 한 세포 기능에 중요 한 역할을 재생 합니다. 백혈구에이 glycoproteins의 여러 면역 글로불린 (Ig) 주름을 소유 하 고 면역 인식 및 규정은. 여기, 우리 디자인, 식 및 인간 B 세포 수용 체 CD22의 세포 외 도메인의 생물 특성에 대 한 플랫폼을 제시. 우리는 이러한 방식을 Ig 도메인을 포함 하는 포유 동물 당단백질 ectodomains의 특성에 광범위 하 게 적용 되는 것을 제안 합니다. 두 개의 서 스 펜 션 인간 미 발달 신장 (HEK) 셀 라인, HEK293F 및 HEK293S, glycoproteins 각각 복잡 하 고 높은-만 노 오 스 glycans를 은닉을 표현 하는 데 사용 됩니다. 다른 glycoforms와 함께 이러한 재조합 glycoproteins glycan 크기와에 ligand 바인딩 구성의 효과 조사 하 고 있습니다. 우리 토론 활동 및 생물학 관련 ligands 및 치료 항 체 후보 당단백질 바인딩의 열역학 공부에 대 한 프로토콜. HEK293S 세포에서 생산 하는 재조합 glycoproteins glycan 동질성, 감소 유연성과 민감성 endoglycosidase H 치료에 대 한 결정 의무가 있습니다. 우리는 각각 당단백질 결정 무거운 원자 및 단계 결정과 ligand 바인딩의 분석에 대 한 작은 분자를 몸을 담글에 대 한 방법을 제시. 실험 프로토콜 논의 여기 그들의 기능에 대 한 통찰력을 제공 하 고 치료의 행동의 메커니즘을 조사에 포유류 glycoproteins 특성에 대 한 약속 잡으십시오.

Introduction

표면 단백질 세포 기능에 중요 한 역할을 재생합니다. 그들의 세포 외 도메인을 통해이 막 단백질 세포 세포 상호 작용, 접착, 전송 및1,2신호를 조절 수 있습니다. 이 단백질의 extracellular 지역화는 그들에 게 다양 한 질병, 암 및 면역 질환3,,45 등의 치료에 대 한 치료제의 개발에 대 한 매력적인 대상 , 6 , 7. 인간의 막 단백질 ectodomains의 가장 일반적인 주름 중 하나는 7 개 이상의 β 물가 2 개의 β-시트8,9으로 배열에 의해 형성 되는 면역 글로불린 같은 (Ig) 배. 일반적으로, glycoproteins Ig를 포함 하는 세포 외 막 단백질10부분에 순차적으로 정렬 된 서 도메인 멀티 도메인 구조. 포스트 번역 상 수정이 세포 표면 단백질, 특히 N-및 O-연결 된 glycosylation의 그들의 레 귤 레이 션, 접이식, 분 비 및 기능11에 필수적인 역할을 보여왔다. 그들의 기능은 그들을 타겟팅 할 수 있습니다 더 나은 디자인 치료제를 우리의 이해를 개선, 기술 하는 필요를 그들의 상세한 분자 특성에 대 한 허용. 여기, 우리는 생물을 허용 하는 기술의 조합을 제시 (biolayer 간섭계 (BLI) 및 등온선 적정 열 량 (ITC)) 및 포함 하는 Ig의 세포 외 도메인의 구조 (x-선 결정학) 특성화 막 glycoproteins, 혼자이 고, 단지 그들의 생물학 관련 ligands와 치료 분자 (그림 1)에서

N 연결 glycosylation 포유류 단백질에서 가장 일반적인 번역 후 수정 중 이며 바인딩과 그물 및 골12,13내 단백질 성숙 하는 동안 발생 합니다. 셀 라인 (HEK) 인간 미 발달 신장 293 세포, 등 대량의 당화 포유류 단백질14,15의 재조합 형 식에 대 한 개발 되었습니다. 이 셀 라인 부착 세포 라인에 비해 대량 단백질 생산 확장의 용이성을 위해 수 있는 서 스 펜 션 형식으로 개발 되었습니다. 여기, 우리 두 HEK293 세포 라인 활용: HEK293F 및 HEK293 Gnt 나-/- (HEK293S), N-acetylglucosaminyl 전이 효소의 부재에 의해 차이가 나는 (Gnt 나) 후자에. 차례로, (에서 본된 HEK293F)으로 복잡 한 glycans의 생산은 불가능 하 고 대신 높은 노 오 스-타입 glycans (주로 남자5GlcNAc2) N 연결 glycan 사이트18,19,20에서 거주 . 동시에이 두 셀 라인을 사용 하 여 생물 학적 기능 및 치료 대상에 glycan 크기와 복잡성의 효과 공부 하 고 있습니다. 실제로, HEK293F 세포에서 생산 하는 glycoproteins HEK293S 세포에서 생산 하는 동일한 당단백질에 비해 더 크고, 더 복잡 한 glycans를 있을 것 이다. Glycoproteins HEK293S 세포에서 생산 되는 그들의 N-연결 된 glycans의 감소 된 화학 및 구조적이 더 많은 의무가 결정, 됩니다. 더욱 개선 하기 위해 crystallizability, glycoproteins HEK293S (그러나 아닙니다 HEK293F) 세포에서 생산 효소 endoglycosidase H (엔도 H), 귀착되 고만 노 오 스 glycans의 분열 등으로 치료 될 수만 있는 단일 N-acetylglucosamine (GlcNAc) moiety 각 N 연결 glycosylation 사이트21,22에 남아 있다. 다른 방법 또한 당단백질 식, kifunensine23를 포함 하 여 동안 glycosyltransferase 억제제의 추가 같은 셀 내에서 N glycan 처리를 제한 사용할 수 있습니다. 대체 방법을 효소 deglycosylation 펩 티 드 N glycosidase F (PNGaseF)를 사용 하 여 다음 기본 glycoproteins (HEK293F 세포)에 식을 포함 한다. 그러나, PNGaseF와 deglycosylation 기본 조건 및 증가 집계 어떤 단백질;에 덜 효과적인 것으로 표시 되었습니다. 경우에는 단백질 치료 후, 수용 성 유지 그것 가져옵니다 aspartic 산24, 아스파라긴 잔류물의 deamidation 때문에 표면에 음 전을 그것의 결정 화에 대 한 될 수 있습니다. 예측된 N glycosylation 사이트 수 또한 변경 될, 알라닌 또는 글루타민 잔류물,이 사이트에서 glycosylation N 연결을 방지 하 고 높은 동질성의 당단백질 샘플을 생성 하는 가장 자주. 또는, glycoproteins 효 모, 곤충, 및 공장 시스템, 또는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포16,17등 다른 포유류 세포 라인을 포함 하 여 다른 진 핵 세포 배양에서 생산 수 있습니다.

PHLsec를 포함 하 여 많은 포유류 식 벡터 셀 중간25에 재조합 당단백질 ectodomains의 분 비에 대 한 수 있습니다. HEK293 세포에서 glycoproteins의 분 비 세포 세포의 용 해에 대 한 필요 없이 신속 하 고 쉽게 정화 수 있습니다. 정화 태그의 추가 (예: 그의 태그, Strep 태그 플래그-태그, Myc-태그, 하-태그) 대상의 N 또는 C terminus 당단백질 단일 단계 친화성 크로마토그래피에 의해 정화 있습니다. 그 후, 크기 배제 크로마토그래피는 생물 및 구조적 특성에 대 한 단 분산 예제를 사용할 수 있습니다.

적절 한 조건 하에서 매우 순수 하 고 균질 당단백질 샘플 잘 diffracting 결정에서 발생할 수 있습니다. 전체 x 선 회절 데이터 집합 같은 결정에서 얻은 되어, 초기 단계는 당단백질의 전자 밀도 계산 하기 위해 결정을 해야 합니다. 구조 단백질 데이터 은행 (PDB)에서 이제까지 증가 수, 덕분에 단계적으로 대 한 가장 일반적으로 사용 되는 방법 지금까지 초기 단계26관련된 단백질 구조를 사용 하 여 분자 교체 (MR) 되고있다 합니다. 그러나, 때때로 멀티-Ig 도메인 glycoproteins27,,2829경우 되었습니다 미스터 위상 문제를 해결 하기 위해 실패 하면 다른 방법이 제시해 주셔야 합니다. 이 문서에서는, 우리 CD22 ectodomain28의 구조를 해결 하는 데 필요한 있던 단계적으로 조정, 무거운 원자 (HA)와 결정을 방법 선발. 단계적으로 조정 하는 권리를 식별 특정된 결정 격자와 결정 화 솔루션30,31당단백질에 사용할 수 있는 원자 하 반응에 의존 하는 반복적인 프로세스입니다. 또는, 시스테인과 메티오닌 잔류물에 자연 유황 원자 단계적으로 조정, 당단백질에 다른 원자에 충분히 높은 비율에 있는 경우 그리고 만약 충분히 높은 중복32, x 선 회절 데이터를 수집할 수 있습니다. 사용할 수 있습니다. 33.

