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Medicine

दंत प्रत्यारोपण के लिए विभिंन सामग्रियों पर मौखिक फिल्म गठन

Published: June 24, 2018 doi: 10.3791/57756
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Dental Materials and Prosthodontics, School of Dentistry of Ribeirão Preto, University of São Paulo, 2Department of Restorative Dentistry, School of Dentistry of Ribeirão Preto, University of São Paulo

Summary

यहां, हम दंत कृत्रिम अंग अंग abutments के लिए टाइटेनियम और zirconia सामग्री पर मौखिक फिल्म गठन का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद, बैक्टीरियल कोशिकाओं व्यवहार्यता और रूपात्मक विशेषताओं का विश्लेषण भी शामिल है । एक में सीटू मॉडल शक्तिशाली माइक्रोस्कोपी तकनीक के साथ जुड़े मौखिक फिल्म विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है.

Abstract

दंत प्रत्यारोपण और उनके कृत्रिम घटकों बैक्टीरियल औपनिवेशीकरण और फिल्म गठन के लिए प्रवण हैं । सामग्री है कि कम माइक्रोबियल आसंजन प्रदान करता है का उपयोग पेरि प्रत्यारोपण रोगों की व्यापकता और प्रगति को कम कर सकते हैं । मौखिक पर्यावरण जटिलता और मौखिक फिल्म विविधता को ध्यान में रखते हुए, सूक्ष्म तकनीक की जरूरत है कि दांत और दंत सामग्री की सतहों के एक फिल्म विश्लेषण को सक्षम कर सकते हैं । यह लेख कृत्रिम abutments के लिए टाइटेनियम और सिरेमिक सामग्री पर मौखिक फिल्म के गठन की तुलना के लिए कार्यांवित प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला का वर्णन करता है, साथ ही साथ मौखिक में शामिल तरीके रूपात्मक और सेलुलर स्तर पर फिल्म विश्लेषण । इस अध्ययन में वर्णित के रूप में दंत कृत्रिम अंग अंग abutments के लिए टाइटेनियम और zirconia सामग्री पर मौखिक फिल्म गठन का मूल्यांकन करने के लिए सीटू मॉडल में ४८ एच की फिल्म के एक संतोषजनक संरक्षण प्रदान करता है, जिससे methodological पर्याप्तता का प्रदर्शन. Multiphoton माइक्रोस्कोपी परीक्षण सामग्री पर गठित की गई फिल्म के एक क्षेत्र प्रतिनिधि के विश्लेषण की अनुमति देता है. इसके अलावा, fluorophores और multiphoton माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर छवियों के प्रसंस्करण का उपयोग सूक्ष्मजीवों की एक बहुत विषम जनसंख्या में बैक्टीरियल व्यवहार्यता के विश्लेषण की अनुमति देता है । इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए जैविक नमूनों की तैयारी जैव फिल्म के संरचनात्मक संरक्षण, अच्छा संकल्प के साथ छवियों, और कोई कलाकृतियों को बढ़ावा देता है ।

Introduction

बैक्टीरियल फिल्म जटिल, कार्यात्मक और संरचनात्मक रूप से संगठित माइक्रोबियल समुदायों रहे हैं, एक extracellular, जैविक रूप से सक्रिय बहुलक मैट्रिक्स1,2कि संश्लेषण माइक्रोबियल प्रजातियों की विविधता की विशेषता । बायोटिक या अजैव सतहों के लिए बैक्टीरियल आसंजन अधिग्रहीत पतली झिल्ली के गठन से पहले है, मुख्य रूप से लार से मिलकर नच1,3,4. सूक्ष्मजीवों और पतली झिल्ली के बीच कमजोर भौतिक बातचीत शुरू में स्थापित कर रहे है और बैक्टीरियल adhesins और अधिग्रहीत पतली झिल्ली के ग्लाइकोप्रोटीन रिसेप्टर्स के बीच मजबूत बातचीत के बाद । माइक्रोबियल विविधता धीरे coaggregation माध्यमिक कॉलोनाइजरों के पहले से ही संलग्न जीवाणुओं के रिसेप्टर्स के माध्यम से बढ़ जाती है, एक multispecies समुदाय बनाने1,3,4, 5.

ओरल microbiota के Homeostasis और उसके सहजीवी संबंध की मेज़बानी के साथ मौखिक स्वास्थ्य को बनाए रखने में महत्वपूर्ण है. मौखिक dysbiosis के भीतर फिल्म क्षय और periodontal रोग2,5के विकास के लिए खतरा बढ़ सकता है । नैदानिक अध्ययन दांत या दंत प्रत्यारोपण और मसूड़े की सूजन या पेरि-प्रत्यारोपण mucositis6,7के विकास पर फिल्म के संचय के बीच एक कारण और प्रभाव संबंध प्रदर्शित करता है । भड़काऊ प्रक्रिया की प्रगति पेरि-implantitis और प्रत्यारोपण8के फलस्वरूप नुकसान होता है ।

