Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Mundtlige Biofilmdannelse på forskellige materialer til tandimplantater

Published: June 24, 2018 doi: 10.3791/57756
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Dental Materials and Prosthodontics, School of Dentistry of Ribeirão Preto, University of São Paulo, 2Department of Restorative Dentistry, School of Dentistry of Ribeirão Preto, University of São Paulo

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at vurdere mundtlige Biofilmdannelse på titanium og zirconia materialer for dental protese abutmenter, herunder analyse af bakterieceller levedygtighed og morfologiske karakteristika. En i situ model forbundet med kraftfulde mikroskopi-teknikker bruges til analysen af orale biofilm.

Abstract

Tandimplantater og deres protesekomponenterne er tilbøjelige til at bakteriel kolonisering og Biofilmdannelse. Brug af materialer, der giver lav mikrobielle vedhæftning kan mindske forekomsten og progression af peri-implantat sygdomme. I betragtning af den mundtlige miljø kompleksitet og orale biofilm heterogenitet, mikroskopi teknikker er nødvendige for at kunne muliggøre en biofilm analyse af overflader af tænderne og dental materialer. I denne artikel beskrives en række protokoller, der gennemføres for at sammenligne mundtlige Biofilmdannelse på titanium og keramiske materialer til proteser abutments samt de metoder, der er involveret i orale biofilm analyser på morfologiske og cellulært niveau. I situ -model til at vurdere mundtlige Biofilmdannelse på titanium og zirconia materialer for dental protese abutmenter som beskrevet i denne undersøgelse giver en tilfredsstillende bevarelse af 48 h biofilm, hvilket viser metodologiske tilstrækkelighed. Multiphoton mikroskopi giver mulighed for analyse af et område repræsentant af biofilm dannet på test materialer. Desuden giver brug af fluorophores og behandling af billeder ved hjælp af multiphoton mikroskopi analysen af bakteriel levedygtighed i en meget heterogen population af mikroorganismer. Forberedelse af biologiske prøver til elektronmikroskopi fremmer strukturel bevarelse af biofilm, billeder med god opløsning og ingen artefakter.

Introduction

Bakterielle biofilm er komplekse, funktionelt og strukturelt organiseret mikrobielle samfund, kendetegnet ved en mangfoldighed af mikrobielle arter, der syntetiserer en ekstracellulære, biologisk aktive polymer matrix1,2. Den bakteriel adhæsion til biotiske eller abiotiske overflader er indledes med en dannelsen af den erhvervede halvgennemsigtigt, hovedsageligt bestående af spyt glykoproteiner1,3,4. Svage fysisk-kemiske vekselvirkninger mellem mikroorganismer og halvgennemsigtigt er oprindeligt etableret og efterfulgt af stærkere interaktioner mellem bakteriel adhesins og glycoprotein receptorer af den erhvervede halvgennemsigtigt. Mikrobiel diversitet gradvist øges gennem coaggregation af sekundær kolonisatorer til receptorer af allerede vedlagte bakterier, danner et multispecies fællesskab1,3,4, 5.

Homeostase af den mundtlige mikrobiota og dens symbiotisk forhold med værten er vigtige for opretholdelsen af oral sundhed. Dysbiosis inden for orale biofilm kan øge risikoen for udvikling af caries og paradentose2,5. Kliniske undersøgelser viser en årsag og virkning forholdet mellem ophobning af biofilm på tænderne eller dentale implantater og udviklingen af tandkødsbetændelse eller peri-implantat mucositis6,7. Progression af den inflammatoriske proces fører til parodontose og de deraf følgende tab af implantatet8.

Tandimplantater og deres protesekomponenterne er tilbøjelige til at bakteriel kolonisering og biofilm dannelse9. Brug af materialer med en kemisk sammensætning og overflade topografi, der giver lav mikrobielle vedhæftning kan mindske forekomsten og progression af peri-implantat sygdomme9,10. Titanium er det mest anvendte materiale til fremstilling af proteser abutmenter for implantater; men keramiske materialer blev for nylig introduceret og stigende popularitet som et alternativ til titanium på grund af deres æstetiske egenskaber og biokompatibilitet11,12. Også vigtigere, har keramiske materialer været forbundet med en angiveligt reduceret potentiale til at overholde mikroorganismer, hovedsagelig på grund af deres overfladeruhed, befugtningen og overflade fri energi10,13.

