Summary
Hier presenteren we een protocol om te evalueren van mondelinge biofilm vorming op titanium en zirconia materialen voor tandheelkundige prothese abutments, met inbegrip van de analyse van de levensvatbaarheid van de bacteriële cellen en morfologische kenmerken. Een in situ -model die samenhangen met krachtige microscopie technieken wordt gebruikt voor de analyse orale biofilm.
Abstract
Tandheelkundige implantaten en hun prothesecomponenten zijn gevoelig voor bacteriële kolonisatie en biofilm vorming. Het gebruik van materialen waarmee lage microbiële hechting kan verminderen de prevalentie en de progressie van peri-implantaat ziekten. Met het oog op de mondelinge omgeving complexiteit en orale biofilm heterogeniteit, microscopie technieken nodig zijn die een biofilm analyse van het oppervlak van de tanden en tandheelkundige materialen kunt inschakelen. Dit artikel beschrijft een aantal protocollen ten uitvoer gelegd voor het vergelijken van mondelinge biofilm vorming op titanium en keramische materialen voor prothetische abutments, alsmede de methoden die betrokken zijn bij de mondelinge biofilms analyses de morfologische en cellulair niveau. Het objectmodel in situ te evalueren van mondelinge biofilm vorming op titanium en zirconia materialen voor tandheelkundige prothese abutments, zoals beschreven in deze studie biedt een bevredigende behoud van de 48 h biofilm, waardoor het aantonen van methodologische toereikendheid. Multiphoton microscopie kan de analyse van de vertegenwoordiger van een gebied van de biofilm gevormd op de test-materialen. Verder staat het gebruik van fluorophores en de verwerking van de beelden met behulp van multiphoton microscopie de analyse van de bacteriële levensvatbaarheid in een zeer heterogene populatie van micro-organismen. De voorbereiding van biologische monsters voor elektronenmicroscopie bevordert de structurele behoud van biofilm, afbeeldingen met goede resolutie en geen artefacten.
Introduction
Bacteriële biofilms zijn complexe, functioneel en structureel georganiseerd microbiële gemeenschappen, gekenmerkt door een verscheidenheid van microbiële soorten die een polymeer van extracellulaire, biologisch actieve matrix1,2te synthetiseren. De bacteriële hechting op biotische of abiotische oppervlakken wordt voorafgegaan door een formatie van de verworven pellicle, voornamelijk bestaande uit speeksel glycoproteïnen1,3,4. Zwakke fysisch-chemische interacties tussen de micro-organismen en de pellicle worden in eerste instantie vastgesteld en gevolgd door sterkere interacties tussen bacteriële adhesines en glycoproteïne receptoren van de verworven pellicle. Microbiële diversiteit stijgt geleidelijk door de coaggregation van secundaire kolonisten aan de receptoren van de al toegevoegde bacteriën, vormen een diepteverschillen Gemeenschap1,3,4, 5.
Homeostase van de mondelinge microbiota en de symbiotische relatie met de host is belangrijk bij het handhaven van de mondgezondheid. De dysbiosis binnen de mondelinge biofilms kan verhogen het risico voor de ontwikkeling van cariës en Parodontitis2,5. Klinische studies tonen aan dat een oorzaak-en-gevolg relatie tussen de accumulatie van biofilm op tanden of tandheelkundige implantaten en de ontwikkeling van gingivitis of peri-implantaat mucositis6,7. De progressie van het inflammatoire proces leidt tot peri-implantitis en het daaruit voortvloeiende verlies van het implantaat8.
Tandheelkundige implantaten en hun prothesecomponenten zijn gevoelig voor bacteriële kolonisatie en biofilm vorming9. Het gebruik van materialen met een chemische samenstelling en de oppervlakte topografie waarmee lage microbiële hechting kan verminderen de prevalentie en de progressie van peri-implantaat ziekten9,10. Titanium is het meest gebruikte materiaal voor de vervaardiging van prothetische abutments voor implantaten; echter, keramische materialen werden onlangs ingevoerd en zijn populariteit als een alternatief voor titanium wint omwille van hun esthetische eigenschappen en biocompatibiliteit11,12. Ook belangrijker, zijn keramische materialen geassocieerd met een zogenaamd verminderde potentieel aan micro-organismen, voornamelijk te wijten aan hun oppervlakteruwheid, bevochtigbaarheid en oppervlakte vrije energie10,13te houden.
In vitro studies hebben bijgedragen tot vooruitgang in het begrip van microbiële hechting prothetische landhoofd oppervlakken9,14,15,16,17. De dynamische omgeving van de mondholte, gekenmerkt door haar variërende temperatuur en de pH en de beschikbaarheid van nutriënten, alsook door de aanwezigheid van shear troepen, is echter niet reproduceerbaar in in vitro experimentele protocollen18, 19. Om dit probleem te verhelpen, is een alternatief het gebruik van in situ modellen van biofilm formatie, die voordelig de driedimensionale structuur voor ex vivo analyse10,20, behoudt 21 , 22 , 23 , 24.