멤브레인 glycoproteins의 생물 학적 기능은 종종 탄수화물과 같은 단백질 단백질 상호 작용 또는 상호 작용 단백질-리간드, 중재. ligand는 결정 격자에 있는 당단백질 바인딩 사이트에 솔루션에서 확산, 실험을 몸을 담글 수 있습니다 리간드 인식을 이해 하기 당단백질 ligand 공동 결정 구조를 성공.

여기에 제시 된 프로토콜 합성 치료 ligands34,35 및 항 체 치료제36,37와 표면 glycoproteins의 상호 작용을 이해 관련이 있습니다. 결합 구조 정보, 활동 및 열역학을 바인딩 이해 하 고 그들의 행동의 메커니즘을 개선 하는 강력한 될 수 있습니다. 치료 항 체는 당단백질에 바인딩의 운동 분석을 허용 하는 1 개의 기술은 씨38,39이다. 라스 고정된 ligand와 바이오 센서를 사용 하 여 바인딩 파트너, 궁극적으로 결정 하는 평형 분리 상수 (KD) 협회 및 분리 속도 측정. Glycoproteins의 적은 양이 필요 하기 때문에 씨는 매력적인 방법입니다 (< 100 µ g), 실험 시간 빠릅니다 (10 ~ 15 실행 당 분), 그리고 자동화 될 수 있다. ITC는 또한 glycoproteins와 바인딩 파트너40,41,,4243사이의 선호도 공부 하 고 유용 합니다. ITC는 더 많은 시간과 집중 시 약, (ΔG, ΔH, ΔS, 및 산출할) 상호 작용의 열역학에 관한 귀중 한 정보를 얻을 수 있습니다. ITC는 또한 수시로 ligands에 표면 glycoproteins의 과도 바인딩 연관 된다 약한 상호 작용을 공부 하 고 매우 유용 합니다. 또한, 이러한 기법을 평가의 다양 한 구문 바인딩 다른 세포에서 당단백질 표현에서 얻은 다른 N-연결 된 glycoforms의 효과 평가 하는 함께에서 사용할 수 있습니다. Glycoproteins HEK293F, HEK293S에서에서 생산 하 고도 H로 치료와 씨와 ITC 수행 생물 활동 및 치료 참여에 glycans의 역할의 깊이 보기를 제공할 수 있습니다.

우리는 성공적으로 인간의 CD2228,44 B 세포 항상성 유지 하기 위한 필수적인 sialic acid 바인딩 Ig 같은 lectins (Siglecs) 가족의 당단백질 구성원의 세포 외 도메인 (ECD)의 특성을 이러한 프로토콜 적용 . 우리는 결정 화를 촉진 하기 위하여 심층 구조 설계를 수행 하 고 Hg에 몸을 담글 하 여 x-선 데이터 집합 위상. 우리는 또한 면역 수용 체 ligand 복합물의 구조를 그것의 ligand sialic 산 (α2-6 sialyllactose) CD22 결정을 젖 었 고 따라서 glycan mimetics45,46의 구조 기반 디자인에 대 한 청사진을 제공. 또한, 우리 생성 안티 CD22 치료 항 체 epratuzumab-현재 비-Hodgkin의 림프 종47단계 III 임상 시험에서에서 치료 후보-의 단편 항 원 바인딩 (팹) 씨에 의해 그것의 바인딩 선호도 결정 하 고 차동 당화를 ITC CD22 ECD를 생성합니다. 이러한 연구는 CD22 인식 역 기능 B 세포에 대 한 잠재적인 영향으로 epratuzumab 연계, glycosylation N 연결에 대 한 중요 한 역할을 계시 했다.

Protocol

1. 당단백질 ECD에 대 한 디자인 구성

  1. 인간의 CD22의 아미노산 시퀀스를 평가 (Uniprot) 단백질48,49내에 있는 예측된 도메인 요소와 경계를 식별 하는 InterPro 및 Phyre2 서버를 사용 하 여.
  2. 복제 인간의 CD22, 신호 펩타이드, 막 횡단 및 cytosolic 도메인 (잔류물 20-687, 여기서 부터는 CD22 extracellular 도메인, CD22 ECD) 사용 하 여 제한 효소 AgeI 및 KpnI (pHLsec 포유류 식 벡터25 에 부족의 순서 그림 2 A) 50.
    참고: pHLsec 벡터25포유류 세포 있는 수용 성, 분 비 단백질의 overexpression에 최적화 되어 있습니다. 이 벡터 녹는 glycoproteins의 세포 외 분 비에 대 한 허용 하도록 분 비 신호를 포함 되어 있습니다. pHLsec에는 고정된 금속 친화성 크로마토그래피 방법을 사용 하 여 셀 supernatants에서 친 화력 정화를 촉진 하기 위하여 C-터미널 (그의)6 x 태그를 포함 되어 있습니다.
  3. C-터미널 Ig 도메인 순차 삭제 CD22 ECD의 잘린된 구조 복제: 1-6 (잔류물 20-687), 1-5 (잔류물 20-592) 도메인, 도메인 1-4 (20-504 잔류물) 도메인과 도메인 1-3 (20-330 잔류물) (그림 2B와 2c)50 .
  4. NetNGlyc 서버를 사용 하 여 예측된 N 연결 glycosylation 사이트 구문51에 식별 CD22 ECD의 기본 시퀀스를 평가 합니다.
  5. 사용 하 여 사이트 지시 된 mutagenesis, 표준 프로토콜52 또는 PCR53, 중복 변형 각 예측된 N 연결 glycosylation 사이트 (Gln에 Asn 또는 Asn Ala) CD22 ECD의 단일 또는 몇 가지를 포함 하는 구조를 만드는 N 연결 glycosylation 돌연변이입니다.
  6. 유능한 대장균 변환 순서 확인 후 복제 구문, DH5α 세포54 와 맥시 prep (제조 업체의 지침)에 따라 DNA transfection에 대 한 준비.

2. HEK293F 및 HEK293S 셀 설립

참고: 필요한 시 약 및 장비를 가진 HEK293F 또는 HEK293S 세포의 모든 조작 적당 한 biosafety 캐비닛에 biosafety 수준 2 시설에서 수행 되어야 합니다. 모든 항목의 외부 표면 70% 에탄올 솔루션 또는 해당 시는 살 균 되어야 합니다.

  1. HEK293F 및 HEK293S 현 탁 액 셀 ( 재료의 표참조)을 얻기까지 사용 하기 위해 준비-80 ° C에서 저장.
  2. 미디어 따뜻한 ( 재료의 표참조)를 37 ° C 물 욕조에 1 h. 환풍구 뚜껑 125 mL 당황된 셀 문화 플라스 크를 따뜻하게 미디어의 24 mL를 전송 합니다.
  3. 1 mL 셀 aliquot-80 ° C 및 얼음 전송에서 얻을.
  4. 부분적으로 세포를 해 동 약 1 분 동안 37 ° C 물 욕조에 셀을 품 어. 셀의 1 mL 유리병에서 125 mL 당황된 셀 문화 플라스 크 포함 하는 미디어 전송.
  5. 발명 캡 셀 문화 플라스 크 그리고 장소 플라스 크 37 ° C, 130 rpm, 습도 70% 및 8% CO2로 설정 통에 닫습니다.

3. HEK293 세포 유지 보수

참고: 셀 밀도 세포의 생존 해야 녹고 후 약 24 시간 체크. 이 단계는 세포 접종; 다음 복구 보장 초기 생존 해야한다 > 80%.

  1. 신중 하 게 신선한 현 탁 액 셀을 포함 하는 125 mL 플라스 크에서 셀의 10 µ L을 제거 하 고 살 균 1.5 mL microtube에 그것을 전송. 플라스 크를 닫고 인큐베이터를 반환 합니다.
  2. 셀을 포함 하는 1.5 mL microtube로 Trypan 블루 솔루션의 10 µ L를 플라스틱, 철저 하 게 혼합 하 고 세 슬라이드의 약 실에 10 µ L를 전송.
  3. 자동 셀 카운터로 세 슬라이드를 넣고 (셀 mL-1단위로) 셀 밀도 세포 생존 능력 (비율)에 대 한 값을 얻을.
  4. ~0.8 x 106 셀 mL-1 다음과 같은 방정식을 사용 하 여 최종 밀도에 신선한 200 mL 문화를 예방 하는 데 필요한 것이 셀의 볼륨을 계산:
    Equation 1(1)
    Equation 2(2)
    참고:이 걸릴 수 있습니다 ~ 200 mL 문화에 접종에 대 한 적합 한 세포 밀도를 5 d.
  5. 일단 셀 밀도 200 mL 문화의 접종에 대 한 충분 한, 37 ° C에 1 시간 워밍업 미디어 목욕 물 하 고 biosafety 캐비닛으로 따뜻하게 미디어를 전송.
  6. 발명된 모자와 함께 500 mL 당황된 셀 문화 플라스 크에 필요한 양의 (서 방정식 2에서 계산 된) 미디어를 전송 신중 하 게 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여.
  7. 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 미디어가 있는 500ml 당황된 셀 문화 플라스 크에 (방정식 1에서에서 계산) 현 탁 액 셀의 필요한 볼륨 전송.
  8. 새로운 200 mL 유지 보수 재고 모자 고 인큐베이터에 그것을 반환 합니다. 약 3 x 106 세포 mL-1의 밀도를 세포를 성장 한다. 통로 106 세포 mL-1 x 0.8의 조밀도에 셀 셀 (섹션에서에서 설명한 대로 3.4-3.7)의 안정 된 문화를 유지 하기 위해 매일 2-3 d. X 106 세포 mL-1~ 4의 밀도 초과 하는 세포를 허용 하지 않습니다.