In vitro undersøgelser har medvirket til betydelige fremskridt i forståelsen af mikrobielle vedhæftning til proteser abutment overflader9,14,15,16,17. Den dynamiske miljø af mundhulen, kendetegnet ved sin varierende temperatur og pH og næringsstoftilgængelighed samt ved tilstedeværelsen af shear styrker, er imidlertid ikke reproducerbare i in vitro- eksperimentelle protokoller18, 19. For at løse dette problem, er et alternativ brugen af i situ modeller af Biofilmdannelse, som med fordel bevarer sin tre-dimensionelle struktur for ex vivo analyse10,20, 21 , 22 , 23 , 24.

Analysen af den komplekse struktur af biofilm dannet på mundtlige substrater kræver anvendelse af mikroskopi-teknikker kan vise optisk tætte sag25. Multiphoton laser scanning mikroskopi er en moderne indstilling for biofilm strukturel analyse26. Det er kendetegnet ved brug af ikke-lineær optik med en belysning kilde tæt på den infrarøde bølgelængde, pulserende femtoseconds27. Denne metode er indiceret til billede erhvervelse af autofluorescence materialer eller materialer, der er præget af fluorophores, ud over billeder genereret af ulineære optiske signaler afledt af et fænomen kendt som anden Generation af harmoniske. Blandt fordelene ved multiphoton mikroskopi er den store billeddybde opnås med minimum celleskader forårsaget af intensiteten af excitation lys27.

For en levedygtighed og analysen af biofilm på abiotiske overflader af multiphoton mikroskopi, brug af fluorescerende nukleinsyre farvestoffer med forskellige spectral Karakteristik og en penetration kapacitet i bakterieceller er påkrævet28. Fluorophores SYTO9 (grønt-fluorescerende) og propidium Iodid (rødt-fluorescerende) kan bruges til en visuel skelnen mellem levende og døde bakterier28,29,30. Propidium Iodid trænger kun bakterier med beskadigede membraner, mens SYTO9 træder bakterieceller med en intakt og kompromitteret membran. Når begge farvestoffer er til stede inde i en celle, propidium Iodid har en større affinitet til nukleinsyrer og fortrænger SYTO9, maerkning det røde28,30.

I betragtning af den mundtlige miljø kompleksitet og orale biofilm heterogenitet, mikroskopi teknikker er nødvendige for at kunne muliggøre biofilm analysen af overfladen af tænderne og dental materialer. I denne artikel beskrives en række protokoller, der gennemføres for at sammenligne mundtlige Biofilmdannelse på titanium og keramiske materialer til proteser abutments samt de metoder, der er involveret i orale biofilm analyser på morfologiske og cellulært niveau.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne undersøgelse blev godkendt af det institutionelle Review Board af Tandlægeskolen i Ribeirão Preto, og de frivillige deltager underskrevet den skriftlige samtykke (proces 2011.1.371.583).

1. Biofilmdannelse in Situ

  1. Udvælgelse af deltagere
    1. Vælg patienter baseret på de følgende inklusionskriterierne: en sund person med en komplet tandsæt og ingen kliniske tegn med oral sygdomme.
    2. Udelukke patienter baseret på de følgende udelukkelseskriterier: graviditet, amning, karies, en parodontale sygdom eller antibiotisk behandling i de sidste 3 måneder, ryger eller nogen systemisk sygdom, der kan påvirke parodontal status.
  2. Forberedelse af intraorale enhed
    1. Optage maxillary buen ved hjaelp af natriumalginat indtryk.
    2. Forbered type IV sten ved at tilføje 19 mL vand til 100 g af sten pulver. Hæld stenen i calciumalginat formen til at lave en model af den maksillære arch.
    3. Designe og fabrikere en akryl intraorale enhed for at støtte prøveemner (titanium og keramiske diske).
      1. Fremstil retentive spænder fra NiCr wire (0,7 mm i diameter) ved hjælp af Ortodontisk tænger #139 og placere dem på modellen. Hvis du vil placere klemmen mellem de øverste præmolarer, bøje ene ende af hver ledning, så de danner en løkke.
        1. Tilpasse loop i regionen af interdentalt papilla. I den okklusale, indsætte en blid krumning for ikke at blande sig med kontaktpunkter og okklusion. Gøre en 90° fold for enden af klemme til en tilbageholdelse i akryl.
        2. For at passe klemmen i den øverste anden kindtand, tilpasse krumning af wire i den cervikale tredje (vestibulære) til kontur tand (distale) og lave en 90° fold for enden af klemme til en tilbageholdelse i akryl.
          Bemærk: For at give passende opbevaring/stabilitet til intraorale enheden, retentive hægter var placeret mellem de øverste præmolarer og distale aspekt af den anden kindtand på begge sider af dental arch.
      2. Manipulere den selvstændige hærdning akryl harpiks ifølge producentens anvisninger og tryk på akryl harpiks mellem 2 glasplader (med en 3 mm tykke spacer indskudt) plast fase, at gøre en 3 mm tykke plader.
      3. Læg arket akryl på palatal regionen af modellen, ifølge den enhed design, og trim off overskydende akryl harpiks med en carver, før polymerisering.
      4. Fremstil voks diske ved hjælp af en metallisk matrix [10 mm i diameter, 2 mm i tykkelse (areal af 78,5 mm2)] ved at placere smeltet voks i matrixen og venter på voks til at størkne. Manuelt indkapsle 4 voks diske i akryl harpiks, 2 af dem mellem præmolarer og de andre 2 ved siden af den anden kindtand.
      5. Lad akryl harpiks polymerisere i en presset gryde under 20 psi komprimeret luft i 20 min.
      6. Afslutte intraorale enheden med en elektrisk dental lab saloner og cutter og polere det med slibende gummi.
      7. Justere enhed for en ordentlig pasform i munden ved hjælp af det udstyr, der er beskrevet ovenfor.
  3. Forberedelse af titanium og zirconia prøver
    Bemærk: Prøver (n = 14) er 10 mm i diameter og 2 mm i tykkelse og har et areal på 78,5 mm2.
    1. Polske enheder overflader med vandkølede sandpapers af faldende abrasiveness (600, 1200, og 2000 grus), i ca 20 min.
      Bemærk: Polering af modellerne blev udført for at standardisere overfladeruhed på 0,2 µm.
    2. Rengøre og desinficere de prøver og intraorale enhed med flydende vaskemiddel og vand fra hanen, og derefter bruge ultralydbad isopropylalkohol for 15 min. tør dem med absorberende papirhåndklæder.
    3. Fix enhederne i intraorale mundtlige enheden med ca. 0,1 mL af giftfri hotmelt lim (figur 1).
    4. Installere den enhed, der indeholder modellerne i mundhulen.
      Bemærk: Enheden intraorale indeholdende modellerne bør bæres for 48 h. Enheden blev fjernet og gemt i fosfatbufferet saltopløsning (PBS), mens patienten spise og udføre mundtlige rengøring.