De analyse van de complexe structuur van de biofilm gevormd op mondelinge substraten vereist het gebruik van microscopie technieken staat de weergave van optisch dichte zaak25. Multiphoton laser scanning microscopie is een moderne optie voor biofilm structurele analyse26. Het wordt gekenmerkt door het gebruik van niet-lineaire optica met een verlichting bron dicht bij de infrarood golflengte, gepulseerde tot femtosecondes27. Deze methode is geïndiceerd voor de verwerving van de afbeelding van autofluorescence materialen of materialen gekenmerkt door fluorophores, naast afbeeldingen gegenereerd door niet-lineaire optische signalen afgeleid van een fenomeen dat bekend staat als tweede-harmonische generatie. Onder de voordelen van multiphoton microscopie is de diepte van de grote afbeelding verkregen met de minimumgrootte voor een celschade veroorzaakt door de intensiteit van het licht van excitatie27.
Voor een analyse van de levensvatbaarheid van biofilm op abiotische oppervlakken door multiphoton microscopie, het gebruik van fluorescerend nucleïnezuur kleurstoffen met verschillende spectrale kenmerken en een capaciteit van de penetratie in bacteriecellen is vereist28. Fluorophores SYTO9 (groen-fluorescerende) en propidium jodide (rood-fluorescerende) kunnen worden gebruikt voor een visuele differentiatie tussen levende en dode bacteriën28,29,30. Propidium jodide doordringt enige bacteriën met beschadigde membranen, terwijl SYTO9 bacteriële cellen met een intacte en beschadigde membraan treedt. Wanneer beide kleurstoffen aanwezig in een cel zijn, propidium jodide heeft een grotere affiniteit voor nucleïnezuren en verdringt SYTO9, rode28,30te markeren.
Met het oog op de mondelinge omgeving complexiteit en orale biofilm heterogeniteit, microscopie technieken nodig zijn, die de biofilm analyse van het oppervlak van de tanden en tandheelkundige materialen kunt inschakelen. Dit artikel beschrijft een aantal protocollen ten uitvoer gelegd voor het vergelijken van mondelinge biofilm vorming op titanium en keramische materialen voor prothetische abutments, alsmede de methoden die betrokken zijn bij de mondelinge biofilms analyses de morfologische en cellulair niveau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie werd goedgekeurd door de institutionele Review Board van de School voor tandheelkunde van Ribeirão Preto, en de vrijwilligers deelnemer ondertekende schriftelijke toestemming (proces 2011.1.371.583).
1. de Biofilm vorming in Situ
-
Selectie van de deelnemers
- Selecteer patiënten op basis van de volgende criteria: een gezonde persoon met een volledig gebit en geen klinische symptomen van orale ziekten.
- Uitsluiten van patiënten op basis van de volgende Uitsluitingscriteria: zwangerschap, borstvoeding, cariës, parodontale ziekte of behandeling met antibiotica in de laatste 3 maanden, roker of een systemische ziekte die de parodontale status kan beïnvloeden.
-
Voorbereiding van intraoral apparaat
- Record de maxillaire boog door middel van een alginaat indruk.
- Type IV steen voor te bereiden door 19 mL water met 100 g stenen poeder toe te voegen. Giet de steen in de mal alginaat om een model van de maxillaire boog te maken.
- Ontwerpen en fabriceren van een acryl intraoral apparaat ter ondersteuning van de proefstukken (titanium en keramische schijven).
- Fabriceren nulspanningsveilig gespen van NiCr draad (0.7 mm in doorsnede) met behulp van orthodontische tangen #139 en plaats deze op het model. Als u wilt plaatsen de klem tussen de bovenste premolars, buig u één uiteinde van elke draad zodat zij een lus vormen.
- Passen de lus in de regio van de interdentale Papil. Invoegen in de occlusaal, een zachte kromming om niet te bemoeien met de punten van contact en met de occlusie. Maak een 90° vouwen aan het eind van de klem voor een retentie in het acryl.
- Om de klem in de bovenste tweede Kies past, passen de kromming van de draad in de cervicale derde (vestibulaire) aan de contour van de tand (distale) en maak een 90° vouwen aan het eind van de klem voor een retentie in het acryl.
Opmerking: Om te zorgen voor voldoende retentie/stabiliteit naar het intraoral apparaat, de nulspanningsveilig beugels werden gepositioneerd tussen de bovenste premolars en distale aspect van de tweede Kies aan beide zijden van de tandheelkundige boog.
- Manipuleren van de eigen uithardende acryl hars volgens de instructies van de fabrikant en druk op de acryl hars tussen 2 glazen platen (met een 3 mm dikke spacer viel) tijdens de kunststof fase, om een 3 mm dik blad.
