Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لتقييم تكوين بيوفيلم الشفوي على مواد التيتانيوم وزركونيا للدعائم الأسنان الاصطناعية، بما في ذلك تحليل الجدوى الخلايا البكتيرية والخصائص المورفولوجية. نموذج في الموقع المرتبطة بتقنيات الفحص المجهري قوية يستخدم لتحليل بيوفيلم الشفوي.
Abstract
زراعة الأسنان ومكوناتها الاصطناعية المعرضة للاستعمار الجرثومي وتشكيل بيوفيلم. قد يقلل استخدام المواد التي توفر التصاق الميكروبات منخفضة بانتشار وتطور الأمراض زرع المناطق المحيطة بالمدن. وبالنظر إلى البيئة عن طريق الفم التعقيد والفم بيوفيلم التغايرية، الفحص المجهري التقنيات اللازمة التي تمكن من إجراء تحليل بيوفيلم لأسطح الأسنان ومواد طب الأسنان. توضح هذه المقالة سلسلة من البروتوكولات التي نفذت لمقارنة تشكيل بيوفيلم الشفوي على التيتانيوم ومواد خزفية للدعائم الاصطناعية، فضلا عن أساليب المشاركة في تحليلات الأغشية الحيوية عن طريق الفم المستويات المورفولوجية والهاتف الخلوي. يوفر الطراز في الموقع لتقييم تشكيل بيوفيلم شفويا في مواد التيتانيوم وزركونيا للدعائم بدلة الأسنان كما هو موضح في هذه الدراسة الحفاظ على مرض بيوفيلم ح 48، مدللة بذلك على مدى ملاءمة المنهجية. مولتيفوتون المجهري يسمح تحليل المجال ممثل بيوفيلم شكلت في اختبار المواد. وبالإضافة إلى ذلك، استخدام فلوروفوريس، ومعالجة الصور باستخدام الفحص المجهري مولتيفوتون يسمح تحليل جدوى البكتيرية في عدد سكان متباينة للغاية من الكائنات الحية الدقيقة. إعداد العينات البيولوجية الميكروسكوب الإلكتروني يعزز الحفاظ على هيكلية بيوفيلم والصور مع قرار جيد، ولا التحف.
Introduction
الأغشية الحيوية البكتيرية معقدة، وظيفيا وهيكليا بتنظيم المجتمعات الميكروبية، وتتميز بتنوع الأنواع الميكروبية التي توليف مصفوفة بوليمر خارج الخلية، نشط بيولوجيا1،2. التصاق البكتيريا على أسطح أحيائياً أو غير أحيائي مسبوقاً بتشكيل من جليده المكتسبة، تتكون أساسا من جليكوبروتينس اللعابية1،،من34. في البداية ضعف التفاعلات الفيزيائية بين الكائنات الحية الدقيقة وجليده في المنشأة وتليها أقوى من التفاعلات بين أدهيسينس البكتيرية ومستقبلات بروتين سكري من جليده المكتسبة. التنوع الميكروبي يزيد تدريجيا من خلال كواجريجيشن المستعمرين الثانوية لمستقبلات البكتيريا الفعل المرفقة، تشكيل مجتمع المنصبة1،،من34، 5.
التوازن الحجمية الشفوي وعلاقتها التكافلية مع المضيف مهم في الحفاظ على صحة الفم والأسنان. ديسبيوسيس داخل الأغشية الحيوية عن طريق الفم قد تزيد من مخاطر تطوير نخر الأسنان وأمراض اللثة2،5. وتبين الدراسات السريرية علاقة السبب والنتيجة بين تراكم بيوفيلم في الأسنان أو زراعة الأسنان وتطوير التهاب اللثة أو المناطق المحيطة زرع التهاب الغشاء المخاطي6،7. تطور عملية التهاب يؤدي إلى المناطق المحيطة إيمبلانتيتيس وما يترتب عليه من ضياع زرع8.
زراعة الأسنان ومكوناتها الاصطناعية المعرضة للاستعمار الجرثومي و تشكيل بيوفيلم9. قد يقلل استخدام المواد بالتركيب الكيميائي وتضاريس السطح التي توفر التصاق الميكروبات منخفضة بانتشار وتطور المناطق المحيطة زرع الأمراض9،10. التيتانيوم هو المادة الأكثر استخداماً في صنع الأطراف الاصطناعية الدعائم ليزرع؛ ومع ذلك، أدخلت مؤخرا مواد السيراميك وتكتسب شعبية كبديل للتيتانيوم بسبب الخصائص الجمالية وتوافق مع الحياة11،12. أيضا الأهم من ذلك، مواد السيراميك ارتبطت مع احتمال انخفاض يفترض أن التمسك بالكائنات المجهرية، أساسا نظراً لخشونة السطح، ويتابيليتي، والطاقة الحرة السطحية10،13.
الدراسات في المختبر قد ساهمت في تحقيق تقدم كبير في فهم التصاق الجراثيم لدعمه الاصطناعية سطوح9،14،15،،من1617. ومع ذلك، البيئة الحيوية في تجويف الفم، تتميز باختلاف درجة الحرارة ودرجة الحموضة وتوافر المغذيات، فضلا عن وجود قوات القص، ليس استنساخه في المختبر البروتوكولات التجريبية18، 19. للتغلب على هذه المشكلة، وبديل هو استخدام النماذج في الموقع لتشكيل بيوفيلم، الذي يحفظ مفيد لها هيكل ثلاثي الأبعاد السابقين فيفو تحليل10،20، 21 , 22 , 23 , 24.