2. vurdering af bakteriel levedygtighed

Bemærk: Stikprøve størrelse n = 10.

  1. Forbered en farvning løsning ved at tilføje 3 µL af SYTO9 (grøn fluorescerende nukleinsyre farvestof) og 3 µL af propidium Iodid (rødt fluorescerende nukleinsyre farvestof) 1 ml sterilt destilleret vand.
    Bemærk: Forberede løsninger beskyttet mod lys.
  2. Overføre prøverne til en 24-godt plade og vask dem grundigt med PBS til at fjerne enhver ikke-tilhænger celler.
  3. Tilføje den passende mængde (1 mL) af fluorescerende farvestof løsning til at dække den biofilm, der indeholder modellen. Tilføje farvestoffet meget nøje for ikke for at disorganize biofilm.
  4. Inkuber modellen for 20-30 min. ved stuetemperatur, beskyttet mod lys.
  5. Forsigtigt vaske biofilm prøven med sterilt destilleret vand for at fjerne eventuelle overskydende farvestof.
  6. Placer modellen i et glas bund fad og udføre multiphoton laser scanning mikroskopi til analysen af biofilm.
    Bemærk: Analyse af bakterieceller levedygtighed blev udført ved hjælp af en multiphoton mikroskopi. Fluorescens af propidium Iodid blev fundet ved hjælp af et filter med en excitation/emission bølgelængde af 546/680 nm og 477/600 nm for SYTO9. Størrelsen af billederne opnået var 5.16188 x 5.16188 mm, hvilket svarer til 26.64 mm2 af det samlede areal af hver prøve (78,5 mm2) eller 33.94% af det samlede areal. Billederne blev foretaget fra den mest centrale del af prøven, med en opløsning på 1.024 x 1.024 pixel. Den røde kanal og grønne kanal billeder blev analyseret separat ved hjælp af Fiji software31. Hver celle er valgt ved hjælp af markeringsværktøjet og intensiteten af fluorescens blev målt ved hjælp af integreret tætheden af pixels, fratrække billede baggrund.

3. analyse af prøver kemiske sammensætning af Energy Dispersive spektroskopi (EDS)

Bemærk: Stikprøve størrelse n = 3.

  1. Vælg 3 eksemplarer af hver biofilm-fri prøvemateriale, og vurdere den kemiske sammensætning i 2 forskellige områder af hver prøve ved hjælp af en scanning elektron mikroskop koblet til en udbredt energi spektrometer, med en elektron beam spænding på 10 kV32.

4. morfologisk analyse af den bakterielle Biofilm ved Scanning elektronmikroskopi

Bemærk: Stikprøve størrelse n = 1.