4. 당단백질 식 HEK293 세포의 transfection

  1. 계산 볼륨 세포 transfection 0.8 x 10에 대 한 200 mL 문화에 필요한 미디어의6 mL-1 (섹션 3.4에서에서 식 1 및 2 사용 하 여) 세포.
    참고: 수행할 수 있는 200 mL transfections 수 유지 보수의 세포 밀도에 따라 달라 집니다.
  2. 발명된 모자와 함께 새로운 500 mL 셀 문화 플라스 크에 미디어와 transfection에 대 한 셀의 필요한 볼륨을 전송 하 고 인큐베이터에 셀 주식을 반환 합니다.
  3. 셀 분할에 따라 순응을 셀 수 있도록 transfection 전에 1 시간을 품 어.
  4. 살 균 50 mL 원뿔 튜브로 50 µ g의 DNA 전송 및 미디어의 5 mL로 희석. 진공 0.22 μ m 여과 시스템을 사용 하 여 다른 무 균 튜브에 희석된 DNA 필터링.
  5. 혼합 희석, transfection 시 약 질량: 볼륨 1:1 비율에 DNA 필터링. 부드럽게 혼합 하 고 10 분 동안 실내 온도에 솔루션을 품 어 DNA: transfection 시 약 해결책을 소용돌이 친다.
  6. 셀에 직접 DNA: transfection 시 솔루션을 추가 합니다. 37 ° C, 130 rpm, 습도 70% 및 8% CO2 5-7 d 통에 transfected 세포를 품 어.

5입니다. 세포 Transfection 조건의 최적화

참고: 최대 당단백질 수율에 대 한 세포 transfection 조건 최적화, transfect 세포 초기 셀 밀도의 다양 한에서와 시간(그림 3)에 단백질 수율을 평가. 섹션 4에서에서 설명한 대로 셀을 transfect, 초기 셀 밀도 0.5 x 10에서 배열에서 2 x 106 6 mL-1 55셀. 시험 transfections (125 mL 당황 하 고 세포 배양 플라스 크)에 25 mL 전체 볼륨을 공간 및 시 약 하기 DNA의 6 µ g으로 확장할 수 있습니다. DNA의 양을 최적화 된55를 수도 있습니다.

  1. 모든 하루 후 transfection (일 1-7), (biosafety 내각)에서 멸 균 1.5 mL microtube 세포 배양에서 500 µ L 약 수를 전송할.
  2. 컬렉션 직후는 microcentrifuge에서 5 분 12000 x g에서 aliquoted 세포를 스핀. 모든 샘플 얻을 때까지 상쾌한 새로운 1.5 mL microtube 및 4 ° C에 게 전송 합니다.
  3. Densitometry에 의해 분 비 당단백질을 quantitate
    1. 모든 샘플은 얻은 각각의 aliquot 20 µ L 새로운 1.5 mL microtube로 시음 하 고 6 µ L의 4 x Laemmli 샘플 버퍼를 비 감소와 함께 혼합.
    2. 샘플 온도 블록에서 95 ° C에서 5 분 동안 끓인 다. microcentrifuge에서 12000 x g에서 1 분에 대 한 샘플을 회전 합니다.
    3. 10 잘 4-15% 그라데이션 SDS 페이지 젤 잘 당 각 샘플의 20 µ L을 로드 합니다. 단백질 크기 마커 대 한 차선을 포함 합니다. 트리 스/글리신/SDS 버퍼에 20 분에 대 한 250 V에서 젤을 실행 합니다.
    4. 젤 Coomassie 전송 실행된 완료, 다음 20 분 대 ( 재료의 표참조) 얼룩 ddH2O 20 분 이미지 젤 젤 드 얼룩.
    5. Densitometry ImageJ, 표준 프로토콜57,58다음을 수행 합니다.
    6. 컴파일하고 x 축에 '일 후 transfection'와 데이터 플롯 및 y 축(그림 3)에 ' densitometry 값'.
      참고: 또는, 단백질 발현 SDS 페이지 시각화에 대 한 충분 하지 않은 경우 부 럽 같은 기술을 수 있습니다 사용된56.
  4. 씨에 의해 분 비 당단백질을 quantitate
    1. 씨59를 사용 하 여 분 비 당단백질의 금액을 quantitate Ni NTA 바이오 센서를 사용 하 여.
    2. 컴파일하고 x 축에 '일 후 transfection'와 데이터를 플롯과 '단백질 농도 (µ g/mL)' y (그림 3A).

6. HEK293 상쾌한에서 수용 성 당단백질의 정화

  1. 4 ° c.에 20 분 동안 6,371 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 수확 CD22 ECD 분 비를 포함 하는 상쾌한을 유지 하 고 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 필터링 합니다.
  2. 로드에 미리 equilibrated 4 mL 분-1 에서 상쾌한 벤치탑 크로마토그래피 시스템을 사용 하 여 (20 mM Tris pH 9.0, 150 mM NaCl, 5mm 이미) Ni NTA 열 (5 mL 볼륨).
    참고: 다른 선호도 기반 정화 기술은 사용할 수 있습니다, 제 1에서 구조 디자인에 포함 된 선호도 태그에 따라.
  3. 3-4 열 량 (CV) 워시 버퍼 (20 mM Tris pH 9.0, 150 mM NaCl, 5mm 이미)의 유사성 열 세척 표면에 뜨는 로드, 다음.
  4. 분수 (그림 3B)를 수집 하는 동안 차입 버퍼 (20 m m Tris pH 9.0, 150 m NaCl, 500mm 이미 m)의 4-100% 그라데이션 (4 CVs)을 사용 하 여 열에서 순화 된 당단백질 elute
  5. 15 분 동안 또는 샘플 500 µ L의 볼륨에 도달할 때까지 4 ° C에서 4000 x g에서 centrifuging 여 10 kDa 공칭 분자 무게 제한 (NMWL)와 집중 된 원심 여과 장치에 eluted 피크를 포함 하는 풀 분수.
  6. 500 µ L 샘플 루프 및 미리 equilibrated (20 mM Tris, pH 9.0, 150 mM NaCl)에 0.5 mL 분-1 에 부하 집중된 당단백질 주입 고속 단백질 액체 크로마토그래피 (FPLC)에 높은-성능 크기 제외 열 (약 24 mL 볼륨) 분수 (그림 3C)를 수집 하는 동안 4 ° C에서 시스템.
  7. SDS 페이지 젤 eluted 분수 분수를 포함 하는 당단백질을 식별 하기 위해 실행 하 고 해당 분수 수영장. SDS 페이지 젤60섹션 5 설명 된 대로 실행할 수 있습니다.

7입니다. 정화 당단백질의 Deglycosylation

  1. 크기 배제 크로마토그래피 280에서 흡 광도 사용 하 여 다음 순화 된 단백질의 농도 측정 nm 소멸 계수 (예: 1.418 M-1 c m-1 CD22 ECD에 대 한)로 나눈 값.
    참고: 관심사의 단백질의 이론적인 소멸 계수 계산할 수 있습니다 ExPASy ProtParam61같은 서버를 사용 하 여.
  2. 10 µ L 1 X 엔 H 버퍼 (제조 업체의 지침)에 따라 상업 효소의 순화 된 단백질의 1 밀리 그램의 비율로 37 ° C에서 1 시간에 대 한 엔도 H로 순화 된 단백질을 품 어.
    참고: 엔도 H 앞 생산 높은 노 오 스 glycans HEK293S에서 각 glycosylation 사이트21에서 단일 GlcNAc moiety를 떠나. 엔도 H는 다른 효소 (예를 들어,PNGaseF24)이이 목적을 위해 사용할 수 있습니다 HEK293F 셀22에서 생산 하는 단백질에 glycans를 쪼개 하지 않습니다.
  3. Deglycosylated ECD 500 µ L에 집중 하 고 높은-성능 크기 제외 열 (약 24 mL 볼륨)도 H를 제거 하 고 모든 결과 집계를 분리 하는 FPLC에 0.5 mL 분-1 에 젤 여과 착 색 인쇄기를 실행.
  4. 다운스트림 실험에 사용 될 때까지 4 ° C에서 deglycosylated 단백질을 저장 합니다.

8입니다. Glycoproteins의 결정 화

참고: 상업적으로 사용 가능한 화면을 사용 하 여 결정 화 실험을 수행 하 고 앉아 드롭 실험 결정 화 로봇을 사용 하 여 설정 합니다.

  1. 집중, ECD에 10 mL-1 원하는 농도 얻을 때까지 10 kDa NMWL 4000 x g (4 ° C)에서 원심 여과 장치를 사용 하 여 deglycosylated.
  2. 280에서 흡 광도 사용 하 여 단백질 농도 결정 및 소멸 계수에 의해 나누어.
  3. 이전 샘플에서 원치 않는 먼지나 다른 오염 물질을 제거 하는 결정 화 실험 4 ° C에서 5 분 동안 12000 x g에서 원심 분리기 샘플.
  4. 저수지를 채우기 96 잘 앉아의 우물 상업적인 결정 화면에서 80 µ L 화 솔루션의 결정 화 접시를 드롭.
    참고: 우리는 스파스 매트릭스 상업 화면 설계 된 구조는 PDB에 관하여 가장 성공적인 결정 화 조건에 따라 사용 합니다.
  5. 200의 총 드롭 볼륨으로 결정 화 접시의 우물에 상품을 특 면 결정 화 로봇을 사용 하 여 1: 1의 순화 된 단백질: 결정 화 솔루션의 비율로 nL.
  6. 전체 접시는 적절 하 고, 일단 표시 및 자외선 빛 접시 영상 검사에 테이프와 장소 접시를 봉인.
  7. 초기 당단백질 크리스탈 안타 게 하는 조건을 식별 하기 위해 표시 하 고 자외선 빛을 사용 하 여 결정 화 접시 즉시 설치, 다음 그리고 다음 주에 검사 합니다.
  8. 더 크리스탈 크리스탈 히트 또는 임의의 행렬 마이크로 시드 방법62,63,,6465의 조건에 따라 좋은 스크린을 사용 하 여 초기 결정 화 안타에서 얻은 최적화.
  9. 곳을 알아내는 보호 어떠한 결정 라도 어머니에 크리스탈을 몸을 담글 하 여 결정 화 조건 내에서 충분 한 곳을 알아내는-막는 부족 주류 20% (v/v) 글리세롤 솔루션과 보완 솔루션 (또는 동등한 곳을 알아내는-막는, 에틸렌 글리콜 등 또는 폴 리 에틸렌 글리콜 400)입니다.
  10. Cryoloops 및 플래시 마운트 크리스탈 홈 소스 diffractometer 또는 싱크 로트 론 방사선을 사용 하 여 데이터 수집 전에 액체 질소에 그들을 동결.

9. 무거운 원자 Derivatization를 사용 하 여 단계적으로

참고: 전에 하 화합물의 조작, 안전 측면 고려 되어야 한다. 단백질 결정학에서 사용 되는 화합물 생물학 분자를 그들의 강한 유사성에 대 한 선택를 하 하 고 장기간된 노출에서 인간의 건강에 위험을 포즈. HA 화합물 그들의 물질 안전 데이터 시트에 언급 된에 대 한 적절 한 안전 조치를 취할.

  1. 테스트 하려면 다른 하 화합물, 농도 및 부 화 시간을 매달려 드롭 수증기 유포 방법66를 사용 하 여 24-잘 결정 화 접시에 8 절에서에서 얻은 잘 diffracting 크리스탈 재현 합니다.
  2. 결정 하 되 크리스탈 derivatization 사용. 서버 (예를 들어, 무거운 원자 데이터베이스 시스템67) 그들은 단백질 결정 화 상태에 대 한 적절 한 보장 하 복합 선택, 지원할 수 있습니다.
    참고: 하 스크린 가장 효과적인 하 화합물 단계적으로 조정의 쉬운 심사에 대 한 상업적으로 사용할 수 있습니다. "매직 7" 하 화합물의 집합 이전 HA derivatization68에 대 한 성공의 높은 가능성을가지고 설명 했습니다.
  3. HA(그림 4)를몸을 담글에 대 한 워크스테이션을 설정 합니다. 빠르게 전송는 cryoloop를 사용 하 여 0.2 µ L 하의 최종 농도가 1-20 m m에서에서 배열 되도록 결정 화 조건에 희석 HA 솔루션을 포함 하는 22 m m 커버 슬립에 드롭 크리스탈. 방울을 봉인 하 고 시간 (그림 4B)의 서로 다른 길이 대 한 품 어. 좋은 출발점은 5, 10, 60, 및 90 분와 하룻밤.
  4. 시각적으로 가능한 균열 또는 당단백질 크리스털 또는 크리스털 derivatization에 불리 한 효과 나타낼 수 있는 색상의 변화를 식별 하는 가벼운 현미경으로 결정을 검사 합니다.
  5. 마운트 cryoloops에서 결정 및 다시 담가 크리스탈 30 s 3 연속 0.2 µ L에 20% (v/v) 글리세롤 (또는 다른 곳을 알아내는-막는) 보충 포함 어머니 주류 솔루션 상품69. 결정에 다시 몸을 담근 채 하 복합 였던 비 특히 부분 인 약한 HA 바인딩에 의해 발생 감소를 제거 합니다. 플래시 동결 결정 액체 질소 (그림 4B).
  6. 데이터 수집, 처리, 구조 솔루션, 그리고 세련미, 앞에서 설명한 프로토콜26,70,,7172사용 합니다.

10. 몸으로 그것의 Ligand와 당단백질 결정

  1. 교수형-드롭 증기 확산 방법을 사용 하 여 24-잘 결정 화 접시에 8 절에서에서 얻은 잘 diffracting 결정을 재현 합니다.
  2. 20 mM Tris, pH 9.0, 150 m NaCl m에서에서 50 m m ligand의 재고 솔루션을 준비 합니다.
    참고:는 ligand의 농도 당단백질에 선호도 따라 준비 되어야 한다. 선호도 알 수 없는 경우 메서드를 사용 하는 ITC (섹션 12.2) 등 몸으로 실험 시작 전에 선호도 결정 해야 수 있습니다. ligand 필요한 버퍼에 원하는 농도에서 수용 성 인지 확인 합니다.
  3. 드롭 포함 ECD 결정 하는 리간드의 다양 한 농도 추가 하 고 시간 길이 5 d 5 분 사이에 부 화에 대 한 드롭 인감.
  4. 시각적으로 형태에 가능한 변화를 식별 하는 가벼운 현미경으로 결정을 추적 합니다.
  5. Cryoloops 및 곳을 알아내는 결정 탑재-어머니 주류 솔루션 20% (v/v) 글리세롤 (또는 에틸렌 글리콜 또는 저 분자 무게 폴 리 에틸렌 글리콜 400 등 다른 곳을 알아내는-막는) 보충에서 그들을 보호69.
  6. 앞에서 설명한 프로토콜73,,7475을 사용 하 여 데이터 수집, 처리, 구조 솔루션 및 수정, 있습니다.

11. 단편 항 원 바인딩 (팹)의 생산

  1. 유전자 팹 무거운 체인 (HC) 및 안티-ECD 항 체, 예를 들어,epratuzumab의 가벼운 체인 (LC) 시퀀스에 해당 하는 subclone
    참고: 또는, IgG 수 수 죽 습 효소 papain Fab 조각76를 생성 하 여.
  2. 다음 수정 섹션 4에서 설명한 대로 셀을 transfect:
    1. 문화의 200 mL 당 90 µ g의 팹 조각의 transfection에 대 한 DNA의 총 질량을 사용 합니다.
    2. HC 및 LC 플라스 미드 LC 이합체 형성의 양을 줄이기 위해 2:1 비율에 transfect
  3. 외피의 7d, 후 세포를 수확 하 고 상쾌한을 유지 한 0.22 μ m 진공 기반 여과 장치와 필터.
  4. 벤치탑 크로마토그래피 시스템을 사용 하 여 PBS 버퍼에서 안티-LC (카파 나 람다) 선호도 열 equilibrate
    참고: 지금까지 이면 LC 이합체 형성 문제 정화 동안에 단백질 G 친화성 크로마토그래피 카파/람다 LC 친 화력 정화 대 안으로 사용할 수 있습니다.
  5. 상쾌한 선호도 4 mL 분-1열에 로드 합니다. 샘플 로드, 다음 3-4 CVs PBS를 가진 열을 씻어.
  6. 100mm 글리신, pH 2.2, 즉시 중화 10% (v/v) 1 M eluted 분수와 isocratic 차입을 사용 하 여 열에서 단백질을 elute 트리 스, 각 분수에 pH 9.0.
    참고: eluted 팹 수 더 정화 이온 교환 크로마토그래피 / 크기 배제 크로마토그래피는 FPLC를 사용 하 여 4 ° c.에 의해

12.는 당단백질에 바인딩 하는 팹 및 작은 분자의 특성

  1. Biolayer 간섭계
    1. 1x 속도 론 버퍼 (1 x PBS, 0.002% (v/v) 트윈 20, 0.01% (w/v) BSA) 50 mL를 준비 합니다.
    2. 6. 바이오 센서 Ni NTA 사전 일로 판에 10 분에 대 한 1 x 속도 론 버퍼의 200 µ L에서 하이드 레이트.
    3. 그의 태그 ECD 25 ng µ L-1의 최종 농도에 1x 속도 론 버퍼의 1 mL에 희석. 500 nM의 높은 농도와 250의 후속 직렬 희석 속도 론 버퍼, x 1의 200 µ L로 순화 팹의 직렬 희석 플라스틱 nM, 125 nM, 그리고 62.5 nM.
    4. Aliquot 시 약 같이 그림 5A, 블랙 플랫 바닥 폴 리 프로필 렌 96 잘 microplate에 각각 잘 표시 된 솔루션의 200 µ L을 포함.
    5. 38,,3977 (그림 5A) 이전에 설명 된 대로 데이터 수집 소프트웨어에 활동 분석 실험을 사용 하 여 데이터를 수집 합니다.
      1. 간단히, 우물 속도 론 버퍼 기준 60 x 1에 바이오 센서를 전송 s 240에 대 한 당단백질의 25 ng µ L-1 을 로드 하기 전에 s (또는 1.0의 임계값까지 nm에 도달) 1000 rpm.
      2. 60의 두 번째 기준 후 속도 론 버퍼, x 1에는 s에 웰 스 팹의 직렬 희석을 포함 하는 바이오 센서 전송. 180 s 협회 단계 이후에 속도 론 버퍼 x 1에서 180 s 분리 단계 뒤.
        참고: 바이오 센서 다시 사용할 수 있습니다 위의 프로토콜 버퍼 (500mm 이미와 PBS) 스트립에 바이오 센서 세척의 3 주기를 이루어져 있는 재생 단계 다음 5 s 뒤 5 중화에 대 한 속도 론 버퍼 x 1에서 s. 바이오 센서는 10 ~ 20까지 다시 사용할 수 있습니다 시간 같은 날 또는 가난한 데이터까지 품질 관찰 됩니다.
    6. (그림 5A) 분석 소프트웨어를 사용 하 여 데이터 분석:
      1. 아래 탭 1, 가져오기 및 선택 데이터.
      2. 탭 2, 단계 1: 데이터 선택, 선택 ' 센서 선택 ' 및 하이라이트 참조 웰 스 (행 E와 F, 그림 5A), 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 잘 참조로 설정. 단계 2: 빼기, 선택 ' 참조 웰 스 '. 단계 3: y 축 정렬에서 0.1 59.8의 시간 범위에서 '베이스 라인'을 선택 s. 간 단계 보정 단계 4: '분리에 맞춤'을 선택 단계 5: 프로세스, 선택 'Savitzky Golay 필터링'과 언론 과정 데이터.
      3. 탭 3 선택 '협회와 분리' 분석 하는 단계는 1:1 모델. '글로벌 피팅' 및 '색상으로 그룹'을 선택 합니다. 곡선을 클릭 마우스 오른쪽, '색상 변경'을 선택, 당신의 선택의 색깔에 모든 커브를 설정. '맞는 커브'를 선택 합니다. 데이터는 잘 적합 하, 만약 ' 보고서 저장 '을 선택 하 여 보고서를 내보낼 수 있습니다.
    7. 팹 인식에 다른 glycoforms의 HEK293F 및 HEK293S 세포 (5)에서 생산 하 고도 H 치료 (7) 경우는 효과 평가 하기 위해 다음과 당단백질으로 실험을 반복 합니다. 또한, 팹 준수할 ECD 잘림은 도메인에 대 한 통찰력을 제공 하는 실험을 반복 합니다.
  2. 팹 당단백질 상호 작용의 등온선 적정 열 량
    참고: 여기서 설명 하는 ITC 실험 자동된 ITC 악기를 사용 하 여 수행 됩니다. 실험은 하단 96 잘 블록 라운드 1 mL에서 수행 됩니다.
    1. ECD와 팹 20 mM Tris, pH 8.0, 밤새 저 어 바와 4 ° C에서 150 m m NaCl의 단일 4 L 비 커에 dialyze.
    2. 집중 dialyzed ECD와 팹 5 µ M, 50 µ M, 각각, 사용 하기 전에 4 ° C에서 5 분 동안 4000 x g에서 버퍼 집중 막 투 석의 5 mL로 세 번 세척을 보장 10 kDa NMWL와 원심 필터를 사용 하 여.
      참고: 셀에 주사기 샘플 사이의 버퍼에 어떤 불일치 ITC 실험 및 데이터에서 품질의 결과 발표를 원치 않는 열을 발생할 수 있습니다.
    3. 에 대 한 실험 1: 400 µ L a 1 셀에 로드할 수를 ECD의 그리고 120 µ L를 주사기에 로드 잘 A2에 팹의 추가. 잘 A3 혼합된 샘플 다음 실험 완료 반환 하려면 비어입니다. 각 후속 실험 순서에서 판에 추가할 수 있습니다 (즉, 실험 2: 셀-A4, A5, 주사기-빈 잘-A6; 그림 5 B)입니다.
      참고: 포함 버퍼 버퍼 컨트롤 (악기를 잘 작동 확인)에 시작 하 고 각 실행으로 주사기에 샘플에 대 한 희석의 열을 계산 하기 위해 버퍼 (에 셀) 컨트롤에 (주사기)에 ligand의 끝에. 이 희석의 열 해야 다음 뺄 원시 실험 데이터에서 데이터 분석 (그림 5B) 중 계산.
    4. 각 주입에 대 한 2.5 μ의 볼륨으로 총 16 주사를 실행 합니다. 주사 기간은 5 s, 180 s 간격 주사. 750 rpm의 교 반 속도와 5의 필터 기간 25 ° C 셀 온도 설정 s.
      참고: 선호도 및 ECD:Fab 상호 작용의 열역학에 따라, 그것은 샘플 농도, 수의 주사 또는 셀 온도 변경 하려면 필요할 수 있습니다.
    5. 앞에서 설명한40,,4143 (그림 5B) 분석 소프트웨어를 사용 하 여 데이터를 분석 합니다.
    6. 중복, 말은 KD 값과 표준 오류 계산에서 적어도 실험을 반복 합니다. 팹: 당단백질 상호 작용의 열역학에 glycoforms의 다른 glycoforms (섹션 5와 6) 경우는 효과 평가 하기 위해 ECD와 실험을 반복 합니다.
  3. 리간드-당단백질 상호 작용의 등온선 적정 열 량, ITC 실험 다음 변경 섹션 12.2에 설명 된 대로 설정:
    1. Dialyze 투 버퍼의 4 L에 ECD 하룻밤. 투 석의 완료 다음 투 석 버퍼를 사용 하 여 리간드를 분해.
    2. 낮은 친 화력 상호 작용을 검출 수 상당히 높은 농도에서 ITC 실험을 수행 합니다. ECD와 ligand 상호 작용에 대 한 셀에는 주사기에 ligand의 1mm ECD의 100 μ M의 농도에서 ITC 실험을 수행 합니다.

Representative Results

CD22 ECD의 여러 구문은 pHLsec 식 벡터에 복제 성공적으로 되었고 overexpressed 포유류 HEK293F 및 HEK293S 셀 라인에서 (그림 2 , 3A). 모든 구문 크기 배제 크로마토그래피에 의해 크기 동질성을 순화 되었고 결정 화 연구 (그림 3B 와 3c) 매우 순수한 예제를 굴복. CD22 구문을 잘 diffracting 결정을 주도 했다 d1 d3 잘림 (잔류물 20-330), Ala (N67A, N112A, N135A, N164A 및 N231A), Asn에서 돌연변이 6 예측된 N 연결 glycosylation 사이트의 5 등만 HEK293S 세포에서 생산 위치 N101 유지 되었다 glycosylation 사이트 (이 구문을 CD22 라는20-330, 5A). 크리스탈 MCSG 1 스파스 매트릭스 스크린의 여러 조건에서 가져온 하지만 최고의 결정 pH 8.5 30% (w/v) 폴 리 에틸렌 글리콜 4000, 0.2 M 리튬 염화 물 및 0.1 M 트리를 포함 하는 상태에서 했다. 이 기본 결정 2.1 Å 해상도; diffracted 관련된 Siglec 단백질의 Ig 도메인의 알려진된 구조를 사용 하 여 미스터 검색에 어떤 해결책 든 지 생성 하지 않았다.

위상 정보를 취득, 우리 하는 보육 시간 1 d (그림 4)을 5 분에서에 대 한 화합물의 1-20 m m에서 배열 하는 농도에서 Hg, Pt, 운영 체제, Ta, 및 Br 포함 하 화합물의 패널 기본 결정을 젖 었. 우리는 크리스탈 형태학에 있는 변화를 모니터링 하 고 발견 결정 하 20 m m 컴파운드와 배어 귀착되 었 다 급속 한 균열 및 결정의 용 해. 우리 63 탄탈 브 로마 이드 클러스터, 백 금 염화 물, mercuric 아세테이트와 mercuric 염화 젖 었 했다 설정된 부 화 시간을 다음과 같은 그들의 모양을 유지 하는의 총을 동결. 크리스탈 7 m 30 분 캐나다 빛 소스 (CLS) 08-BM beamline (새스커툰, 캐나다)에 형광 스캔에 변칙 신호를 보여준 mercuric 염화의 흠뻑 젖 고 다 파장 변칙 분산 단일 x-선 데이터 컬렉션에 대 한 허용 크리스탈입니다. 이러한 데이터 세트 허용 CD22의 수은 하위 구조를 해결 하기 위해 우리20-330, 5A, 단일 수은 원자 위치 C308 무료 시스테인에 바인딩된 및 궁극적으로 봐도 CD22의 구조를 구축 공개는 단계적으로20-330, 5A 전자 밀도 지도 사용 하 여 빌드78.

Unliganded 구조 해결 되었다, 일단 그것의 ligand, α2-6 siallylactose에 바인딩된 CD22의 구조를 해결에 관심이 있었습니다. 우리는 먼저 α2 6 sialyllactose ITC를 사용 하 여 상호 작용의 바인딩 열역학 특성으로 CD22의 선호도 계산. 우리는 ~ 280 μ M의 선호도 관찰 하 고 초기 농도 식별 하기 위해이 정보를 사용 (~ KDx 100) 우리의 네이티브 CD2220-330, 5A 결정의 적시에 사용할 ligand의. 우리 5 분, 2 시간, 14 h, 40 h 및 5 d 25 m m siallylactose와 CD2220-330, 5A 결정 젖 었 고 크리스탈 형태학에 있는 변화 모니터링. ~ 75 결정의 총 다양 한 시간 포인트에서 동결 되었고 CLS 싱크 로트 론 beamline 08-ID (새스커툰, 캐나다) 원격 데이터 수집에 대 한 전송. 6 x-선 데이터 집합의 총은 잘 diffracting 결정에서 수집 되었다. 각 x-선 데이터 집합에서 구조 unliganded CD2220-330, 5A 구조를 사용 하 여 초기 검색 모델로 서 씨에 의해 해결 되었다. 모든 데이터 집합에 대 한 결과 전자 밀도 CD22의 바인딩 사이트 내에서 α2 6 sialyllactose에 대응할 Fo Fc 지도에 긍정적인 밀도 대 한 다음 검사 했다. 놀랍게도, 모든 데이터 집합 수집, 심지어 그 후 부 화 시간, 5 분만 포함 된 ligand 바인딩 사이트에서에 해당 하는 긍정적인 밀도 젖 었 하는 결정에서. Unliganded 및 liganded CD22의 전반적인 구조 α2 6 sialyllactose와 몸을 담글 실험의 성공을 설명할 수 있는 최소한의 구조적 변화, 매우 유사 했다.

우리는 다음 CD22 치료 항 체 epratuzumab 씨 및 ITC 실험 (그림 5)에 의해 인식의 항 원 표면 특징. 다른 glycoforms와 CD22 구문에 epratuzumab 팹 바인딩의 활동 및 열역학 프로필 작은 glycans (327 nM 대 24 nM에 대 한 선호도에 14-fold 개선까지 함께 감소 N 연결 glycan 크기 증가 선호도 CD22 공개 에 라스; 188 nM 대 58 nM ITC에). CD22의 단일-지점 돌연변이 사용 하 여 씨와 epratuzumab 팹 CD22 d1 d3 공동 결정 구조28해결 glycan CD22 N 연결 제한 액세스 하는 epitope 항 체의 확인 되었다.

Figure 1
그림 1 . 생물 및 구조적 특성을 구문 디자인에서 당단백질 특성 개요. (1) 기본 시퀀스 대표 당단백질의 분석. 회색, 세포 외 도메인 (ECD); 녹색, 막 횡단 (TM) 세그먼트; 그리고 파란색으로 당단백질의 cytosolic 도메인. 예측된 N 연결 glycans로 표시 됩니다. ECD 구문 (2) 복제입니다. (ECD의 표현 3) 포유류 세포에서 생성합니다. (4) 당단백질 정화입니다. HEK293F에 표현 된 단백질 복잡 한 glycans 포함 됩니다, 하는 동안 HEK293S에 표현 된 단백질 높은 노 오 스 glycans가 있을 것 이다. Glycoproteins의 효소 처리 glycosylation N 연결 된 사이트에만 GlcNAc moiety와 glycoproteins에도 H 결과 HEK293S 세포에서 생산. (5a) Glycoproteins 항 체 바인딩을 위한 biolayer 간섭계 (BLI) 및 등온선 적정 열 량 (ITC)에 의해 테스트 됩니다. 작은 ligands 선호도 또한 ITC에 의해 측정할 수 있습니다. 어떤 경우에도 헤 (6) HEK293S와 deglycosylated에 표현 등 균질 N 연결 된 glycans와 glycoproteins의 (5b) 결정 화 실험 돌연변이 glycosylation N 연결 사이트의 결정을 얻을 필요가 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 . CD22 ectodomain DNA 포유류 세포에서 식에 대 한 구성의 디자인. A) pHLsec 플라스 미드 과도 transfection CD22 ECD 구문에 대 한 사용의 표현. 복제에 사용 되는 AgeI 및 KpnI 사이트는 빨간 상자에 표시 됩니다. B) The CD22 ECD 포함 7 Ig 도메인 (d1-d7) 및 12 예측된 N 연결 glycosylation 사이트 (파란색). 4 구조 CD22 ECD에서 설계 되었습니다. C) 1 %agarose 젤 CD22 ECD의 PCR amplicons 보여주는 pHLsec 포유류 식 벡터에 클로닝을 위한 구성. 첫 번째 레인 1 kb DNA 마커를 포함합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

Figure 3
그림 3 . 식 하 고 glycoproteins의 정화입니다. A) 식 수익률에 셀 밀도의 효과. HEK293F 현 탁 액 셀의 소규모 25 mL 문화에서 당단백질 식 페 셀 (0.5 x 106 세포 mL-1, 106 세포 mL-1x 1.0 및 1.5 x 106 세포 mL 의 3 개의 다른 시작 밀도 사용 하 여 -1). 정량화와 오른쪽 패널에서 양적 라스 densitometry SDS 페이지에서 왼쪽된 패널에 의해 수행. 값은 한 당단백질 준비의 대표입니다. B) 첫 번째 정화 단계의 크로마 구성 CD2220-330, 5A에서 Ni NTA 선호도 열을 사용 하 여 상쾌한의 600 mL. 당단백질은 eluted 100 %500 m m 이미 포함 된 차입 버퍼에 해당 한 이미 (회색 선), 그라디언트를 사용 하 여. 풀링된 분수 수직 선으로 묘사 된다. C) 에 대 한 크기-배제 크로마 구성 CD2220-330, 5A는 고성능을 사용 하 여 젤 여과 열. 차입 피크에서 풀링된 분수 수직 선으로 묘사 된다. 삽입: Coomassie 스테인드 SDS 페이지 젤은 당단백질의 순도 보여주는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 . 크리스탈 무거운 원자를 가진 몸을 담글. HA 화합물과 기본 결정을 몸을 담글의 A) 샘플 워크스테이션 모든 도구는 레이블이 필요 합니다. B)의 결정을 따른 스텝 구성 CD2220-330, 5A 하 화합물. 1 단계, 잘 결정, HA 솔루션 HA의 최종 농도 1-10 mM에서 범위는 결정 화 조건에 희석을 포함 된 커버 슬립에는 0.2 µ L 루프를 사용 하 여 전송 결정을 포함 하는 오픈. 2 단계, 결정 화 접시에 방울을 봉인 하 고 다른 기간에 대 한 복합 HA와 크리스털을 품 어. 3 단계, 루프에서 젖된 크리스탈 탑재 및 백-담가 30에서 3 연속 0.2 µ l 20% (v/v) 글리세롤 커버 슬립에 적절 하 게 보충 어머니 주류 솔루션을 포함 하는 s. 4 단계, 플래시 동결 액체 질소로 루프에 장착 된 크리스탈 하 고 싱크 로트 론 beamline에 선적을 위한 퍽에 배치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5 . Biolayer 간섭계와 등온 적정 열 량 측정 측량입니다. A) 대표 씨 실험. 상단 패널: 플레이트 설치 속도 실험, 다음 표시 됩니다에 대 한의 예: 1 x 속도 론 버퍼 (B), 그의6 x-태그 당단백질 로드 (L), 대표 팹 농도 (62.5, 125, 250, 500 nM), PBS + 500 m m 재생성 버퍼 (R), 그리고 속도 론 중화 x 1 버퍼 (B). 각 잘 솔루션의 200 µ L를 포함합니다. 동역학 실험 단계 번호는 접시의 위쪽에 표시 됩니다. 중간 패널: 대표 씨 실험 Ni NTA 바이오 센서를 사용 하 여 수행 및 상단 패널에 설명 된 접시의 원시 데이터입니다. 단계 번호 기준 (1), 그의6 x 당단백질 로드 (2), 초기 (3), 팹 (4) 및 (5) 분리의 직렬 희석에서 협회에 해당 합니다. 재생 단계 표현 (6-7 단계). 하단 패널: 원시 협회 및 해당 분리 (파란 선) 1: 1을 보여주는 대표적인 분석된 데이터 (레드 라인) 적합. B) 상위 패널: 단일 ITC에 대 한 대표적인 플레이트 설치 바닥 블록 라운드 96 잘에서 7 실험 자동된 ITC 악기에서 실행. 각 실험은 3 개의 우물의 구성 되어 있습니다. 셀 (400 µ L)에 대 한 샘플에 해당 하는 첫 번째 잘 (레드), 주사기 (120 µ L)에 대 한 샘플에 해당 하는 두 번째 잘 (녹색). 3 잘 남아 빈, 그리고 혼합된 샘플 잘 실험 완료 다음이 반환 될 것입니다. 실험 1, 2 및 7 버퍼 버퍼 컨트롤에 있습니다. 실험을 3-5 셀 및 팹 또는 주사기에 ligand (L)에서 당단백질 (P)와 triplicate 실험을 나타냅니다. 실험 6 희석 제어의 ligand 열을 나타내고 데이터 분석 중 실험 3-5에서에서 공제 한다. 하단 패널: 대표적인 원료 (맨 위) 및 가공된 (아래) ITC 데이터 CD22 ECD에 바인딩 팹 (epratuzumab)을 보여주는 HEK293F 세포에서 생산. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

막 고정 glycoproteins 세포 기능에 대 한 중요 하 고 매력적인 치료 대상. 여기, 우리 모두 혼자 하 고 작은 분자 ligands 복잡 한 막 glycoproteins, ECD의 구조 및 생물 특성에 대 한 프로토콜을 제시 하 고 놀라 우 파편. 성공적으로 인간의 CD2228, B 셀 체크79에 체액 성 면역을 유지에 관련 된 중요 한 공동 수용 체의 세포 외 액의 3 개의 N-터미널-대부분 Ig 도메인의 결정 구조를 결정 하기 위해이 프로토콜을 사용 했습니다. 우리는 자연 ligand α2 6 sialyllactose CD22의 바인딩 사이트 특징 또한 있고 인간의 CD22 향해 치료 항 체의 인식 모드를 정의. B 세포 및 분자 로드맵 발전 새로운 CD22 대상된 작은 분자의 항 체 기반으로 식을 제한 했다 Siglecs 가족의 중요 한 일원의 구조-기능 관계에 대 한 통찰력을 제공 하는 이러한 결과 치료제입니다. 이 프로토콜은 Ig 포함 된 B 세포 수용 체에 대 한 성공적으로 사용 되었다, 하는 동안 우리는 별개의 도메인 조직과 어떤 막 당단백질의 구조 및 생물 특성에 대 한 우리의 접근을 적용할 수 있는 제안 합니다. 이러한 경우에 설계 및 조합 N 연결 glycan 돌연변이 (Gln 또는 중 Ala) 구문을 결정 성장 및 고해상도 회절에 적합 찾을 수 계산 수를 생성 합니다.

균질 하 고 순수한 당단백질 샘플을 얻는 것은 결정 성장 및 x 선 회절, 뿐만 아니라 류의 생물 특성에 대 한 중요 한 중요성의. N 연결 된 glycans glycoproteins에 본질적으로 다른 유형의 그리고 크리스탈 형성을 막을 수 있는 당단백질 내 구조적 및 화학이 발생할 수 있습니다. 이 마이크로-이 줄이기 위해, 전략 항구 N 연결 glycans, 또는 뒤에 endoglycosidases (EndoH) 같은 치료 돌연변이 세포 라인 (HEK293S) 등을 사용 하 여 예측 하는 Asn 잔류물을 제거 하려면 포인트 변이 소개 하는 상당히 수 있습니다. 결정 화 성공15,,2122향상. 이 프로토콜을 수용 성 glycoproteins 및 셀 표면에 뜨는에 분 비 된 팹의 정화를 다루겠습니다. 당단백질 분 비 세포 세포의 용 해에 대 한 필요성 또는 가혹한 화학 제품 또는 세제의 추가 없이 순으로 비교적 간단한 경로 제공합니다. 세포 표면에 뜨는, 얻은 다음 셀 수확 다음 열 (예를 들어, Ni NTA 태그 그의 glycoproteins 또는 Fab 조각에 대 한 LC 선호도) 관심사의 단백질에 대 한 선호도 통해 직접 실행 됩니다. 그러나, 사용 열 셀 표면에 뜨는 (예, pH)의 조건에 따라 열에 관심사의 단백질의 바인딩 기능 수 있습니다 영향을 받을. 이 경우 그것은 집중 하 고 버퍼 교환 표면에 뜨는 셀 열에 바인딩 개선 하기 위해 필요할 수 있습니다. 또한, 단백질 순도 평가할 수 있도록 정화 하는 동안 품질 관리 단계를 고용 하는 것이 좋습니다. SDS 페이지 젤 또는 (이전, 도중 및 정화 단계 후)는 모든 샘플의 서쪽 오 점 실행 제안 된 정화 계획은 관심사의 단백질에 대 한 적합 여부에 대 한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 오염 밴드 SDS 페이지에 표시 되는 경우 또는 여러 종의 정화 하는 동안 가져온 경우 (예를 들어, 크기 배제에 여러 봉우리), 추가 정화 단계 고려해 야 합니다, 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피, 얻을 수 다운스트림 결정 화80의 순도 증가 기회

고분자의 결정 화에 대 한 잠재적인 결정 화 조건 높은 단백질 농도에서 다 수의 심사에 대 한 적합 한 크리스탈 안타를 찾을 수 있도록 관심사의 단백질의 높은 수익률을 얻기 위해 중요 한이. 일반적으로, HEK293 세포 라인 여기 논의 (HEK293F 및 HEK293S) 강력한 식 시스템을 필요에 따라 더 많은 샘플을 생산 하 쉽게 확장 될 수 있습니다. 그러나, 그것은 관심사의 단백질이 세포 라인 내에서 충분히 표현 하지 않을 수 있습니다. 이러한 경우에는에서 Expi293 셀81,82, 같은 다른 셀 라인, 단백질 식의 우수한 수준을 보여주 발견 되었습니다 하 고 대 안으로 고려해 야 합니다.

정돈, diffracting 크리스탈 얻지 못하면 다음의 고 순도도 불구 하 고 관심사의 단백질의 여러 구문 테스트, 크리스탈 형성을 촉진 하는 결정 화 기술을 확장 필요할 수 있습니다. 그것은 그 항 체 및 nanobodies의 팹 조각 우수한 결정 화 강화, 고 수 정돈된 크리스탈83,,8485포장 홍보 표시 되었습니다. 이 파편은 표현 고 동질성, 정화 고 결정 화를 촉진 하 관심사의 단백질을 가진 복합물에 사용 될 수 있습니다. 중요 한 것은, 제 10에 설명 된 대로 생산 팹 조각 비작동 LC 이합체86를 형성 하는 경향이 있을 수 있습니다. 이러한 이합체 오염 물질 고 정화 하는 동안 제거 한다. 그러나 우리의 경험에서 LC 이합체 종종 다른 보존 볼륨 크기 제외에 또는 이온 교환 크로마토그래피에 뚜렷한 피크로 elute 있고 따라서에서 제거할 수 있습니다 팹 정화-이것은 항상 사실이 아니다. 이러한 기술을 Fab 정화에서 LC 이합체를 제거 하기에 충분 하지 않으면, 추가 정화 방법, 단백질 G 친 화력 정화 등 순도 향상 시키기 위해 사용할 수 있습니다.

대안 공동-complexation 놀라 우 파편을, 임의의 행렬 microseeding 같은 문서화 기법 정돈된 크리스탈63,70를 얻기의 기회를 높일 수 있습니다. 이 방법은 크리스탈 크리스탈 성장을 촉진 핵 제공 결정 화 조건에 짓 눌린, 차선의 결정의 작은 금액의 추가 포함 한다. 이 관심, 또는 유사한 도메인 아키텍처 및 3 차 구조에 그들의 단백질의 결정을 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 또한, 혼자, 단백질을 구체화 하려고 또는 Fab 조각 또는 관심의 작은 분자와 복잡 한 임의 매트릭스 microseeding은 수행할 수 있습니다. Cryo 전자 현미경 검사 법의 최근 발전 또한 게이 기술을 적절 한 기능87,88와 분자에 대 한 고해상도 구조 정보를 얻기 위해 엑스레이 결정학에 매력적인 대안 89,,9091.