- Leg de acrylplaat op de palatale regio van het model, volgens het ontwerp van het apparaat, en versiering uit de overtollige acrylaat hars met een carver, voordat de polymerisatie.
- Fabriceren wax schijven met behulp van een metalen matrix [10 mm diameter, 2 mm dikte (oppervlakte van 78,5 mm2)] door gesmolten wax in de matrix te plaatsen en te wachten voor de wax te stollen. Handmatig insluiten 4 wax schijven in het acryl hars, 2 van hen tussen de premolars en de andere 2 naast de tweede kiezen.
- Laat de acryl hars polymeriseren in een drukvat onder 20 psi van samengeperste lucht gedurende 20 minuten.
- Afwerking van het intraoral apparaat met een elektrische dental lab handinstrument en cutter en het Pools met schurende rubber.
- Stel het apparaat voor een goede pasvorm in de mond met behulp van de hierboven beschreven apparatuur.
- Fabriceren nulspanningsveilig gespen van NiCr draad (0.7 mm in doorsnede) met behulp van orthodontische tangen #139 en plaats deze op het model. Als u wilt plaatsen de klem tussen de bovenste premolars, buig u één uiteinde van elke draad zodat zij een lus vormen.
-
Voorbereiding van de titanium en zirconia specimens
Opmerking: Specimens (n = 14) zijn 10 mm in diameter en 2 mm in dikte en hebben een oppervlakte van 78,5 mm2.- Pools de specimens oppervlakken met watergekoelde sandpapers van afnemende abrasiviteit (600, 1200 en 2000 grit), voor ongeveer 20 min.
Opmerking: Het polijsten van de specimens werd uitgevoerd om te standaardiseren van de oppervlakteruwheid op 0,2 µm. - Reinig en Desinfecteer de specimens en intraoral apparaat met vloeibaar wasmiddel en leidingwater, en gebruik vervolgens een ultrasoonbad isopropyl alcohol voor 15 min. droog ze met absorberend keukenpapier.
- Het herstellen van de specimens in het intraoral mondelinge apparaat met ongeveer 0,1 mL van niet-giftige hot melt lijm (Figuur 1).
- Installeer het apparaat met de modellen in de mondholte.
Opmerking: Het intraoral apparaat met de monsters moet gedurende 48 uur gedragen worden. Het apparaat werd verwijderd en opgeslagen in een fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), terwijl de patiënt was het eten en uitvoeren van mondelinge schoonmaken.
- Pools de specimens oppervlakken met watergekoelde sandpapers van afnemende abrasiviteit (600, 1200 en 2000 grit), voor ongeveer 20 min.
2. beoordeling van bacteriële levensvatbaarheid
Opmerking: Het monster grootte n = 10.
- Bereid een verven-oplossing door het toevoegen van 3 µL van SYTO9 (groene nucleïnezuur fluorescerende kleurstof) en 3 µL van propidium jodide (rode fluorescerende nucleïnezuur kleurstof) aan 1 mL steriel gedistilleerd water.
Opmerking: Bereiden oplossingen beschermd tegen licht. - De specimens overbrengen in een 24-well-plate en ze grondig te wassen met PBS niet-aanhanger cellen verwijderen.
- Voeg het juiste volume (1 mL) van fluorescente kleurstof oplossing ter dekking van de biofilm-bevattende specimen. Voeg de kleurstof zeer zorgvuldig om niet te disorganize de biofilm.
- Incubeer het monster gedurende 20-30 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
- Voorzichtig wassen de biofilm monster met steriel gedistilleerd water te verwijderen van de eventuele overtollige kleurstof.
- Plaats van het model in een glazen bodem schotel en multiphoton laser scanning microscopie voor de biofilm analyse uit te voeren.
Opmerking: De analyse van de levensvatbaarheid van de bacteriecellen werd uitgevoerd met behulp van een systeem van multiphoton microscopie. De fluorescentie van propidium jodide werd ontdekt met behulp van een filter met een golflengte van excitatie/emissie van 546/680 nm en 477/600 nm voor de SYTO9. De grootte van de beelden verkregen was 5.16188 x 5.16188 mm, hetgeen overeenkomt met 26.64 mm2 van de totale oppervlakte van elk specimen (78,5 mm2) of 33.94% van de totale oppervlakte. De beelden werden gemaakt van de meest centrale gedeelte van het monster, met een resolutie van 1024 x 1024 pixels. Het rode kanaal en groene kanaal afbeeldingen werden geanalyseerd afzonderlijk met behulp van Fiji software31. Elke cel werd geselecteerd met een selectiegereedschap en de intensiteit van de fluorescentie werd gemeten via de geïntegreerde dichtheid van de pixels, af te trekken van de achtergrond van de afbeelding.
3. analyse van de chemische samenstelling van de de Specimens met energie dispersieve infraroodspectroscopie (EDS)
Opmerking: Het monster grootte n = 3.