  1. Lave biofilm ved at nedsænke modellerne i 2,5% glutaraldehyd fortyndet i 0,1 M natrium cacodylate buffer, pH 7,0-7.3, i 24 timer.
  2. Vask prøven i PBS buffer (pH = 7.6).
  3. Postfix biofilm med 1% osmium dinitrogentetraoxid for 1 h.
  4. Vask prøven i PBS buffer (pH = 7.6).
  5. Dehydrere biofilm prøver omhyggeligt, at holde dem nedsænket i stigende koncentrationer ethanol løsninger (50%, 70%, 90%, 95% og 100%).
    Bemærk: Udfør 3 udveksling af ethanol i en koncentration på 100%. Det samlede dehydrering skridt tager ca 2 h.
  6. Overføre modellerne til det kritiske punkt tørretumbler og foretage flere erstatninger med kuldioxid (CO2) indtil enhederne er tørre.
  7. Fjern de tørrede prøver fra apparatet og montere dem på scanning elektron mikroskop indehavere.
  8. Sputter-coat en 20 nm lag guld på modellens overflade for 120 s.
  9. Indsæt de Guld-belagte diske i scanning elektron mikroskop kammer. Fremskaf billeder fra 5 forskellige områder af hver prøve, på 20-30 kV variable pres og på 650 X forstørrelse12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kolonisering tætheden af biofilm efter 48 h i situ vækst var repræsenteret i denne undersøgelse af andelen af titanium og zirconia diskene i forhold til det samlede scannede området af prøven af med multiphoton mikroskopi (koloniseret området 26.64 mm2). Figur 2 repræsenterer bakteriel kolonisering tæthed på overfladen af de 3 testede materialer. En højere tæthed af biofilm blev observeret på overflader i støbt, og bearbejdet titanium diske (0.0292 µm2 og 0.0213 µm2, henholdsvis) end i zirconia diske (0.0099 µm2; p < 0,05; Kruskal-Wallis test, efterfulgt af Dunn's test).

Figur 3 viser bakterieceller levedygtighed på overflader af zirconia (figur 3A, 3A', og 3A "), bearbejdet titanium (figur 3B, 3B', og 3B"), og kastet titanium (figur 3 c, 3 C' , og 3 C ") diske. I denne protokol, nukleinsyre farvestoffet propidium Iodid trænger kun ind bakterier med en beskadiget membran, og derfor udsender et rødt-fluorescerende signal, der er relateret til døde celler. SYTO9 trænger bakterieceller med intakt eller kompromitteret membran og udsender en grøn fluorescerende signal fra levende mikroorganismer. Cellulære bakteriel levedygtighed var ens mellem test materialer, med en overvægt af levende mikroorganismer i alle grupperne (figur 4). Live/døde celler proportioner var 2.10 for zirconia, 1,95 for bearbejdet titanium og 1.63 for cast titanium.

Revner, riller eller slid defekter produceret på overfladen af alle materialer i løbet af processen af polering og/eller bearbejdning blev observeret, mere klart i bearbejdet og støbt titanium diske. I zirconia diske, blev større områder observeret med fravær af mikroorganismer; lille polymorfe mikrobielle aggregater består hovedsageligt af kokker, baciller og fintrådede bakterier blev også observeret (figur 5A og 5A'). Forekomst af kokker og baciller blev spredt på overflader bearbejdede titanium diske (figur 5B og 5B'). Cast titanium prøver præsenteret kolonier af mikroorganismer, der er involveret i en matrix med en biofilm-lignende udseende på overfladen (figur 5 c og 5 C'). Mindre matrix materiale blev observeret på overfladen af zirconia diskene i forhold til bearbejdet titanium og støbt titanium diske.

EDS analyse afslørede 70.83% af zirconia, 22.84% af ilt, 4,52% af yttrium og 1.57% af hafnium i zirconia diske; 95.16% af titanium, 3,99% ilt og 0,85% kulstof i støbt titanium diske; og 89.86% af titanium, 7.53% ilt, og 2,61% kulstof i bearbejdet titanium diske (figur 6).