दंत प्रत्यारोपण और उनके कृत्रिम घटकों बैक्टीरियल औपनिवेशीकरण और फिल्म गठन9के लिए प्रवण हैं । एक रासायनिक संरचना और सतह स्थलाकृति है कि कम माइक्रोबियल आसंजन प्रदान करता है के साथ सामग्री के उपयोग के प्रसार और पेरि प्रत्यारोपण रोगों9,10की प्रगति को कम कर सकते हैं । टाइटेनियम प्रत्यारोपण के लिए कृत्रिम abutments के निर्माण के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया सामग्री है; हालांकि, चीनी मिट्टी सामग्री हाल ही में शुरू किए गए थे और क्योंकि उनके सौंदर्य गुण और11संगतता,12के टाइटेनियम के लिए एक विकल्प के रूप में लोकप्रियता प्राप्त कर रहे हैं । इसके अलावा महत्वपूर्ण बात, सिरेमिक सामग्री एक माना जाता कम क्षमता के साथ जुड़ा हुआ है सूक्ष्मजीवों का पालन करने के लिए, मुख्य रूप से उनकी सतह किसी न किसी की वजह से, गीला, और सतह मुक्त ऊर्जा10,13।

इन विट्रो अध्ययनों में कृत्रिम abutment सतहों के लिए माइक्रोबियल आसंजन की समझ में महत्वपूर्ण प्रगति के लिए योगदान दिया है9,14,15,16,17। हालांकि, मौखिक गुहा के गतिशील वातावरण, इसके अलग तापमान और पीएच और पोषक तत्वों की उपलब्धता, साथ ही कतरनी बलों की उपस्थिति के द्वारा विशेषता है, में reproducible नहीं है इन विट्रो प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल18में, 19. शी. इस समस्या को दूर करने के लिए, एक विकल्प है, जो कि पूर्व वीवो विश्लेषण के लिए अपने तीन आयामी संरचना को बरकरार रखता है के लिए, एक वैकल्पिक के रूप में , के लिए है । 21 , 22 , 23 , 24.

मौखिक सब्सट्रेट पर गठित फिल्म के जटिल संरचना के विश्लेषण ऑप्टिकली सघन बात25प्रदर्शित करने में सक्षम सूक्ष्म तकनीक के उपयोग की आवश्यकता है. Multiphoton लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी फिल्म संरचनात्मक विश्लेषण26के लिए एक आधुनिक विकल्प है । यह अवरक्त तरंग दैर्ध्य के करीब एक रोशनी स्रोत के साथ रैखिक प्रकाशिकी के उपयोग की विशेषता है,27femtoseconds को स्पंदित । इस विधि autofluorescence सामग्री या fluorophores द्वारा चिह्नित सामग्री के छवि अधिग्रहण के लिए संकेत दिया है, गैर रेखीय ऑप्टिकल एक दूसरी सुरीले पीढ़ी के रूप में जाना जाता घटना से व्युत्पंन संकेतों द्वारा उत्पंन छवियों के अलावा । multiphoton माइक्रोस्कोपी के लाभों के अलावा महान छवि उत्तेजना प्रकाश27की तीव्रता की वजह से न्यूनतम कोशिका क्षति के साथ प्राप्त गहराई है.

multiphoton माइक्रोस्कोपी द्वारा अजैव सतहों पर फिल्म की व्यवहार्यता विश्लेषण के लिए, अलग वर्णक्रमीय विशेषताओं और बैक्टीरियल कोशिकाओं में एक पैठ क्षमता के साथ फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड रंजक का उपयोग28की आवश्यकता है । Fluorophores SYTO9 (ग्रीन-फ्लोरोसेंट) और propidium आयोडाइड (रेड-फ्लोरोसेंट) जीवित और मृत बैक्टीरिया28,29,30के बीच एक दृश्य भेदभाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । Propidium आयोडाइड क्षतिग्रस्त झिल्ली के साथ ही बैक्टीरिया प्रवेश, जबकि SYTO9 एक बरकरार है और समझौता झिल्ली के साथ बैक्टीरियल कोशिकाओं में प्रवेश करती है । जब दोनों रंजक एक सेल के अंदर मौजूद हैं, propidium आयोडाइड न्यूक्लिक एसिड और विस्थापन SYTO9 के लिए एक बड़ा संबंध है, यह लाल28,30अंकन ।

मौखिक पर्यावरण जटिलता और मौखिक फिल्म विविधता को ध्यान में रखते हुए, सूक्ष्म तकनीक की जरूरत है कि दांत और दंत सामग्री की सतहों के लिए इस फिल्म के विश्लेषण को सक्षम कर सकते हैं । यह लेख कृत्रिम abutments के लिए टाइटेनियम और सिरेमिक सामग्री पर मौखिक फिल्म के गठन की तुलना के लिए कार्यांवित प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला का वर्णन करता है, साथ ही साथ मौखिक में शामिल तरीके रूपात्मक और सेलुलर स्तर पर फिल्म विश्लेषण ।

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Protocol

यह अध्ययन Ribeirão Preto के स्कूल ऑफ दंत चिकित्सा के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था, और स्वयंसेवक भागीदार लिखित सहमति (प्रक्रिया 2011.1.371.583) पर हस्ताक्षर किए ।