تحليل البنية المعقدة بيوفيلم تشكيل على ركائز الشفوي يتطلب استخدام تقنيات مجهرية قادرة على عرض المسألة بصريا كثيفة25. مولتيفوتون ليزر المسح المجهري خيار حديثة ل التحليل الهيكلي بيوفيلم26. ويتميز باستخدام البصريات غير الخطية مع مصدر إضاءة قريب من الطول الموجي تحت الحمراء، نابض فيمتوسيكوندس27. تتم الإشارة إلى هذا الأسلوب للحصول على صورة مواد أوتوفلوريسسينسي أو المواد التي تميزت فلوروفوريس، بالإضافة إلى الصور التي تم إنشاؤها بواسطة الإشارات الضوئية غير الخطية المستمدة من ظاهرة تعرف باسم "جيل التوافقي الثاني". من بين مزايا الفحص المجهري مولتيفوتون هو عمق صورة كبيرة حصلت مع الخلية الحد الأدنى الأضرار الناجمة عن شدة الإثارة الخفيفة27.
تحليل جدوى من بيوفيلم على الأسطح اللاأحيائية بالفحص المجهري مولتيفوتون، استخدام الحمض النووي الفلورية الأصباغ مع الخصائص الطيفية المختلفة وقدرة اختراق في الخلايا البكتيرية المطلوب28. فلوروفوريس SYTO9 (أخضر-فلوري) ويوديد propidium (الأحمر-فلوري) يمكن استخدامها لتفريق بصرية بين البكتيريا الحية والميتة28،،من2930. يوديد Propidium تخترق البكتيريا فقط مع الأغشية التالفة، بينما يدخل SYTO9 الخلايا البكتيرية مع غشاء سليمة والمساس بها. عند كل الأصباغ موجودة داخل خلية، يوديد propidium لها صلة أكبر للأحماض النووية ويزيح SYTO9، وضع علامة عليه بالأحمر28،30.
وبالنظر إلى البيئة عن طريق الفم التعقيد والفم بيوفيلم التغايرية، الفحص المجهري التقنيات اللازمة التي تمكن من تحليل بيوفيلم أسطح الأسنان ومواد طب الأسنان. توضح هذه المقالة سلسلة من البروتوكولات التي نفذت لمقارنة تشكيل بيوفيلم الشفوي على التيتانيوم ومواد خزفية للدعائم الاصطناعية، فضلا عن أساليب المشاركة في تحليلات الأغشية الحيوية عن طريق الفم المستويات المورفولوجية والهاتف الخلوي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
هذه الدراسة أقر "المجلس الاستعراض المؤسسي" من كلية طب الأسنان من ريبيراو بريتو، والمشارك المتطوعين وقع بموافقة خطية (عملية 2011.1.371.583).
1-بيوفيلم تشكيل في الموقع
-
اختيار المشاركين
- حدد المرضى استناداً إلى معايير الاشتمال التالية: صحة فرد مع التسنين كامل ولا يوجد علامات سريرية لأمراض الفم.
- استبعاد المرضى استناداً إلى معايير الاستبعاد التالية: الحمل أو الرضاعة، وتسوس الأسنان، وأمراض اللثة أو العلاج بالمضادات الحيوية في آخر 3 أشهر أو مدخن أو أي مرض النظمية التي يمكن أن تؤثر على حالة اللثة.
-
إعداد الجهاز فموية
- سجل القوس فكي علوي عن طريق انطباع بالجينات.
- إعداد النوع الرابع الحجر بإضافة 19 مل من الماء إلى 100 غرام مسحوق الحجر. صب الحجر في العفن الجينات جعل نموذج القوس فكي علوي.
- تصميم واختلاق جهاز فموية اكريليك لدعم اختبار العينات (التيتانيوم والسيراميك الأقراص).
- اختﻻق المشابك متذكر من نيكر السلك (0.7 ملم في القطر) باستخدام كماشة الأسنان #139 ووضعه في النموذج. لتحديد موضع المشبك بين بريمولارس العلوي، ثني واحدة من نهاية كل سلك حتى أنها تشكل حلقة.
- التكيف مع الحلقة في منطقة الحليمة انتردنتال. في أطباقي، إدراج انحناء لطيف حتى لا يؤدي إلى التدخل مع نقاط الاتصال والانسداد. جعل من 90° إضعاف في نهاية المشبك للاحتفاظ بحق في اﻷكريليك.
- لاحتواء المشبك في المولى الثاني العلوي، التكيف مع انحناء السلك الثالث عنق الرحم (الدهليزية) كفاف الأسنان (القاصي) وجعل من 90° إضعاف في نهاية المشبك للاحتفاظ بحق في اﻷكريليك.
ملاحظة: من أجل توفير قدر كاف من الاستقرار/الاحتفاظ بالجهاز فموية، تمركزت المشابك متذكر بين بريمولارس العلوي والجانب القاصي للمولى الثاني على جانبي قوس الأسنان.