Figure 1
Figur 1 : Intraorale enheden for den i situ studere. Retentive hægter blev fabrikeret med smedejern wire, og titanium og zirconia test diske (10 mm i diameter, 2 mm tyk) var tilfældigt placeret i regionerne præmolarer og kindtænder, delvist integreret i selvstændige hærdning akryl harpiks. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Fluorescens billeder af bakteriel celle massefylde. Disse er fluorescens billeder af bakteriel celle tæthed på (A) zirconia, (B) bearbejdet titanium, og (C) kastede titanium diske efter 48 h i situ. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 3
Figur 3 : Cellernes levedygtighed af bakterier levet op til overfladerne. Disse paneler viser cellernes levedygtighed af bakterier levet op til overfladen af (A) døde og live bakterieceller på zirconia, (B) døde og live bakterieceller på bearbejdet titanium, og (C) døde og live bakterieceller på støbt Titan diske skildret af fluorescens billeddannelse. Døde bakterieceller farves med propidium Iodid (A', B', og C': rødt-fluorescerende signal). Levende bakterier farves med SYTO9 (A ", B", og C ": grøn fluorescens signal). Paneler A, Bog C Vis farve-fusionerede billeder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Boxplots repræsenterer biofilm cellernes levedygtighed på de forskellige prøvningsmaterialer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Scanning Elektron Mikroskopi. Disse paneler viser den scanning Elektron Mikroskopi af (A, A') zirconia, (B, B') bearbejdet titanium, og (C, C') stemmer titanium diske med biofilm, panoramisk og tæt op visninger, efter 48 h in situ . Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : En elementært analyse af Energy Dispersive spektroskopi (EDS). Disse paneler viser (A) zirconia diske (Zr = zirconia, Y = yttrium, C = carbon, O = ilt, og Hf = hafnium); (B) bearbejdet titanium, og (C) kastede titanium diske (Ti = titanium, O = ilt, og C = carbon). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den protokol, der er beskrevet i denne undersøgelse blev udviklet for at evaluere Biofilmdannelse på titanium og zirconia materialer til proteser abutmenter, herunder analyse af bakteriel cellernes levedygtighed og morfologiske karakteristika. For at opnå dette, var en i situ model af Biofilmdannelse designet, bestående af en intraorale enhed i stand til at rumme prøver af test materialer og holde dem udsat til den dynamiske mundtlig miljø for 48 h. Enheden blev betragtet som behageligt og nemt at indsætte, fjerne og rense af frivilligt. Men det viste lille indvirkning på fonetik og æstetik, var enkel og billig at fremstille, og tilladt en let genindvinding af enheder uden afbrydelse af biofilm struktur. Derudover metoden tilladt at bevare de bakterieceller og den ekstracellulære matrix integritet. Kontakt af tungen med enhederne og utilsigtet tab af disken under eksperimentet er begrænsninger i den foreslåede model. For at minimere begrænsningerne af metoden, blev positionering af diske i intraorale enheden tilfældigt fordelt; Derudover diske blev fastsat med giftfri hotmelt lim, og ingen tab af prøven blev rapporteret.

På grund af den høje heterogenitet bakteriel arter lever den mundtlige miljø, er kraftfulde mikroskopi-teknikker nødvendige for analyse af biofilm koloniserer sin hårde overflader. Multiphoton mikroskopi giver flere fordele over konventionelle eller Konfokal mikroskopi analyser, såsom en iboende tredimensionale opløsning, en nær-infrarødt excitation for overlegen optisk penetration, en reduktion af photobleaching og solskader når imaging levende celler, og en evne til at give kvantitative oplysninger33,34. Disse fordele stammer gennem den meget lokaliserede excitation af to-foton absorption processen og reduceret effekten af lysspredning i modellerne. Derfor muliggør multiphoton mikroskopi dybe væv imaging, minimum celleskader og en indledning af godt lokaliseret fotokemi34. Stikprøvekontrol og et repræsentativt antal felter er valgt for præcise analyser35,36. Multiphoton laser scanning mikroskopi tilladt analyse af områder af 5161.88 x 5161.88 µm, svarende til 33.94% af den samlede model område. Konfokal mikroskopi blev ikke brugt på grund af behovet for et stort antal felter for den repræsentative analyse og en lang periode med evaluering af modellerne. Desuden begrænset ud af fokus baggrund signal anvendelse af Fluorescens mikroskopi. Trods fordelene ved multiphoton mikroskopi er kun et par applikationer på det mikrobiologiske område rapporteret37,38,39. Blandt dem er dets anvendelse som en manipulation værktøj; for eksempel, for at opnå lokal ablation, celler apoptose/nekrose, blegning eller photoactivation af en veldefineret volumen af biofilm26. En anden anvendelse af denne metode er at vurdere effekten af antibakterielle midler mod flere biofilm komponenter25,40,41.

