Summary
ここでは、口腔バイオ フィルム形成細菌の細胞生存率と形態的特徴の分析を含む歯科補綴アバットメント チタン、ジルコニア材料を評価するためのプロトコルを提案する.強力な顕微鏡検査の技術に関連付けられているその場でモデルは、口腔バイオ フィルムの解析に使用されます。
Abstract
歯科インプラントと補綴コンポーネントが細菌の植民地化およびバイオ フィルム形成しやすいです。低い微生物付着を提供する材料の使用は、有病率とインプラント周囲の病気の進行を減らすことができます。観点から、口腔内環境の複雑さと口腔バイオ フィルムの不均一性歯や歯科材料の表面のバイオ フィルムの解析を有効にすることができます技術が必要な顕微鏡検査。この資料では、口腔バイオ フィルム形成チタンとセラミック補綴支台用材として形態学的および細胞レベルで口腔バイオ フィルム解析にかかわる方法を比較するために実装されたプロトコルのシリーズを説明します。前述のように本研究ではチタン、ジルコニアの歯科補綴物の支台用材料の口腔バイオ フィルム形成の評価の in situモデルは、方法論の妥当性を実証することにより、48 h のバイオ フィルムの良好な保全を提供します。多光子顕微鏡には、試験材料に形成されるバイオ フィルムの領域代表者の分析ができます。さらに、蛍光物質の使用と多光子顕微鏡による画像の処理微生物の非常に異質人口の細菌生存率の解析をことができます。電子顕微鏡用試料の調製は、バイオ フィルム、画像解像度が良いとしない人工の構造の保全を推進しています。
Introduction
細菌バイオ フィルム複雑構造的機能的組織微生物、細胞、生物学的活性ポリマー マトリックス1,2を合成する微生物種の多様性によって特徴付けられます。生物的または非生物的表面に細菌の付着には、主に唾液糖タンパク質1,3,4から成る, 獲得被膜の形成が続きます。微生物とペリクルの物理化学的相互作用弱い最初確立、細菌アドヘシンと獲得被膜の糖蛋白受容体との間の強い相互作用によって続いた。多種間コミュニティ1,3,4,を形成、既に添付している細菌の受容体への二次植民の 1006 ヘテロ凝集を通じて徐々 に微生物の多様性5。
口腔微生物叢とホストとの共生関係の恒常性は、口腔の健康を維持する上で重要です。口腔バイオ フィルム内 dysbiosis は齲蝕と歯周疾患2,5の開発のリスクを高める可能性があります。臨床研究は、歯またはインプラントのバイオ フィルムの蓄積と歯肉炎やインプラント周囲粘膜炎6、7の発展と因果関係を示しています。炎症性プロセスの進行は、インプラントとインプラント8の結果の損失に します。
歯科インプラントと補綴コンポーネントは、細菌の植民地化およびバイオ フィルム形成9になりやすいです。低い微生物付着を提供する表面の構造と化学組成と材料の使用は、有病率とインプラント周囲疾患9,10の進行を減らすことができます。チタンは、インプラントの補綴橋台の製造のためほとんど使用材料しかし、セラミック材料は最近導入された、彼らの審美的な特性と生体適合性11,12のためチタンに代わるものとして人気を集めています。また重要なは、セラミック材料に関連付けられているおそらく減らされた潜在的な表面粗さ、濡れ性、表面自由エネルギー10,13のために主に、微生物に付着します。
In vitro研究は補綴支面9,14,15,16,17に微生物の理解の進歩に貢献しています。しかし、その変化する温度と pH および栄養アベイラビリティおよびせん断力の存在によって表される口腔内の動的な環境はない体外実験プロトコル18、再現性のあります。 19。この問題を克服するために代わりに、その場で有利ex vivo解析10,20,のための立体構造を保持するバイオ フィルム形成のモデルの使用21,22,23,24。
口腔の基板上に形成されたバイオ フィルムの複雑な構造の解析光学的高密度物質25を表示することができる顕微鏡検査の技術が必要です。多光子レーザー顕微鏡は、バイオ フィルムの構造解析26モダンなオプションです。フェムト27にパルス赤外の波長に近い光源と非線形光学の使用が特徴です。このメソッドは、蛍光材料または材料の蛍光物質、第 2 高調波発生と呼ばれる現象から派生した非線型光信号によって生成された画像に加え、マークの画像の獲得のために示されます。多光子顕微鏡の利点の中では励起光27の強度によるセルの最小被害で得られた素晴らしい画像の深度です。
多光子顕微鏡による非生物的表面にバイオ フィルムの実行可能性分析、蛍光核酸の使用染料分光特性の異なると、細菌の細胞の浸透能力必要な28です。ライブとデッド細菌28,29,30間の視覚的な差別の fluorophores が付いて SYTO9 (緑色蛍光) とヨウ化 propidium (赤色蛍光) を使用できます。Propidium ヨウ化 SYTO9 そのままと侵害された膜を細菌細胞に入る間だけ破損した膜細菌に浸透します。両方の染料がセル内に存在する場合 propidium ヨウ化核酸の相性が大きいとマーク赤28,30SYTO9 を転置します。