- Selecteer 3 exemplaren van elke biofilm-vrije testmateriaal en beoordelen van de chemische samenstelling in 2 verschillende gebieden van elk monster met behulp van een Scannende Elektronen Microscoop gekoppeld aan een dispersief energie-spectrometer, met een electron beam spanning van 10 kV32.
4. morfologische analyse van de bacteriële Biofilm door Scanning elektronen microscopie
Opmerking: Het monster grootte n = 1.
- De biofilm vast door de specimens in 2,5% Glutaaraldehyde verdund in 0,1 M natrium cacodylate buffer, pH 7.0-7.3, gedurende 24 uur onder te dompelen.
- Wassen van het monster in PBS buffer (pH = 7.6).
- Postfix de biofilm met 1% osmium tetroxide gedurende 1 uur.
- Wassen van het monster in PBS buffer (pH = 7.6).
- De biofilm monsters zorgvuldig uitdrogen, houden ze ondergedompeld in toenemende concentraties van ethanol oplossingen (50%, 70%, 90%, 95% en 100%).
Opmerking: Voer 3 uitwisseling van ethanol op een 100% concentratie. De totale uitdroging stap duurt ongeveer 2 h. - Overdracht van de specimens aan het kritieke punt droger en diverse vervangingen laten uitvoeren met kooldioxide (CO2) totdat de specimens zich droog.
- De gedroogde monsters uit het apparaat verwijderen en monteren ze op de Scannende Elektronen Microscoop houders.
- Sputter-vacht een 20 nm laagje goud op het oppervlak van het model voor 120 s.
- Plaats de schijven goud beklede in de zaal scannende elektronen microscoop. Het verkrijgen van afbeeldingen uit 5 verschillende gebieden van elk specimen, op 20-30 kV onder variabele druk en op 650 X vergroting12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De dichtheid van de kolonisatie van de biofilm na 48u van in situ groei in deze studie werd vertegenwoordigd door het aandeel van de gekoloniseerde gebied op de schijven van het titanium en zirconia ten opzichte van de oppervlakte van het monster met behulp van multiphoton microscopie (op de gescande 26.64 mm2). Figuur 2 geeft de dichtheid van de bacteriële kolonisatie op het oppervlak van de 3 geteste materialen. Een hogere dichtheid van biofilm werd waargenomen op de oppervlakken van de cast en op de machinaal titaan-schijven (0.0292 µm2 en 0.0213 µm2, respectievelijk) dan in de zirconia schijven (0.0099 µm2; p < 0.05; Kruskal-Wallis test, gevolgd door Dunns test).
Figuur 3 toont de levensvatbaarheid van de bacteriecellen op de oppervlakken van zirconia (figuur 3A, 3A', en 3A "), machinaal titanium (figuur 3B, 3B', en 3B"), en gegoten titanium (Figuur 3 c, 3 C' , en 3 C ") schijven. In dit protocol, het nucleïnezuur kleurstof propidium jodide doordringt alleen in bacteriën met een beschadigde membraan en, derhalve, stoot een signaal rood-fluorescerende die betrekking heeft op dode cellen. SYTO9 doordringt de bacteriële cellen met intact of gecompromitteerde membraan en stoot een groen fluorescent signaal van levende micro-organismen. Cellulaire bacteriële levensvatbaarheid was vergelijkbaar tussen de materialen van de test, met een overwicht van levende micro-organismen in alle groepen (Figuur 4). Live/dode cellen verhoudingen waren 2.10 voor Zirkonia, 1.95 voor machinaal titanium en 1.63 voor cast titanium.
Scheuren, groeven, of schuren gebreken geproduceerd op het oppervlak van alle materialen die tijdens het proces van het polijsten en/of machinale werden waargenomen, duidelijker in gefreesd en gegoten titanium schijven. In de zirconia schijven, werden grotere gebieden waargenomen met een afwezigheid van micro-organismen; kleine polymorfe microbiële aggregaten, voornamelijk bestaande uit Kokken, bacillen en filamenteuze bacteriën werden ook waargenomen (figuur 5A en 5A'). De aanwezigheid van kokken en bacillen werd verspreid op de oppervlakken van machinaal titanium schijven (figuur 5B en 5B'). Cast titanium specimens gepresenteerd kolonies van micro-organismen die betrokken zijn in een matrix met een biofilm-achtige verschijning op het oppervlak (figuur 5C en 5 C'). Minder materiaal matrix werd waargenomen op het oppervlak van de schijven van de Zirkonia in vergelijking met de machinaal titanium en cast titanium schijven.
De EDS-analyse bleek 70.83% van zirconia, 22.84% van de zuurstof, 4.52% van yttrium en 1.57% van hafnium in de zirconia schijven; 95,16% van titanium, 3.99% zuurstof en 0,85% koolstof in de cast titanium schijven; en 89.86% van titanium, 7.53% van de zuurstof en 2.61 gewichtspercent koolstof in het machinaal titanium schijven (Figuur 6).