1. सीटू में हुआ फिल्म निर्माण

  1. प्रतिभागियों का चयन
    1. निंनलिखित शामिल किए जाने के मानदंडों के आधार पर रोगियों का चयन करें: एक पूर्ण दांत निकलना और मौखिक रोगों के कोई नैदानिक लक्षण के साथ एक स्वस्थ व्यक्ति ।
    2. निंनलिखित अपवर्जन मानदंड के आधार पर रोगियों को बाहर निकालें: गर्भावस्था, स्तनपान, दंत क्षय, एक periodontal रोग या पिछले 3 महीने में एंटीबायोटिक उपचार, धूंरपान न करने, या किसी भी प्रणालीगत रोग है कि periodontal स्थिति को प्रभावित कर सकता है ।
  2. intraoral डिवाइस की तैयारी
    1. एक alginate छाप के माध्यम से दाढ़ की हड्डी मेहराब रिकॉर्ड ।
    2. स्टोन पाउडर के १०० ग्राम के लिए 19 मिलीलीटर पानी जोड़कर प्रकार चतुर्थ स्टोन तैयार करें । दाढ़ की हड्डी मेहराब के एक मॉडल बनाने के लिए alginate मोल्ड में पत्थर डालो ।
    3. डिजाइन और एक एक्रिलिक intraoral उपकरण बनाना परीक्षण नमूनों का समर्थन करने के लिए (टाइटेनियम और सिरेमिक डिस्क) ।
      1. NiCr तार (व्यास में ०.७ मिमी) से orthodontic चिमटा #139 का उपयोग कर और उन्हें मॉडल पर स्थिति से नजरबंदी अकवारों किर । ऊपरी premolars के बीच दबाना स्थिति, प्रत्येक तार के एक छोर इतना मोड़ कि वे एक पाश फार्म ।
        1. दंत papilla के क्षेत्र में पाश अनुकूलन । occlusal में, एक कोमल वक्रता डालें ताकि संपर्क के बिंदुओं के साथ और रोड़ा के साथ हस्तक्षेप न करें । ऐक्रेलिक में एक प्रतिधारण के लिए दबाना के अंत में एक ९० ° गुना बनाओ ।
        2. ऊपरी दूसरी दाढ़ में दबाना फिट करने के लिए, गर्भाशय ग्रीवा तीसरे (vestibular) में तार की वक्रता के लिए दांत (बाहर) समोच्च और एक ९० ° एक्रिलिक में एक प्रतिधारण के लिए दबाना के अंत में गुना कर अनुकूलित ।
          नोट: intraoral डिवाइस के लिए पर्याप्त अवधारण/स्थिरता प्रदान करने के लिए, निरोधी अकवारों को दंत चाप के दोनों किनारों पर दूसरी दाढ़ के ऊपरी premolars और बाहर के पहलू के बीच तैनात किया गया था ।
      2. खुद को निर्माता के निर्देशों के अनुसार इलाज एक्रिलिक राल हेरफेर और 2 ग्लास प्लेटों के बीच एक्रिलिक राल प्रेस (एक 3 मिमी मोटी स्पेसिंग के साथ) प्लास्टिक चरण के दौरान, एक 3 मिमी मोटी चादर बनाने के लिए ।
      3. मॉडल के तालु क्षेत्र पर एक्रिलिक शीट रखना, उपकरण के डिजाइन के अनुसार, और बंद एक carver के साथ अधिशेष एक्रिलिक राल ट्रिम कर दीजिए, बहुलकीकरण से पहले ।
      4. बनाना मोम एक धातु मैट्रिक्स का उपयोग डिस्क [व्यास में 10 मिमी, मोटाई में 2 मिमी (७८.५ mm2की सतह क्षेत्र)] मैट्रिक्स में पिघला हुआ मोम रखकर और मोम जमना के लिए इंतज़ार कर रहे । मैंयुअल रूप से ऐक्रेलिक राल में 4 मोम डिस्क एंबेड, उनमें से 2 premolars और अंय दूसरे दाढ़ के बगल में 2 के बीच ।
      5. 20 मिनट के लिए संकुचित हवा के 20 साई के तहत एक दबाव पॉट में एक्रिलिक राल polymerize चलो ।
      6. एक इलेक्ट्रिक दंत प्रयोगशाला हाथ टुकड़ा और कटर के साथ intraoral डिवाइस समाप्त करें और यह घर्षण रबर के साथ पॉलिश ।
      7. ऊपर वर्णित उपकरणों का उपयोग कर मुंह में एक उचित फिट के लिए डिवाइस को समायोजित करें ।
  3. टाइटेनियम और zirconia नमूनों की तैयारी
    नोट: नमूनों (n = 14) 10 मिमी व्यास में और 2 मिमी मोटाई में कर रहे हैं और ७८.५ मिमी2की एक सतह क्षेत्र है.
    1. पॉलिश ' नमूनों पानी के साथ सतहों-घर्षण (६००, १२००, और २००० धैर्य) कम के सैड ठंडा, लगभग 20 मिनट के लिए ।
      नोट: नमूनों की चमकाने के लिए ०.२ µm में सतह किसी न किसी प्रकार का मानकीकरण किया गया था ।
    2. साफ और नमूनों और तरल डिटर्जेंट और नल का पानी के साथ intraoral डिवाइस को संक्रमित, और फिर 15 मिनट के लिए एक isopropyl शराब अल्ट्रासोनिक स्नान का उपयोग करने के लिए उन्हें शोषक कागज तौलिए के साथ सूखी ।
    3. गैर विषैले गर्म पिघल चिपकने वाला (चित्रा 1) के बारे में ०.१ मिलीलीटर के साथ intraoral मौखिक डिवाइस में नमूनों को ठीक करें ।
    4. मौखिक गुहा में नमूनों से युक्त डिवाइस स्थापित करें ।
      नोट: intraoral डिवाइस वाले नमूनों को ४८ ज के लिए पहना जाना चाहिए । डिवाइस हटा दिया गया था और फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) में संग्रहीत है, जबकि रोगी खाने और मौखिक सफाई प्रदर्शन कर रहा था ।