観点から、口腔内環境の複雑さと口腔バイオ フィルムの不均一性歯や歯科材料の表面のバイオ フィルムの解析を有効にすることができます技術が必要な顕微鏡検査。この資料では、口腔バイオ フィルム形成チタンとセラミック補綴支台用材として形態学的および細胞レベルで口腔バイオ フィルム解析にかかわる方法を比較するために実装されたプロトコルのシリーズを説明します。
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Protocol
本研究は、リベイラン ・ プレトの歯学部の制度検討委員会によって承認された、ボランティア参加者署名された書面による同意 (2011.1.371.583 プロセス)。
1. バイオ フィルム形成その場観察
-
参加者の選定
- 次の包含の規準に基づく患者の選択: 完全な歯や口腔疾患の臨床徴候と健康な人。
- 以下の除外基準に基づいて患者を除外: 妊娠、母乳、齲蝕、歯周病や歯周の状態に影響を与えることができる任意の全身性疾患や喫煙者、最後の 3ヶ月で抗生物質による治療。
-
口腔内のデバイスの準備
- アルジネート印象による上顎歯列を記録します。
- タイプ IV 石を準備するには、石の粉 100 g に水 19 mL を追加すます。石を上顎歯列弓のモデルを作成するアルギン酸金型に注ぐ。
- 設計および試験片 (チタン ・ セラミック ディスク) をサポートするアクリル口腔内装置を作製します。
- NiCr ワイヤ (0.7 mm 径) #139 の矯正用プライヤーを使用してから保留め金を作製し、モデルにそれらを配置します。上の小臼歯の間クランプを配置して、ループを形成する各ワイヤの一方の端を曲げます。
- 歯間乳頭部にループを適応します。咬合、咬合と接触点と干渉しないように穏やかな曲率を挿入します。アクリルの固定クランプの端を折る 90 ° を作る。
- 上顎の第 2 大臼歯にクランプを合わせて頚側 1/3 の線の曲率を適応に (遠位部) の歯の輪郭を見つけ、アクリルの固定クランプの端を折る 90 ° (前庭)。
注: 十分な保持/口腔内のデバイスに安定性を提供するために保の留め金は上顎歯列弓の両側に第二大臼歯の遠位面と配置されました。
- 製造元の指示に従って自己硬化アクリル樹脂を操作し、プラスチック フェーズ 3 mm 厚いシート (介在 3 mm 厚スペーサー) と 2 のガラス板アクリル樹脂を押します。
- デバイスの設計によるとモデルの, 口蓋部にアクリル板を置き、重合前に、カーバーで余剰レジンを切り落とします。
- マトリックスに溶けたロウを配置しワックスを待っている金属行列 [2 mm 厚 (78.5 mm2の面積) で、直径 10 mm] を使用した、固めるワックス ディスクを作製します。アクリル樹脂、小臼歯と第二大臼歯の横にある他の 2 の間それらの 2 に 4 ワックス ディスクを手動で埋め込みます。
- 圧力鍋 20 psi 未満 20 分のための圧縮空気で重合アクリル樹脂ができます。
- 電気歯科ラボ ハンドピースとカッターと口腔内のデバイスを終了し、ソフトス トーンで磨いてください。
- 上記機器を使用して口の中で適切な適合のためのデバイスを調整します。
- NiCr ワイヤ (0.7 mm 径) #139 の矯正用プライヤーを使用してから保留め金を作製し、モデルにそれらを配置します。上の小臼歯の間クランプを配置して、ループを形成する各ワイヤの一方の端を曲げます。
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チタン、ジルコニアの標本の作製
注: 標本 (n = 14) 直径 10 mm 厚さ 2 mm は、78.5 mm2の表面積を持っています。- 摩損の減少の水冷サンドペーパーで標本の表面を磨く (600、1200、および 2000 グリット)、約 20 分。
注: 試料の研磨表面粗さ 0.2 μ m での標準化を行った。 - きれいし、標本や液体洗剤と水道水で口腔内装置を消毒し使用イソプロピル アルコール超音波浴 15 分吸水紙タオルで乾かします。
- 口腔内口腔デバイスで無毒ホットメルト接着剤 (図 1) の約 0.1 mL で試料を固定します。
- 口腔内に試料を含むデバイスをインストールします。
注: 標本を含む口腔内のデバイスは 48 時間着用必要があります。デバイスを除去し、患者が食べると口内清掃を実行するリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) に格納されます。