- التلاعب على راتنج اﻷكريليك علاج الذاتي طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة واضغط على راتنج اﻷكريليك بين ألواح الزجاج 2 (مع فاصل 3 مم سميكة توسط) أثناء مرحلة البلاستيك، جعل ورقة سميكة 3 مم.
- وضع ورقة اﻷكريليك في منطقة حنكي النموذج، طبقاً لتصميم الجهاز، وتقليم قبالة راتنج اﻷكريليك الفائض مع كارفر، قبل البلمرة.
- اختﻻق أقراص الشمع باستخدام مصفوفة معدنية [10 ملم في القطر، 2 مم في السمك (مساحة 78.5 مم2)] قبل وضع الشمع المنصهر في المصفوفة وانتظار الشمع على ترسيخ. يدوياً تضمين 4 أقراص الشمع في راتنج اﻷكريليك، 2 منهم بين بريمولارس والأخرى 2 بجوار الأضراس الثانية.
- واسمحوا راتنج اﻷكريليك بلمرة في وعاء ضغط تحت 20 رطل هواء المضغوط لمدة 20 دقيقة.
- إنهاء الجهاز فموية مع الجهاز مختبر الأسنان الكهربائية والقاطع والبولندية مع كشط المطاط.
- ضبط الجهاز لتناسب سليم في الفم باستخدام المعدات المذكورة أعلاه.
- اختﻻق المشابك متذكر من نيكر السلك (0.7 ملم في القطر) باستخدام كماشة الأسنان #139 ووضعه في النموذج. لتحديد موضع المشبك بين بريمولارس العلوي، ثني واحدة من نهاية كل سلك حتى أنها تشكل حلقة.
-
إعداد العينات الزركونيا والتيتانيوم
ملاحظة: العينات (n = 14) 10 ملم وقطرها 2 مم في السمك ولها مساحة 78.5 مم2.- البولندية السطوح العينات مع ساندبابيرس المياه المبردة لتقليل أبراسيفينيس (600 و 1200 و 2000 الحصباء)، لمدة حوالي 20 دقيقة.
ملاحظة: والتلميع العينات أجرى لتوحيد خشونة السطح في 0.2 ميكرون. - تنظيف وتطهير العينات والجهاز فموية مع المنظفات السائلة ومياه الحنفية، ومن ثم استخدم حمام كحول الأيزوبروبيل بالموجات فوق الصوتية لتجفيفها 15 دقيقة مع مناشف ورقية ماصة.
- إصلاح العينات في الجهاز عن طريق الفم فموية مع حوالي 0.1 مل من مادة لاصقة تذوب الساخنة غير سامة (الشكل 1).
- قم بتثبيت الجهاز الذي يحتوي على العينات في تجويف الفم.
ملاحظة: يجب أن تلبس الجهاز فموية تحتوي على العينات ح 48. إزالة الجهاز والمخزنة في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) بينما كان يأكل المريض والقيام بتنظيف الفم.
- البولندية السطوح العينات مع ساندبابيرس المياه المبردة لتقليل أبراسيفينيس (600 و 1200 و 2000 الحصباء)، لمدة حوالي 20 دقيقة.
2-تقييم جدوى البكتيرية
ملاحظة: حجم العينة n = 10.
- تعد حلاً صباغة بإضافة 3 ميليلتر من SYTO9 (الخضراء صبغة الفلورسنت الحمض النووي) وماء مقطر 3 ميليلتر من يوديد propidium (الصبغ الأحمر نيون الحمض النووي) إلى 1 مل من العقيمة.
ملاحظة: إعداد حلول الحماية من الضوء. - نقل العينات إلى لوحة 24-جيدا وغسلها جيدا مع برنامج تلفزيوني لإزالة أي من الخلايا غير ملتصقة.
- إضافة وحدة التخزين المناسبة (1 مل) من حل صبغة الفلورسنت لتغطية العينة المحتوية على بيوفيلم. إضافة الصبغة بعناية فائقة حتى لا تتعرض يضعفان في بيوفيلم.
- احتضان العينة لمدة 20-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء.
- بلطف تغسل العينة بيوفيلم بماء مقطر معقم لإزالة أي صبغة الزائدة.
- ضع العينة في صحن أسفل زجاج وإجراء مولتيفوتون ليزر المسح المجهري لتحليل بيوفيلم.
ملاحظة: أجرى تحليل جدوى الخلايا البكتيرية باستخدام نظام الفحص المجهري مولتيفوتون. الأسفار يوديد propidium تم الكشف عن استخدام عامل تصفية مع الطول موجي إثارة/انبعاثات من 546/680 نانومتر و 477/600 نانومتر ل SYTO9. وكان حجم الصور التي تم الحصول عليها 5.16188 × 5.16188 مم، الذي يناظر 26.64 مم2 من المساحة الإجمالية لكل عينة (78.5 مم2) أو 33.94% من المساحة الإجمالية. وأدلى الصور من الجزء الأكثر مركزية للعينة، مع قرار من 1,024 x 1,024 بكسل. تم تحليل القناة الحمراء والخضراء قناة الصور بشكل منفصل باستخدام البرمجيات فيجي31. تم تحديد كل خلية باستخدام أداة تحديد وتم قياس كثافة الأسفار من خلال كثافة بكسل، طرح خلفية الصورة المتكاملة.
3-تحليل التركيب الكيميائي للعينات بالطاقة المشتتة التحليل الطيفي (EDS)
ملاحظة: حجم العينة n = 3.