I denne undersøgelse, blev levedygtigheden af overholdt bakterieceller evalueret med fluorescerende nukleinsyre farvestoffer, der trænger celler som funktion af deres membran integritet28. SYTO9 fluorophores og propidium Iodid blev brugt til den visuelle skelnen mellem levende og døde bakterier. Visse begrænsninger af brugen af SYTO9 og propidium Iodid er rapporteret i litteraturen, som er vanskeligheden for SYTO9 at plette gram-negative bakterier med en intakt membran, fordi det har til at krydse to celle membraner i struktur30, 42. Levende celler kan således undervurderes af en kombineret farvning. Desuden, når SYTO9 ikke er helt erstattes af propidium Iodid, kan gul fluorescens observeres i stedet for rødt i bakterieceller30,42. En anden begrænsning er faldet i SYTO9 signalet over tid. Det anbefales, at mikroskopi analyser udføres inden for 30 minutter efter eksponering for farvestoffer29,30. Det er nødvendigt at overveje baggrund fluorescens at beregne signal intensitet, siden autofluorescence af substratet og tilstedeværelsen af ubundne farvestof kan interferere med resultater30. Ikke desto mindre, da disse begrænsninger er godt rapporterede, det er muligt at have prøverne behandles inden for den specificerede tidsramme, samt omhyggeligt vælge og trække billeder baggrunden ved hjælp af Fiji software.

Højt vakuum og elektron bestråling under scanning elektronmikroskopi repræsenterer ugunstige betingelser for prøver med biologisk materiale. Ud over ikke-ledende egenskaber, er biofilm i sin naturlige tilstand hydreret, der forstyrrer den elektron generation og registrering system, danner artefakter43. Derfor skal prøver indeholdende biologisk materiale forberedes med henblik på at sikre bevarelse af strukturen og overledning af deres elektroner43,44. Protokollen faser inddrage fiksering, dehydrering, blev tørring, og belægning af prøver med ledende materiale udviklet med særlig opmærksom på de fortyndinger og tid. Fiksering af biologisk materiale, der blev udført med en aldehyd i en cacodylate buffer og efter fiksering med osmium dinitrogentetraoxid, for at bevare strukturen af overholdt biofilm43,45,46. Dehydrering blev opnået med en stigende række af ethanol koncentrationer, med vand bliver gradvist erstattet af den organiske opløsningsmidler44. Tørring med en minimal forvrængning af biofilm arkitektur blev udført gennem det kritiske punkt med gentagne udskiftninger af flydende CO2 for ethanol fjernelse, efterfulgt af en konvertering af CO2 til gasfasen, en fjernelse af væsken / gas interface, og fjernelse af overfladespænding på modellen43,44,45,46. For at sikre ledningsevne af elektroner, forhindre eller reducere skader, og billede artefakter, modellerne var belagt med en 10-20 nm lag af guld eller guld/palladium. Derudover kan belægning prøver med et tyndt lag af metal reducere den elektriske ladning opbygning inden for et eksemplar, forbedre kontrast og øge image resolution46.