- 摩損の減少の水冷サンドペーパーで標本の表面を磨く (600、1200、および 2000 グリット)、約 20 分。
2. 細菌性の評価
注: サンプル サイズn = 10。
- SYTO9 の 3 μ L を追加することによって染色ソリューションを準備 (緑色の蛍光核酸色素) と 3 μ L propidium ヨウ化物イオン (赤い蛍光核酸色素) 1 mL の滅菌蒸留水します。
注: は、光から保護ソリューションを準備します。 - 24 ウェル プレートに試料を転送し、任意の非付着性細胞を除去する PBS でそれらを徹底的に洗浄します。
- バイオ フィルムを含む試料をカバーする蛍光色素溶液の適切なボリューム (1 mL) を追加します。バイオ フィルムを聖ように非常に慎重に染料を追加します。
- 部屋の温度、光から保護で 20-30 分のための標本を孵化させなさい。
- 水洗いして余分な染料を除去する滅菌蒸留水とバイオ フィルム サンプル。
- ガラス底皿に試料を置きし、バイオ フィルム分析用顕微鏡多光子レーザーを実行します。
注: 多光子顕微鏡システムを使用して細菌細胞生存率の解析を行った。Propidium ヨウ化物イオンの蛍光は励起/蛍光波長 546/680 のフィルターを使用して検出された nm と 477/600 SYTO9 の nm。得られた画像のサイズ (78.5 mm2) 各試験片の面積や総面積 33.94 %26.64 mm2に対応する 5.16188 x 5.16188 mm であった。画像は、1,024 × 1,024 ピクセルの解像度のサンプルの最も中心的部分から作られました。赤チャン ネル、緑チャンネルの画像は、フィジー ソフトウェア31を使用して別々 に分析しました。選択ツールを使用して選択された各セル、蛍光性の強度を画像の背景を引く、ピクセルの統合の密度を測定しました。
3. エネルギー分散分光法 (EDS) で試料の化学組成の分析
注: サンプル サイズn = 3。
- 各バイオ フィルム無料テスト材料の 3 片を選択し、結合した分散型エネルギー分光計、電子ビーム電圧 10 kV32の走査型電子顕微鏡を使用して各試験片の 2 つの異なるエリアの化学組成を評価します。
4. 走査型電子顕微鏡による細菌のバイオ フィルムの解析
注: サンプル サイズn = 1。
- 24 時間 pH 7.0 7.3 0.1 M ナトリウム cacodylate バッファーで希釈した 2.5% グルタルアルデヒドで標本を浸すことによってバイオ フィルムを修正します。
- PBS バッファーでサンプルを洗う (pH 7.6 を =)。
- 1 時間 1% オスミウム四酸化でバイオ フィルムを後置します。
- PBS バッファーでサンプルを洗う (pH 7.6 を =)。
- バイオ フィルムのサンプルを慎重に脱水するため、エタノール溶液 (50%、70%、90%、95%、100%) の濃度を高めることに没頭してそれらを保ちます。
注: は、100% の濃度でエタノールの 3 つの交換を実行します。合計脱水ステップは、約 2 時間かかります。 - 臨界点乾燥機に標本を転送し、二酸化炭素 (CO2) いくつかの置換を行う標本が乾くまで。
- 装置から乾燥標本を削除し、走査型電子顕微鏡のホールダーにそれらをマウントします。
- スパッタ コート 120 のため試験片の表面に金の 20 nm 層 s。
- 走査型電子顕微鏡室にゴールド コーティング ディスクを挿入します。各試験片は、圧力可変下 20-30 kV、650 X 倍率12の異なる 5 つのエリアからイメージを取得します。
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Representative Results
本研究では多光子顕微鏡検査 (を使用して標本の合計スキャン領域に関連してチタン、ジルコニア ディスクに植民地化された領域の割合によって表されるバイオ フィルムの in situ成長の 48 時間後の植民地化の密度26.64 mm2)。図 2は、3 のテスト材料の表面の細菌の定着密度を表します。バイオ フィルムの密度が高いが、加工チタン ディスク上、キャストの表面に観察された (0.0292 μ m2と 0.0213 μ m2、それぞれ) よりジルコニア ディスク (0.0099 μ m2;p < 0.05;ダンのテスト続いて Kruskal-Wallis テスト)。