- حدد 3 عينات من كل مادة اختبار بيوفيلم خالية، وتقييم التركيب الكيميائي في مجالات مختلفة 2 لكل عينة باستخدام المسح الإلكتروني المجهري بالإضافة مطياف الطاقة المشتتة، مع جهد شعاع إلكترون من 10 كيلوفولت32.
4-الخصائص المورفولوجية تحليل بيوفيلم البكتيرية عن طريق فحص المجهر الإلكتروني
ملاحظة: حجم العينة n = 1.
- إصلاح في بيوفيلم بغمر العينات في 2.5 ٪ glutaraldehyde المخفف في م 0.1 الصوديوم كاكوديلاتي المخزن المؤقت، ودرجة الحموضة 7.0-7.3، عن ح 24.
- تغسل العينة في المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني (pH = 7، 6).
- Postfix بيوفيلم مع أكسيد الاوزميوم 1% ح 1.
- تغسل العينة في المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني (pH = 7، 6).
- يذوي عينات بيوفيلم بعناية، وإبقائها منغمسين في التركيزات المتزايدة لحلول الإيثانول (50% و 70%، 90%، 95% و 100%).
ملاحظة: إجراء تبادلات 3 من الإيثانول بتركيز 100%. ويأخذ خطوة الجفاف مجموع حوالي 2 ح. - نقل العينات إلى النقطة الحرجة مجفف وجعل عدة بدائل مع ثاني أكسيد الكربون (CO2) حتى العينات جافة.
- إزالة عينات مجففة من الجهاز وجبل لهم على المكلفين بالمسح الإلكتروني المجهري.
- الرش-معطف 20 نانومتر طبقة من الذهب على سطح العينة 120 ثانية.
- إدراج الأقراص المغلفة بالذهب في دائرة المسح الإلكتروني المجهري. الحصول على الصور من 5 مناطق مختلفة لكل عينة، 20-30 كيلو فولت تحت ضغط متغير و التكبير X 65012.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ومثلت كثافة استعمار بيوفيلم بعد 48 ساعة نمو في الموقع في هذه الدراسة نسبة من منطقة المستعمر على الأقراص التيتانيوم والزركونيا فيما يتعلق بمجال الممسوحة ضوئياً مجموع العينة باستخدام (الميكروسكوب مولتيفوتون 26.64 مم2). ويمثل الرقم 2 كثافة الاستعمار الجرثومي على سطح المواد التي تم اختبارها 3. ولوحظ كثافة أعلى من بيوفيلم على أسطح المدلى بها وعلى الأقراص التيتانيوم تشكيلة (0.0292 ميكرومتر2 و2من 0.0213 ميكرومتر، على التوالي) مما في الأقراص زركونيا (0.0099 ميكرومتر2؛ ف < 0.05؛ اختبار كروسكالواليس، تليها الاختبار دن).
ويبين الشكل 3 صلاحية الخلايا البكتيرية على أسطح زركونيا (الشكل 3 ألف، 3A '، و 3A")، تشكيلة التيتانيوم (الشكل 3B، 3B '، و 3B")، ويلقي التيتانيوم (الشكل 3، ج 3 ' ، و ج 3 ") أقراص. في هذا البروتوكول، يوديد propidium صبغ الحمض النووي تخترق فقط البكتيريا مع غشاء تالفة، وذلك، تنبعث منه إشارة الفلورسنت الأحمر المرتبط بالخلايا الميتة. SYTO9 تخترق الخلايا البكتيرية مع الأغشية سليمة أو المساس بها، وتنبعث إشارة فلورية خضراء من الكائنات الحية الدقيقة. وكان بقاء البكتيريا الخلوية مماثلة بين مواد الاختبار، مع غلبة للكائنات المجهرية الحية في جميع الفئات (الشكل 4). وكانت نسب الخلايا يعيش الميت 2.10 الزركونيا و 1.95 للتيتانيوم تشكيلة 1.63 للتيتانيوم المدلى بها.
الشقوق أو الأخاديد أو عيوب التآكل أنتجت على السطح من جميع المواد أثناء عملية التلميع و/أو القطع ولوحظت، أكثر وضوحاً في تشكيلة ويلقي التيتانيوم الأقراص. ولوحظت في الأقراص الزركونيا، مساحات أكبر مع عدم وجود الكائنات الحية الدقيقة؛ كما لوحظ المجاميع الميكروبية متعددة الأشكال الصغيرة تتألف أساسا من كوتشي، والعصيات والبكتيريا الخيطية (الشكل 5A و 5A '). وجود كوكسي وعصيات كانت منتشرة على أسطح الأقراص التيتانيوم تشكيلة (الشكل 5B و 5B '). عرض العينات التيتانيوم المدلى بها مستعمرات الكائنات الدقيقة المعنية في مصفوفة مع مظهر يشبه بيوفيلم على السطح (الشكل 5 و 5 ج '). ولوحظ أقل المواد المصفوفة على سطح الأقراص الزركونيا بالمقارنة مع تشكيلة من التيتانيوم ويلقي التيتانيوم الأقراص.