Figuur 1 : Het intraoral apparaat voor de in situ bestuderen. Nulspanningsveilig gespen werden vervaardigd met smeedijzeren draad en titanium en zirconia test schijven (10 mm diameter, 2 mm dik) willekeurig werden geplaatst in de gebieden premolars en kiezen is uitgevallen, gedeeltelijk in het genezen van zelf acryl hars ingesloten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Beelden van de fluorescentie van de bacteriële celdichtheid. Dit zijn de beelden van de fluorescentie van de bacteriële cel dichtheid op (A) Zirkonia, (B) machinaal titanium, en (C) kant titanium schijven na 48u in situ. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : De levensvatbaarheid van de cellen van bacteriën de oppervlakken worden nageleefd. Deze panelen Toon dat de levensvatbaarheid van de cellen van bacteriën vastgehouden aan de oppervlakken van (A) dode en levende bacteriecellen op Zirkonia, (B) dode en levende bacteriecellen op machinaal titanium, en (C) dode en levende bacteriecellen op gegoten titanium schijven afgebeeld door fluorescentie imaging. Dood bacteriecellen worden gekleurd met propidium jodide (A', B', en C': rood-fluorescerende signaal). Levende bacteriën zijn gekleurd met SYTO9 (A ", B", en C ": groene fluorescentie signaal). Panelen A, Ben C tonen beelden kleur-samengevoegd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Levensvatbaarheid op de verschillende test materialen van de cellen van de Boxplots vertegenwoordigen van de biofilm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Scanning elektronen microscopie. Deze panelen tonen de scanning elektronen microscopie van (A, A') Zirkonia, (B, B') machinaal titanium, en (C, C') kant van titanium schijven met biofilm, in een panoramisch en close-up weergaven, na 48 h in situ . Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 : Een elementaire analyse door energie dispersieve spectroscopie (EDS). Deze panelen tonen (A) zirconia schijven (Zr Zirkonia, Y = = yttrium, C = koolstof, O = zuurstof en Hf = hafnium); (B) machinaal titanium, en (C) gegoten titanium schijven (Ti = titanium, O = zuurstof, en C = koolstof). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol beschreven in deze studie werd ontwikkeld om de vorming van de biofilm op titanium en zirconia materialen voor prothetische abutments, met inbegrip van de analyse van de levensvatbaarheid van de bacteriële cel en morfologische kenmerken te evalueren. Om dit te verwezenlijken, is een model in situ van biofilm formatie ontworpen, bestaande uit een intraoral apparaat in staat om geschikt voor monsters van de test-materialen en houd ze aan de dynamische mondelinge omgeving gedurende 48 uur blootgesteld. Het apparaat werd beschouwd als comfortabel en gemakkelijk invoegen, verwijderen en reinigen van de vrijwilliger. Het bleek echter weinig effect op de fonetiek en esthetiek, was eenvoudig en goedkoop te fabriceren, en toegestaan een gemakkelijke terugwinning van de specimens zonder verstoring van de biofilm structuur. Bovendien, de methode toegestaan het behoud van de bacteriële cellen en integriteit van de extracellulaire matrix. De contactpersoon van de tong met de specimens en het verlies van de disc tijdens het experiment zijn beperkingen van het voorgestelde model. Oog op het minimaliseren van de beperkingen van de methode, was de positionering van de schijven in het intraoral apparaat willekeurig verdeeld; Bovendien, de schijven met niet-toxisch hot melt lijm werden vastgesteld, en geen verlies van monster werd gemeld.
Als gevolg van de hoge heterogeniteit van de bacteriesoorten bevolken het mondelinge milieu, zijn krachtige microscopie technieken vereist voor de analyse van biofilms koloniseren de harde oppervlakken. Multiphoton microscopie biedt verschillende voordelen boven conventionele of confocal microscopie analyses, zoals een inherente driedimensionale resolutie, een nabij-infrarood excitatie voor superieure optische marktpenetratie, een vermindering van photobleaching en photodamage wanneer imaging levende cellen, en een vermogen om kwantitatieve informatie33,34. Deze voordelen zijn afkomstig via de uiterst gelokaliseerde excitatie van de twee-foton absorptie-proces en het beperkte effect van verstrooiing van licht in de specimens. Daarom kan multiphoton microscopie diepe weefsel imaging, minimale celbeschadiging en een initiatie van de goed gelokaliseerde Fotochemie34. Steekproefsgewijze bemonstering en een representatief aantal velden moeten worden gekozen voor nauwkeurige analyses35,36. De multiphoton laser scanning microscopie toegestaan de analyse van de gebieden van 5161.88 x 5161.88 µm, overeenkomt met 33.94% van het totale monster gebied. Confocale microscopie was niet gebruikt vanwege de behoefte aan een groot aantal velden voor de representatieve analyse en een lange periode van evaluatie van de specimens. Bovendien, het signaal van de out-of-focus achtergrond beperkt het gebruik van fluorescentie microscopie. Ondanks de voordelen van multiphoton microscopie zijn slechts een paar toepassingen op het gebied van microbiologische gerapporteerde37,38,39. Onder hen is het gebruik ervan als een manipulatie tool; bijvoorbeeld, om te bereiken gelokaliseerde ablatie, cellen apoptosis/necrose, bleken of photoactivation van een welbepaalde hoeveelheid biofilm26. Een andere toepassing van deze methode is het evalueren van de werkzaamheid van antibacteriële middelen tegen meerdere biofilm onderdelen25,40,41.