2. बैक्टीरियल व्यवहार्यता का आकलन

नोट: नमूना आकार n = 10 ।

  1. SYTO9 के 3 µ एल जोड़कर एक रंगाई समाधान तैयार (ग्रीन फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड डाई) और 3 µ एल के propidium आयोडाइड (लाल फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड डाई) बाँझ आसुत पानी की 1 मिलीलीटर के लिए.
    नोट: प्रकाश से संरक्षित समाधान तैयार करें ।
  2. नमूनों को 24-वेल प्लेट में ट्रांसफर करें और किसी भी गैर-अनुयाई कोशिकाओं को हटाने के लिए उन्हें अच्छी तरह से पंजाबियों से धोएं ।
  3. फ्लोरोसेंट डाई समाधान के उपयुक्त मात्रा (1 मिलीलीटर) को जोड़ने के लिए इस फिल्म-युक्त नमूना कवर । डाई को बहुत सावधानी से जोड़ें ताकि इस फिल्म को अव्यवस्थित न कर सके ।
  4. कमरे के तापमान पर 20-30 मिनट के लिए नमूना मशीन, प्रकाश से सुरक्षित ।
  5. धीरे बाँझ आसुत पानी के साथ किसी भी अतिरिक्त डाई हटाने के लिए इस फिल्म के नमूने धो लो ।
  6. एक गिलास नीचे पकवान में नमूना प्लेस और multiphoton लेजर प्रदर्शन के लिए सूक्ष्म फिल्म विश्लेषण के लिए स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी ।
    नोट: बैक्टीरियल कोशिकाओं व्यवहार्यता का विश्लेषण एक multiphoton माइक्रोस्कोप प्रणाली का उपयोग कर बाहर किया गया था । propidium आयोडाइड के प्रतिदीप्ति एक उत्तेजना/उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ एक फिल्टर का उपयोग कर पाया गया था 546/680 एनएम और SYTO9 के लिए 477/600 एनएम । प्राप्त छवियों का आकार ५.१६१८८ x ५.१६१८८ मिमी है, जो प्रत्येक नमूना (७८.५ मिमी2) या कुल क्षेत्र के ३३.९४% के कुल क्षेत्र के २६.६४ mm2 से मेल खाती है । छवियों नमूने के सबसे केंद्रीय भाग से बनाया गया था, १,०२४ x १,०२४ पिक्सल के एक संकल्प के साथ । लाल चैनल और ग्रीन चैनल छवियों अलग फिजी सॉफ्टवेयर31का उपयोग विश्लेषण किया गया । प्रत्येक कोशिका एक चयन उपकरण का उपयोग कर चुना गया था और प्रतिदीप्ति की तीव्रता पिक्सल के एकीकृत घनत्व के माध्यम से मापा गया था, छवि पृष्ठभूमि घटाकर.

3. ऊर्जा फैलाव स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा नमूनों ' रासायनिक संरचना का विश्लेषण ()

नोट: नमूना आकार n = 3 ।

  1. प्रत्येक जैव फिल्म के 3 नमूनों का चयन करें मुक्त परीक्षण सामग्री, और प्रत्येक नमूने के 2 विभिंन क्षेत्रों में रासायनिक संरचना का आकलन एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन एक फैलाव ऊर्जा स्पेक्ट्रोमीटर को मिलकर माइक्रोस्कोप का उपयोग कर, 10 केवी३२की एक इलेक्ट्रॉन बीम वोल्टेज के साथ ।

4. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग द्वारा बैक्टीरियल फिल्म का रूपात्मक विश्लेषण

नोट: नमूना आकार n = 1 ।

  1. ०.१ मीटर सोडियम cacodylate बफर, पीएच ७.०-७.३ में २.५% glutaraldehyde पतला में नमूनों विसर्जित करके इस फिल्म को ठीक, 24 घंटे के लिए ।
  2. पंजाब में नमूना बफर (पीएच = ७.६) ।
  3. 1 ज के लिए 1% आज़मियम tetroxide के साथ पोस्टफिक्स फिल्म ।
  4. पंजाब में नमूना बफर (पीएच = ७.६) ।
  5. निर्जलीकरण के लिए इस फिल्म के नमूने ध्यान से, उंहें इथेनॉल समाधान की सांद्रता बढ़ाने में डूबे रखते हुए (५०%, ७०%, ९०%, ९५%, और १००%) ।
    नोट: १००% एकाग्रता पर इथेनॉल के 3 एक्सचेंजों प्रदर्शन । कुल निर्जलीकरण कदम के बारे में 2 एच लेता है ।
  6. महत्वपूर्ण बिंदु ड्रायर करने के लिए नमूनों हस्तांतरण और कार्बन डाइऑक्साइड के साथ कई प्रतिस्थापन बनाने (2CO) जब तक नमूनों सूख रहे हैं ।
  7. तंत्र से सूखे नमूनों को निकालें और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप धारकों पर उन्हें माउंट ।
  8. धूम-कोट १२० एस के लिए है नमूना सतह पर सोने की एक 20 एनएम परत ।
  9. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप चैंबर में गोल्ड-लेपित डिस्क डालें । प्रत्येक नमूने के 5 विभिंन क्षेत्रों से छवियां प्राप्त करें, चर दबाव के तहत और 650X आवर्धन12पर 20-30 केवी में ।