وكشف تحليل EDS 70.83% زركونيا، 22.84% من الأكسجين، 4.52% من الإيتريوم، و 1.57% من الهافنيوم الرباعي في الأقراص الزركونيا؛ 95.16% تيتانيوم و 3.99% من الأوكسجين 0.85 في المائة من الكربون في الأقراص التيتانيوم المدلى بها؛ و 89.86 في المائة تيتانيوم، 7.53 في المائة من الأكسجين، و 2.61% من الكربون في الأقراص التيتانيوم تشكيلة (الشكل 6).
الشكل 1 : جهاز فموية في الموقع الدراسة. كانت ملفقة المشابك متذكر بسلك المطاوع، والتيتانيوم والزركونيا اختبار الأقراص (10 ملم في القطر، 2 مم) تمركزت عشوائياً في منطقتي بريمولارس والاضراس، جزئيا جزءا لا يتجزأ من علاج ذاتي راتنج اﻷكريليك. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : الصور fluorescence كثافة الخلايا البكتيرية. هذه صور الأسفار من التيتانيوم على زركونيا (A)، (ب) كثافة تشكيلة الخلايا البكتيرية، ويلقي (ج) أقراص التيتانيوم بعد 48 ساعة في الموقع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : استمرارية الخلية البكتيريا انضمت إلى السطوح. هذه اللوحات إظهار جدوى خلية البكتيريا التمسك أسطح الميت (A) ويعيش الخلايا البكتيرية في زركونيا، (ب) الميت وتعيش الخلايا البكتيرية على تشكيلة من التيتانيوم، والميت (ج) وتعيش الخلايا البكتيرية على التيتانيوم المدلى بها الأقراص التي صورت بالتصوير بالأسفار. الخلايا البكتيرية الميت ملطخة يوديد propidium (A '، ب، و ج': إشارة الفلورسنت الأحمر). البكتيريا الحية هي ملطخة SYTO9 (A "، ب"، و ج ": إشارة الفلورية الخضراء). لوحات A، Bو C تظهر الصور دمج الألوان. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : بوكسبلوتس بيوفيلم تمثل الخلية البقاء في اختبار مختلف المواد- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : فحص المجهر الإلكتروني. إظهار هذه الألواح الميكروسكوب الإلكتروني المسح الضوئي ل (أ، أ ') الزركونيا، (ب، ب) تشكيلة التيتانيوم، و (ج، ج') يلقي التيتانيوم الأقراص مع بيوفيلم، بانورامية وقرب وجهات النظر، بعد 48 ساعة في الموقع . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 : تحليل عنصري بالطاقة المشتتة التحليل الطيفي (EDS). هذه اللوحات تظهر الأقراص زركونيا (A) (Zr الزركونيا، Y = = الإيتريوم، ج = الكربون، س = الأكسجين، والتردد = الهافنيوم)؛ (ب) تشكيلة التيتانيوم، ويلقي (ج) أقراص التيتانيوم (Ti = التيتانيوم، O = الأكسجين، وج = الكربون). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ووضع البروتوكول، المذكورة في هذه الدراسة لتقييم تكوين بيوفيلم مواد التيتانيوم وزركونيا للدعائم الاصطناعية، بما في ذلك تحليل الجدوى الخلية البكتيرية والخصائص المورفولوجية. من أجل تحقيق هذا الهدف، صمم في الموقع نموذجي لتشكيل بيوفيلم، تتألف من جهاز فموية قادرة على استيعاب عينات مواد الاختبار وإبقائهم في معرضة للبيئة الحيوية الشفوي ح 48. واعتبر الجهاز مريحة وسهلة لإدراج وإزالة وتنظيف بالمتطوعين. حتى الآن، أظهرت أنه أثر ضئيل على علم الصوتيات وعلم الجمال، بسيطة ومنخفضة التكلفة اختﻻق، ويسمح سهولة استرداد العينات دون الإخلال ببنية بيوفيلم. وعلاوة على ذلك، يسمح الأسلوب الحفاظ على الخلايا البكتيرية والنزاهة في المصفوفة خارج الخلية. جهة الاتصال للسان مع العينات وفقدانها للقرص أثناء التجربة هي القيود المفروضة على النموذج المقترح. بغية التقليل إلى أدنى حد من القيود المفروضة على الأسلوب، تحديد المواقع من الأقراص في الجهاز فموية كانت موزعة بشكل عشوائي؛ وبالإضافة إلى ذلك، تم إصلاح الأقراص بمادة لاصقة تذوب الساخنة غير سامة، وأبلغ أي فقدان للعينة.
نظراً لعدم تجانس عالية من الأنواع البكتيرية التي تعيش في البيئة عن طريق الفم، تقنيات الفحص المجهري القوية مطلوبة من أجل تحليل الأغشية الحيوية استعمار السطوح الصلبة. مولتيفوتون المجهري يوفر عدة مزايا أكثر التحليلات الفحص المجهري التقليدي أو [كنفوكل]، مثل حل ثلاثي الأبعاد الأصيلة، إثارة القريبة من الأشعة تحت الحمراء للاختراق بصري متفوقة، والحد فوتوبليتشينج و د عند التصوير الخلايا الحية، وقدرة على تقديم معلومات كمية33،34. وتنشأ هذه المزايا عن طريق الإثارة العالية مترجمة لعملية امتصاص فوتون اثنين وتأثير انخفاض نثر الضوء في العينات. ولذلك، تمكن مولتيفوتون المجهري تصوير الأنسجة العميقة وتلف الخلايا الحد الأدنى، والتكريس للكيمياء الضوئية جيدا المترجمة34. أخذ عينات عشوائية وعدد تمثيلي من الحقول أن ينتخب لتحليلات دقيقة35،36. الليزر مولتيفوتون الفحص المجهري يسمح تحليل مجالات 5161.88 x 5161.88 ميكرومتر، تناظر 33.94% من المنطقة العينة الإجمالية في. لم يستخدم مجهرية [كنفوكل] بسبب الحاجة إلى عدد كبير من الحقول لتحليل الممثل وفترة طويلة من التقييم للعينات. وعلاوة على ذلك، تقتصر الإشارات الخلفية خارج نطاق التركيز استخدام مجهر الأسفار. وعلى الرغم من مزايا مجهرية مولتيفوتون، هي إلا عدد قليل من التطبيقات في مجال الميكروبيولوجي عنها37،،من3839. ومن بين هذه هو استخدامه كأداة لتلاعب؛ على سبيل المثال، لتحقيق الاستئصال المترجمة، الخلايا المبرمج/نخر أو تبيض أو فوتواكتيفيشن من وحدة تخزين محددة جيدا من بيوفيلم26. تطبيق آخر لهذا الأسلوب تقييم فعالية العوامل المضادة للبكتيريا ضد بيوفيلم متعددة المكونات25،،من4041.
في هذه الدراسة، تم تقييم جدوى التقيد بها الخلايا البكتيرية مع الأصباغ الفلورية الحمض النووي، التي تخترق الخلايا كدالة على سلامة الغشاء28. واستخدمت يوديد SYTO9 فلوروفوريس وبروبيديوم للتفريق بين البصرية بين البكتيريا الحية والميتة. وترد بعض القيود المفروضة على استخدام يوديد SYTO9 وبروبيديوم في الأدب، مثل صعوبة SYTO9 وصمة عار بكتيريا سلبية الغرام مع غشاء سليمة لأنها عبر أغشية الخلية اثنين موجودة في بنية30، 42. وهكذا، يمكن الاستهانة بها الخلايا الحية تلطيخ مجتمعة. وبالإضافة إلى ذلك، عندما لا يتم استبدال SYTO9 تماما يوديد propidium، يمكن ملاحظة fluorescence الأصفر بدلاً من الأحمر في الخلايا البكتيرية30،42. قيد آخر هو انخفاض إشارة SYTO9 على مر الزمن. من المستحسن أن تجري تحاليل مجهرية داخل 30 دقيقة بعد التعرض ل الأصباغ29،30. من الضروري أن تنظر في الأسفار الخلفية لحساب كثافة إشارة، منذ أوتوفلوريسسينسي الركازة ووجود صبغة غير منضم قد تتداخل مع نتائج30. ومع ذلك، حيث يتم أيضا الإبلاغ عن هذه القيود، من الممكن أن العينات التي تتم معالجتها في الإطار الزمني المحدد، كذلك فيما يتعلق بتحديد وطرح الخلفية للصور مع معونة البرمجيات فيجي بعناية.
تشعيع الفراغ والالكترون عالية أثناء المسح الضوئي المجهر الإلكتروني تمثل الظروف المعاكسة للعينات المحتوية على المواد البيولوجية. بالإضافة إلى خصائص غير موصل، هو رطب بيوفيلم في حالته الطبيعية، الذي يتداخل مع إلكترون توليد والكشف عن النظام، تشكيل التحف43. ولذلك، يجب إعداد العينات تحتوي على مواد بيولوجية ضمانا للحفاظ على هيكل والتوصيل بها43،الإلكترونات44. وضعت مراحل البروتوكول المتعلقة بالتثبيت، الجفاف، والتجفيف، وطلاء من العينات مع مواد موصلة مع إيلاء اهتمام خاص لتخفيف والوقت. تثبيت المواد البيولوجية التي أجرى مع ألدهيد في المخزن مؤقت كاكوديلاتي وبعد انتهاء التثبيت مع أكسيد الاوزميوم، بغية الحفاظ على هيكل بيوفيلم التقيد بها43،،من4546. وقد تحقق الجفاف بسلسلة تصاعدي من تركيزات الإيثانول، مع الماء ويجري تدريجيا الاستعاضة عن المذيبات العضوية44. التجفيف بتشويه الحد أدنى للهندسة المعمارية بيوفيلم أنجز عن طريق نقطة حرجة مع استبدال المتعاقبة من أول أكسيد الكربون السائل2 لإزالة الإيثانول، متبوعاً تحويل CO2 إلى الطور الغازي، إزالة السائل/ واجهة الغاز، والقضاء على التوتر السطحي في العينة43،45،،من4446. لضمان التوصيل للإلكترونات، ومنع أو الحد من الأضرار، وصورة القطع الأثرية، العينات كانت مغطاة بطبقة شمال البحر الأبيض المتوسط 10-20 من الذهب أو الذهب/البلاديوم. وباﻹضافة إلى ذلك، طلاء العينات مع طبقة رقيقة من المعدن ويمكن الحد من تراكم حشوة كهربائية داخل عينة وتحسين التباين وزيادة صورة القرار46.