In deze studie werd de levensvatbaarheid van zelfklevend bacteriecellen geëvalueerd met fluorescerende nucleïnezuur kleurstoffen, die cellen als een functie van hun membraan integriteit28 dringen. SYTO9 fluorophores en propidium jodide werden gebruikt voor de visuele differentiatie tussen levende en dode bacteriën. Sommige beperkingen van het gebruik van SYTO9 en propidium jodide worden gemeld in de literatuur, zoals de moeilijkheid van SYTO9 om vlek van gram-negatieve bacteriën met een intact membraan, omdat er over te steken de twee celmembranen aanwezig zijn in de structuur30, 42. Levende cellen kunnen dus worden onderschat door een gecombineerde kleuring. Bovendien, wanneer SYTO9 niet volledig door propidium jodide vervangen is, kan gele fluorescentie worden waargenomen in plaats van rood in bacteriecellen30,42. Een andere beperking is de daling van het SYTO9 signaal na verloop van tijd. Het wordt aanbevolen dat de microscopie analyses worden uitgevoerd binnen 30 min na de blootstelling aan de kleurstoffen29,30. Het is noodzakelijk te overwegen de fluorescentie van de achtergrond voor de berekening van de signaalsterkte, sinds de autofluorescence van het substraat en de aanwezigheid van niet-afhankelijke kleurstof kan interfereren met de resultaten30. Aangezien deze beperkingen ook worden gerapporteerd, is het echter mogelijk om de monsters verwerkt binnen de opgegeven termijn, alsmede over zorgvuldig selecteren en aftrekken van de beelden achtergrond met behulp van de Fiji-software.
Hoog vacuüm en elektron bestraling tijdens het scannen van elektronenmicroscopie vertegenwoordigen ongunstige omstandigheden voor monsters biologisch materiaal bevatten. Naast de eigenschappen van het niet-geleidende, is de biofilm in zijn natuurlijke staat gehydrateerd, die interfereert met het elektron generatie en detectie systeem, vorming van artefacten43. Exemplaren met biologisch materiaal moeten daarom bereid zijn met het oog op het behoud van de structuur en de geleiding van hun elektronen43,44. De fasen van de protocol waarbij fixatie, uitdroging, werden drogen, en coating van de specimens met geleidend materiaal ontwikkeld met bijzondere aandacht voor de verdunningen en tijd. De fixatie van het biologisch materiaal werd uitgevoerd met een aldehyde in een buffer van de cacodylate en de na fixatie met osmium tetroxide, zodat de structuur van de zelfklevend biofilm43,45,46. Uitdroging werd bereikt met een oplopende reeks ethanol concentraties, met het water wordt geleidelijk vervangen door de organische oplosmiddelen44. Drogen met een minimale verstoring van de biofilm architectuur werd uitgevoerd door het kritieke punt met opeenvolgende vervangingen van vloeibare CO2 voor de verwijdering van ethanol, gevolgd door een conversie van CO2 naar gasfase, een verwijdering van de vloeistof / gas-interface, en de afschaffing van de oppervlaktespanning op de specimen43,44,45,46. Om ervoor te zorgen de geleidbaarheid van de elektronen, voorkomen of beperken van schade, en beeld die de artefacten, de specimens werden bedekt met een laag van 10-20 nm van goud of goud/palladium. Daarnaast kan coating van de specimens met een dun laagje metaal verminderen de opbouw van de elektrische lading binnen een specimen, contrast te verbeteren en verhogen van de beeld resolutie46.
Ondanks enkele beperkingen was de in situ model, als beschreven in deze studie voldoende voor de evaluatie van mondelinge biofilm vorming op titanium en zirconia materialen, behoud van de biofilm 48u. Het gebruik van fluorophores gekoppeld beeldvorming door multiphoton microscopie toegestaan van de analyse van de levensvatbaarheid van de bacteriële cellen in een zeer heterogene populatie van micro-organismen koloniseren de test materialen. De technieken gebruikt bij de voorbereiding van de biologische monsters van de biofilm structurele behoud bevorderd en mogen de acquisitie van afbeeldingen van hoge kwaliteit voor de visualisatie en morfologische karakterisering van de kolonisatie van de micro-organismen .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken voor zijn genereuze hulp met de EDS en SEM José Augusto Maulin van microscopie intervals laboratorium (School van geneeskunde van Ribeirão Preto) analyses en Hermano Teixeira Machado voor zijn genereuze technische bijstand in de videouitgave.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrogum 5 | Zhermack Dental | C302070 | |
| Durone IV | Dentsply | 17130500002 | |
| NiCr wire | Morelli | 55.01.070 | |
| JET auto polymerizing acrylic | Clássico | ||
| Dental wax | Clássico | ||
| Pressure pot | Essencedental | ||
| Sandpapers 600 grit | NORTON | T216 | |
| Sandpapers 1200 grit | NORTON | T401 | |
| Sandpapers 2000 grit | NORTON | T402 | |
| Metallographic Polishing Machine | Arotec | ||
| Isopropyl alcohol | SIGMA-ALDRICH | W292907 | |
| Hot melt adhesive | TECSIL | PAH M20017 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit | Invitrogen | L10316 | |
| Pipette Tips, 10 µL | KASVI | K8-10 | |
| Pipette Tips, 1,000 µL | KASVI | K8-1000B | |
| 24-well plate | KASVI | K12-024 | |
| Glass Bottom Dish | Thermo Scientific | 150680 | |
| AxioObserver inverted microscope | ZEISS | ||
| Chameleon vision ii laser | Coherent | ||
| Objective EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DIC | ZEISS | 440452-9903-000 | |
| SDD sensors - X-Max 20mm² | Oxford Instruments | ||
| Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G5882 | |
| Sodium cacodylate Buffer | SIGMA-ALDRICH | 97068 | |
| Osmium tetroxide | SIGMA-ALDRICH | 201030 | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH | S9638 | Used for preparation of phosphate buffered saline |
| KH2PO4 | SIGMA-ALDRICH | P9791 | |
| NaCl | MERK | 1.06404 | |
| Kcl | SIGMA-ALDRICH | P9333 | |
| Ethanol absolute for analysis EMSURE | MERK | 1.00983 | |
| CPD 030 Critical Point Dryer | BAL-TEC | ||
| JSM-6610 Series Scanning Electron Microscope | JEOL | ||
| SCD 050 Sputter Coater | BAL-TEC |
References
- Do, T., Devine, D., Marsh, P. D. Oral biofilms: molecular analysis, challenges, and future prospects in dental diagnostics. Clinical, Cosmetic and Investigational Dentistry. 5, 11-19 (2013).
- Samaranayake, L., Matsubara, V. H. Normal Oral Flora and the Oral Ecosystem. Dental Clinics of North America. 61 (2), 199-215 (2017).
- Larsen, T., Fiehn, N. E. Dental biofilm infections - an update. Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 125 (4), 376-384 (2017).
- Marsh, P. D., Do, T., Beighton, D., Devine, D. A. Influence of saliva on the oral microbiota. Periodontology 2000. 70 (1), 80-92 (2016).
- Marsh, P. D., Zaura, E. Dental biofilm: ecological interactions in health and disease. Journal of Clinical Periodontology. 44 Suppl 18, S12-S22 (2017).
- Zitzmann, N. U., Berglundh, T., Marinello, C. P., Lindhe, J.
- Meyer, S., et al. Experimental mucositis and experimental gingivitis in persons aged 70 or over. Clinical and biological responses. Clinical Oral Implants Research. 28 (8), 1005-1012 (2017).
- Salvi, G. E., Cosgarea, R., Sculean, A. Prevalence and Mechanisms of Peri-implant Diseases. Journal of Dental Research. 96 (1), 31-37 (2017).
- Hahnel, S., Wieser, A., Lang, R., Rosentritt, M. Biofilm formation on the surface of modern implant abutment materials. Clinical Oral Implants Research. 26 (11), 1297-1301 (2015).
- Nascimento, C., et al. Bacterial adhesion on the titanium and zirconia abutment surfaces. Clinical Oral Implants Research. 25 (3), 337-343 (2014).
- Nakamura, K., Kanno, T., Milleding, P., Ortengren, U. Zirconia as a dental implant abutment material: a systematic review. The International Journal of Prosthodontics. 23 (4), 299-309 (2010).
- Scarano, A., Piattelli, M., Caputi, S., Favero, G. A., Piattelli, A. Bacterial adhesion on commercially pure titanium and zirconium oxide disks: an in vivo human study. Journal of Periodontology. 75 (2), 292-296 (2004).
- Nascimento, C., et al. Microbiome of titanium and zirconia dental implants abutments. Dental Materials. 32 (1), 93-101 (2016).
- Rimondini, L., Cerroni, L., Carrassi, A., Torricelli, P. Bacterial colonization of zirconia ceramic surfaces: an in vitro and in vivo study. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants. 17 (6), 793-798 (2002).