図 3は、ジルコニアの表面の細菌の細胞生存率を示しています (図 3 a、 3 a 'と3 a」)、チタンを加工 (図 3 b、 3B'と3B」)、チタン鋳造と (図 3 3 C'と3 C") ディスクします。このプロトコルでは核酸色素 propidium ヨウ化は破損した膜で細菌にだけ浸透し、したがって、死んだ細胞に関連する赤蛍光信号を発する。SYTO9 はそのまままたは侵害された膜の細菌細胞を浸透し、ライブ微生物から緑色の蛍光信号を発する。細胞の細菌生存率 (図 4) のすべてのグループで生きている微生物の優位性と試料間類似していた。ジルコニアの 2.10、1.95 加工チタン鋳造チタンの 1.63 され、ライブ/死細胞の比率。
亀裂、溝、または研磨や加工の過程ですべての材料の表面に生成される耐摩耗性欠陥が観察されたより明確にで加工、チタン円板をキャストします。微生物; の不在の中で認められたジルコニア ディスク領域を拡大主に球菌、桿菌、糸状性細菌から成る小さなポリモーフィックな微生物集合体も認められた (図 5 a 5 a ')。球菌と細菌の存在が加工チタン円板の表面に散らばっていた (図 5 bと5 b ')。鋳造チタン試験片表面にバイオ フィルムのような外観を持つ行列に関わる微生物のコロニーを発表した (図 5 5 C')。以下のマトリックス材料は、機械加工によるチタンとキャスト チタン ディスクに比べてジルコニア ディスクの表面に観察されました。
ジルコニア ディスク中のハフニウムの 1.57%、イットリウム、4.52% 酸素の 22.84% 70.83% ジルコニアの EDS 分析が明らかにチタンの 95.16%、酸素の 3.99% とキャスト チタン ディスク中の炭素の 0.85%チタン 89.86%、酸素の 7.53%、加工チタン ディスク (図 6) で炭素の 2.61%。
図 1: 口腔内装置、その場で研究します。保の留め金が伸線製造、チタン、ジルコニアのテスト ディスク (直径 2 mm 厚さ 10 mm) が部分的に自己硬化アクリル樹脂で埋め込まれて、小臼歯と大臼歯の地域で配置されたランダムに。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:細菌の細胞密度の蛍光イメージ。これらは細菌の細胞密度 (B) (A) ジルコニア加工チタンの蛍光画像であり、(C) は、その場で48 時間後チタン円板をキャストします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 細菌の細胞生存率は表面に付着します。これらのパネル (A) 死者の表面に付着した細菌の細胞生存率を示すジルコニア、(B) 死んだ細菌細胞加工チタン、および (C) 死者に細菌の細胞し、鋳造チタンの細菌セルをライブディスク蛍光イメージングによって描かれています。Propidium ヨウ化死んで細菌細胞が染色 (A'、 B'とC': 赤蛍光信号)。生きたバクテリアが SYTO9 で染色 (A"、 B」とC": 緑の蛍光性信号)。A B、およびCのパネルは、色にマージされた画像を表示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: バイオ フィルムを表すひげ細胞別のテスト材料生。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 走査電顕。これらのパネル表示の走査型電子顕微鏡 (A、 A') ジルコニア、(B、 B') 加工、チタンと (C、 C') 48 h原後バイオ フィルム、パノラマのクローズ アップ ビューをチタン ディスクをキャスト.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 元素分析によるエネルギー分散分光法 (EDS).これらのパネル (A) ジルコニア ディスクが表示 (Zr ジルコニア、Y を = = イットリウム、C = 炭素、O = 酸素と Hf ハフニウムを =);(B) 加工チタン、および (C) キャスト チタン ディスク (Ti = チタン、O = C と酸素、炭素を =)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
本研究で説明されたプロトコルは、チタン、ジルコニア補綴橋台は、細菌の細胞生存率と形態的特徴の分析を含む用材料のバイオ フィルム形成を評価するため開発されました。このため、テスト材料のサンプルを収容し、48 h の動的な口腔環境にさらされるそれらを保つために口腔内装置から成るバイオ フィルム形成の場でモデルは設計されました。デバイスは、快適かつ簡単に挿入、削除、およびボランティアによってきれいと考えられていた。まだ、音声学と美学にはほとんど影響はシンプルかつ低コストに、でき、バイオ フィルムの構造の中断のない標本の簡単な回復を示した。さらに、メソッドは、細菌細胞と細胞外マトリックスの整合性の保持を許可しました。標本と舌の接触実験中にディスクの偶発的な損失は、提案モデルの制限事項。メソッドの制限事項を最小限にするためには、口腔内のデバイスのディスクの位置決めは配布されたランダムに;さらに、ディスクが非毒性ホットメルト接着剤で修正され、サンプルの損失は報告されませんでした。