وعلى الرغم من بعض القيود، كان النموذج في الموقع الموصوفة في هذه الدراسة الكافية لتقييم تكوين بيوفيلم الشفوية على المواد الزركونيا والتيتانيوم، الحفاظ على بيوفيلم ح 48. استخدام fluorophores المرتبطة بالتصوير بالفحص المجهري مولتيفوتون يسمح تحليل جدوى الخلايا البكتيرية في عدد سكان متباينة للغاية من الكائنات المجهرية استعمار مواد الاختبار. التقنيات المستخدمة في إعداد البيولوجية عينات تشجيع الحفاظ على بيوفيلم هيكلية ويسمح بالحصول على صور عالية الجودة للتصور وتوصيف الخصائص المورفولوجية للكائنات الحية الدقيقة المستعمر .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون خوسيه أوغوستو مولين من "مختبر الفحص المجهري متعدد المستخدمين" (مدرسة الطب في ريبيراو بريتو) لمساعدته السخية مع EDS ووزارة شؤون المرأة التحليلات و Hermano تيكسيرا ماتشادو لمساعدته التقنية السخية في طبعة الفيديو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrogum 5 | Zhermack Dental | C302070 | |
| Durone IV | Dentsply | 17130500002 | |
| NiCr wire | Morelli | 55.01.070 | |
| JET auto polymerizing acrylic | Clássico | ||
| Dental wax | Clássico | ||
| Pressure pot | Essencedental | ||
| Sandpapers 600 grit | NORTON | T216 | |
| Sandpapers 1200 grit | NORTON | T401 | |
| Sandpapers 2000 grit | NORTON | T402 | |
| Metallographic Polishing Machine | Arotec | ||
| Isopropyl alcohol | SIGMA-ALDRICH | W292907 | |
| Hot melt adhesive | TECSIL | PAH M20017 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit | Invitrogen | L10316 | |
| Pipette Tips, 10 µL | KASVI | K8-10 | |
| Pipette Tips, 1,000 µL | KASVI | K8-1000B | |
| 24-well plate | KASVI | K12-024 | |
| Glass Bottom Dish | Thermo Scientific | 150680 | |
| AxioObserver inverted microscope | ZEISS | ||
| Chameleon vision ii laser | Coherent | ||
| Objective EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DIC | ZEISS | 440452-9903-000 | |
| SDD sensors - X-Max 20mm² | Oxford Instruments | ||
| Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G5882 | |
| Sodium cacodylate Buffer | SIGMA-ALDRICH | 97068 | |
| Osmium tetroxide | SIGMA-ALDRICH | 201030 | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH | S9638 | Used for preparation of phosphate buffered saline |
| KH2PO4 | SIGMA-ALDRICH | P9791 | |
| NaCl | MERK | 1.06404 | |
| Kcl | SIGMA-ALDRICH | P9333 | |
| Ethanol absolute for analysis EMSURE | MERK | 1.00983 | |
| CPD 030 Critical Point Dryer | BAL-TEC | ||
| JSM-6610 Series Scanning Electron Microscope | JEOL | ||
| SCD 050 Sputter Coater | BAL-TEC |
References
- Do, T., Devine, D., Marsh, P. D. Oral biofilms: molecular analysis, challenges, and future prospects in dental diagnostics. Clinical, Cosmetic and Investigational Dentistry. 5, 11-19 (2013).
- Samaranayake, L., Matsubara, V. H. Normal Oral Flora and the Oral Ecosystem. Dental Clinics of North America. 61 (2), 199-215 (2017).
- Larsen, T., Fiehn, N. E. Dental biofilm infections - an update. Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 125 (4), 376-384 (2017).
- Marsh, P. D., Do, T., Beighton, D., Devine, D. A. Influence of saliva on the oral microbiota. Periodontology 2000. 70 (1), 80-92 (2016).
- Marsh, P. D., Zaura, E. Dental biofilm: ecological interactions in health and disease. Journal of Clinical Periodontology. 44 Suppl 18, S12-S22 (2017).
- Zitzmann, N. U., Berglundh, T., Marinello, C. P., Lindhe, J.
- Meyer, S., et al. Experimental mucositis and experimental gingivitis in persons aged 70 or over. Clinical and biological responses. Clinical Oral Implants Research. 28 (8), 1005-1012 (2017).
- Salvi, G. E., Cosgarea, R., Sculean, A. Prevalence and Mechanisms of Peri-implant Diseases. Journal of Dental Research. 96 (1), 31-37 (2017).
- Hahnel, S., Wieser, A., Lang, R., Rosentritt, M. Biofilm formation on the surface of modern implant abutment materials. Clinical Oral Implants Research. 26 (11), 1297-1301 (2015).
- Nascimento, C., et al. Bacterial adhesion on the titanium and zirconia abutment surfaces. Clinical Oral Implants Research. 25 (3), 337-343 (2014).
- Nakamura, K., Kanno, T., Milleding, P., Ortengren, U. Zirconia as a dental implant abutment material: a systematic review. The International Journal of Prosthodontics. 23 (4), 299-309 (2010).
- Scarano, A., Piattelli, M., Caputi, S., Favero, G. A., Piattelli, A. Bacterial adhesion on commercially pure titanium and zirconium oxide disks: an in vivo human study. Journal of Periodontology. 75 (2), 292-296 (2004).
- Nascimento, C., et al. Microbiome of titanium and zirconia dental implants abutments. Dental Materials. 32 (1), 93-101 (2016).