Trods nogle begrænsninger var i situ model beskrevet i denne undersøgelse passende for evaluering af mundtlige Biofilmdannelse på titanium og zirconia materialer, bevare 48 h biofilm. Anvendelse af fluorophores forbundet med billedbehandling af multiphoton mikroskopi tilladt analyse af bakteriel cellernes levedygtighed i en meget heterogen population af mikroorganismer koloniserer test materialer. Teknikkerne ansat i udarbejdelsen af biologiske prøver forfremmet den biofilm strukturel bevarelse og tilladt erhvervelse af billeder i høj kvalitet til visualisering og morfologiske karakterisering af de colonizing mikroorganismer .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne takke José Augusto Maulin fra mikroskopi flerbruger laboratorium (School of Medicine i Ribeirão Preto) for hans generøse bistand med EDS og SEM analyserne og Hermano Teixeira Machado for hans generøse teknisk bistand i den video udgave.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hydrogum 5 Zhermack Dental C302070
Durone IV Dentsply 17130500002
NiCr wire  Morelli 55.01.070
JET auto polymerizing acrylic Clássico
Dental wax  Clássico
Pressure pot  Essencedental
Sandpapers 600 grit NORTON T216
Sandpapers 1200 grit NORTON T401
Sandpapers 2000 grit NORTON T402
Metallographic Polishing Machine Arotec
Isopropyl alcohol SIGMA-ALDRICH W292907
Hot melt adhesive TECSIL PAH M20017
Filmtracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit Invitrogen L10316
Pipette Tips, 10 µL KASVI K8-10  
Pipette Tips, 1,000 µL KASVI K8-1000B  
24-well plate  KASVI K12-024
Glass Bottom Dish Thermo Scientific 150680
AxioObserver inverted microscope  ZEISS
Chameleon vision ii laser Coherent
Objective EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DIC ZEISS 440452-9903-000
SDD sensors - X-Max 20mm² Oxford Instruments
Glutaraldehyde solution SIGMA-ALDRICH G5882
Sodium cacodylate Buffer  SIGMA-ALDRICH 97068 
Osmium tetroxide SIGMA-ALDRICH 201030
Na2HPO4 SIGMA-ALDRICH S9638 Used for preparation of phosphate buffered saline
KH2PO4 SIGMA-ALDRICH P9791 
NaCl MERK 1.06404
Kcl SIGMA-ALDRICH P9333 
Ethanol absolute for analysis EMSURE MERK 1.00983
CPD 030 Critical Point Dryer BAL-TEC
JSM-6610 Series Scanning Electron Microscope JEOL
SCD 050 Sputter Coater BAL-TEC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Do, T., Devine, D., Marsh, P. D. Oral biofilms: molecular analysis, challenges, and future prospects in dental diagnostics. Clinical, Cosmetic and Investigational Dentistry. 5, 11-19 (2013).
  2. Samaranayake, L., Matsubara, V. H. Normal Oral Flora and the Oral Ecosystem. Dental Clinics of North America. 61 (2), 199-215 (2017).
  3. Larsen, T., Fiehn, N. E. Dental biofilm infections - an update. Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 125 (4), 376-384 (2017).
  4. Marsh, P. D., Do, T., Beighton, D., Devine, D. A. Influence of saliva on the oral microbiota. Periodontology 2000. 70 (1), 80-92 (2016).
  5. Marsh, P. D., Zaura, E. Dental biofilm: ecological interactions in health and disease. Journal of Clinical Periodontology. 44 Suppl 18, S12-S22 (2017).
  6. Zitzmann, N. U., Berglundh, T., Marinello, C. P., Lindhe, J. Experimental peri-implant mucositis in man. Journal of Clinical Periodontology. 28 (6), 517-523 (2001).
  7. Meyer, S., et al. Experimental mucositis and experimental gingivitis in persons aged 70 or over. Clinical and biological responses. Clinical Oral Implants Research. 28 (8), 1005-1012 (2017).
  8. Salvi, G. E., Cosgarea, R., Sculean, A. Prevalence and Mechanisms of Peri-implant Diseases. Journal of Dental Research. 96 (1), 31-37 (2017).
  9. Hahnel, S., Wieser, A., Lang, R., Rosentritt, M. Biofilm formation on the surface of modern implant abutment materials. Clinical Oral Implants Research. 26 (11), 1297-1301 (2015).
  10. Nascimento, C., et al. Bacterial adhesion on the titanium and zirconia abutment surfaces. Clinical Oral Implants Research. 25 (3), 337-343 (2014).
  11. Nakamura, K., Kanno, T., Milleding, P., Ortengren, U. Zirconia as a dental implant abutment material: a systematic review. The International Journal of Prosthodontics. 23 (4), 299-309 (2010).
  12. Scarano, A., Piattelli, M., Caputi, S., Favero, G. A., Piattelli, A. Bacterial adhesion on commercially pure titanium and zirconium oxide disks: an in vivo human study. Journal of Periodontology. 75 (2), 292-296 (2004).
  13. Nascimento, C., et al. Microbiome of titanium and zirconia dental implants abutments. Dental Materials. 32 (1), 93-101 (2016).
  14. Rimondini, L., Cerroni, L., Carrassi, A., Torricelli, P. Bacterial colonization of zirconia ceramic surfaces: an in vitro and in vivo study. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants. 17 (6), 793-798 (2002).
  15. de Avila, E. D., Avila-Campos, M. J., Vergani, C. E., Spolidorio, D. M., Mollo Fde, A. Jr Structural and quantitative analysis of a mature anaerobic biofilm on different implant abutment surfaces. Journal of Prosthetic Dentistry. 115 (4), 428-436 (2016).
  16. de Avila, E. D., et al. Impact of Physical Chemical Characteristics of Abutment Implant Surfaces on Bacteria Adhesion. Journal of Oral Implantology. 42 (2), 153-158 (2016).
  17. de Avila, E. D., et al. Effect of titanium and zirconia dental implant abutments on a cultivable polymicrobial saliva community. Journal of Prosthetic Dentistry. 118 (4), 481-487 (2017).