口腔内環境に生息する菌種の高の不均一性による強力な顕微鏡検査の技術はそのハード面を植民地化するバイオ フィルムの解析に必要です。多光子顕微鏡は本来三次元の解像度などの従来または共焦点顕微鏡解析上優れた光透過性、退色の削減のための近赤外励起の利点のいくつかを提供します、生きているセルと定量的情報33,34を提供する機能のイメージングと光損傷。これらの利点は、2 光子吸収過程の局所高励起と試料の光散乱の減少効果を起源としています。したがって、多光子顕微鏡検査により、深部組織イメージング、セルの最小の損傷およびよくローカライズされた光化学34の開始。ランダム サンプリングとフィールドの代表的な数は、正確な解析35,36のために選ばれます。多光子レーザー顕微鏡は、5161.88 5161.88 μ m、試料の総面積 33.94% に対応する x の分野の分析を許可しました。共焦点顕微鏡は、代表的な分析と標本の評価の長い期間のためのフィールド数が多いため必要性使用されませんでした。さらに、アウト フォーカスの背景の信号は、蛍光顕微鏡の使用を制限されています。多光子顕微鏡の利点にもかかわらず微生物学的フィールドでのみいくつかのアプリケーションが報告37,38,39です。その中では、操作ツールとしての利用たとえば、ローカライズされたアブレーションを達成するために/壊死アポトーシス、漂白、またはバイオ フィルムの明確に定義されたボリュームの photoactivation 細胞26。このメソッドを別のアプリケーションは、複数バイオ コンポーネント25,40,41に対する抗菌薬の有効性を評価することです。
本研究では、付着細菌細胞の蛍光核酸色素の膜の整合性28の関数としてセルに浸透すると評価しました。SYTO9 fluorophores が付いて、propidium ヨウ化は、ライブとデッド細菌間視覚的な差別のため使用されました。SYTO9 と propidium のヨウ化物の使用のいくつかの制限が構造30、現在 2 つの細胞膜をクロスにもっているためにそのまま膜とグラム陰性菌を染色する SYTO9 の難しさなど、文献で報告されています。 42。したがって、結合染色によって、生きた細胞を過小評価します。さらに、SYTO9 は propidium ヨウ化によって完全に置き換えられません、細菌細胞30,42の赤ではなく黄色蛍光ことがあります。別の制限は、時間をかけて SYTO9 信号の減少です。顕微鏡解析が染料29,30への曝露後 30 分内で実行されることをお勧めします。自発蛍光を基板からの信号強度を計算する背景の蛍光性を考慮する必要があるし、バインドされていない色素の存在が結果30と干渉するかもしれない。それにもかかわらず、これらの制限がよく報告されているので、指定した期間内、同様慎重に選択し、フィジーのソフトウェアの助けを借りて画像の背景を減算する処理のサンプルを持っていることが可能です。
走査電子顕微鏡観察中に高真空及び電子照射は、生物学的物質を含むサンプルの不利な条件を表します。非導べ電性のプロパティに加えてアーティファクト43を形成、電子の生成と検出システムを妨害する自然な状態でバイオ フィルムが取り込まれます。したがって、生物学的物質を含む試料は、伝導の電子43,44の構造の保全を確保するために準備されなければなりません。固定、脱水を含むプロトコル フェーズ乾燥およびコーティングによる導電性材料試験片の希釈と時間に留意して開発されました。生物材料の固定 cacodylate バッファーと四酸化オスミウムで固定を後にアルデヒド付着バイオ フィルム43,45,46の構造を維持するために実行されました。脱水は、徐々 に有機溶剤44に置き換えされている水とエタノール濃度の上昇シリーズで達成されました。連続置換を液体 CO2 CO2の気体、液体の除去への変換に続いて、エタノールの除去のための重要なポイントを行ったバイオ アーキテクチャの最小限の歪みで乾燥/ガスのインターフェイス、および標本43,44,45,46での界面張力の除去。電子の伝導性を確保するため、防止または損傷、および人工物、標本は金や金/パラジウムの 10-20 nm の層でコーティングしたイメージを減らします。さらに、金属の薄い層で供試体をコーティングすることができます標本内の電荷蓄積を減らす、向上コントラスト、させイメージ解像度46。