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Representative Results

४८ के बाद इस अध्ययन में औपनिवेशीकरण घनत्व के बाद फिल्म की सघनता का प्रतिनिधित्व किया गया था और टाइटेनियम में zirconia डिस्क पर बृहदांत्र क्षेत्र के अनुपात में कुल स्कैन के क्षेत्र के नमूने के multiphoton माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर ( २६.६४ मिमी2). चित्रा 2 3 परीक्षण सामग्री की सतह पर बैक्टीरियल औपनिवेशीकरण घनत्व का प्रतिनिधित्व करता है । फिल्म का एक उच्च घनत्व कलाकारों की सतहों पर मनाया गया था और मशीन टाइटेनियम डिस्क पर (०.०२९२ µm2 और ०.०२१३ µm2, क्रमशः) की तुलना में zirconia डिस्क (०.००९९ µm2; p < ०.०५; Kruskal-वालिस टेस्ट, इसके बाद डन का टेस् ट) ।

चित्रा 3 zirconia की सतहों पर बैक्टीरियल कोशिकाओं व्यवहार्यता से पता चलता है (आंकड़ा3 ए, 3ए, और 3 ए "), machined टाइटेनियम (चित्र3बी, 3 बी, और बी 1"), और कास्ट टाइटेनियम , और 3 सी ") डिस्क । इस प्रोटोकॉल में, न्यूक्लिक एसिड डाई propidium आयोडाइड केवल एक क्षतिग्रस्त झिल्ली के साथ बैक्टीरिया में प्रवेश और, इसलिए, एक लाल फ्लोरोसेंट संकेत है कि मृत कोशिकाओं से संबंधित है उत्सर्जन करता है । SYTO9 बरकरार या समझौता झिल्ली के साथ जीवाणु कोशिकाओं प्रवेश और जीवित सूक्ष्मजीवों से एक हरी फ्लोरोसेंट संकेत उत्सर्जन करता है । सेलुलर बैक्टीरियल व्यवहार्यता परीक्षण सामग्री के बीच समान था, सभी समूहों में रहते सूक्ष्मजीवों की एक प्रबलता के साथ (चित्रा 4) । जीवित/मृत कोशिकाओं अनुपात zirconia, १.९५ के लिए machined टाइटेनियम के लिए २.१० थे, और १.६३ कास्ट टाइटेनियम के लिए ।

दरारें, खांचे, या घर्षण दोष चमकाने और/या मशीनिंग की प्रक्रिया के दौरान सभी सामग्रियों की सतह पर उत्पादित, और अधिक स्पष्ट रूप से मशीनी और कास्ट टाइटेनियम डिस्क में देखा गया । zirconia डिस्क में, सूक्ष्मजीवों की अनुपस्थिति के साथ बड़े क्षेत्रों में मनाया गया; cocci, बेसिली के मुख्य रूप से शामिल छोटे बहुरूपी माइक्रोबियल समुच्चय, और रेशा बैक्टीरिया भी मनाया गया (चित्रा 5 ए और 5 ए '). cocci और बेसिली की उपस्थिति मशीन्ड टाइटेनियम डिस्क (फिगर 5B और 5B ') की सतहों पर बिखरी हुई थी । कास्ट टाइटेनियम नमूने सतह (चित्रा 5C और 5C ') पर एक फिल्म की तरह उपस्थिति के साथ एक मैट्रिक्स में शामिल सूक्ष्मजीवों की कालोनियों प्रस्तुत किया । कम मैट्रिक्स सामग्री zirconia डिस्क की सतह पर मशीनी टाइटेनियम और कास्ट टाइटेनियम डिस्क की तुलना में मनाया गया था ।

इस zirconia के विश्लेषण से पता चला ७०.८३%, ऑक्सीजन का २२.८४%, yttrium का ४.५२%, और zirconia डिस्क में hafnium का १.५७%; टाइटेनियम की ९५.१६%, ऑक्सीजन का ३.९९%, और कास्ट टाइटेनियम डिस्क में कार्बन का ०.८५%; और टाइटेनियम की ८९.८६%, ऑक्सीजन की ७.५३%, और मशीन्ड टाइटेनियम डिस्क में कार्बन का २.६१% (चित्रा 6) ।

Figure 1
चित्रा 1 : intraoral डिवाइस के लिए सीटू में अि । निरोधक अकवार तार गढ़ा के साथ गढ़े गए थे, और टाइटेनियम और zirconia टेस्ट डिस्क (व्यास में 10 मिमी, 2 मिमी मोटी) बेतरतीब ढंग से premolars और दाढ़ क्षेत्रों में तैनात थे, आंशिक रूप से स्वयं के इलाज एक्रिलिक राल में एंबेडेड । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : बैक्टीरियल कोशिका घनत्व के प्रतिदीप्ति छवियां । इन पर बैक्टीरियल कोशिका घनत्व के प्रतिदीप्ति छवियों है (एक) zirconia, (ख) machined टाइटेनियम, और (ग) टाइटेनियम डिस्क कास्ट के बाद ४८ एच में सीटू। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 3
चित्रा 3 : बैक्टीरिया की कोशिका व्यवहार्यता सतहों का पालन किया । इन पैनलों की सतहों का पालन जीवाणुओं की कोशिका व्यवहार्यता दिखाने के (एक) मृत और zirconia पर रहते बैक्टीरियल कोशिकाओं, (ख) मर चुका है और मशीन टाइटेनियम पर रहते बैक्टीरियल कोशिकाओं, और (ग) मृत और कास्ट टाइटेनियम पर जीवित बैक्टीरियल कोशिकाओं प्रतिदीप्ति इमेजिंग द्वारा चित्रित डिस्क । मृत जीवाणु कोशिकाओं propidium आयोडाइड (ए ', बी ', और सी ': लाल फ्लोरोसेंट संकेत) के साथ दाग रहे हैं । लाइव बैक्टीरिया SYTO9 के साथ दाग रहे हैं (एक ", बी", और सी ": ग्रीन प्रतिदीप्ति संकेत). पैनलों A, B, और C शो रंग-मर्ज की गई छवियां । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : Boxplots अलग परीक्षण सामग्री पर फिल्म की कोशिका व्यवहार्यता का प्रतिनिधित्व । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी. इन पैनलों की स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी दिखाने के (एक, एक ') zirconia, (बी, बी ') machined टाइटेनियम, और (सी, सी ') टाइटेनियम डिस्क कास्ट के साथ फिल्म, panoramic में और विचारों को बंद करें, के बाद ४८ एच में सीटू . कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6 : ऊर्जा फैलाव स्पेक्ट्रोस्कोपी (सी. ए.) द्वारा एक मौलिक विश्लेषण । इन पैनलों शो (A) zirconia डिस्क (Zr = zirconia, Y = yttrium, C = कार्बन, O = ऑक्सीजन, और Hf = hafnium); (B) मशीन्ड टाइटेनियम, और (c) कास्ट टाइटेनियम डिस्क (Ti = टाइटेनियम, O = ऑक्सीजन, और C = कार्बन) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस अध्ययन में वर्णित प्रोटोकॉल कृत्रिम abutments के लिए टाइटेनियम और zirconia सामग्रियों पर, बैक्टीरियल कोशिका व्यवहार्यता और रूपात्मक विशेषताओं के विश्लेषण सहित, पर फिल्म निर्माण का मूल्यांकन करने के लिए विकसित किया गया था । आदेश में यह पूरा करने के लिए, एक फिल्म निर्माण के सीटू मॉडल में डिजाइन किया गया था, एक intraoral के लिए परीक्षण सामग्री के नमूनों को समायोजित करने में सक्षम डिवाइस से मिलकर और उंहें ४८ एच के लिए गतिशील मौखिक वातावरण को उजागर रखना । डिवाइस सहज और स्वयंसेवक द्वारा डालने, हटाने, और साफ करने के लिए आसान माना जाता था । फिर भी, यह ध्वंयात्मक और सौंदर्यशास्त्र पर थोड़ा प्रभाव दिखाया, सरल और कम लागत के निर्माण के लिए था, और बिना नमूनों की एक आसान वसूली की अनुमति दी संरचना के विघटन । इसके अलावा, विधि बैक्टीरियल कोशिकाओं और extracellular मैट्रिक्स अखंडता के संरक्षण की अनुमति दी । प्रयोग के दौरान नमूनों और डिस्क के आकस्मिक नुकसान के साथ जीभ का संपर्क प्रस्तावित मॉडल की सीमाएं हैं । विधि की सीमाओं को कम करने के लिए, intraoral डिवाइस में डिस्क की स्थिति यादृच्छिक रूप से वितरित किया गया था; इसके अलावा, डिस्क गैर विषैले गर्म पिघल चिपकने के साथ तय किया गया था, और नमूना की कोई हानि की सूचना दी थी ।