- de Avila, E. D., Avila-Campos, M. J., Vergani, C. E., Spolidorio, D. M., Mollo Fde, A. Jr Structural and quantitative analysis of a mature anaerobic biofilm on different implant abutment surfaces. Journal of Prosthetic Dentistry. 115 (4), 428-436 (2016).
- de Avila, E. D., et al. Impact of Physical Chemical Characteristics of Abutment Implant Surfaces on Bacteria Adhesion. Journal of Oral Implantology. 42 (2), 153-158 (2016).
- de Avila, E. D., et al. Effect of titanium and zirconia dental implant abutments on a cultivable polymicrobial saliva community. Journal of Prosthetic Dentistry. 118 (4), 481-487 (2017).
- Lin, N. J. Biofilm over teeth and restorations: What do we need to know? Dental Materials. 33 (6), 667-680 (2017).
- Prada-Lopez, I., Quintas, V., Tomas, I. The intraoral device of overlaid disk-holding splints as a new in situ oral biofilm model. Journal of Clinical and Experimental Dentistry. 7 (1), e126-e132 (2015).
- Prada-Lopez, I., Quintas, V., Vilaboa, C., Suarez-Quintanilla, D., Tomas, I. Devices for in situ Development of Non-disturbed Oral Biofilm. A Systematic Review. Frontiers in Microbiology. 7, 1055 (2016).
- Burgers, R., et al. In vivo and in vitro biofilm formation on two different titanium implant surfaces. Clinical Oral Implants Research. 21 (2), 156-164 (2010).
- do Nascimento, C., et al. Oral biofilm formation on the titanium and zirconia substrates. Microscopy Research and Technique. 76 (2), 126-132 (2013).
- Al-Ahmad, A., et al. In vivo study of the initial bacterial adhesion on different implant materials. Archives of Oral Biology. 58 (9), 1139-1147 (2013).
- Al-Ahmad, A., et al. Bacterial adhesion and biofilm formation on yttria-stabilized, tetragonal zirconia and titanium oral implant materials with low surface roughness - an in situ study. Journal of Medical Microbiology. 65 (7), 596-604 (2016).
- Thomsen, H., et al. Delivery of cyclodextrin polymers to bacterial biofilms - An exploratory study using rhodamine labelled cyclodextrins and multiphoton microscopy. International Journal of Pharmaceutics. 531 (2), 650-657 (2017).
- Lakins, M. A., Marrison, J. L., O'Toole, P. J., van der Woude, M. W. Exploiting advances in imaging technology to study biofilms by applying multiphoton laser scanning microscopy as an imaging and manipulation tool. Journal of Microscopy. 235 (2), 128-137 (2009).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain, BacLight. Cytometry Part A. 61 (2), 189-195 (2004).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (79), e50729 (2013).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15, 36 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Placko, H. E., Mishra, S., Weimer, J. J., Lucas, L. C. Surface characterization of titanium-based implant materials. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants. 15 (3), 355-363 (2000).
- So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M.
- Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 4, Unit 4.11 11-24 (2013).
- Gardi, J. E., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. The proportionator: unbiased stereological estimation using biased automatic image analysis and non-uniform probability proportional to size sampling. Computers in Biology and Medicine. 38 (3), 313-328 (2008).
- Melvin, N. R., Poda, D., Sutherland, R. J. A simple and efficient alternative to implementing systematic random sampling in stereological designs without a motorized microscope stage. Journal of Microscopy. 228 (Pt 1), 103-106 (2007).
- Neu, T. R., Kuhlicke, U., Lawrence, J. R. Assessment of fluorochromes for two-photon laser scanning microscopy of biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 68 (2), 901-909 (2002).
- Neu, T. R., Woelfl, S., Lawrence, J. R. Three-dimensional differentiation of photo-autotrophic biofilm constituents by multi-channel laser scanning microscopy (single-photon and two-photon excitation). Journal of Microbiological Methods. 56 (2), 161-172 (2004).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends in Microbiology. 23 (4), 233-242 (2015).
- Lacroix-Gueu, P., Briandet, R., Leveque-Fort, S., Bellon-Fontaine, M. N., Fontaine-Aupart, M. P. In situ measurements of viral particles diffusion inside mucoid biofilms. Comptes Rendus Biologies. 328 (12), 1065-1072 (2005).
- Briandet, R., et al. Fluorescence correlation spectroscopy to study diffusion and reaction of bacteriophages inside biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 74 (7), 2135-2143 (2008).
- Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).
- Bergmans, L., Moisiadis, P., Van Meerbeek, B., Quirynen, M., Lambrechts, P. Microscopic observation of bacteria: review highlighting the use of environmental SEM. International Endodontic Journal. 38 (11), 775-788 (2005).
- Hannig, C., Follo, M., Hellwig, E., Al-Ahmad, A. Visualization of adherent micro-organisms using different techniques. Journal of Medical Microbiology. 59 (Pt 1), 1-7 (2010).
- Knutton, S.
- Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 2, Unit 2B.2 (2012).