いくつかの制限にもかかわらず本その場でモデルだった 48 h バイオ フィルムを維持する、チタン、ジルコニアの材料の口腔バイオ フィルム形成の評価のために適切です。Fluorophores の使用は、微生物試験材料を植民地化の非常に異質人口の細菌セル実行可能性の分析を許可多光子顕微鏡によるイメージングに関連付けられています。生物の準備で使用される技術サンプル バイオ フィルムの構造の保全を推進し、可視化のための高品質の画像の獲得および植民地化微生物の形態的特性を許可.
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者に感謝顕微鏡マルチユーザ研究室 (リベイラウンプレトの医学) からジョゼ ・ アウグスト ・ Maulin EDS と SEM の彼の寛大な支援の分析とビデオ版の彼の寛大なテクニカル サポートにビッグブラザー テイシェイラ マチャド。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrogum 5 | Zhermack Dental | C302070 | |
| Durone IV | Dentsply | 17130500002 | |
| NiCr wire | Morelli | 55.01.070 | |
| JET auto polymerizing acrylic | Clássico | ||
| Dental wax | Clássico | ||
| Pressure pot | Essencedental | ||
| Sandpapers 600 grit | NORTON | T216 | |
| Sandpapers 1200 grit | NORTON | T401 | |
| Sandpapers 2000 grit | NORTON | T402 | |
| Metallographic Polishing Machine | Arotec | ||
| Isopropyl alcohol | SIGMA-ALDRICH | W292907 | |
| Hot melt adhesive | TECSIL | PAH M20017 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit | Invitrogen | L10316 | |
| Pipette Tips, 10 µL | KASVI | K8-10 | |
| Pipette Tips, 1,000 µL | KASVI | K8-1000B | |
| 24-well plate | KASVI | K12-024 | |
| Glass Bottom Dish | Thermo Scientific | 150680 | |
| AxioObserver inverted microscope | ZEISS | ||
| Chameleon vision ii laser | Coherent | ||
| Objective EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DIC | ZEISS | 440452-9903-000 | |
| SDD sensors - X-Max 20mm² | Oxford Instruments | ||
| Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G5882 | |
| Sodium cacodylate Buffer | SIGMA-ALDRICH | 97068 | |
| Osmium tetroxide | SIGMA-ALDRICH | 201030 | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH | S9638 | Used for preparation of phosphate buffered saline |
| KH2PO4 | SIGMA-ALDRICH | P9791 | |
| NaCl | MERK | 1.06404 | |
| Kcl | SIGMA-ALDRICH | P9333 | |
| Ethanol absolute for analysis EMSURE | MERK | 1.00983 | |
| CPD 030 Critical Point Dryer | BAL-TEC | ||
| JSM-6610 Series Scanning Electron Microscope | JEOL | ||
| SCD 050 Sputter Coater | BAL-TEC |
References
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