- Rimondini, L., Cerroni, L., Carrassi, A., Torricelli, P. Bacterial colonization of zirconia ceramic surfaces: an in vitro and in vivo study. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants. 17 (6), 793-798 (2002).
- de Avila, E. D., Avila-Campos, M. J., Vergani, C. E., Spolidorio, D. M., Mollo Fde, A. Jr Structural and quantitative analysis of a mature anaerobic biofilm on different implant abutment surfaces. Journal of Prosthetic Dentistry. 115 (4), 428-436 (2016).
- de Avila, E. D., et al. Impact of Physical Chemical Characteristics of Abutment Implant Surfaces on Bacteria Adhesion. Journal of Oral Implantology. 42 (2), 153-158 (2016).
- de Avila, E. D., et al. Effect of titanium and zirconia dental implant abutments on a cultivable polymicrobial saliva community. Journal of Prosthetic Dentistry. 118 (4), 481-487 (2017).
- Lin, N. J. Biofilm over teeth and restorations: What do we need to know? Dental Materials. 33 (6), 667-680 (2017).
- Prada-Lopez, I., Quintas, V., Tomas, I. The intraoral device of overlaid disk-holding splints as a new in situ oral biofilm model. Journal of Clinical and Experimental Dentistry. 7 (1), e126-e132 (2015).
- Prada-Lopez, I., Quintas, V., Vilaboa, C., Suarez-Quintanilla, D., Tomas, I. Devices for in situ Development of Non-disturbed Oral Biofilm. A Systematic Review. Frontiers in Microbiology. 7, 1055 (2016).
- Burgers, R., et al. In vivo and in vitro biofilm formation on two different titanium implant surfaces. Clinical Oral Implants Research. 21 (2), 156-164 (2010).
- do Nascimento, C., et al. Oral biofilm formation on the titanium and zirconia substrates. Microscopy Research and Technique. 76 (2), 126-132 (2013).
- Al-Ahmad, A., et al. In vivo study of the initial bacterial adhesion on different implant materials. Archives of Oral Biology. 58 (9), 1139-1147 (2013).
- Al-Ahmad, A., et al. Bacterial adhesion and biofilm formation on yttria-stabilized, tetragonal zirconia and titanium oral implant materials with low surface roughness - an in situ study. Journal of Medical Microbiology. 65 (7), 596-604 (2016).
- Thomsen, H., et al. Delivery of cyclodextrin polymers to bacterial biofilms - An exploratory study using rhodamine labelled cyclodextrins and multiphoton microscopy. International Journal of Pharmaceutics. 531 (2), 650-657 (2017).
- Lakins, M. A., Marrison, J. L., O'Toole, P. J., van der Woude, M. W. Exploiting advances in imaging technology to study biofilms by applying multiphoton laser scanning microscopy as an imaging and manipulation tool. Journal of Microscopy. 235 (2), 128-137 (2009).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain, BacLight. Cytometry Part A. 61 (2), 189-195 (2004).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (79), e50729 (2013).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15, 36 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Placko, H. E., Mishra, S., Weimer, J. J., Lucas, L. C. Surface characterization of titanium-based implant materials. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants. 15 (3), 355-363 (2000).
- So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M.
- Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 4, Unit 4.11 11-24 (2013).
- Gardi, J. E., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. The proportionator: unbiased stereological estimation using biased automatic image analysis and non-uniform probability proportional to size sampling. Computers in Biology and Medicine. 38 (3), 313-328 (2008).
- Melvin, N. R., Poda, D., Sutherland, R. J. A simple and efficient alternative to implementing systematic random sampling in stereological designs without a motorized microscope stage. Journal of Microscopy. 228 (Pt 1), 103-106 (2007).
- Neu, T. R., Kuhlicke, U., Lawrence, J. R. Assessment of fluorochromes for two-photon laser scanning microscopy of biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 68 (2), 901-909 (2002).
- Neu, T. R., Woelfl, S., Lawrence, J. R. Three-dimensional differentiation of photo-autotrophic biofilm constituents by multi-channel laser scanning microscopy (single-photon and two-photon excitation). Journal of Microbiological Methods. 56 (2), 161-172 (2004).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends in Microbiology. 23 (4), 233-242 (2015).
- Lacroix-Gueu, P., Briandet, R., Leveque-Fort, S., Bellon-Fontaine, M. N., Fontaine-Aupart, M. P. In situ measurements of viral particles diffusion inside mucoid biofilms. Comptes Rendus Biologies. 328 (12), 1065-1072 (2005).
- Briandet, R., et al. Fluorescence correlation spectroscopy to study diffusion and reaction of bacteriophages inside biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 74 (7), 2135-2143 (2008).
- Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).
- Bergmans, L., Moisiadis, P., Van Meerbeek, B., Quirynen, M., Lambrechts, P. Microscopic observation of bacteria: review highlighting the use of environmental SEM. International Endodontic Journal. 38 (11), 775-788 (2005).
- Hannig, C., Follo, M., Hellwig, E., Al-Ahmad, A. Visualization of adherent micro-organisms using different techniques. Journal of Medical Microbiology. 59 (Pt 1), 1-7 (2010).
- Knutton, S.
- Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 2, Unit 2B.2 (2012).