मौखिक पर्यावरण का निवास करने वाले जीवाणु प्रजातियों के उच्च विविधता के कारण, शक्तिशाली सूक्ष्म तकनीक अपनी हार्ड सतहों बस्तियां के विश्लेषण के लिए आवश्यक हैं । Multiphoton माइक्रोस्कोपी पारंपरिक या फोकल माइक्रोस्कोपी विश्लेषण पर कई लाभ प्रदान करता है, जैसे एक अंतर्निहित तीन आयामी संकल्प, बेहतर ऑप्टिकल प्रवेश के लिए एक के पास अवरक्त उत्तेजना, photobleaching की कमी और धूप जब इमेजिंग लाइव कोशिकाओं, और एक क्षमता मात्रात्मक जानकारी३३,३४प्रदान करने के लिए । इन लाभों को दो के उच्च स्थानीयकृत उत्तेजना के माध्यम से शुरू-फोटॉन अवशोषण की प्रक्रिया और नमूनों में प्रकाश बिखरने का कम प्रभाव. इसलिए, multiphoton माइक्रोस्कोपी गहरी ऊतक इमेजिंग, न्यूनतम कोशिका क्षति, और अच्छी तरह से स्थानीयकृत photochemistry३४की एक दीक्षा के लिए सक्षम बनाता है. यादृच्छिक नमूना और खेतों की एक प्रतिनिधि संख्या सही विश्लेषण के लिए चुने जाने के लिए कर रहे हैं३५,३६. multiphoton लेजर माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग ५१६१.८८ x ५१६१.८८ µm, कुल है नमूना क्षेत्र के ३३.९४% के लिए इसी के क्षेत्रों के विश्लेषण की अनुमति दी । फोकल माइक्रोस्कोपी प्रतिनिधि विश्लेषण और नमूनों के मूल्यांकन की एक लंबी अवधि के लिए क्षेत्रों की एक बड़ी संख्या के लिए जरूरत के कारण इस्तेमाल नहीं किया गया था । इसके अलावा, बाहर की-फोकस पृष्ठभूमि संकेत प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के उपयोग को सीमित । multiphoton माइक्रोस्कोपी के लाभों के बावजूद, केवल सूक्ष्मजीवविज्ञानी क्षेत्र में कुछ अनुप्रयोगों३७,३८,३९की रिपोर्ट कर रहे हैं । उनमें एक हेरफेर उपकरण के रूप में इसका इस्तेमाल होता है; उदाहरण के लिए, स्थानीयकृत पृथक प्राप्त करने के लिए, apoptosis/परिगलन, ब्लीचिंग, या photoactivation के एक अच्छी तरह से परिभाषित मात्रा में फिल्म कोशिकाओं के26। इस विधि का एक अंय अनुप्रयोग के लिए एकाधिक फिल्म घटक25,४०,४१के खिलाफ जीवाणुरोधी एजेंटों की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए है ।

इस अध्ययन में, पालन बैक्टीरियल कोशिकाओं की व्यवहार्यता फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड रंजक है, जो उनकी झिल्ली अखंडता28के एक समारोह के रूप में कोशिकाओं घुसना के साथ मूल्यांकन किया गया था । SYTO9 fluorophores और propidium आयोडाइड रहते है और मृत बैक्टीरिया के बीच दृश्य भेदभाव के लिए इस्तेमाल किया गया । SYTO9 और propidium आयोडाइड के उपयोग की कुछ सीमाएं साहित्य में सूचित की जाती हैं, जैसे कि SYTO9 के लिए ग्राम-नकारात्मक जीवाणुओं को अक्षुण्ण झिल्ली से दाग देने में कठिनाई होती है क्योंकि उसे30संरचना में मौजूद दो कोशिका झिल्ली को पार करना पड़ता है, ४२. इस प्रकार, जीवित कोशिकाओं को एक संयुक्त धुंधला द्वारा आंका जा सकता है । इसके अलावा, जब SYTO9 पूरी तरह से propidium आयोडाइड द्वारा प्रतिस्थापित नहीं है, पीला प्रतिदीप्ति के बजाय लाल जीवाणु कोशिकाओं30,४२में मनाया जा सकता है । एक और सीमा समय के साथ SYTO9 संकेत की कमी है । यह सिफारिश की है कि सूक्ष्म विश्लेषण 30 मिनट के भीतर प्रदर्शन कर रहे है के बाद रंजक29,30के लिए जोखिम । यह पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति पर विचार करने के लिए संकेत तीव्रता की गणना करने के लिए आवश्यक है, के बाद से सब्सट्रेट के autofluorescence और असीम डाई की उपस्थिति के परिणाम के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं30. फिर भी, के बाद से इन सीमाओं अच्छी तरह से रिपोर्ट कर रहे हैं, यह निर्दिष्ट समय सीमा के भीतर संसाधित नमूनों है संभव है, के रूप में अच्छी तरह के रूप में ध्यान से चुनने के लिए और फिजी सॉफ्टवेयर की सहायता से ' छवियां पृष्ठभूमि घटाना ।

इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग के दौरान उच्च वैक्यूम और इलेक्ट्रॉन विकिरण जैविक सामग्री युक्त नमूनों के लिए प्रतिकूल परिस्थितियों का प्रतिनिधित्व करते हैं । गैर-प्रवाहकीय गुणों के अलावा इसके प्राकृतिक राज्य में होने वाली इस फिल्म में यह हाइड्रेटेड है, जो इलेक्ट्रॉनक पीढ़ी और डिटेक्शन सिस्टम के साथ हस्तक्षेप करती है, कलाकृतियों का गठन४३. इसलिए, जैविक सामग्री युक्त नमूनों के लिए तैयार किया जाना चाहिए ताकि संरचना और उनके इलेक्ट्रॉनों के संचालन के संरक्षण सुनिश्चित करने के लिए४३,४४। प्रोटोकॉल निर्धारण शामिल चरणों, निर्जलीकरण, सुखाने, और प्रवाहकीय सामग्री के साथ नमूनों की कोटिंग कमजोर पड़ने और समय के लिए विशेष रूप से ध्यान के साथ विकसित किया गया । जैविक सामग्री का निर्धारण एक cacodylate बफर में एक एल्डिहाइड और आज़मियम tetroxide के साथ पद-निर्धारण के साथ किया गया था, ताकि पालन की गई जैव फिल्म४३,४५,४६की संरचना को बनाए रखने के लिए । निर्जलीकरण इथेनॉल सांद्रता के एक आरोही श्रृंखला के साथ प्राप्त किया गया था, पानी के साथ-धीरे कार्बनिक विलायक४४द्वारा प्रतिस्थापित किया जा रहा है । इस फिल्म वास्तुकला के एक ंयूनतम विरूपण के साथ सुखाने इथेनॉल हटाने के लिए तरल co2 के उत्तराधिकारी प्रतिस्थापन के साथ महत्वपूर्ण बिंदु के माध्यम से किया गया था, गैस चरण के लिए सह2 के एक रूपांतरण के बाद, तरल का एक हटाने/ गैस इंटरफेस, और नमूना४३,४४,४५,४६पर सतह तनाव के उंमूलन । इलेक्ट्रॉनों की चालकता को सुनिश्चित करने, को रोकने या नुकसान को कम करने, और छवि कलाकृतियों, नमूनों सोने या सोने की 10-20 एनएम परत के साथ लेपित थे/ इसके अलावा, कोटिंग धातु की एक पतली परत के साथ नमूनों को कम कर सकते है बिजली प्रभारी का निर्माण एक नमूना के भीतर, इसके विपरीत सुधार, और छवि संकल्प४६वृद्धि हुई है ।

कुछ सीमाओं के बावजूद, इस अध्ययन में वर्णित सीटू मॉडल में टाइटेनियम और zirconia सामग्री पर मौखिक रूप से फिल्म गठन के मूल्यांकन के लिए पर्याप्त था, ४८ एच के संरक्षण की फिल्म । multiphoton माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेजिंग के साथ जुड़े fluorophores के प्रयोग के परीक्षण सामग्री बस्तियां सूक्ष्मजीवों की एक बहुत विषम जनसंख्या में बैक्टीरियल कोशिका व्यवहार्यता के विश्लेषण की अनुमति दी । जैविक नमूनों की तैयारी में कार्यरत तकनीकों को जैव फिल्म के संरचनात्मक संरक्षण को बढ़ावा दिया और बस्तियां सूक्ष्मजीवों के विज़ुअलाइज़ेशन और रूपात्मक लक्षण वर्णन के लिए उच्च गुणवत्ता वाले चित्रों के अधिग्रहण की अनुमति दी .

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों ने अपनी उदार सहायता के लिए शिक्षा और SEM विश्लेषण और Preto Hermano Teixeira वीडियो संस्करण में अपने उदार तकनीकी सहायता के लिए सूक्ष्म Multiuser प्रयोगशाला (Ribeirão मचाडो की चिकित्सा के स्कूल) से जोस Augusto माउलीं धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hydrogum 5 Zhermack Dental C302070
Durone IV Dentsply 17130500002
NiCr wire  Morelli 55.01.070
JET auto polymerizing acrylic Clássico
Dental wax  Clássico
Pressure pot  Essencedental
Sandpapers 600 grit NORTON T216
Sandpapers 1200 grit NORTON T401
Sandpapers 2000 grit NORTON T402
Metallographic Polishing Machine Arotec
Isopropyl alcohol SIGMA-ALDRICH W292907
Hot melt adhesive TECSIL PAH M20017
Filmtracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit Invitrogen L10316
Pipette Tips, 10 µL KASVI K8-10  
Pipette Tips, 1,000 µL KASVI K8-1000B  
24-well plate  KASVI K12-024
Glass Bottom Dish Thermo Scientific 150680
AxioObserver inverted microscope  ZEISS
Chameleon vision ii laser Coherent
Objective EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DIC ZEISS 440452-9903-000
SDD sensors - X-Max 20mm² Oxford Instruments
Glutaraldehyde solution SIGMA-ALDRICH G5882
Sodium cacodylate Buffer  SIGMA-ALDRICH 97068 
Osmium tetroxide SIGMA-ALDRICH 201030
Na2HPO4 SIGMA-ALDRICH S9638 Used for preparation of phosphate buffered saline
KH2PO4 SIGMA-ALDRICH P9791 
NaCl MERK 1.06404
Kcl SIGMA-ALDRICH P9333 
Ethanol absolute for analysis EMSURE MERK 1.00983
CPD 030 Critical Point Dryer BAL-TEC
JSM-6610 Series Scanning Electron Microscope JEOL
SCD 050 Sputter Coater BAL-TEC

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Silva, T. S. O., Freitas, A. R.,… More

Silva, T. S. O., Freitas, A. R., Pinheiro, M. L. L., do Nascimento, C., Watanabe, E., Albuquerque, R. F. Oral Biofilm Formation on Different Materials for Dental Implants. J. Vis. Exp. (136), e57756, doi:10.3791/57756 (2018).

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