X 선 회절 데이터 집합의 단계적 씨에 의해 실패, 몸을 담글 하 변칙 분산 또는 isomorphous 교체 하 여 위상 문제를 해결 하기 위해 필요할 수 있습니다. 단백질의 아미노산 시퀀스의 검사 하 derivatization, 바인딩에 대 한 최적의 pH를 포함 하 여에 대 한 전략에 대 한 단서를 제공할 수 있습니다. 특히, 단백질 내 짝이 없는 시스테인 특히 하 화합물 수은 포함 하는 바인딩할 수 있습니다. HA 화합물과 기본 결정을 몸을 담글 최적의 하 화합물의 id, 그것의 농도 및 필요한 보육 시간을 결정 하는 반복 프로세스입니다. 초기 몸을 담글 시도 단계적 적합 하 포함 잘 diffracting 결정을 양보 하지, 그것은 HA 바인딩의 확률을 개선 하 여 비정상적인 신호를 개선 아미노를 함유한 산 성 대체를 소개 해야 있습니다. 그러나 예로 돌연변이 바인딩할 효율적으로 Hg, Au, Pt 식이나 Pb. 단백질의 변칙 단계적으로 조정, 광범위 하 게 사용 되는 대장균 에서 seleno-메티오닌 보충 미디어에 변칙 단계적 무료 시스테인 잔류물을 포함 하는 해당 시스템을 안정적으로 seleno-메티오닌 정지92,93, 포유류 세포를 위해 쉽게 사용할 수 있는 이며 미래 발달의 지역 이다.

관심의 당단백질의 unliganded 구조를 얻은 작은 분자 ligands와 결정을 몸을 담글 면역 수용 체 ligand 복합물의 구조를 얻기 위해 수행할 수 있습니다. 이러한 데이터는 당단백질의 생물학적 기능에 높은 해상도 통찰력을 제공 뿐만 아니라 작은 분자 치료제로 사용 될 수 있는 더 구체적이 고 높은 선호도 ligands의 합리적인 디자인에 대 한 청사진을 제공 합니다. 관심의 작은 분자 ligands과 당단백질 결정을 할 때 unliganded 크리스탈 구조의 검사 해야 하는지 여부를 몸을 담글 수 나타낼 수 있습니다. 만약 가까운 크리스탈 포장 연락처 ligand 바인딩 사이트 발견 또는 ligand 바인딩 시 구조적 변화를 받을 것으로 예상 하는 지역, 주변 문제가 될 가능성이 몸을 담근 채. 이 경우에, 단백질-리간드 복합체의 공동 화 등 다른 방법은 수행 되어야 한다.

Disclosures

저자 아무 경쟁 관심사를 선언합니다.

Acknowledgments

이 문서에서 설명 하는 x 선 회절 실험은 캐나다 재단 혁신, 자연과학 및 공학 연구 위원회 캐나다에 대 한 지원, 캐나다 광원에서 08-ID와 08-BM beamlines를 사용 하 여 수행 했다는 서스캐처원 대학, 서스캐처원 정부, 서쪽 경제 다양화 캐나다, 국가 연구 위원회 캐나다 건강 연구의 캐나다 학회. 우리는 ITC는 및 씨 계기에 대 한 액세스에 대 한 구조 및 생물 핵심 시설, 병원 아픈 어린이 위한 인정 하 고 싶습니다. J.E.O.에 의해 밴팅 박사 친목 BPF-144483 건강 연구의 캐나다 학회에서 지원 되었다. T.S.는의 캐나다 대학원 장학금 석사 받는 보너스와 건강 연구의 캐나다 학회에서 Vanier 캐나다 대학원 장학금. 이 작품은 건강 연구의 캐나다 학회에서 부여 PJT 148811 (제이-P.J.)를 운영 하 여 지원 했다. 이 연구는 캐나다 연구의 자 프로그램 (제이-P.J.)에서 자금 지원 덕분에, 부분적으로, 착수 했다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm Steritop filter EMD Millipore SCGPS02RE
10 well 4-15% gradient SDS-PAGE gel Bio-Rad 4561084
10x glycobuffer 3 New England Biolabs P0702S Comes with Endo H reagent
10x Kinetics Buffer PALL FortéBio 18-1092
10x Tris/Glycine/SDS Buffer Bio-Rad 1610732
1 mL round bottom 96 well block ThermoFisher 260251
22 mm cover slip Hampton research HR3-231
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747
96-3 well INTELLIPLATE  low volume reservior Art Robbins Instruments 102-0001-03
AgeI New England Biolabs R0552S
ÄKTA Pure GE Healthcare
ÄKTA Start  GE Healthcare
Amicon Ultra 15 centrifugal filtration device 10KDa MWCO Millipore UFC901008
Amicon Ultra 4 centrifugal filtration device 10KDa MWCO Millipore UFC801008
Auto-iTC200 Malvern
Axygen MaxyClear Snaplock 1.5 mL microtubes Fisher Scientific MCT150C
Countess Cell Counting Chamber Slides Thermo Fisher Scientific C10228
CryoLoop 18 x 0.05-0.1 mm Hampton research HR4-945
CryoLoop 18 x 0.1-0.2 mm Hampton research HR4-947
CryoLoop 18 x 0.2-0.3 mm Hampton research HR4-970
Digital Dry Bath Bio-Rad 1660562EDU
E. coli DH5α Invitrogen 18258012
Endo H New England Biolabs P0702S
Erlenmeyer flask (baffled base), polycarbonate, sterile, 500 mL, DuoCAP TriForest Labware FBC05000S
Erlenmeyer flask 125 mL (baffled base), polycarbonate, sterile, 125 mL with vented cap VWR 89095-258
Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 10 mL Greiner Bio-One 607180
Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 25 mL Greiner Bio-One 760180
Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 5 mL Greiner Bio-One 606180
Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 50 mL Greiner Bio-One 768180
FectoPRO DNA Transfection Reagent, Polyplus VWR 10118-842
Freestyle 293F cells Thermo Fisher Scientific R79007
Freestyle Expression medium Thermo Fisher Scientific 12338001
Heavy Atom Screens Au Hampton research HR2-444
Heavy Atom Screens Hg Hampton research HR2-446
Heavy Atom Screens M1 Hampton research HR2-448
Heavy Atom Screens M2 Hampton research HR2-450
Heavy Atom Screens Pt Hampton research HR2-442
HEK 293S ATCC ATCC CRL-3022
HisTrap Affinity Column GE Healthcare 17525501
HiTrap KappaSelect Affinity Columns GE Healthcare 17545811
HiTrap LambdaSelect Affinity Columns GE Healthcare 17548211
KpnI New England Biolabs R0142S
MCSG-1 Crystal Screen 1.7 mL block Anatrace MCSG-1
MCSG-2 Crystal Screen 1.7 mL block Anatrace MCSG-2
MCSG-3 Crystal Screen 1.7 mL block Anatrace MCSG-3
MCSG-4 Crystal Screen 1.7 mL block Anatrace MCSG-4
Mercuric chloride Sigma 1044170100
Microplate, 96 well, polypropelene, flat bottom, black  Greiner Bio-One 655209
Minstrel DT UV Formulatrix
Multitron Pro shaker Infors HT MP25-TA-CO2HB
Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-2000
Nanosep 3K Omega centrifugal device PALL Life Science OD003C33
Ni-NTA biosensors PALL FortéBio 18-5102
Octet RED96 PALL ForteBio
Oryx 4 crystallizaiton robot Douglas Instrument ORY-4/1
Platinum chloride Sigma 520632-1g
Precision Plus Protein Standard Bio-Rad 161-0374
PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit Invitrogen K210006
Quick Coomassie Stain Protein Ark GEN-QC-STAIN-1L
Steriflip Sterile 50 mL Disposable Vacuum Filtration System 0.22 µm Millipore Express EMD Millipore SCGP00525
Superdex 200 Increase 10/300 GL GE Healthcare 28990944
Superose 6 10/300 GL GE Healthcare 17517201
Tantalum bromide cluster Jena bioscience PK-103
Top96 Crystallization Screen Rigaku Reagents 1009846
Tryphan Blue Thermo Fisher Scientific T10282
VDX 24-well with sealant Hampton research HR3-172
α2-6 sialyllactose Sigma Aldrich A8556-1mg

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생화학 문제 137 Glycoproteins N 연결 glycosylation 결정 화 biolayer 간섭계 등온선 적정 열 량 측정 크리스탈 몸을 담글 항 원 바인딩 조각.
X 선 결정학 및 생물 기술에 의해 면역 글로불린 겹와 Glycoproteins의 특성
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Ereño-Orbea, J., Sicard, T.,… More

Ereño-Orbea, J., Sicard, T., Cui, H., Akula, I., Julien, J. P. Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques. J. Vis. Exp. (137), e57750, doi:10.3791/57750 (2018).

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