  18. Lin, N. J. Biofilm over teeth and restorations: What do we need to know? Dental Materials. 33 (6), 667-680 (2017).
  19. Prada-Lopez, I., Quintas, V., Tomas, I. The intraoral device of overlaid disk-holding splints as a new in situ oral biofilm model. Journal of Clinical and Experimental Dentistry. 7 (1), e126-e132 (2015).
  20. Prada-Lopez, I., Quintas, V., Vilaboa, C., Suarez-Quintanilla, D., Tomas, I. Devices for in situ Development of Non-disturbed Oral Biofilm. A Systematic Review. Frontiers in Microbiology. 7, 1055 (2016).
  21. Burgers, R., et al. In vivo and in vitro biofilm formation on two different titanium implant surfaces. Clinical Oral Implants Research. 21 (2), 156-164 (2010).
  22. do Nascimento, C., et al. Oral biofilm formation on the titanium and zirconia substrates. Microscopy Research and Technique. 76 (2), 126-132 (2013).
  23. Al-Ahmad, A., et al. In vivo study of the initial bacterial adhesion on different implant materials. Archives of Oral Biology. 58 (9), 1139-1147 (2013).
  24. Al-Ahmad, A., et al. Bacterial adhesion and biofilm formation on yttria-stabilized, tetragonal zirconia and titanium oral implant materials with low surface roughness - an in situ study. Journal of Medical Microbiology. 65 (7), 596-604 (2016).
  25. Thomsen, H., et al. Delivery of cyclodextrin polymers to bacterial biofilms - An exploratory study using rhodamine labelled cyclodextrins and multiphoton microscopy. International Journal of Pharmaceutics. 531 (2), 650-657 (2017).
  26. Lakins, M. A., Marrison, J. L., O'Toole, P. J., van der Woude, M. W. Exploiting advances in imaging technology to study biofilms by applying multiphoton laser scanning microscopy as an imaging and manipulation tool. Journal of Microscopy. 235 (2), 128-137 (2009).
  27. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  28. Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain, BacLight. Cytometry Part A. 61 (2), 189-195 (2004).
  29. Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (79), e50729 (2013).
  30. Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15, 36 (2015).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  32. Placko, H. E., Mishra, S., Weimer, J. J., Lucas, L. C. Surface characterization of titanium-based implant materials. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants. 15 (3), 355-363 (2000).
  33. So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. Two-photon excitation fluorescence microscopy. Annual Review of Biomedical Engineering. 2, 399-429 (2000).
  34. Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 4, Unit 4.11 11-24 (2013).
  35. Gardi, J. E., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. The proportionator: unbiased stereological estimation using biased automatic image analysis and non-uniform probability proportional to size sampling. Computers in Biology and Medicine. 38 (3), 313-328 (2008).
  36. Melvin, N. R., Poda, D., Sutherland, R. J. A simple and efficient alternative to implementing systematic random sampling in stereological designs without a motorized microscope stage. Journal of Microscopy. 228 (Pt 1), 103-106 (2007).
  37. Neu, T. R., Kuhlicke, U., Lawrence, J. R. Assessment of fluorochromes for two-photon laser scanning microscopy of biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 68 (2), 901-909 (2002).
  38. Neu, T. R., Woelfl, S., Lawrence, J. R. Three-dimensional differentiation of photo-autotrophic biofilm constituents by multi-channel laser scanning microscopy (single-photon and two-photon excitation). Journal of Microbiological Methods. 56 (2), 161-172 (2004).
  39. Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends in Microbiology. 23 (4), 233-242 (2015).
  40. Lacroix-Gueu, P., Briandet, R., Leveque-Fort, S., Bellon-Fontaine, M. N., Fontaine-Aupart, M. P. In situ measurements of viral particles diffusion inside mucoid biofilms. Comptes Rendus Biologies. 328 (12), 1065-1072 (2005).
  41. Briandet, R., et al. Fluorescence correlation spectroscopy to study diffusion and reaction of bacteriophages inside biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 74 (7), 2135-2143 (2008).
  42. Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).
  43. Bergmans, L., Moisiadis, P., Van Meerbeek, B., Quirynen, M., Lambrechts, P. Microscopic observation of bacteria: review highlighting the use of environmental SEM. International Endodontic Journal. 38 (11), 775-788 (2005).
  44. Hannig, C., Follo, M., Hellwig, E., Al-Ahmad, A. Visualization of adherent micro-organisms using different techniques. Journal of Medical Microbiology. 59 (Pt 1), 1-7 (2010).
  45. Knutton, S. Electron microscopical methods in adhesion. Methods in Enzymology. 253, 145-158 (1995).
  46. Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 2, Unit 2B.2 (2012).

Tags

Medicin sag 136 mikrobiologi biofilm bakterier mikrobiel levedygtighed mikroskopi multiphoton scanning elektronmikroskopi energy dispersive X-ray spektroskopi klinisk vurdering dentale materialer zirconia titanium
Mundtlige Biofilmdannelse på forskellige materialer til tandimplantater
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Silva, T. S. O., Freitas, A. R.,… More

Silva, T. S. O., Freitas, A. R., Pinheiro, M. L. L., do Nascimento, C., Watanabe, E., Albuquerque, R. F. Oral Biofilm Formation on Different Materials for Dental Implants. J. Vis. Exp. (136), e57756, doi:10.3791/57756 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter